Роль слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз в устойчивости растений к биотическому стрессу
На правах рукописи
ГРАСКОВА ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА РОЛЬ СЛАБОСВЯЗАННЫХ С КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКОЙ ПЕРОКСИДАЗ В УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К БИОТИЧЕСКОМУ СТРЕССУ 03.00.12 – физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени Доктора биологических наук
ИРКУТСК – 2008 2
Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского Отделения Российской Академии Наук
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор В.К. Войников
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Ф.В. Минибаева доктор биологических наук, доцент Т.П. Побежимова доктор биологических наук, профессор И.Э. Илли
Ведущая организация: Казанский государственный университет
Защита состоится «04» июня 2008 г. в 10.00 ч на заседании специализированного диссертационного Совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г.
Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952)510754;
E-mail:
С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН
Автореферат разослан «» 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Г.П. Акимова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Важной проблемой современной биологии является изучение механизмов индуцирования устойчивости растений к действию патогенов. В ответ на заражение патогеном включаются защитные реакции такие, как усиление барьерных свойств (лигнификация), экспрессия генов и синтез ряда белков, в том числе, ферментов, среди которых особая роль отводится пероксидазам [Рогожин, 2000].
Большое количество работ посвящено роли пероксидазы в защитных механизмах растения при патогенезе [Аверьянов, 1994;
Андреева, 1987;
Газарян и др., 2006;
Горбачева и др., 1991;
Ильинская и др., 1991;
Кулаева и др., 1991;
Максимов, Черепанова, 2006;
Минибаева, Гордон, 2003;
Тарчевский, 2002;
Baker et al., 1997;
Bestwick et al., 1998;
Bolwell et al., 2002;
Zhao, Sakai, 2003]. Но участие ее в защитном ответе пораженных растений остается недостаточно исследованным. В настоящее время установлено, что в растениях некоторые пероксидазы локализованы в апопластном пространстве клеток [Bestwick et al., 1998].
В самые последние годы появились данные о том, что на клеточной поверхности растительных клеток присутствуют слабосвязанные с клеточной стенкой пероксидазы, способные легко отделяться от клеточной стенки и циркулировать по апопласту целого растения, инициируя в месте контакта с патогеном «иммунный ответ». Вероятно, именно эти пероксидазы первыми сталкиваются с «атакой» патогена, вступают в борьбу с ним, «посылают» сигнал о появлении патогена в геном растительной клетки, инициируя тем самым ее защитную реакцию. Однако все эти вопросы, несмотря на свою важность, остаются изученными крайне слабо. Поэтому изучение вопросов формирования с участием слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз иммунного ответа растения в самые первые моменты патогенеза представляется актуальным.
Цель работы Изучить роль слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в формировании ответа растительной клетки (на примере картофеля) при патогенезе кольцевой гнили.
Задачи исследований 1. Используя набор различных генотипов картофеля определить разнообразие по признаку их устойчивости к действию ряда штаммов кольцевой гнили Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms).
2. Изучить межтканевой и межсортовой полиморфизм по признаку активности пероксидазы, прежде всего слабосвязанной с клеточной стенкой, в контрольных растениях и при патогенезе.
3. Исследовать множественные молекулярные формы слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы у картофеля как в контроле, так и при инфицировании растений Cms штамм 5369.
4. Изучить механизм участия слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в формировании защитной реакции растений на действие патогена: определить динамику изменения активности этого фермента при инфицировании растений Cms;
определить кинетические параметры и зависимость их от экспрессии генома клетки.
5. Изучить изменение активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы при флуктуациях температуры на фоне инфицирования Cms.
6. Определить связь между активностью слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы и устойчивостью клеток картофеля к действию патогена и установить роль этой пероксидазы в устойчивости картофеля к патогену.
7. Изучить возможность использования пероксидаз в качестве маркеров стрессовой нагрузки у растений.
Положения, выносимые на защиту 1. Среди генотипов картофеля существует полиморфизм по ряду признаков:
по устойчивости к такому биотическому стрессу как инфицирование кольцевой гнилью, по активности слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз, по множеству ее молекулярных форм.
2. Действие патогена кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Сms) активирует слабосвязанную с клеточной стенкой пероксидазу и по этому признаку контрастные по устойчивости генотипы картофеля различаются: быстрое повышение активности фермента происходит за счет изменения кинетических параметров у устойчивого сорта и медленное повышение активности фермента у восприимчивого сорта происходит за счет синтеза новых молекул.
3. Слабосвязанные с клеточной стенкой пероксидазы участвуют в механизмах, определяющих устойчивость растений картофеля к патогену:
ингибирование фермента приводит к резкому снижению жизнеспособности клеток картофеля при действии патогена.
4. Пероксидазу можно использовать для детекции активации защитных механизмов растений при действии биологически активных веществ или для определения абиотического стресса, который испытывают растения в агроэкосистемах при их загрязнении промышленными выбросами.
Научная новизна Впервые показано участие слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз в формировании защитных механизмов растений на действие бактериальных патогенов. Получены оригинальные данные о межтканевом и межсортовом полиморфизме множественных молекулярных форм слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз картофеля. Установлено, что активность этих пероксидаз резко возрастает при бактериальном патогенезе, степень увеличения этой активности сортоспецифична и наибольшей активностью обладают энзимы устойчивых к патогену генотипов картофеля.
Впервые доказано, что устойчивость суспензионных клеток картофеля к действию патогена в значительной степени обусловлена увеличением активности слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз. Впервые показана реализация двух стратегий защиты клеток картофеля от действия патогена. Одна их них присуща устойчивым генотипам и связана с быстрой и резкой активацией уже существовавших до инфицирования молекул слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз. Другая, свойственная восприимчивым генотипам, связана с синтезом молекул фермента de novo на более поздних этапах патогенеза. Первая – обеспечивает устойчивость растений к патогену, а вторая – не позволяет вовремя сформировать необходимую устойчивость.
Практическая значимость работы Проведенные исследования вскрывают тонкие механизмы защиты растений от действия патогена, показывают участие слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз в сигнальных системах клетки при ее инфицировании, указывают на функционирование различных стратегий защиты клетки от патогена. На основании проведенных исследований разработана схема защиты растительной клетки от действия патогена в зависимости от устойчивости к нему сорта картофеля. Полученные результаты вносят вклад в развитие теории иммунитета растений, показывают возможности управления им, в том числе при флуктуациях температуры, что особенно важно в практике сельского хозяйства.
Практическое применение полученных результатов позволит снизить потери урожая картофеля от кольцевой гнили и повысить качество продукции.
Апробация работы Основные результаты работы докладывались на Всероссийских съездах общества физиологов растений (С.-Петербург, 1993;
Москва, 1999;
Пенза, 2003), общества биохимиков (С.-Петербург, 2002), VII молодежной конференции ботаников (С.-Петербург, 2000), симпозиумах «Signal system of Plant cell» (Москва, 2001), “Stress of Plant” (Москва, 2001), “ELSO” (2002), «FEBS Special Meeting on Signal Transduction» (Брюссель, 2003), «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений» (Харьков, 2003), Всероссийских научных конференциях «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007), конференциях «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004) и «Роль сельскохозяйственной науки в развитии АПК Приангарья» (Иркутск, 2007).
Связь с планами НИР Работа выполнялась в соответствии с планами НИР Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН по проекту 19.1.9:
«Механизмы устойчивости растений к биотическим стрессам;
клеточные и молекулярные основы фитоиммунитета;
регуляция симбиотической азотфиксации при гипотермии» (2004-2006 гг.) и по проекту 6.7.1.5:
«Взаимодействие растений и микроорганизмов при действии биотических и абиотических стрессоров;
молекулярные основы фитопатогенеза;
защитно регуляторные механизмы при развитии бобово-ризобиального симбиоза» (2007-2009 гг.) (№ гос. рег. 01.2.007 07209).
Конкурсная поддержка работы Исследования были поддержаны Грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (НШ-4812.2006.4) "Молекулярно-генетические и физико-химические механизмы редокс-регуляции экспрессии генов при биотических и абиотических стрессах", междисциплинарным интеграционным проектом СО РАН-2006 N 47, грантами РФФИ 07-04-01055 а, РФФИ 07-04-01177-а, 05-04-97242-р_байкал_а.
Публикации Основные результаты исследований отражены в 40 научных публикациях, в том числе в 11 статьях в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов докторских диссертаций.
Структура и объем диссертации Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка используемой литературы (538 работ, в том числе 307 на иностранных языках). Диссертация изложена на 394 стр., содержит 23 таблиц и 68 рисунков.
Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и анализе полученных результатов.
Благодарности.
Выражаю благодарность д.б.н., профессору В.К. Войникову за постоянную и неоценимую помощь, поддержку и внимание при выполнении этой работы. Благодарю сотрудников нашей лаборатории – д.б.н., профессора А.С. Романенко, к.б.н. Е.Г. Рихванова, к.б.н. Ю.А. Маркову, к.б.н. Т.Н.
Шафикову, Е.В. Кузнецову, Т.И. Трибой, А.Л. Алексеенко.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследования являлись растения картофеля in vitro (Solanum tuberosum L.) сортов: Луговской, Темп, Адретта, Сосновский, Былина, Искра, Тулунский ранний, Раменский, Лукьяновский, Ирена Барская, Сантэ, а также дикие мексиканские типы картофеля, которые были получены из лаборатории биотехнологии РУП «Институт картофелеводства НАН Беларуси»: Solanum bulbocastanum (Sbk.), Solanum cardiophyllum (Л-8), Solanum polyadenium (Л-39-2). Растения выращивали из черенков на агаризированной среде Мурасиге и Скуга (МС) [Murashige, Scoog, 1962] с добавлением гормонов и витаминов [Бутенко и др., 1984] в климатической камере с контролируемым режимом выращивания: температура 23-25оС днем и 18-20оС – ночью, влажность – 75-85 %, освещенность – 5000-7000 лк при 16-часовом световом дне.
Каллусы и суспензионные клетки картофеля культивировали на среде МС с добавлением гормонов и витаминов при постоянном встряхивании при температуре 25оС. Скорость вращения круговой качалки была в пределах об/мин с амплитудой вращения 2-4 см.
Для работы использовали различные по вирулентности и мукоидности штаммы бактерии Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, вызывающие кольцевую гниль клубней картофеля. Штамм 5369 (вирулентный, мукоидный) был получен из НИИ картофельного хозяйства (пос. Коренево, Московская обл.). Штаммы CsR14 (вирулентный, мукоидный), Cic (вирулентный, немукоидный), Cs3NM (слабовирулентный, немукоидный), Cs4 (невирулентный, немукоидный), CsR5 (невирулентный, мукоидный) были любезно предоставлены М. Метцлер (университет г.Турку, Финляндия). Бактерии культивировали на картофельном агаре с добавлением глюкозы (1,5% в конечной концентрации) в течение 5-6 дней. Пересадку бактериальных культур производили через 7 суток. Через 5-7 пассажей бактерии высевали на картофельно-глюкозный агар: 200 г картофеля (мякоть клубней), глюкоза 20 г/л, агар-агар 17-20 г/л для сохранения вирулентных свойств.
Жизнеспособность суспензионной культуры определяли по окраске живых клеток с красителем 0.05 % синим Эванса (Evans blue) [Reboutier et al., 2005]. Также использовали метод окрашивания суспензионных клеток солями тетразолия [Еникеев и др., 1995]. Метод основан на способности живых клеток восстанавливать ТТХ (2,3,5-трифенилтетразолий хлорид) в водонерастворимый формазон, с последующим извлечением его органическими растворителями и колориметрированием [Yoshida et al., 1993].
Инфицирование растений in vitro и суспензионных клеток проводили внесением бактериальной суспензии (титр 2х104, 5х107, 2х106, 2х клеток/мл) в среду культивирования. Высев бактериального патогена из тканей зараженных растений проводили по методу, разработанному в нашей лаборатории: растение делили на четыре зоны: 1 – зона (корень), 2 – зона (нижняя часть стебля), 3 – зона (средняя часть стебля), 4 – зона (верхушка).
Для стерилизации части растения помещали в 10% раствор белизны с добавлением Tween, затем трехкратно промывали стерильной бидистиллированной водой. Каждую часть растения растирали с добавлением 400 мкл стерильной воды. Затем 200 мкл пробы наносили на агар, с добавлением 5% дрожжевого экстракта и 1.5% глюкозы.
Выделение и очистку экзополисахаридов (ЭПС), продуцируемых штаммом 5369, осуществляли методом колоночной ионообменной хроматографии [Strobel, 1967]. Для заражения использовали 0.1% концентрацию ЭПС.
Растительные экстракты, содержащие растворимую и слабосвязанную с клеточной стенкой пероксидазу, получали согласно [Паду, 1995], активность фермента определяли по методу Бояркина [Ермаков и др., 1987], в качестве субстрата использовали гваякол.
За кинетикой пероксидазной реакции в суспензионных клетках картофеля сортов Луговской и Лукьяновский следили, измеряя скорость окисления субстрата (гваякола) [Войников, Тимина, 1983]. Для этого измеряли увеличение оптической плотности при 580 нм в реакционной смеси, состоящей из 0.5 мл 0.1 М цитратно-фосфатного буфера (рН 6.2 и 5.4), 0.5 мл 0.3% перекиси водорода и 0.5 мл (0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.5%, 0.055%) гваякола. Кинетику снимали на спектрофотометре СФ-26.
Кинетические константы рассчитывали по методу Лайнуивера-Берка [Виноградова, 1978].
Для определения оптимума рН активности слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз из тканей растений картофеля и из суспензионных культур картофеля фермент выделяли в 0.1 М цитратно-фосфатном буфере, варьируя рН буфера от 4.0 до 7.0 (шаг 0.2).
Для подавления синтеза пероксидазы использовали ингибитор белкового синтеза – циклогексимид (5 мг/л) и специфический ингибитор РНК-полимеразы II – А-Аманитин (0.01 мг/л) [Граскова и др., 2002].
Электрофорез нативного белка проводили в блоках полиакриламидного геля в модифицированной системе Андерсон, Борг и Микаэльсон [Колесниченко и др., 2000]. Для выявления ферментативной активности на полиакриламидном геле использовали диаминобензидиновый метод Graham, Karnovski (1966) в модификации [Лойд и др., 1982]. Гели помещали в раствор, содержащий ДАБ (3,3, - диаминобензидин), цитратно-фосфатный буфер 0.1 М и 0.3% Н2О2 и инкубировали до появления коричневой окраски.
Электрофорез в ПААГ с ДДС-Na проводили в модифицированной системе Лэммли [Laemmli, 1970]. Для визуализации белков гели окрашивали в водном растворе, содержащем 0.1% Кумасси R-250, 25% изопропанола, 10% уксусной кислоты. Для обесцвечивания фона гели переносили в 10% раствор уксусной кислоты и отмывали в течение нескольких часов [Побежимова и др., 2004]. Вестерн-блоттинг: перенос белков после электрофоретического разделения на нитроцеллюлозную мембрану проводили в Toubin-буфере ( мМ трис, 192 мМ глицин, 20% метанол, рН 9.2). После переноса белков нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в растворах первичных и вторичных антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой и окрашивали раствором красителя (BCIP+NTB), приготовленным в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. После окрашивания мембраны сканировали.
Иммунизацию кроликов проводили препаратом пероксидазы хрена в смеси с адъювантом Фрейна [Колесниченко, 2002]. Через 10 дней после третьей иммунизации производили забор крови. Белки очищенной сыворотки осаждали сульфатом аммония (50% насыщения) и хранили в виде осадка под сульфатом аммония. Встречную диффузию в геле антигенов и антител проводили по методу Ухтерлони [Остерман, 1983].
Повторность экспериментов была 3-6 кратная. Полученные результаты обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические величины и ошибки средних. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ StatSoft [Statistica 6.0].
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Определение степени устойчивости сортов картофеля к кольцевой гнили при заражении вирулентным штаммом in vitro Была определена устойчивость ряда сортов картофеля к кольцевой гнили, вызываемой бактериальным патогеном Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) вирулентного штамма 5369. Было установлено, что изученные сорта картофеля по степени устойчивости к данному патогену разделяются на три группы: устойчивые, среднеустойчивые и восприимчивые (табл. 1).
Таблица 1. Устойчивость растений in vitro различных сортов картофеля к С. michiganensis subsp. sepedonicus (штамма 5369) после инкубации с патогеном в течение 10 суток. М±m, n=3-5.
Средний прирост % Устойчивость Устойчивость стебля на неповрежденных растение, % от листьев на Сорт контроля (Б) растение (А) А+Б/2 Баллы 107 Пригожий-2 96±2 119± 107 Луговской 96±2 118± 104 Темп 88±2 119± 99 Адретта 86±2 111± 97 Домодедовский 85±2 95± 97 Сосновский 83±2 93± 93 Былина 81±2 91± 2- Искра 82±2 88± Тулунский 78 77±2 80± ранний 72 1- Раменский 74±2 70± 63 Лукьяновский 56±2 70± 56 Ирена Барская 45±2 66± Примечание: баллы: 4 – устойчивые;
3-2 – среднеустойчивые;
1 – восприимчивые.
Распространение бактерий по тканям растений картофеля in vitro при заражении вирулентным штаммом 5369 Cms При изучении распространения бактериального патогена по тканям растений картофеля было установлено, что при корневом инфицировании патоген постепенно распространяется вверх по растению, заражая остальные его ткани. Интенсивность продвижения патогена по растению зависит от степени устойчивости сорта. Проникновение патогена по тканям устойчивого сорта происходит намного медленнее, чем у восприимчивого сорта (табл.2).
Таблица 2. Рост колоний патогена, высеянных из тканей зараженных растений картофеля in vitro. M±m, n=3-5.
Первые Через 2 Через Сорт картофеля Зоны сутки суток суток растения культивир. культивир. культивир.
(КОЕ) (КОЕ) (КОЕ) Луговской 1 зона 620 ± 30 360 ± 50 560 ± (устойчивый) 2 зона 130 ± 30 740 ± 20 70 ± 3 зона нет роста 380 ± 20 7± 4 зона нет роста нет роста нет роста Лукьяновский 1 зона Газон 380 ± 20 Газон (восприимчивый) 2 зона 210 ± 20 1800 ± 40 2700 ± 3 зона 170 ± 10 490 ± 30 120 ± 4 зона нет роста нет роста 830 ± Обозначение: КОЕ – колониеобразующие единицы.
Влияние различных штаммов Cms на активность растворимой пероксидазы в тканях растений картофеля (корень, лист, стебель) После заражения картофеля через корни различными штаммами Cms активность растворимой пероксидазы резко возрастала во всех тканях растения. Причем активность фермента в тканях устойчивого сорта Луговской была выше, чем в тканях восприимчивого сорта Лукьяновский (рис.1).
Среди набора различных по вирулентности штаммов Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus наибольшим патогенным эффектом (судя по пероксидазной активности) обладал штамм 5369, который был использован в дальнейших исследованиях.
Сорт Луговской Сорт Лукьяновский Активность пероксидазы, условные единицы/мг белка Активность пероксидазы, условные единицы/ мг белка 1 123 1 23 4 5 6 23 456 7 12 34 56 7 1 234 5 67 12 34 56 корни листья стебли корни стебли листья Рис. 1. Активность растворимой пероксидазы в тканях корней, листьев и стеблей картофеля в присутствии различных штаммов возбудителя кольцевой гнили картофеля при рН 6.2.
1 – без патогена (контроль);
2 – Cs4 (невирулентный);
3 – CsR (невирулентный);
4 – Cs3NM (слабовирулентный);
5 – Cic31 (вирулентный);
6 - CsR14 (вирулентный);
7 – 5369 (вирулентный).
Исследование активности растворимой и слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в тканях растений картофеля in vitro Активность пероксидазы различна в тканях корней, стеблей и листьев растений картофеля in vitro. Это заключение касается как растворимой пероксидазы, так и пероксидазы слабосвязанной с клеточной стенкой.
Активность растворимой пероксидазы, как правило, выше во всех тканях устойчивых сортов по сравнению с тканями восприимчивых сортов картофеля. Активность слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы была выше в тканях корней, по сравнению с тканями стеблей и листьев и во всех тканях была выше у устойчивых сортов, чем у восприимчивых (табл.3).
Наблюдается межсортовой полиморфизм активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы - она всегда выше у устойчивых к патогену сортов, чем у восприимчивых. Более высокая активность этой пероксидазы в тканях корней связана с тем, что корни первыми сталкиваются с патогеном и первыми вступают в борьбу с ним. Вероятно, высокая активность слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в корнях устойчивых Таблица 3. Активность слабосвязанной с клеточной стенкой и растворимой пероксидазы, выделенной из тканей растений картофеля in vitro. Активность фермента выражена в условн. ед./г сырой массы. M±m, n=3-5.
Активность слабосвязанной с Активность растворимой клеточной стенкой пероксидазы пероксидазы Сорт лист стебель корень лист стебель корень Пригожий-2 1.581±0.017 1.224±0.020 1.674±0.023 1.628±0.016 1.256±0.034 1,708±0. Луговской 1.367±0,073 1.570±0,020 1.952±0.011 1.295±0,054 1.503±0.074 1.896±0. Темп 1.163±0,029 1.667±0.067 1.253±0.005 1.124±0.035 1.563±0.054 1.350±0. Домодедовс- 0.844±0.012 0.861±0.043 0.871±0.008 0.952±0.023 0.897±0.054 0.853±0. кий Сосновский 0.830±0.031 1.016±0.082 0.840±0.057 0.865±0.025 1.124±0.061 0.912±0. Былина 0.887±0,015 1.170±0.025 1.485±0.005 0.963±0.023 1.210±0.014 1.398±0. Тулунский 0.706±0.015 0.653±0.046 0.927±0.015 0.697±0.054 0.751±0.036 1.052±0. ранний Лукьяновский 0.814±0.009 0.696±0.007 0.614±0.019 0.945±0.063 0.742±0.020 0.725±0. Ирена Барская 0.746±0.025 0.689±0.019 0.968±0.030 0.752±0.026 0.650±0.035 0.986±0. сортов картофеля наряду с другими механизмами защиты, обеспечивает способность этих растений противостоять действию патогена.
Межтканевой и межсортовой полиморфизм слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз исследуемых сортов картофеля Исследование множественных форм слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы у различных генотипов картофеля in vitro с различной степенью устойчивости и восприимчивости к возбудителю кольцевой гнили показало полиморфизм исследуемой пероксидазы. Оказалось, что существует межтканевой полиморфизм фермента (рис. 2). Среди форм слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы имеются как общие для всех тканей, так и специфические, что может быть связано с различными их функциями в разных тканях растений.
При сравнении спектров слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной их тканей листьев, стеблей и корней исследованных растений, также обнаружились различия в количестве и электрофоретической подвижности изоформ в зависимости от сорта (рис.3).
Рис. 2. Изофер ментный спектр слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз карто феля в тканях листьев, стеблей и корней исследуе мых сортов карто феля. Нативный электрофорез в ПААГ при 4 С.
Гели окрашены ДАБ.
Rf – относительная электрофоретическая подвижность.
1 – ткани листа;
2 - ткани стебля;
3 – ткани корня.
А. Ткани листьев Б. Ткани стеблей В. Ткани корней Рис. 3. Изоферментный спектр слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз, выделенных из тканей листьев (А), стеблей (Б) и корней (В) исследуемых сортов картофеля. Нативный электрофорез в ПААГ при 40С. Гели окрашены ДАБ. Rf - относительная электрофоретическая подвижность.
1 – сорт Пригожий-2. 2 – сорт Луговской. 3 – сорт Темп. 4 – сорт Домодедовский. 5 – сорт Сосновский. 6 – сорт Былина. 7 – сорт Тулунский ранний. 8 – сорт Лукьяновский. 9 – сорт Ирена Барская.
Анализ экспрессии молекулярных форм слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из разных тканей одного сорта картофеля, позволил показать проявление пространственной и временной регуляции изопероксидаз в растениях картофеля. Таким образом, у картофеля существует сортовой полиморфизм исследуемой пероксидазы. Число форм фермента у разных сортов различно и варьирует от 2 до 6. Чаще всего встречается форма с Rf 0.75, и она обнаружена у большинства сортов в различных тканях.
Влияние заражения кольцевой гнилью на изоферментный состав слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы картофеля в тканях листьев, стеблей и корней Инфицирование растений патогенами приводит к быстрой активации пероксидазы, часто сопровождаемой появлением новых множественных форм и исчезновением некоторых других форм этого фермента. В дальнейших опытах изучали изменение молекулярных форм исследуемой пероксидазы.
На рисунке 4 показаны молекулярные формы слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из тканей листьев, стеблей и корней растений картофеля, контрастных по устойчивости к кольцевой гнили: Луговской (устойчивый) и Лукьяновский (восприимчивый).
Заражение растений картофеля, относящихся к группе устойчивых, не приводило к появлению новых форм слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы (рис.4). При этом на гелях наблюдается интенсификация окраски полос, что свидетельствует об увеличении активности фермента у этих растений после заражения патогеном. В остальных исследуемых сортах (слабоустойчивые и восприимчивые) заражение вызывало изменение в количестве изоформ в сторону увеличения (табл. 4). Например, у сорта Тулунский ранний отмечали появление новых четырех форм фермента во всех исследуемых тканях.
А. Сорт Луговской (устойчивый) Б. Сорт Лукьяновский (восприимчивый) Рис. 4. Изоферментный спектр слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз, выделенных из тканей картофеля сорта Луговской и Лукьяновский.
Нативный электрофорез в ПААГ при 40С. Гели окрашены ДАБ. Rf – относительная электрофоретическая подвижность.
Таблица 4. Изменение числа слабосвязанных с клеточной стенкой изопероксидаз, выделенных из тканей исследуемых сортов картофеля при инфицировании кольцевой гнилью.
Кол-во изоформ в Кол-во изоформ в Изменения кол-ва Баллы контрольных зараженных растениях изоформ после Сорт устой- растениях заражения чивости Л С К Л С К Л С К 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0. 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27 - - Пригожий-2 4 0.45 0.53 0.53 0.45 0.53 0. 0.53 0.63 0.53 0. 0.63 0.75 0.63 0. 0.75 0. 0.61 0.47 0.47 0.61 0.47 0. Луговской 4 0.75 0.61 0.61 0.75 0.61 0.61 - - 0.83 0.75 0.75 0.83 0.75 0. 0.83 0.83 0.83 0. 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0. Темп 4 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 - - 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83 0. 0.83 0.21 0.61 0.05 0.21 0. 0.86 0.83 0.75 0.21 0.83 0.75 +4 - Домодедовский 3 0.86 0.83 0.67 0.86 0. 0.86 0.75 0. 0. 0. 0.05 0.75 0.63 0.05 0.57 0. 0.27 0.83 0.75 0.27 0.63 0.47 +2 +2 + Сосновский 3 0.83 0.57 0.75 0. 0.86 0.63 0.83 0. 0.83 0. 0.86 0. 0.63 0.63 0.63 0.05 0.05 0. 0.75 0.83 0.75 0.27 0.53 0.43 +1 +2 + Былина 3 0.83 0.86 0.83 0.63 0.63 0. 0.83 0.75 0. 0.83 0. 0.67 0.75 0.67 0.05 0.05 0. 0.75 0.83 0.83 0.27 0.27 0.45 +4 +4 + 0.83 0.86 0.53 0.61 0. Тулунский ранний 2 0.61 0.67 0. 0.67 0.75 0. 0.75 0.83 0. 0.83 0. 0.61 0.67 0.67 0.11 0.67 0. 0.67 0.75 0.75 0.27 0.75 0.67 +3 - + 0.75 0.83 0.83 0.61 0.83 0. Лукьяновский 1 0.83 0.67 0. 0. 0. 0. 0.75 0.53 0.67 0.53 0.27 0. Ирена Барская 1 0.83 0.75 0.83 0.75 0.53 0.53 +1 +1 + 0.83 0.86 0.83 0.75 0. 0.83 0. Обозначения: + - увеличение числа изоформ;
- число не изменяется). Л – ткани листа;
С – ткани стебля;
К – ткани корня.
Исследования диких и гибридных линий картофеля Дикие виды картофеля обладают высокой адаптивной способностью против многих возбудителей болезней и служат источниками генов устойчивости ко всем основным заболеваниям и ряду неблагоприятных факторов среды. Были исследованы изменения активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в тканях диких типов картофеля при заражении возбудителем кольцевой гнили. Заражение не вызывало появления характерных симптомов заболевания, таких как угнетение роста и хлороза листовых пластинок. Растения отличались высокой устойчивостью к действию патогена, и их использование в селекции на устойчивость к кольцевой гнили может быть перспективным.
Активность исследуемого фермента в тканях контрольных растений дикого типа была примерно равной и в случае корней, выше, чем в тканях стеблей и листьев, а также чем в тканях картофеля культурных сортов.
Изоферментный состав слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в тканях картофеля одного дикого типа различается по своему составу.
Отмечены различия между типами дикого картофеля (табл.5). Заражение диких типов картофеля вирулентным штаммом 5369 кольцевой гнили вызывало увеличение активности исследуемого фермента во всех тканях. Но наиболее сильное увеличение активности фермента отмечали в тканях корней (примерно в три раза).
Электрофоретическое разделение исследуемых пероксидаз, выделенных из тканей диких типов картофеля после заражения патогеном, не показало изменения в количестве молекулярных форм фермента по сравнению с неинфицированными тканями. Повышение активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из тканей диких типов картофеля, происходит, вероятно, за счет изменения активного центра, а также изменение конформации молекулы может происходить за счет разрыва слабых связей, что и обеспечивает значительное повышение Таблица 5. Множественные Дикий тип Корни (Rf) Листья (Rf) Стебли (Rf) картофеля молекулярные формы слабо 0.05 0.05 0. связанной с клеточной сте 0.13 0. Solanum 0.17 0. нкой пероксидазы, выделен bulbocastanum 0.37 0. ные из тканей корней, (S.b.) 0. листьев и стеблей диких 0. 0. типов картофеля.
0.05 0.05 0. Solanum 0.15 0.15 0. Rf - относительная электрофо cardiophyllum 0.32 0.32 0. ретическая подвижность.
(Л-8) 0.42 0. 0.52 0. 0.61 0. 0.70 0. 0. 0.06 0.08 0. Solanum 0.11 0.44 0. 0.40 0.56 0. polyadenium 0.51 0.60 0. 0.55 0. 0. (Л-39-2) 0. активности молекулярных форм фермента.
Динамика активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из суспензионных клеток картофеля сортов Луговской и Лукьяновский во время заражения патогеном Для изучения молекулярных механизмов, приводящих к изменениям в клетках во время действия различных стрессов, удобным объектом являются суспензионные культуры клеток. Были получены и использованы культуры клеток двух контрастных по устойчивости к кольцевой гнили сортов картофеля: Луговской (устойчивый) и Лукьяновский (восприимчивый).
Использование именно такой модельной системы позволило изучить динамику активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в самые первые моменты действия патогена.
Активность фермента у устойчивого сорта всегда была выше, чем у восприимчивого и резко возрастала при действии патогена. Исследования активности пероксидазы в культуральной среде и в клетках патогена показали, что активность не детектировалась. Поиск в базе данных UniProtKB/NrEMBL показал отсутствие пероксидазы у Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Так как бактерии не имеют собственной пероксидазной активности и, следовательно, их вклада в тестируемую активность фермента не было.
При культивировании клеток картофеля восприимчивого сорта Лукьяновский с патогеном повышение активности исследуемого фермента наблюдали через 10 мин после начала и через 1.5-2.5 ч. Активность пероксидазы во втором пике была выше, чем в первом (рис. 5). Добавление ингибиторов циклогексимида и А-Аманитина привело к снижению уровня активности в течение первого часа инкубирования и полностью элиминировало увеличение активности через 1-2.5 ч. Добавление патогена к клеткам устойчивого сорта Луговской вызывало увеличение активности фермента примерно вдвое. Первое увеличение активности наблюдалось через 5 мин после начала заражения и второе в промежуток от 1.5 до 2.5 ч, причем уровень активности был примерно равным. Добавление ингибиторов не влияло на активность фермента в первые минуты заражения и полностью снимало активирование фермента после первого часа культивирования (рис.5).
Изменение активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы во времени свидетельствует о двухфазном ответе на инфицирование. Причем, второй пик активности (через 1.5-2 ч после инфицирования) у обоих сортов картофеля связан с синтезом новых молекул фермента, то есть он обусловлен изменением экспрессии генома при патогенезе. Первый пик активности (через 5-20 мин после инфицирования) исследуемой пероксидазы у устойчивого сорта не зависит от синтеза белка и, возможно, он обусловлен быстрой активацией слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, которая уже имелась на поверхности клеток до их инфицирования.
0, Активность пероксидазы, усл.ед/мг белка 0, Сорт Лукьяновский (восприимчивый) 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1 2 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 Время, мин Сорт Луговской (устойчивый) 0, Активность пероксидазы, усл.ед/мг белка 0, 0, 0, 6 0, 0, 0, 3 2 0, 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 Время, мин Рис. 5. Динамика активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из суспензионных клеток картофеля устойчивого и восприимчивого сортов картофеля.
1 - контроль, без патогена и ингибиторов;
2 - контроль, без патогена + циклогексимид;
3 - контроль, без патогена + А-Аманитин;
4 - суспензионные клетки картофеля + патоген;
5 - суспензионные клетки картофеля + патоген + циклогексимид;
6 - суспензионные клетки картофеля + патоген + А Аманитин. M±m, n=3-5.
Изменение кинетических параметров активации слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из суспензионных клеток картофеля, в ответ на бактериальное заражение Фермент пероксидаза может менять свои каталитические свойства под влиянием заражения растения-хозяина патогенами, а снижение Км для пероксидазы инфицированных растений может происходить в результате повышения ее сродства к субстрату. Были получены данные, которые показывали, что при патогенезе регуляция активности слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз суспензионных клеток картофеля осуществляется за счет изменения кинетических параметров этих ферментов [Граскова и др., 2004]. Причем в первые моменты инфицирования клеток изменяются кинетические параметры уже существующих молекул ферментов. С увеличение длительности действия патогена, вероятно, синтезируются новые молекулы ферментов (возможно, другие их изоформы) с другими кинетическими параметрами [Граскова и др., 2003].
Были получены данные о том, что слабосвязанные с клеточной стенкой пероксидазы устойчивого и восприимчивого сортов картофеля в отсутствии патогена конкурентно ингибированы. Добавление патогена к клеткам устойчивого сорта привело к резкому снижению Км. При этом величина Vmax достоверно не изменялась. Это свидетельствует о том, что до инфицирования пероксидазы устойчивого сорта были конкурентно ингибированы, а в ответ на инфицирование произошло снижение этого ингибирования и как следствие - увеличение активности. Эти данные позволяют заключить, что в первые моменты инфицирования резкое повышение активности ферментов устойчивого сорта происходит за счет увеличения их сродства к субстрату в результате снижения конкурентного ингибирования (рис.6). У восприимчивого сорта картофеля не происходит резкого увеличения активности фермента из-за протекания одновременно двух разнонаправленных процессов: снижение Км и снижение скорости образования и распада фермент-субстратного комплекса Vmax (рис.6).
Рис. 6. Изменение 1 /[V ] кинетических пара метров слабосвя занной с клеточной стенкой пероксидазы устойчивого и вос приимчивого сортов картофеля в на 1 чальный период инфицирования.
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0, 1 - Сорт Луговской, 1 /[S ] - контроль;
2 – Сорт Лукьяновский, кон троль;
3 – Сорт Луговской, заражение 10 мин;
4 – Сорт Лукьяновский, заражение 10 мин. V – скорость реакции (условн. ед./г сырой массы);
S – концентрация субстрата (мМ).
Изучение изоферментных спектров пероксидазы, выделенной из суспензионных клеток картофеля В контрольных клетках картофеля восприимчивого сорта Лукьяновский растворимая пероксидаза представлена четырьмя изоформами с Rf 24, 39, 41 и 48 (рис.7, А, трек 1). Слабосвязанная с клеточной стенкой пероксидаза этого сорта картофеля имела только три изоформы с Rf 39, 41 и 48 (рис.7, А, трек 2). Эти данные свидетельствуют о различии спектров изоэнзимов растворимой и слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидаз у восприимчивого сорта картофеля. Спектр изоформ пероксидазы клеток устойчивого сорта картофеля (сорт Луговской) был значительно беднее. Он состоял из одной изоформы (Rf 41) растворимой пероксидазы и двух изоформ (Rf 15 и 41) слабосвязанной с клеточной стенкой (рис.7, Б, треки 1,2).
При заражении клеток картофеля устойчивого сорта патогеном спектр изопероксидаз не изменялся, но резко повышалась интенсивность окрашивания полос (рис.7, Б, треки 3,4), что свидетельствует об увеличении активности изоэнзимов. Активность изоферментов пероксидаз восприимчивого сорта картофеля при бактериальном заражении также А Рис. 7. Спектры изоперо ксидаз суспензионных клеток картофеля сортов Лукьяновский (А) и Луговской (Б) при действии штамма 5369 C. michiganensis subsp. sepedonicus, ЭПС (0. %) и ингибитора белкового Б синтеза (циклогексимид).
Гели окрашены ДАБ + Н2 О2.
1,2 – контроль;
3,4 – инкубация с бактериями;
5,6 – инкубация с ЭПС;
7,8 инкубация с бактериями и циклогексимидом;
9,10 – инкубация с ЭПС и циклогексимидом;
1,3,5,7,9 – растворимые пероксидазы;
2,4,6,8,10 – слабосвязанные с клеточной стенкой пероксидазы.
увеличивалась. Об этом можно судить по возрастанию интенсивности окрашивания изоформ (рис.7, А, треки 3,4). В отличие от устойчивого сорта в спектре изопероксидаз восприимчивого сорта картофеля при бактериальном заражении появились новые изоформы с Rf 43 и 52 (рис.7, А, треки 3,4). Эти результаты свидетельствуют о том, что при бактериальном заражении у восприимчивого сорта картофеля происходит как увеличение активности существующих изоформ пероксидазы, так и образование новых изоферментов, в то время как у устойчивого сорта увеличивается активность существующих изоэнзимов и их число не изменяется.
Влияние гипо- и гипертермии на активность слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз при бактериальном заражении В производственных условиях растения картофеля сталкиваются не с одним стрессирующим фактором, а несколькими. Например, они одновременно переживают биотический стресс при патогенезе и абиотический стресс при флуктуациях температуры. Поэтому было изучено изменение в активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы при действии этих двух стрессов. Температуру изменяли в контролируемых условиях от 4оС до 38оС. Прежде всего, оказалось, что рост бактерии зависит от температуры: высокая температура его угнетает через 5 суток, а при низкой - происходит постоянное увеличение роста бактерии (рис.8).
Рис. 8. Динамика роста бактерий при повышен ной и пониженной Титр бактерий, 1х температуре культиви рования.
1 – температура культиви рования 250С;
2 – темпера тура культивирования 40С;
3 – температура культиви 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 рования 380С.
Время,сутки При низкой температуре (40С) активность фермента во всех вариантах опыта (контроль и патогенез, устойчивый и восприимчивый сорта) изменялась незначительно (рис.9). Такая ситуация создает благоприятные условия для проникновения патогена в ткани растений, так как их защитные системы недостаточно активны.
На этом основании можно сделать практическое заключение:
высаживать картофель в поле при низкой температуре крайне нежелательно из-за высокой вероятности его инфицирования. Высокая температура, наоборот, активирует защитные механизмы растений (судя по активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы), а рост бактерий замедляется. В этих условиях резко активируется пероксидаза в первые моменты действия патогена, что связано с изменениями ее кинетических параметров (рис.10).
Активность пероксидазы, условн.
0, 0, ед /мг сырой массы 0, 0, 0, 0, 0,2 0, 0 30 60 90 120 150 Время, мин.
Рис. 9. Динамика активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы суспензионных клеток картофеля, культивируемых с патогеном при гипотермии (40С).
1,2 – восприимчивый сорт картофеля Лукьяновский;
3,4 – устойчивый сорт картофеля Луговской. 1 – контрольные клетки сорта Лукьяновский;
2 – клетки картофеля (сорт Лукьяновский) + патоген;
3 – контрольные клетки сорта Луговской;
4 – клетки картофеля (сорт Луговской) + патоген.
0, условн. ед./ мг сырой массы Активность пероксидазы, 0, 0, 0, 0, 0, 3 0, 0, 0 30 60 90 120 150 Время, мин Рис. 10. Динамика активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из суспензионных клеток сортов картофеля, контрастных по устойчивости к кольцевой гнили. Температура культивирования 360С.
1 – сорт Луговской (устойчивый) с добавлением патогена;
2 – сорт Луговской, контрольный вариант;
3 – сорт Лукьяновский (восприимчивый) с добавлением патогена;
4 – сорт Лукьяновский, контрольный вариант.
Влияние антител к пероксидазе хрена на активность слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в суспензионных клетках картофеля при заражении кольцевой гнилью Полученные ранее результаты позволяют сделать предположение о том, что слабосвязанные с клеточной стенкой пероксидазы играют важную роль в устойчивости картофеля к бактериальным патогену, вызывающему кольцевую гниль. Поэтому для выявления роли слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в дальнейших экспериментах их активность блокировали кроличьими антителами к пероксидазе хрена.
Была проведена иммунизация кроликов препаратом пероксидазы хрена. Полученные антитела проверяли на преципитацию в плоском слое агара, находящегося в чашке Петри. На рисунке 11 наблюдается реакция идентичности: полосы преципитации, образованные антигенами и антисывороткой к ним, сливаются, что указывает на серологическое тождество сравниваемых антигенов.
Рис. 11. Реакция преципитации в агаре. В среднюю лунку внесен раствор, содержащий слабо связанные с клеточной стенкой пероксидазы, выделенные из суспензионных клеток картофеля устойчивого сорта Луговской. В другие лунки внесен раствор кроличьих антител к пероксидазе хрена.
Для подбора оптимальной концентрации кроличьих антител к пероксидазе хрена варьировали количество антител, выбирая такое, при котором активность слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы была наименьшей. Добавление кроличьих антител к пероксидазе хрена привело к уменьшению активности. Концентрация антител 110 мкл/мл наиболее сильно снижала активность исследуемой пероксидазы, выделенной как из клеток устойчивого, так и из клеток восприимчивого сортов картофеля. В дальнейших опытах использовали именно эту концентрацию антител. Оказалось, что блокирование слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из суспензионных клеток устойчивого сорта картофеля Луговской приводит к значительному снижению активности этого фермента как в контроле, так и после действия патогена (рис.12).
0, активность пероксидазы, условн. ед. / мг 0, 0, сырой массы 0, 0, 0, 0, Контроль бактерии антитела бакт+антит Рис. 12. Активность слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из суспензионных клеток картофеля устойчивого сорта Луговской.
Контроль – суспензионные клетки с добавлением среды культивирования;
бактерии – суспензионные клетки с добавлением бактерий (титр 2х кл/мл);
антитела – суспензионные клетки с добавлением антител ( мкл/мл);
бакт+антит – суспензионные клетки с добавлением бактерий и антител. M±m, n=3-5.
Следовательно, слабосвязанные с клеточной стенкой пероксидазы картофеля имеют общие иммунохимические детерминанты с пероксидазой хрена, и их блокирование приводит к снижению активности фермента.
Вестерн-блоттинг слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы картофеля в присутствии антител на пероксидазу хрена Вестерн-блоттинг показал, что в тканях картофеля присутствуют молекулярные формы этой пероксидазы, иммунородственные пероксидазе хрена (рис.13). Так, у устойчивого сорта картофеля Луговской в тканях корней была найдена форма с Rf 0.61, которая является иммунородственной пероксидазе хрена. Такая же форма с Rf 0.61 была обнаружена в тканях листьев. У восприимчивого сорта Лукьяновский в тканях стеблей и корней Solanum polyadenium (Л39-2) Сорт Луговской Сорт Лукьяновский Рис. 13. Вестерн-блоттинг слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из тканей картофеля с поликлональными кроличьими антителами на пероксидазу хрена.
1 – ткани стебля;
2 – ткани листа;
3 – ткани корня. Rf – относительная электрофоретическая подвижность.
было обнаружена одна иммунородственная форма с Rf 0.67. В тканях листьев также была обнаружена одна форма с Rf 0.63. У дикого типа картофеля Solanum polyadenium (Л39-2) было показано несколько иммунородственных форм к пероксидазе хрена во всех исследуемых тканях. Так, в тканях корней обнаружено четыре формы с Rf 0.11, 0.40, 0.55, 0.68, в тканях стеблей – три формы с Rf 0.11, 0.44, и 0.52, в тканях листьев - также три формы с Rf 0.08, 0.44 и 0.56 (рис.13).
Таким образом, ткани хрена имеют изоформы иммунородственные изоформам слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы картофеля.
Этот факт позволяет использовать антитела к пероксидазе хрена для инактивации слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы картофеля.
Такая инактивация наблюдалась как в контрольном варианте, так и при патогенезе.
Выживаемость суспензионных клеток картофеля при заражении кольцевой гнилью. Влияние добавления антител к пероксидазе хрена на выживаемость клеток картофеля при заражении Добавление к суспензионным клеткам картофеля устойчивого сорта Луговской кроличьих антител к пероксидазе хрена приводило к блокировке активности слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз и в результате клетки погибали при культивировании с патогеном (рис. 14).
Восстановление ТТХ (ОД 485/ мг сырой 1, 0, массы) 0, 0, 0, Луг. Луг.+бакт. Луг.+антит. Луг.+бакт.+антит.
Рис. 14. Выживаемость суспензионных клеток картофеля устойчивого сорта Луговской.
Луг.- контрольные суспензионные клетки;
Луг.+бакт. – клетки с добавлением патогена;
Луг.+антит. – клетки с добавлением антител к пероксидазе хрена;
Луг.+бакт.+антит. – клетки с добавлением патогена и антител к пероксидазе хрена.
В дальнейшем представляло интерес выяснить, есть ли связь между устойчивостью сорта картофеля Луговской к данному патогену и блокировкой слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз поликлональными кроличьими антителами к пероксидазе хрена.
Была определена корреляция между снижением активности исследуемого фермента в присутствии антител (вариант контроль и вариант антитела на рис. 12) и жизнеспособностью клеток картофеля устойчивого сорта при обработке антителами (вариант контроль и антитела, рис.14).
Коэффициент корреляции составлял 0,761597 ± 0,14, достоверность 5,44.
Также была определена корреляция между жизнеспособностью суспензионных клеток картофеля сорта Луговской при заражении патогеном (вариант бактерии и вариант бактерии + антитела, рис.14) и активностью слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из суспензионных тканей с добавлением патогена (вариант бактерии и вариант бактерии + антитела, рис.12). Коэффициент корреляции составлял 0,928895 ± 0,05, достоверность 18,6. Полученные данные позволяют предположить, что устойчивость клеток картофеля сорта Луговской при заражении бактериальным патогеном в значительной степени зависит от активности слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз.
Пероксидаза – как маркер стрессовых состояний у растений.
Практическое применение Использование пероксидазы – как маркера стрессового состояния позволяет более полно характеризовать защитные механизмы растений и найти подходы для диагностики устойчивости к стрессовым факторам абиотической природы у разных сельскохозяйственных культур.
Детекция влияния обработки аналогами препарата «Силк» растений картофеля в полевых условиях. Новое направление в защите культурных растений состоит в использовании «растительных» препаратов, созданных на основе тритерпеновых и других органических кислот, полученных из хвойных [Чекуров и др., 2003]. К этим препаратам относятся Новосил и Лариксин, полученные посредством экстракции из различного сырья деревьев хвойных пород (хвоя, древесина и кора). Эти препараты обладают четко выраженными ростостимулирующими и иммунизирующими эффектами.
При обработке клубней картофеля перед посадкой и затем после трехкратного опрыскивания препаратами вегетирующих растений картофеля было показано, что в тканях листьев увеличивается активность растворимой пероксидазы (табл. 6). Причем обработка Лариксином вызывала меньшее увеличение активности, чем обработка Новосилом. После уборки урожая было проведено взвешивание клубней (в каждом варианте взвешивали клубни, собранные с 20 кустов). Средний вес клубней с одного куста картофеля представлен в таблице 7.
Таблица 6. Изменение активности растворимой пероксидазы, выделенной из тканей листьев картофеля сорта Сантэ при обработке клубней и вегетирующих растений регуляторами роста Новосил и Лариксин. Доза препарата 0.3 мл/л.
Дата обработ- Вариант опыта, Активность Относительная ки регулято- препарат пероксидазы, активность рами роста условн.ед./ г пероксидазы, % сырой массы 24.07.2002 Контроль 0.0063±0.0006 (Фаза Новосил 0.0680±0.0004 бутонизации) Лариксин 0.0460±0.0007 730. 15.08.2002 Контроль 0.0072±0.0004 (Массовое Новосил 0.0727±0.0005 1009. цветение) Лариксин 0.0533±0.0007 740. Контроль 0.0082±0.0008 08.09. Новосил 0.0902±0.0009 Лариксин 0.0623±0.0002 759. Таблица 7. Вес клубней, собранных после обработки картофеля препаратами Новосил и Лариксин (период вегетации 2002 г.).
В дальнейшем было Вариант опыта, Средний вес клубней с препарат одного куста проверено влияние Новосила и картофеля (кг) Лариксина на возбудителя Контроль 1,420±0, Новосил 1,723±0,019 кольцевой гнили картофеля.
Лариксин 1,611±0, Добавление к бактериальной суспензии препарата Новосил приводило к полной гибели бактерий. Также действовал и препарат Лариксин, полностью подавляя рост патогена.
Суспензии препаратов Новосил и Лариксин не содержали в себе каких-либо микроорганизмов. Полученные данные позволяют сделать выводы, о том, что экстракты хвойных деревьев, такие как Новосил и Лариксин в небольших дозах (0.3 мл/л) повышают комплексную устойчивость растений картофеля к болезням в период вегетации и действуют как ростостимуляторы, которые способствуют повышению урожайности.
Влияние высоких доз фторидов на метаболизм яровой пшеницы в модельном опыте 2004-2005 гг. Техногенное загрязнение почв является существенным негативным фактором, влияющим на экосистемы, а также на отдельные составляющие этих экосистем, в частности на растения. Особое внимание заслуживает локальное загрязнение пахотных почв, на которых выращивается сельскохозяйственная продукция [Помазкина и др., 2004]. В зонах аэровыбросов алюминиевых комбинатов, в частности крупнейших в России Иркутского и Братского, почвы сельскохозяйственного назначения подвергаются интенсивному загрязнению фторидами, что обусловлено использованием в производстве в качестве сырья криолита (NaAlF6). В связи с этим было проведено исследование изменения активности слабосвязанной с клеточной стенкой и общей (растворимой) пероксидазы в тканях пшеницы, выращенной на загрязненных фторидами почвах.
В результате проведенных экспериментов было установлено, что при повышении уровня загрязнения серой лесной и аллювиальной почв в тканях корней пшеницы увеличивалась активность слабосвязанной и, особенно, общей пероксидазы. Активность слабосвязанной пероксидазы оказалась выше в опытах на аллювиальной почве с различным уровнем загрязнения.
Анализ данных по активности фермента в тканях листьев выявил, что показатели активности пероксидазы, были ниже, чем в тканях корня.
Изучение тканей колоса показало увеличение активности пероксидазы при выращивании пшеницы в условиях повышения загрязнения почв.
Таким образом, полученные результаты показывают зависимость активности пероксидазы (слабосвязанной с клеточной стенкой и общей) от загрязнения почвы фторидами. Повышение активности пероксидазы при загрязнении объясняется, вероятно, тем, что фториды, попадая из почвы в ткани растений, вызывают значительные изменения в метаболизме клеток и выступают в качестве стрессовых факторов. Растения при этом переходят в состояние стресса и у них активируются сигнальные системы предупреждения о стрессе. Пероксидаза является одним из компонентов таких систем. Поэтому вполне понятно увеличение ее активности в ответ на действие стрессора, в данном случае – фторидов. Все это позволяет заключить, что этот фермент можно рассматривать как маркер стрессового состояния растений при фторидном загрязнении почв.
Заключение Полученные результаты позволяют предположить следующую модель взаимодействия патогена и растения-хозяина (рис.15). У устойчивого сорта картофеля при контакте с патогеном на клеточной стенке активируются пероксидазы, связанные слабыми ионными силами – это так называемые слабосвязанные с клеточной стенкой пероксидазы. При этом происходит одноэлектронное восстановление молекулярного кислорода до супероксидного аниона и накопление перекиси водорода. Эта реакция протекает с высокой скоростью (она длится меньше 1 с) и вызывает так называемый окислительный взрыв и как результат – гибель патогена. При активировании слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз, ассоциированных с рецептором элиситора, происходит освобождение и активация G-белка и также активирование кальциевых каналов. Увеличение концентрации ионов Са2+ влияет на работу протеинкиназы и НАДФН оксидазы. Накопление свободных форм кислорода и перекиси водорода активирует синтез защитных генов. В результате экспрессии этих генов начинается синтез новых белков, а также новых молекул пероксидазы.
Рис. 15. Схема пред полагаемых путей акти вации слабосвязанной с клеточной стенкой перок сидазы при патогенезе кольцевой гнили.
I – первый путь активации слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз устойчи вого сорта картофеля;
II – второй путь активации слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы воспри имчивого сорта картофеля.
Все это приводит к формированию защитной реакции клеток устойчивого сорта картофеля.
У восприимчивого сорта, прежде всего, не происходит резкое активирование слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз и их количество значительно меньше. В результате вся реакция замедляется, увеличивается время прохождения сигнала на геном, вследствие этого патоген успевает повредить клетку.
Таким образом, можно, вероятно, говорить о существовании у картофеля двух стратегий защиты от инфицирования патогеном кольцевой гнили. Одна из низ присуща устойчивым генотипам и связана с быстрой активацией уже существовавших до появления патогена изоформ слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы. Такая активация обусловлена быстрыми изменениями кинетических параметров этих изоформ и позволяет растению немедленно начать борьбу с патогеном, одновременно запуская сигнальную систему, направленную на инициацию защитных механизмов клетки. Такая система позволяет растению быстро реагировать на «нападение» патогена и организовать соответствующую «оборону».
Другая стратегия реализуется восприимчивыми генотипами. Она направлена на передачу в геном информации о начале инфицирования для запуска механизмов защиты. При этом теряется время, не формируется быстрая «оборона», и патоген успевает поразить ткани растения.
Как показали проведенные исследования пероксидаза обладает повышенной чувствительностью к внешним воздействиям. Часто ее рассматривают как стрессовый фермент [Савич, 1989]. Такие свойства пероксидазы позволяют использовать ее в качестве маркера стрессового состояния растений. Действительно, проведенные исследования продемонстрировали возможность использования пероксидазы для детекции активации защитных механизмов растений при использовании биологически активных веществ.
По изменению активности пероксидазы можно судить об абиотическом стрессе, который испытывают растений в агроэкосистемах при их загрязнении промышленными выбросами.
Выводы 1. При анализе набора сортов картофеля было установлено, что они различаются по устойчивости к кольцевой гнили. По этому признаку выделены три группы сортов: устойчивые, восприимчивые и среднеустойчивые.
2. Среди большого набора различных по вирулентности и мукоидности штаммов Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) определен штамм, обладающий наибольшим патогенным эффектом (штамм 5369).
При корневом инфицировании бактерии этого штамма постепенно распространяются вверх по растению, заражая остальные его ткани.
Проникновение этого патогенна по тканям устойчивого сорта происходит намного медленнее, чем у восприимчивого сорта.
3. При инфицировании растений Cms повышается активность как растворимых (общих), так и слабосвязанных с клеточной стенкой растительных пероксидаз. В тканях устойчивых сортов картофеля это повышение значительно выше, чем у восприимчивых сортов. Сам патоген пероксидазной активностью не обладает.
4. Существует межсортовой и тканевой полиморфизм по активности слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз. Как правило эта активность выше в тканях корней. У устойчивых сортов картофеля она всегда намного выше, чем у восприимчивых, как в контрольных тканях, так и при инфицировании Cms.
5. Факторами вирулентности при инфицировании растений кольцевой гнилью являются выделяемые бактерией экзополисахариды, которые активируют пероксидазную активность.
6. Обнаружен межсортовой полиморфизм слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз. У восприимчивых сортов число изоформ этой пероксидазы выше, чем у устойчивых сортов картофеля. При действии Cms их число не изменяется у устойчивых генотипов и увеличивается у восприимчивых.
7. При действии патогена активность слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз суспензионных культур клеток устойчивого и восприимчивого сортов изменяется по разному: у устойчивого сорта она резко увеличивается в первые 10-20 мин и второй пик активности наблюдается через 1.5-2 ч после инфицирования;
у восприимчивого сорта первый пик слабо выражен и основная активность фермента связана со вторым пиком.
8. Второй пик активности пероксидазы у обоих сортов обусловлен с изменением экспрессии генома и с синтезом фермента de novo. Повышение активности фермента у устойчивого сорта картофеля в первые моменты инфицирования не связано с синтезом белков и обусловлено изменением кинетических параметров.
9. При флуктуациях температуры активность слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз значительно изменяется: у устойчивого сорта при повышении температуры она резко возрастает, особенно в первые моменты инфицирования;
при низкой температуре активность этого фермента увеличивается слабо, что на фоне постоянного роста бактерий в этих условиях может приводить к более интенсивному заражению растений патогеном.
10. Установлено, что у картофеля есть изоформы иммунохимически родственные пероксидазе хрена. Блокирование работы слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз картофеля антителами на пероксидазу хрена привело к снижению активности пероксидаз картофеля и к снижению его устойчивости к действию Cms, что свидетельствует об участии слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз в механизмах устойчивости растений картофеля к патогену.
11. Полученные результаты позволяют предполагать, что у картофеля имеются две различные стратегии защиты от патогена. Одна их них присуща устойчивым генотипам и связана с быстрой и резкой активацией уже существовавших до инфицирования молекул слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз. Другая, свойственная восприимчивым генотипам, связана с синтезом молекул фермента de novo на более поздних этапах инфицирования. Первая – обеспечивает устойчивость растений к патогену, а вторая – не позволяет вовремя сформировать необходимую устойчивость.
12. Полученные результаты позволяют рассматривать пероксидазу как стрессовый фермент, который можно использовать для детекции как активации защитных механизмов растений при действии биологически активных веществ природного происхождения, так и абиотического стресса, который испытывают растения в агроэкосистемах при их загрязнении промышленными выбросами.
Основные публикации по теме диссертации Рецензируемые журналы, рекомендованные ВАК:
1. Романенко А.С., Кустов М.Л., Граскова И.А., Рифель А.А., Коненкина Т.А., Саляев Р.К. Роль рН-гомеостаза, рецепции и эндоцитоза в неспецифическом и специфическом иммунитете растений // Докл.
РАН. 1994. Т.338, №2. С.275-277.
2. Романенко А.С., Граскова И.А., Рифель А.А., Копытчук В.Н., Раченко М.А. Стабилизация корнями картофеля рН среды, смещаемого возбудителем кольцевой гнили // Физиология растений. 1996. Т.43, №5.
С. 707-712.
3. Романенко А.С., Граскова И.А., Екимова Е.Г., Саляев Р.К. Обладает ли токсин возбудителя кольцевой гнили картофеля свойствами элиситора, инициирующего защитные ответы? // Докл. РАН. 1997.
Т.355, №6. С.844-845.
4. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Граскова И.А., Саляев Р.К.
Высокая инфекционная нагрузка возбудителя кольцевой гнили картофеля вызывает у растения-хозяина необычные симптомы заболевания // Докл. РАН. 2000. Т.374, №5. С.712-714.
5. Граскова И.А., Владимирова С.В., Рихванов Е.Г. Механизм активации пероксидазы при бактериальном патогенезе различается в клетках устойчивого и неустойчивого к патогену сортов картофеля // Докл.
РАН. 2001. Т.379, №2. С.267-269.
6. Граскова И.А., Боровский Г.Б., Владимирова С.В., Романенко А.С., Войников В.К. Изоферментные спектры пероксидаз картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Докл. РАН. 2002. Т.384, №6. С.844-847.
7. Романенко А.С., Ломоватская Л.А., Граскова И.А. Некрозы как необычные симптомы кольцевой гнили // Физиология растений. 2002.
Т.49, №5. С.773-778.
8. Граскова И.А., Романенко А.С., Владимирова С.В., Колесниченко А.В. Изменение активности пероксидазы при патогенезе кольцевой гнили картофеля // Физиология растений. 2004. №4. С.529-533.
9. Граскова И.А., Боровский Г.Б., Колесниченко А.В., Войников В.К.
Пероксидаза как компонент сигнальной системы клеток картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Физиология растений. 2004. Т.51, №5.
С.692-697.
10. Граскова И.А., Антипина И.В., Потапенко О.Ю., Войников В.К.
Динамика активности внеклеточных пероксидаз суспензионных клеток картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Докл. РАН. 2004. Т.399.
С.567-570.
11. Граскова И.А., Антипина И.В., Потапенко О.Ю., Войников В.К.
Изменение кинетических параметров слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы суспензионных клеток картофеля в начальный период инфицирования // Докл. РАН. 2006. Т.409, №4. С.366-369.
Другие издания:
12. Romanenko A.S., Riffel A.A., Graskova I.A., Rachenko M.A. The role of extracellular pH-homeostasis in potato resistance to ring-rot pathogen // J.Phytopathol. 1999. V.147, N11-12. P.679-686.
13. Граскова И.А., Владимирова С.В., Колесниченко А.В., Рихванов Е.Г., Войников В.К. Изменение активности пероксидазы клеток картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Серия Биология. 2002. №9(1).
С.37-44.
14. Graskova I.A., Borovskii G.B., Kolesnichenko A.V., Voinikov V.K.
Peroxidase as a signal system component of potato cells under ring rot pathogenesis // FJB, 2003. V.270, S.1. P.134.
15. Граскова И.А., Боровский Г.Б., Колесниченко А.В., Войников В.К.
Различия в механизмах активности пероксидазы устойчивого и восприимчивого сортов картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Серия Биология. 2003. №3(2). С.70-77.
16. Граскова И.А., Владимирова С.В., Рихванов Е.Г., Войников В.К.
Зависимость активности пероксидазы клеток картофеля при патогенезе кольцевой гнили от вирулентности штаммов бактерий и степени устойчивости растений // Физиология и биохимия культурных растений. 2003. Т.35, №1. С.35-42.
17. Graskova I.A., Antipina I.V., Potapenko O.Y., Voinikov V.K. Pathogen impact on the activity dynamics of potato suspension cells extra-cellular peroxidase // J. stress physiol. biochem. 2005. V.1, N1. P.15-20.
18. Graskova I.A., Antipina I.V., Potapenko O.Y., Voinikov V.K. The change of kinetic parameters of the weak-associated with wall cell peroxidase in the suspension culture of potato cells in the beginning of infection // J. stress physiol. biochem. 2006. V.2, N1. P.35-40.
19. Graskova I.A., Kolesnichenko A.V., Voinikov V.K. The effect of hypo and hyperthermia on the infection of potato by Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus // J. stress physiol. biochem. 2006. V. 2, N2. P.17-22.
20. Романенко А.С., Кустов М.Л., Граскова И.А., Саляев Р.К., Копытчук В.Н. Роль рН-гомеостаза, рецепции и эндоцитоза в иммунитете растений // Тезисы докладов III съезда ВОФР г. С-Петербург. 1993.
С.716.
21. Граскова И.А., Ломоватская Л.А., Романенко А.С. Возбудитель кольцевой гнили вызывает у картофеля нехарактерные симптомы заболевания // Тезисы докладов IV съезда ВОФР г. Москва. 1999. Т.1.
С.211.
22. Романенко А.С., Ломоватская Л.А., Граскова И.А. Вирулентность, мукоидность и способность к сорбции возбудителя кольцевой гнили картофеля // Тезисы докладов IV съезда ВОФР г. Москва. 1999. Т.1.
С.239.
23. Graskova I.A., RomanenkoA.S., Vladimirova S.V., Voinikov V.K.
Influence of ring rot pathogen and its exopolysaccharides on the activity of potato cells peroxidases //
Abstract
International Symposium “Signaling Sistems of Plant Cellst”. Moscow, Russia, 2001, June, 5-7. P.18-19.
24. Graskova I.A. Peroxidase participation in formation of potato cells protection mechanisms under ring rot pathogen // Abstract International Symposium “Stress of Plant”, Moscow, October 23-28, 2001. P.91-92.
25. Граскова И.А., Боровский Г.Б., Колесниченко А.В., Войников В.К.
Пероксидаза как компонент сигнальной системы клеток картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Тезисы Симпозиума V съезда Общества физиологов растений России, 15-21 сентября 2003 г., Пенза 26. Граскова И.А. Пероксидаза как компонент сигнальной системы клеток картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Тезисы III съезда Биохимического общества, 26 июня -1 июля 2002 г., г. Санкт Петербург. С.435.
27. Граскова И.А., Антипина И.В., Потапенко О.Ю., Колесниченко А.В., Войников В.К. Изменение активности внеклеточной пероксидазы суспензионных клеток картофеля при стрессе // Стрессовые белки растений: Материалы Всероссийской научной конференции, 6- сентября 2004. Иркутск. 2004. С.39-43.
28. Граскова И.А., Антипина И.В., Потапенко О.Ю., Войников В.К.
Полиморфизм слабо-связанных с клеточной стенкой пероксидаз в растениях картофеля // Тезисы докладов Второго Международного симпозиума «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете, Казань, 27-30 июня 2006 г. С.28-29.
29. Граскова И.А., Антипина И.В., Потапенко О.Ю., Войников В.К. Роль слабо-связанных с клеточной стенкой пероксидаз в устойчивости растений // Тезисы докладов Второго Международного симпозиума «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете, Казань, 27-30 июня 2006 г. С.30-31.