Биологические аспекты паразитирования dirofilaria immitis у собак в астраханской области
На правах рукописи
Богданова Татьяна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАРАЗИТИРОВАНИЯ DIROFILARIA IMMITIS У СОБАК В АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.11 – паразитология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2010 2
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессио нального образования «Астраханский государственный университет» Научные руководители: доктор медицинских наук Бойко Оксана Витальевна
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Архипов Иван Алексеевич кандидат биологических наук, с.н.с.
Кузнецов Дмитрий Николаевич
Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение высшего профессиональ ного образования « Московская государственная академия ветеринарной медицины и био технологии им. К.И.Скрябина».
Защита состоится «_» 2010 г. в _ часов на заседании диссертационного сове та Д 002.213.03 при Учреждении РАН Институте проблем экологии и эволюции им.
А.Н.Северцова РАН (119071 г. Москва, Ленинский проспект, д. 33).
С диссертацией можно ознакомиться: в библиотеке Учреждения РАН Института проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН по адресу: 119071 г. Москва, Ленинский про спект, д. 33, факс (495) 952-31-46, e-mail: [email protected]
Автореферат разослан «» 2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.А. Малютина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Дирофиляриоз – трансмиссивное, зоонозное инвазионное заболевание, вызываемое гельминтами, относящимися к классу круглых червей Nematoda, отряду Spirurida, сем. Filariidae, роду Dirofilaria. Род Dirofilaria насчитывает более 20 видов. Возбудителями дирофиляриоза людей и животных являются представители 8 видов: D. immitis, D. repens, D. tenius, D.
ursi, D. subdermata, D. lutrae, D. striata, D. spectans. Распространенные на терри тории России возбудители инвазии D. repens (Railliet et Henry, 1911) и D. im mitis (Leidy, 1856) являются облигатными паразитами плотоядных семейства псовых и кошачьих, D. ursi - бурого медведя и амурского тигра (М.Ш. Акбаев, 2001;
И.А.Архипов, Д.Р.Архипова, 2004).
Проблема дирофиляриоза обусловлена широкой циркуляцией возбудите ля в природной среде и отсутствием надлежащих мер по выявлению и дегель минтизации зараженных животных - облигатных дефинитивных хозяев (до машних собак и кошек). Одним из факторов распространения данного заболе вания следует считать длительный латентный период (до 5 лет), в течение ко торого в крови присутствуют циркулирующие микрофилярии. Этот процесс со четается с повсеместным расселением комаров, являющихся промежуточными хозяевами, их способностью к быстрому увеличению популяции и коротким периодом развития в них микрофилярий до личинок третьей стадии (И.А.Архипов, Е.Н. Борзунов, В.И.Шайкин, 2001;
W.Tarello, 2000).
Патогенетическое действие оказывают взрослые гельминты D. immitis. У большинства собак с паразитированием в их организме небольшого количества особей явных признаков заболевания не проявляется (что резко повышает их эпизоотологическую опасность) и только при значительной инвазии отмечается нарушение функционирования кровеносной системы. В основном это хрониче ская застойная, правосторонняя сердечная недостаточность. Кроме того, воз можны эндокардит сердечных клапанов и пролиферативный легочный эндоар териит. К летальному исходу приводят также легочная эмболия, вызываемая мертвыми или погибающими гельминтами, и синдром полой вены, вызываемый теми же причинами. Контрольные мероприятия при этом заболевании трудно осуществимы, поэтому профилактика основывается преимущественно на лече нии. В настоящее время эта проблема в Северной Америке настолько актуальна, что созданы специальные клиники для лечения сердечных гельминтозов (Д.Р.
Архипова, 2003;
А.Е.Р.Тейлор, 1960;
М.А.Фисько, 2005).
Хотя дирофиляриоз регистрируется чаще в странах и регионах с теплым климатом, где имеет место большое количество комаров, являющихся проме жуточными хозяевами, в последние годы отмечена тенденция к его широкому распространению не только на юге, но и в средней полосе России (Д.Р. Архи пова, 2003;
В.Г. Супряга и др., 2004;
М.В. Сухова, 2002;
В.Б. Ястреб, 2006).
Рост заболеваемости дирофиляриозом, возможно, связан с изменением эколо гии и климата. Определенную роль могут играть и переезды домашних собак и кошек, которые путешествуют со своими хозяевами. По мнению Д.Р.Архиповой, (2002) основными причинами распространения дирофиляриоза являются неограниченные перемещения животных из одного региона в другой, плохо обустроенные оросительные каналы, создающие условия для массового выплода комаров – промежуточных хозяев, ввоз заболевания из других стран, ограничение использования химических средств защиты от гнуса, а также не достаточный арсенал антигельминтиков против взрослых дирофилярий.
Высокий уровень пораженности собак и обилие переносчиков создают явную угрозу и потенциальные возможности для роста инвазирования дирофи ляриями во многих регионах мира, в том числе и России, в связи с чем, эту ин вазию у человека и животных в соответствии с современной терминологией можно рассматривать как «emerging infection» или «возникающую инфекцию» (Г.Г.Онищенко, 2003).
Дирофиляриоз представляет большую опасность и для человека. В Рос сийской Федерации и странах СНГ известно свыше 150 случаев поражения че ловека D.repens, истинная же заболеваемость людей дирофиляриозом в на стоящее время неизвестна, так как не ведется её официальная регистрация.
Вследствие недостаточной информированности врачей дирофиляриоз проходит под различными диагнозами непаразитарной этиологии (Т.И.Авдюхина, В.Ф.Постнова, Л.М.Абросимова, 1996, 1997).
В последние годы дирофиляриозу уделяется значительное внимание со стороны биологов, а также ветеринарных и медицинских специалистов (W.Tarello, 2000;
М.В. Сухова, 2002;
Д.Р.Архипова, 2003;
М.А.Фисько, 2005;
Р.С.Аракельян, 2007;
В.Б.Ястреб, 2009 и др). Сообщаются сведения, касающие ся в основном, распространения дирофиляриоза в том или ином регионе или ас социативном течении с другими болезнями. До сих пор в литературе недоста точно освещены количественные параметры развития D.immitis в организме дефинитивного и промежуточного хозяев, биологические особенности D.immitis и влияние нематоды D.immitis на организм собак различных пород в определенных условиях, а также методы диагностики, для выявления конкрет ного вида паразита и на любой стадии болезни.
Из вышеизложенного следует, что необходима тщательная регистрация и анализ всех выявленных случаев дирофиляриоза (D.immitis) с целью после дующего статистического анализа, выявления устойчивых тенденций в заболе ваемости с определением районов наибольшего риска заражения, усовершенст вования методов диагностики, лечения и профилактики.
Цель исследования: изучение распространения дирофиляриоза, вызы ваемого D. immitis в условиях Астраханского региона;
установление биологиче ских особенностей паразитирования нематоды Dirofilaria immitis у собак и раз работка нового метода диагностики паразитирования Dirofilaria immitis у пло тоядных.
Для достижения цели в ходе исследования решались следующие за дачи:
- установить восприимчивое поголовье дефинитивных хозяев Dirofilaria immitis, количественно изучить городскую популяцию собак и кошек в городе Астрахани;
- дать сравнительную оценку зараженности дирофиляриозом (D. immitis) собак в различных районах города, определить влияние возраста, пола, породы, типа содержания животных на зараженность Dirofilaria immitis.
- изучить промежуточных хозяев и их зараженность личинками дирофи лярий, в различное время года;
- оценить степень летальности и биологические особенности паразитиро вания Dirofilaria immitis;
- разработать унифицированную методику выявления носительства Diro filaria immitis у плотоядных.
Научная новизна работы заключается в том, что впервые количественно определено поголовье собак и кошек, проживающих в условиях города Астра хани. Изучен биологический цикл развития нематоды Dirofilaria immitis у со бак в условиях конкретного региона. Выяснено влияние пола, породы, условий содержания на зараженность собак дирофиляриями (D. immitis) и летальность.
Разработан и внедрен новый метод диагностики дирофиляриоза (D. immitis).
Практическая значимость. Результаты исследований могут быть ис пользованы для дальнейшего изучения данной нозоформы, разработки ком плекса противоэпизоотических и эпидемиологических мероприятий при диро филяриозе (D. immitis). Знание биологических особенностей паразитирования D. immitis у собак в конкретном регионе, поможет в постановке диагноза и прогнозировании планирования профилактических и лечебных мероприятий, направленных на снижение заболеваемости и смертности животных.
Метод диагностики паразитирования Dirofilaria immitis, отличается высо кой чувствительностью и специфичностью и может быть использован для уста новления паразитирования на любой стадии болезни и любой интенсивности инвазии.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Распространение дирофиляриоза, вызываемого D. immitis у собак в г.Астрахани.
2. Влияние сезона года, пола, возраста, породы и типа содержания собак на зараженность их D. Immitis.
3. Метод определения паразитирования Dirofilaria immitis, как способ диагностики при любой интенсивности инвазии и стадии болезни.
Апробация работы и внедрение в практику. Основные положения дис сертационной работы доложены на научно-практических конференциях: «Про блемы ресурсодобывающего производства и переработки экологически чистой сельскохозяйственной продукции» (Астрахань, 2006 г.);
«Актуальные пробле мы современных аграрных технологий» (Астрахань, 2006 г.);
«Актуальные проблемы современных аграрных технологий» (Астрахань, 2007 г.);
научно практическом симпозиуме «Лабораторная медицина: инновационные техноло гии в аналитике, диагностике, образовании, организации» (Москва, 2008 г.);
объединенном иммунологическом форуме (С-Петербург, 2008 г.), V Междуна родной научно-практической конференции «Aktualne problem nowoczesnych nauk -2009» (Przemysl, 2009), научно-практической конференции «Лаборатор ная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 го да» (Москва, 2009).
Результаты проведенных исследований были апробированы и использу ются в лабораториях следующих кафедр: молекулярной биологии, генетики и биохимии ГОУ ВПО «Астраханский государственный университет»;
общей и биоорганической химии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицин ская академия». Предлагаемый метод диагностики был апробирован на группе собак, внедрен в практику в клиниках ветеринарной медицины города Астраха ни и применяется в работе профильной лаборатории ГУ АО «Астраханская об ластная ветеринарная лаборатория».
По результатам исследований подана заявка на изобретение №2007131172 от 15.08.2007г. и получен патент на изобретение «Способ опре деления зараженности собак Dirofilaria immitis» № 2371145 от 27.10. 2009г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных статей, в том числе - 4 в изданиях из списка, рецензируемых ВАК Российской Федерации (журналы: «Вестник АГТУ» (2007), «Клиническая лабораторная диагностика» (2008), «Российский иммунологический журнал» (2008), «Вете ринарная Практика» (2008)).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, ли тературного обзора, главы с описанием методов исследования, двух глав собст венных результатов, обсуждения результатов, выводов, практических рекомен даций и списка литературы. Работа изложена на 123 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 29 таблицами и 12 рисунками. Указатель литературы включает 213 источников, в том числе 162 отечественных и 51 иностранных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследовательская работа проводилась с 2002 по 2009 годы самостоя тельно и на базе кафедры молекулярной биологии, генетики и биохимии биоло гического факультета ГОУ ВПО «Астраханский государственный университет».
Изучение численности собак и кошек проводили методом опроса, по квартирного и подворного обхода, учета бездомных животных на улицах горо да Астрахани с последующей обработкой полученных данных на карте. Кроме того, учитывались официальные данные по регистрации животных в клубах любителей домашних животных. Опрос проводился в двух районах города по три улицы в каждом районе, на каждой улице опрошено равное количество че ловек и обследовано равное количество квартир. Всего было обследовано квартир в благоустроенном секторе, опрошено 1200 человек в частном секторе.
Работу по исследованию крови на наличие микрофилярий проводили на базе ГУ АО «Астраханская областная ветеринарная лаборатория». Всего за лет было проведено 800 исследований крови собак, из них кобелей – 521, сук – 279. Исследования проводили в день взятия крови. Пробы крови объемом 2- мл брали из подкожной вены предплечья или из вены Сафена в дневное время.
В качестве антикоагулянта использовали 5,0% раствор цитрата натрия.
В работе использовали методы:
1) толстой раздавленной капли;
2) обогащения Кнотта;
3) тонкого фиксированного мазка с окраской по Романовскому-Гимзе.
Метод Кнотта, модифицированный Маркеллом и Воге (1965) – 2 мл пе риферической крови смешивали с 10 мл 1% раствора уксусной кислоты и цен трифугировали при 1500 об/мин в течение 2 минут. Далее после гемолиза верх ний слой сливали, а из осадка готовили мазок на предметном стекле, фиксиро вали спиртовым раствором 95% и окрашивали по Романовскому-Гимзе по об щепринятой методике. Размеры личинок изучали под световым микроскопом с помощью миллиметровой линейки. Анатомическое строение и идентификацию микрофилярий проводили после фиксации мазков спиртовым раствором 95% и окраской по Романовскому-Гимзе. Дифференциацию микрофилярий проводили по C.F.Schrey, E. Trautvetter (1996), S. Pampiglione (1995), W. Tarello (1999).
Породу, пол, возраст, хозяйственное назначение, тип содержания собаки определяли по паспорту и родословной или со слов владельца.
На территории городских улиц и квартир произведен отлов 229 комаров различных родов, из них Culex – 93, Anopheles – 67, Aedes – 69. Отлов проводи ли в вечернее время (с 19 до 21 часа) - как в городских квартирах, где есть до машние плотоядные, так и в собачьих питомниках, а также в условиях город ских улиц. Насекомых оглушали этиловым эфиром, отрывали ножки и крылья.
Затем тушки высушивали на предметных стеклах, фиксировали 96% спиртом и окрашивали по Романоскому-Гимзе, микроскопировали при увеличении х90.
Идентифицировали до рода по Е.Н. Павловскому (1934). Вскрытие животных проводили в ГУ АО «Астраханская областная ветеринарная лаборатория». Все го проведено 135 неполных гельминтологических вскрытий по К.И.Скрябину (1928): П-образно сначала препарировалась кожа в районе грудной и брюшной полости, далее вдоль позвоночника выполняли разрез, открывая грудную и брюшную полость. Исследованию подвергали отдельные органы и ткани – под кожную клетчатку, сердце, печень, легкие, органы извлекали из трупа и иссле довали.
За 5 лет в районах области было проведено 404 патологоанатомических вскрытий собак, для работы использовали годовые формы отчетов районных лабораторий области.
В качестве источника материала для получения антигена использовались свежие трупы животных, поступившие из Советского, Кировского и Ленинско го районов города в ГУ АО «Астраханскую областную ветеринарную лабора торию». Было отобрано 10 собак различных пород – 3 кавказские овчарки, среднеазиатские овчарки, 2 восточноевропейские овчарки, 3 крупные беспо родные собаки, из них 3 суки и 7 кобелей. Возраст животных варьировал от до 12 лет.
При конструировании метода диагностики «Способ определения зара женности собак Dirofilaria immitis» использовали:
- для приготовления антигена - половозрелые Dirofilaria immitis в количе стве – 697;
определение общего белка в полученном экстракте проводили реф рактометрическим методом на рефрактометре RL-3 по справочнику «Методы клинической лабораторной диагностики» под ред. проф. И.П. Кондрахина (2004);
- для установления микробиологической чистоты антигена проводили его посев на следующие среды:
Агар Чапмана Агар Мак Конки Агар Сабуро Агар Шэндлера + вит. К + кровь лошади.
также для посева использовали панель Микоплазма ДУО. Все используе мые в работе среды производства Bio-Rad США;
- для получения антисывороток в виварии ГУ АО «Астраханская област ная ветеринарная лаборатория», иммунизировали 10 серых кроликов весом 2,5 3 кг, для контроля использовали 3 серых кроликов той же возрастной группы, кровь у иммунизированных животных брали из краевой вены уха;
- для гипериммунизации использовали этих же кроликов;
- идентификацию антигенов проводили методом иммунодиффузии по Ухтерлони, используя микромодификацию этого метода, на трех предметных стеклах, используя штамп «семерка» (металлический пробойник для агара, со стоящий из семи лунок), во влажной камере при температуре +4оС;
- иммуноэлектрофорез проводили с использование набора «КлиниТест ЭФ» производства НПЦ «Эко-Сервис», на оборудовании: электрофоретической ячейке Wade MiniCell GT System, блок питания PowerPac Basic (300) Power Supple (Bio-Rad, США). Для отмывания балластных белков использовали 5% раствор хлорида натрия, окраску на белки проводили Амидо черным 10Б из на бора «КлиниТест-ЭФ Амидо» производства НПЦ «Эко-Сервис» (Санкт Петербург), для отбеливания фона использовали 5% раствор уксусной кислоты;
- для апробации метода использовали спонтанно зараженных дирофиля риозом (D. immitis) 75 собак. 25 животных, подлежащих выбраковке из собачье го питомника ФБУ ИК-8, остальные (50 собак) – у частных владельцев. В случаях лечение животных не проводилось (контрольная группа). Для после дующего патологоанатомического подтверждения поставленного нами диагно за наблюдения за животными проводилось в течение 2006 – 2008 гг.
Цифровой материал диссертации обработан математическими и стати стическими методами (Плохинский, 1970), в компьютерной программе Micro soft Excel с вычислением средней арифметической (М), средней ошибки сред ней арифметической (m), вероятности различий (p) ( Большев Л.Н., 1983, Мюл лер П., 1982, Халафян А.А., 1995) РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Для распространения и развития дирофиляриоза (D.immitis) необходимы три обязательных компонента: источник инвазии, фактор передачи и воспри имчивый организм. Астраханская область по своим природно-климатическим условиям и современному состоянию социума полностью соответствует крите риям, способствующим распространению дирофиляриоза (D.immitis). Поэтому изучение распространения дирофиляриоза (D.immitis) плотоядных имеет при оритетное значение для города Астрахани и области. Жизненный цикл D.immitis продолжается 7-8 месяцев, плотоядные животные заражаются в пери од лета при нападении комаров рода Aedes, Culex, Anopheles и др. Для Астра ханской области этот период довольно значителен с марта-апреля по октябрь (первые насекомые появляются уже во второй декаде марта).
Изменение температурного режима в последнее десятилетие в Астрахан ской области имеет существенное значение в распространении дирофиляриоза – из-за высоких летних температур высыхают и заболачиваются лиманы и дру гие мелководные водоемы, что, в свою очередь приводит к новым местам вы плода комаров и, следовательно, увеличению их численности. Удлинение сро ков весенне-осенних сезонов приводит к значительной продолжительности жизнедеятельности кровососущих и, соответственно, увеличению периода за ражения дирофиляриозом (D.immitis).
Значительную эпидемическую опасность для жителей городской зоны представляют собаки и кошки, так как они являются соактантами ряда гель минтозов, опасных для человека. Эта опасность многократно возрастает из-за большого числа неучтенных бродячих собак и кошек. В настоящее время в го роде Астрахани существуют устойчивые популяции домашних плотоядных:
кошек (Felis catus domesticus) и собак (Canis Familiaris domesticus), которые яв ляются восприимчивыми животными для заболевания и распространения ди рофиляриоза (D.immitis).
В городе Астрахани в клубах любителей собаководства зарегистрирова но около 2200 животных, в кинологических питомниках и приютах содержится около 600 собак. Количество незарегистрированных животных в десятки раз больше. С целью учета незарегистрированных животных нами были обследо ваны различные сектора города. В результате выяснилось, что в благоустроен ном секторе 1 собака приходится на 29 человек, 1 кошка на 13 человек, в част ном секторе 1 собака на 3-4 человека, кошка на 2-3 человека, кроме того, в каж дом дворе благоустроенного фонда постоянно проживает около 3-5 собак и 5 10 кошек. В результате проведенных исследований также выяснено, что более 70% домашних животных не зарегистрированы, а популяции бродячих собак и кошек с каждым годом увеличиваются, а также их миграция по территории го рода, области и в другие регионы.
Всего по городу были получены следующие результаты - общее поголо вье собак и кошек по городу Астрахани составило 299 527 животных, из них собак – 119 431 голов (16%), кошек – 180 096 голов (24%), всего домашних жи вотных – 260 527 голов, бродячих - 39 000 голов.
Характеризуя дефинитивных хозяев дирофиляриоза (D. immitis) - кошек и собак городской зоны, одной из главных критериев опасности инвазии следует считать способ их содержания.
В городе Астрахани собаки и кошки неравномерно рассредоточены по городу, и их количество зависит от типа застройки жилья;
явное преобладание, как собак, так и кошек наблюдалось в частном секторе. В связи с тем, что такой вид застройки есть в любом районе, это не исключает распространение инвазии повсеместно.
Исходя из потенциальной возможности заражения животных дирофиля риозом (D. immitis), мы условно поделили городские популяции кошек и собак на несколько категорий, взяв за основу классификацию, предложенную И. М.
Зубаревой (2001).
Поголовье городских кошек в данное время представлено следующими категориями:
А – домашние кошки, лишенные возможности контакта с внешней сре дой;
В – полувольные кошки, живущие иногда в квартирах или в частных до мах, имеющие возможность находиться на улице;
С – бродячие или бездомные кошки, живущие в подвалах, чердаках и других местах.
В настоящее время в мире насчитывается более 400 пород собак, которые А.П.Умельцев, (2001), условно поделил на 4 группы, по хозяйственному назна чению: служебные, охотничьи, комнатно-декоративные и бойцовские. По спо собу содержания поголовье городских собак мы также разделили на категории с учетом вышеперечисленных групп:
А – домашние собаки, место обитания – городские квартиры и дома, мес та прогулок – улицы города и дворы;
в данной группе - в основном породистые животные – комнатно-декоративных и служебных пород, бойцовские, а также охотничьи породы собак, хозяева которых имеют дачные участки или выезжа ют на природу;
В – цепные собаки, место обитания и прогулок – частный сектор, изоли рованные дворы;
в данной группе в основном собаки крупных пород – служеб ные и бойцовские, а также беспородные крупные собаки;
С – бродячие или бездомные собаки, местом обитания которых является все свободное жизненное пространство города и пригорода;
это, в основном, беспородные животные, хотя есть и породистые собаки, брошенные хозяевами;
все различных размеров.
Исходя из полученных ранее учетных данных, поголовье собак и кошек г.Астрахани распределены на категории по районам города (на 1000 человек).
Таблица Количество собак и кошек по категориям в районах города % от % от обще Район Собаки (голов) Категория Кошки (голов) Категория общего го кол-ва кол-ва А А 18±1,3 5,1 40±1,5 7, Кировский В В 86±1,4 24,2 110±1,2 21, С С 21±1,7 6,1 63±1,7 12, А А 20±1,0 5,6 17±1,4 3, Советский В В 174±1,5 49 215±1,0 С С 35±1,3 10 71±1,08 13, Наиболее многочисленной категорией у собак является «В» - «цепные» собаки, как в Кировском - 24,2%, так и в Советском - 49% районах;
у кошек – категория «В» - полувольные кошки - как в Кировском - 21,2%, так и в Совет ском – 42%. Эти категории животных значительное время пребывают на улице и подвержены укусам комаров. Так же заметно, что процент бродячих живот ных - категория «С», остается высоким, и превалирует в 2 раза над домашними животными. Эта категория животных наиболее мобильна и может способство вать распространению дирофиляриоза (D.immitis) не только на территории го рода, но и по всей области.
В период активного лета комаров - с апреля по октябрь мы проводили ис следования крови собак, различных категорий из разных районов города на на личие микрофилярий (D. immitis).
Таблица Исследование крови собак на наличие микрофилярий Год Исследовано крови (проб) Обнаружены микрофилярии (проб) ЭИ, % 2003 12 1 8, 2004 59 8 13, 2005 233 34 14, 2006 215 14 6, 2007 281 102 36, 2003-2007 800 159 15,9±5, Морфологические признаки микрофилярий изучали после окраски мазков по Романовскому-Гимзе. Размеры микрофилярий составили от 0,158 до 0, мм, в среднем 0,193±0,01 мм в длину, и от 0,004 до 0, 006 в среднем 0,005±0.0002 мм в ширину. Головной конец микрофилярий слегка вытянут, ко нической формы, затемнен, крупнее остальной части тела, хвостовой конец длинный, конической формы сильно ссужен на конце, экскреторная и анальная поры неокрашены.
Среднемноголетняя экстенсивность инвазии у наблюдаемых собак соста вила – 15,9±5,3%. Наибольшая экстенсивность инвазии (ЭИ) наблюдалась у беспородных собак из категории «С» - 49%, немногим меньше в категории «В» - 16,82±4,3%, и наименьшая экстенсивность инвазии у собак из категории «А» 3,2±0,2%. У декоративных пород собак за период наблюдения инвазия не реги стрировалась.
Для проведения сравнительного ретроспективного анализа мы исследова ли кровь на наличие микрофилярий D.immitis служебных собак тех же пород, только находящихся в одинаковых условиях содержания. С этой целью провели обследование собак в кинологических питомниках. Экстенсивность инвазии у этих животных составила - 36,6±13,2%, а у собак из других категорий она зна чительно ниже - в 2,3 раза.
Зараженность собак дирофиляриозом (D. immitis) по результатам при жизненной диагностики мазков крови на наличие микрофилярий (табл. 3) в Со ветском районе оказалась выше, чем в Кировском, в 1,7 раза.
Таблица Зараженность собак дирофиляриозом (D. immitis) в районах города Обнаружены микрофи Район Всего исследований % положительных лярии Кировский 214 24 11, Советский 189 37 19, В результате проведенного анализа был выявлен возраст зараженных ди рофиляриозом (D.immitis) собак и он составил - от 1,5 до 15 лет;
у собак до по лутора лет инвазия не регистрировалась. Установлено, что болезнь регистриро валась значительно чаше у собак в возрасте от 4 до 10 лет;
зараженность собак в возрасте от 1,5 до 3 лет является минимальной и составляет 1%, от 14 до лет – 5%, от 11 до 13 лет – 8%;
четверть зараженных приходится на возраст от 4 до 6 лет – 25%, наибольшее количество инвазированных дирофиляриозом со бак наблюдалось в возрастном отрезке от 7 до 10 лет;
наивысший же процент инвазированных наблюдался в двух возрастных группах - от 7 до 8 лет (31%) и от 9 до 10 лет (30%).
Кровь для исследований была отобрана у собак различного пола;
резуль таты показали, что чаще в 2,5 раза заражаются дирофиляриозом (D. immitis) кобели, чем суки.
Наибольшее количество зараженных собак наблюдалась в августе – сен тябре (ЭИ – 23,5%), а также в первые месяцы активного лета комаров – апреле – мае (18%) (среднемесячная температура воздуха в регионе в эти месяцы дос тигает + 26°С), наименьшая экстенсивность инвазии наблюдается в самые жар кие летние месяцы региона – июне – июле (16,5%).
Дирофилярии (D. immitis) – биогельминты, их развитие и распростране ние происходит с участием промежуточного хозяина – комара. С целью изуче ния особенностей промежуточного хозяина в регионе мы провели отлов кома ров в период наибольшей их активности в августе месяце (с учетом заражаемо сти собак). Отлов проводили в вечернее время (с 19 до 21 часа) - как в город ских квартирах, где есть домашние плотоядные, так и в собачьих питомниках, а также в условиях городских улиц. Всего исследовано 229 комаров родов Aedes, Anopheles, Culex;
при этом обнаружены микрофилярии у 15 особей, макси мально инвазированы комары рода Culex (ЭИ – 8,6%), минимально – рода Anopheles (ЭИ – 4,5%).
Всего за период наблюдений проведено 135 неполных гельминтологиче ских вскрытий собак тех пород, которые наиболее подвержены заражению ди рофиляриозом (D. immitis). Из них пали от закупорки легочной артерии и зад ней полой вены половозрелыми нематодами D. immitis – 31 собака (27,6±4,2 %), т.е., почти каждая четвертая собака гибнет в результате паразитирования диро филярий (D. immitis). Самый большой процент гибели от дирофиляриоза на блюдался среди восточноевропейских овчарок (40%), самый низкий (15,8%) - у среднеазиатских.
Анализируя особенности распространения дирофиляриоза (D. immitis) в Астраханской области, нельзя не обратить внимание на сезонность. Гибель жи вотных от дирофиляриоза, в результате паразитирования Dirofilaria immitis на ступает не в течение всего года, а в определенные месяцы. Установлено, что гибель собак от дирофиляриоза (D. immitis) наступает преимущественно в - де кабре, январе, феврале, марте и июле. Февраль – самый холодный месяц в Аст раханской области, и именно в нем отмечался максимальный процент павших животных – 48,4;
минимальный процент - в июле (6,4%) - самом жарком месяце, гибель животных может быть связана с усилением нагрузки на сердечно сосудистую систему.
В таблице 4 отражен скрининг зараженности собак по результатам ис следований крови на наличие микрофилярий D. immitis, и падежа собак от ди рофиляриоза (D. immitis) в разрезе пород:
Таблица Сравнительная оценка зараженности D. immitis и падежа собак по поро дам Исследования мазков крови Патологоанатомические вскрытия Породы собак Обнар мик- Обнар.
Всего Всего % % рофил. дирофил.
Немецкая 130 13 10 12 4 33, Кавказская 146 48 32,8 18 5 27, Восточно-европейская 130 9 7,9 5 2 Среднеазиатская 132 11 8,3 19 3 15, Беспородные 262 78 29,7 81 17 Проведенный сравнительный анализ зараженности собак и их падежа в различные годы показывает пропорциональность зараженности и падежа, их прямую зависимость от климатических условий и количества переносчиков в различные годы наблюдений. Наиболее неблагополучными в эпизоотическом плане по дирофиляриозу (D. immitis) можно считать 2004, 2005, 2007 годы (р0,05). Именно в эти годы отмечался наибольший процент зараженности и гибели собак.
В районах области регистрировали гибель собак от паразитирования не матод D. immitis, путем патологоанатомических вскрытий и обнаружения по ловозрелых гельминтов в местах локализации. В четырех районах области, та ких как Енотаевский, Черноярский, Харабалинский, Лиманский гибель собак от дирофиляриоза (D. immitis) не зарегистрирована. Наибольший процент гибели собак зарегистрирован в Наримановском и Камызякском районах области (13,5% и 6,3% соответственно). Эти районы области наиболее приближены к городу, расположены вдоль берегов Волги, в данных районах расположены места отдыха людей (дачные массивы, турбазы, базы отдыха, детские лагеря и «дикие» стоянки туристов). В Камызякском районе расположен Астраханский заповедник, с достаточным количеством диких плотоядных - таких как волки, лисы, енотовидные собаки и другие, что создает угрозу возникновения синан тропного очага по дирофиляриозу (D. immitis) и в дикой природе.
Число павших животных от дирофиляриоза (D. immitis) в городе Астра хани в 4,6 раза превышал показатель по области (27,6±4,2 % и 6,0±1,6% соот ветственно).
Обнаруженные путем неполных гельминтологических вскрытий немато ды по морфологическим, анатомическим признакам идентифицированы как Di rofilaria immitis. Самки D. immitis – крупные белые нитевидные нематоды дли ной - 250±30 мм, шириной 0,960±0,370 мм, хвостовой и головной концы – ко нусовидные, скрученные яичники в заднем отделе тела, поверхность тела имеет продольные гребни. Самцы D. immitis – белые нитевидные нематоды, немного меньше самок, их длина 150±25 мм, ширина – 1,120 ± 0,20 мм. Хвостовой конец конической формы, немного закруглен и сильно ссужен (иногда закручен).
Дальнейшей целью наших исследований стала разработка метода ранней диагностики паразитирования у собак Dirofilaria immitis. Для приготовления антигенного диагностикума, нами были использованы D. immitis, извлеченные путем неполного гельминтологического вскрытия собак различных пород, пола и возраста.
Извлеченных D. immitis сначала промывали водопроводной, затем дис тиллированной водой, далее измельчали на небольшие фрагменты ножницами, затем тщательно растирали с добавлением кварцевого песка в фарфоровой ступке при добавлении небольшого количества физиологического раствора в течение двух часов до получения однородной массы. Затем полученную сус пензию подвергали замораживанию при температуре - 4С. В течение после дующих трех суток суспензию извлекали из морозильной камеры и после неко торого оттаивания смесь тщательно растирали, а затем повторно подвергали замораживанию. Эту процедуру повторяли 3 раза.
В полученную суспензию добавляли физиологический раствор из расчета 1:3, учитывая первоначально добавленное количество физиологического рас твора при растирании гельминтов. После чего полученную смесь экстрагирова ли путем четырехчасового встряхивания на шуттель-аппарате при комнатной температуре. Далее биомассу центрифугировали при 3000 оборотах/минуту в течение 30 минут. Надосадочную жидкость (экстракт) сливали, а к осадку при бавляли 10 мл физиологического раствора и повторно центрифугировали в те чение 30 минут в том же режиме. Полученные порции экстрактов соединяли.
Полученный экстракт для концентрирования помещали в диализный мешок.
Содержание белка в данном экстракте составило – 15,2 г/л (15,2 ± 0,2 мг/мл) (Р 0,01).
Для установления микробиологической чистоты антигена перед введени ем его кроликам проводили посев на питательные среды. Общепринятым мето дом была установлена бактериологическая пригодность антигена, приготовлен ного из Dirofilaria immitis для последующей иммунизации кроликов с целью получения антисывороток, необходимых для подтверждения чистоты получен ного нами диагностикума.
Полный цикл иммунизации кроликов длился 12 суток. На подкожные и внутримышечные инъекции израсходовано – 7,7 мл антиген-экстракта и, соот ветственно – 117,04 мг белка.
Спустя 30 дней после последней инъекции, продолжили иммунизацию кроликов путем внутримышечных инъекций в различные участки бедер.
На весь курс иммунизации было израсходовано 11,4 мл антиген-экстракта, что составило 173,28 мг белка. Все животные опытной и контрольной группы живы.
Идентификацию антигенов проводили методом иммунодиффузии по Ух терлони. Тем же способом было подтверждено отсутствие возможной реакции с перекрестно реагирующими антигенами (сывороткой крови, тканями легких и сердечной мышцы инвазированных собак) при проведении исследования реко мендуемым нами методом. В связи с тем, что чувствительность иммунодиф фузного метода не всегда может достаточно точно свидетельствовать об отсут ствии реакции идентичности или же частичной идентичности между антигена ми, следующим этапом, подтвердившим иммунологическую частоту и высокую специфичность нашего диагностикума, был иммуноэлектрофорез.
Таким образом, в результате проведенных испытаний, получено досто верное подтверждение высокой иммунологической частоты (отсутствие пере крестно реагирующих антител, проверенной в два этапа – иммунодиффузией по Ухтерлони, а затем, с использованием иммуноэлектрофореза) и эффективности предлагаемого нами метода. Только его достоверно подтвержденная иммуноло гическая чистота позволила нам рекомендовать его к широкому применению.
Для проведения дальнейшей апробации метода «Способ определения за раженности собак D. immitis» нами была выбрана группа животных, спонтанно зараженных дирофиляриозом (D. immitis), выявленных по клиническому осмот ру, аускультации. При выборе контрольных групп животных учитывали породу и возраст. Возраст животных составил - от 7 до 13 лет. Всех собак разбили на группы по породам. Перед началом эксперимента у всех животных взяли ве нозную кровь и исследовали на наличие микрофилярий D. immitis по модифи цированному методу Кнотта.
У всех животных параллельно вышеописанным исследованиям получали венозную кровь и приготовляли сыворотки путем отстаивания и удаления сгу стков. Сыворотки хранили в холодильнике при температуре +2…+4С.
Далее проводили постановку реакции преципитации в агаровом геле, со гласно методике «Способ определения зараженности собак D. immitis». Ранее приготовленный антиген из Dirofilaria immitis и сыворотки крови наблюдаемых собак вносили в вырезанные пробойником лунки агара, по следующей схеме: в центральную лунку вносили антиген, по периферии помещали сыворотки собак опытной группы.
Проведенная апробация метода в опытной и контрольной группах собак доказала его высокую специфичность и достоверность. В опытной группе эф фективность предлагаемого нами метода составила – 98%, в контрольной груп пе – 100%. Экспериментальным путем была доказана высокая чувствитель ность и специфичность (98% и 97% соответственно) предлагаемого нами мето да.
ВЫВОДЫ 1. При исследовании собак и кошек г. Астрахани выявлено восприимчивое поголовье дефинитивных хозяев Dirofilaria immitis: наиболее подвержены опасности заражения цепные собаки служебных пород, из-за длительного пребывания их вне помещений и более частого контакта с комарами.
2. По результатам исследований морфологии микрофилярий выявлено пара зитирование у собак в Астраханской области - D.immitis. Максимальная микрофиляремия (ЭИ – 23,5%) наблюдалась у собак в августе-сентябре.
3. Микрофилярии обнаружили у собак 4-х служебных пород и беспородных, чаще инвазию регистрировали у кавказских и немецких овчарок и беспо родных. У декоративных пород инвазию не регистрировали. Значитель ное влияние на зараженность оказывал тип содержания животных и хо зяйственное назначение (бездомные и цепные).
4. Установлено, что чаще подвержены инвазии кобели, чем суки. Зараже нию подвержены собаки всех возрастов, наибольшее количество инвази рованных в возрастном отрезке – от 7 до 10 лет (30±1,0%), возрастной минимум приходится на 1,5-3 года (1,0%).
5. Среди промежуточных хозяев – комаров, наиболее инвазированы личин ками дирофилярий (D. immitis) комары рода Culex (8,6%), менее рода Aedes (5,8%) и Anopheles (4,5%).
6. Результаты гельминтологических вскрытий подтвердили паразитирова ние у собак D. immitis. Летальность собак от дирофиляриоза (D. immitis) наибольшая среди немецких и восточноевропейских овчарок, 81% всех летальных случаев приходится на зиму (декабрь - 10%, январь – 22,6%, февраль – 48%), осенью гибель животных не зарегистрирована.
7. Разработан и апробирован унифицированный метод диагностики «Способ определения зараженности собак Dirofilaria immitis», основанный на ре акции преципитации специфичного антигена и сыворотки крови собак в агаровом геле, который отличается высокой чувствительностью и специ фичностью (98% и 97% соответственно) и имеет ряд преимуществ: по зволяет проводить массовые исследования крови собак и выявлять инва зию на любой стадии болезни.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Исходя из результатов наших исследований по изучению дирофиляриоза (D. immitis) собак в условиях Астраханской области для своевременной диагно стики и усовершенствования мер борьбы с данной инвазией рекомендуем про водить следующие мероприятия:
Не реже одного раза в год в августе проводить обследование всех жи 1.
вотных на наличие микрофилярий D. immitis, а также обследовать всех ввози мых на территорию области собак.
При подозрении на дирофиляриоз (D. immitis), необходимо принимать 2.
во внимание – возраст животного, породу, пол, сезон года и особенно способ содержания.
Для установления достаточно точного диагноза рекомендуется исполь 3.
зовать разработанный «Способ определения зараженности собак Dirofilaria im mitis» - ввиду его специфичности к определенному виду Dirofilaria, достовер ности и надежности, а также финансовой доступности.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Богданова Т.В. Дирофиляриоз собак в Астраханской области / Бойко О.В.
//Журнал «Вестник АГТУ». – №4(39). - Астрахань, 2007. – С.137-139.
2. Богданова Т.В. Иммунологическая диагностика дирофиляриоза собак / Бойко В.И. // Российский иммунологический журнал. – Т.2(11), №2-3. – Москва, 2008. – С.164.
3. Богданова Т.В. Диагностика паразитирования D. immitis у собак в Астра ханской области //Журнал «Ветеринарная практика».- № 4 (43). – С-Петербург, 2008. –С.24-26.
4. Богданова Т.В. Диагностическое использование антигена, приготовлен ного из D. immitis / Бойко В.И.// Журнал «Клиническая лабораторная диагно стика». - №9. – Москва, 2008. –С.52-53.
5. Богданова Т.В. Ветеринарный контроль за паразитозами собак и кошек в г. Астрахани / Полковниченко А.П. // Материалы II Всеросс. научной конфе ренции студентов и молодых ученых с межд. участием: «Актуальные проблемы современных аграрных технологий». – Астрахань, 2007. - С.199-200.
6. Богданова Т.В. Дирофиляриоз плотоядных в условиях Астраханской об ласти /Полковниченко А.П.// Материалы международной научно-практической конференции: «Проблемы ресурсодобывающего производства и переработки экологически чистой с/х. продукции». - Астрахань, 2006 – С.77-78.
7. Богданова Т.В. Лабораторная диагностика и лечение дирофиляриоза со бак / Полковниченко А.П.// Материалы межд. научно-практической конферен ции: «Проблемы ресурсодобывающего производства и переработки экологиче ски чистой с/х продукции». - Астрахань, 2006 – С.82-83.
8. Богданова Т.В. Некоторые актуальные проблемы ветеринарной паразито логии в Астраханской области / Бойко О.В.// Материалы Российской научной конференции студентов и молодых ученых с межд. участием: «Актуальные проблемы современных аграрных технологий». – Астрахань, 2006. - С.111-112.
9. Богданова Т.В. Климато-географические особенности Астраханской об ласти как приоритетный фактор распространения дирофиляриоза / Бойко О.В.// Materialy V miedzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji “Aktualne problemy nowoczesnych nauk-2009”. - Volume 18. - Przemysl, Nauka I studia, 2009. – Р.45 46.
Богданова Т.В. Эпизоотологический мониторинг дирофиляриоза в 10.
Астраханской области // Materialy V miedzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji “Aktualne problemy nowoczesnych nauk-2009”. - Volume 18. Przemysl, Nauka I studia, 2009. – Р. 47-48.
Богданова Т.В.Иммунологический метод диагностики инвазии, вы 11.
зываемой D. immitis/Бойко О.В., Бойко В.И.//Труды научно-практической кон ференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохране ния России до 2020 года». – Москва, 28-30 сентября 2009. – С.220-221.