авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Евгения анваровна влияние наноструктурирования поверхности медицинских полимерных материалов на их физико химические и биологические свойства

На правах рукописи

УДК 577.3 РЕМЕЕВА Евгения Анваровна ВЛИЯНИЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАНИЯ ПОВЕРХНОСТИ МЕДИЦИНСКИХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ИХ ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 03.00.02. – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА – 2007 -2

Работа выполнена в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ «Научно исследовательского института трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий» и на кафедре физики живых систем Московского физико технического института (государственного университета)

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Севастьянов Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Назаров Виктор Геннадьевич, доктор биологических наук, профессор Иткин Георгий Пинкусович

Ведущая организация: "МАТИ" - Российский Государственный Технологический Университет им.

К.Э. Циолковского

Защита диссертации состоится 25 октября 2007 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета К.212.156.03. при Московском физико-техническом институте (ГУ) (141700, г. Долгопрудный, Институтский пер, д. 9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (ГУ).

Автореферат разослан «» сентября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156.03.

кандидат физико-математических наук Брагин В. Е.

-3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы Несмотря на то, что имплантируемые медицинские изделия из биоматериалов искусственного и природного происхождения достаточно широко применяются в различных областях современной медицины, актуальной остается проблема улучшения их функциональных характеристик.

Одним из основных требований к медицинским изделиям является их соответствие необходимым биологическим свойствам. Так, в случае протезов кровеносных сосудов, дренажей, катетеров, искусственных хрусталиков глаза, биосенсоров и др. взаимодействие поверхности изделия с биологической средой должно быть минимально, а для ортопедических и стоматологических имплантатов, напротив, требуется прорастание окружающей ткани в объем изделия.

Разработки медицинских изделий с улучшенными био- и гемосовместимыми свойствами ведутся по двум основным направлениям: создание новых материалов и модифицирование уже существующих материалов и изделий.

Реакция организма на имплантат определяется, в основном, его поверхностными свойствами: химическим составом, структурой и морфологией. В связи с этим, существующие способы регулирования биологических свойств медицинских изделий направлены на изменение физико-химических свойств поверхности (химический состав, степень гидрофильности, заряд, морфология и др.) с использованием физических, химических и физико-химических методов модифицирования. Особый интерес представляют методы модифицирования, которые позволяют изменять физико химические, структурные и функциональные свойства поверхности, не влияя на объёмные характеристики изделия, такие как прочность, эластичность, коэффициент пропускания, показатель преломления, электрофизические параметры и т.д.

Одним из перспективных путей улучшения биологических свойств медицинских изделий является модифицирование их поверхности различными физико-химическими методами (травление, обработка плазмой тлеющего разряда, ионная бомбардировка, литография и др.).

В 2001-2005 гг. в Центре по исследованию биосовместимых материалов ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов был проведен сравнительный анализ химических, физических и физико-химических методов модифицирования медицинских материалов и изделий из синтетических полимерных материалов, направленных на улучшение их медико-технических свойств. Результатом работы явилось доказательство перспективности двух подходов к созданию биосовместимых поверхностей: технологий, -4 основанных на ионно-плазменных методах и метод вакуумной ультрафиолетовой (ВУФ) обработки. Было доказано, что выбранные способы модифицирования позволяют создавать на поверхности гидрофильно-гидрофобные микро- и наноструктуры, имитирующие структуры белков и клеточных мембран. Однако детального анализа влияния ионно-плазменной и ВУФ обработки поверхности на изменение ее структурных характеристик и биологических свойств не проводилось. Кроме того, исследования ограничивались только синтетическими биостабильными полимерными материалами.

Цель работы Цель работы заключалась в исследовании физико-химических и биологических свойств поверхности биополимерного материала (сополимера 3-оксибутирата и 3 оксивалерата) и синтетических полимерных материалов (политетрафторэтилена, полиэтилентерефталата), наноструктурированных различными физическими методами.

Основные задачи работы Исходя из поставленной цели, задачи работы сводились к следующему:

1) доказать возможность применения магнетронного, ионно-плазменного метода и метода ВУФ-обработки для наноструктурирования поверхности синтетических и природных медицинских полимерных материалов;

2) изучить влияние наноструктурирования пленочных образцов полимерных материалов на химический состав, морфологию и гидрофильность их поверхности;

3) исследовать в условиях in vitro биологические свойства полимерных материалов и найти оптимальные условия наноструктурирования поверхности, приводящие к улучшению биологических свойств модифицированных образцов.

Научная новизна 1. Доказана возможность применения ВУФ-обработки для улучшения био- и гемосовместимых свойств бактериального сополимера 3-оксибутирата и 3 оксивалерата, предназначенного для замещения дефектов мягких тканей, в том числе, в качестве имплантируемого носителя для трансплантации клеток.

2. Доказано, что обработка пленок политетрафторэтилена, полиэтилентерефталата и сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата выбранными для них способами модифицирования, приводит к изменению наноразмерной шероховатости, гидрофильности и химического состава поверхности.

3. Проведен сравнительный анализ влияния микро- и наноструктуры гладкой и пористой поверхности полиэтилентерефталата, полученных, соответственно, ионно плазменным методом с последующим нанесением алмазоподобного углеродного -5 покрытия и магнетронным нанесением высокопористого алюминия/оксида алюминия в сочетании с ионно-плазменным методом, на биологические свойства образцов.

4. Для каждого вида полимерного материала и выбранного способа наноструктурирования поверхности исследовано влияние наноразмерной шероховатости и гидрофильности поверхности на ее гемо- и биосовместимые свойства.

Практическая значимость Найдены оптимальные режимы обработки ионно-плазменными методами для политетрафторэтилена (ПТФЭ, 30 мин травления, 100 нм -C:Н) и полиэтилентерефталата (ПЭТ, 10 мин травления, 100 нм - C:Н;

ПЭТ/Al(Al2O3), 3 мин травления, 50 нм -C:Н), а также оптимальные режимы ВУФ-облучения образцов сополимера 3-оксибутирата и 3 оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ, 30 мин. облучения, 2.5 торр), улучшающие их гемо- и биосовместимые свойства на белковом и клеточном уровне.

Результаты работы рекомендуются к использованию в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов», Федеральном государственном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена», Научном центре сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева, Федеральном государственном учреждении «Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова».

Апробация работы Основные материалы, изложенные в диссертации, доложены и обсуждены на следующих семинарах и конференциях:

межинститутский семинар Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий (2005, 2006, 2007 гг.), 45, 46 и 49-ая научные конференции МФТИ (Долгопрудный, 2002, 2003, 2006 гг.), 31-й Европейский Конгресс по искусственным органам ESAO (г. Варшава, Польша, 2004 г.), 11-ая научно-техническая конференция «Вакуумная наука и техника» (г. Судак, Украина, 2004г.), 19-ая Европейская Конференция по биоматериалам ESB (г. Сорренто, Италия, 2005 г.), -6 4-й Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.), IX-й Российско-Китайский Симпозиум «Новые материалы и технологии» (Астрахань, 2007 г.).

Публикации Результаты проведенных исследований отражены в 13 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.

Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, трёх глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты и их обсуждение, а также заключения и выводов.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков, таблицы и список литературы из наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

§ 1. Материалы - политетрафторэтилен (ПТФЭ) в виде плёнок, ГОСТ 5-1078-71, толщина мкм, Россия;

- полиэтилентерефталат (ПЭТ) в виде плёнок ПЭТ-Э ГОСТ 24234-80, толщина 30 мкм, Россия.

Для исследования адсорбции белков использовали:

лиофилизованный сывороточный альбумин человека (САЧ, 99%, ММ 66500), Sigma Chemical, США;

флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ, ММ 389.4), Sigma Chemical, США;

фосфатный буфер (0.1 M NaCl, 0.086 M KH2PO4, 0.041 M Na2HPO4, pH = 7.4) Для исследования адгезии тромбоцитов получали свежеприготовленную тромбоцитарную плазму крови человека.

Основным компонентом биодеградируемого матрикса был высокоочищенный двухкомпонентный сополимер 3-оксибутирата и 3-оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ) с долей оксивалерата 2030 мол. %, полученный в лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Института биофизики СО РАН (зав. лаб. д.б.н., проф. Т.Г. Волова). Полимеры синтезированы бактериями Ralstonia eutropha B5786 в автотрофных стерильных условиях роста. Молекулярная масса ПОБ-со-ПОВ, MМ = 295 000-360 000 Да, кристалличность 50 -7 60%. При приготовлении образцов в качестве растворителя использовали метилен хлорид (дихлорметан, CH2Cl2) ОСЧ (Синтактон, Россия).

§ 2. Методы модифицирования поверхностей полимерных материалов Исходя из природы полимерных материалов, для обработки поверхности ПТФЭ был привлечен двухстадийный ионно-плазменный метод, включающий в себя ионно плазменную обработку поверхности ионами CF4 с последующим нанесением алмазоподобного углеродного покрытия. Поверхность ПЭТ модифицировали двумя способами: ионно-плазменным методом с последующим нанесением алмазоподобного углеродного покрытия и методом магнетронного нанесения Al(Al2O3) в сочетании с ионно-плазменным методом. Пленки бактериального сополимера поли(оксибутират-со оксивалерат) подвергали вакуумному ультрафиолетовому излучению.

2.1. Ионно-плазменная обработка Модифицирование поверхностей ПТФЭ и ПЭТ алмазоподобным углеродным покрытием (–С:Н) проводили в лаборатории микроэлектроники «МАТИ»-РГТУ (зав. лаб.

д.т.н., проф. Елинсон В.М.). Первый этап модифицирования заключался в обработке (травлении) исходной поверхности пучком ионной плазмы в атмосфере активных газов (CF4 и воздуха) в течение 1-30 мин, что приводило к образованию наноструктурированной поверхности. На втором этапе (–С:Н)- покрытие формировали двумя способами:

1. осаждением углерода непосредственно на поверхность обработанных образцов из направленных ионно-плазменных потоков паров углеводородов (циклогексан);

2. осаждением углерода на слой высокопористого алюминия, предварительно нанесенный магнетронным методом на поверхность обработанного ПЭТ.

Общий вид шифра исследуемых образцов имеет вид:

Rконтр и Rобр(i)/Cj, где R – вид материала (ПТФЭ, ПЭТ, ПЭТ/Al(Al2O3));

обр(i) – время обработки материала (в минутах) в ионной плазме CF4 и воздуха для ПТФЭ и ПЭТ соответственно;

j – толщина -C:H – покрытия (в нм) 2.2. Облучение вакуумным ультрафиолетовым излучением Установка для модифицирования полимеров медицинского назначения (УМП-1) вакуумным ультрафиолетовым излучением была изготовлена в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО совместно с ФГУП НИИ физических проблем им. Ф.В.

Лукина. Установка позволяет облучать образцы монохроматическим излучением с -8 длиной волны 147 нм и интенсивностью 3х1015 квант·с-1·см-2, в диапазоне рабочих давлений 0.02 – 25 торр.

§ 3. Методы исследования физико-химических свойств наноструктурированной поверхности полимерных материалов 3.1. Метод сканирующей электронной микроскопии Для исследования морфологии поверхности образцов использовали сканирующий электронный микроскоп JSM 6360LA (JEOL, Япония). Элементный состав поверхности анализировали методом энергетического дисперсионного рентгеновского анализа с использованием СЭМ JSM 6360LA (JEOL, Япония).

3.2. Метод атомно-силовой микроскопии Наноструктуру поверхности оценивали с помощью атомно-силового микроскопа «ФемтоСкан» («Центр перспективных технологий», МГУ, Москва) и зондового микроскопа NTegra Tomo (NT-MDT, Москва). Поле сканирования от 0,20,2 до мкм. Для каждого образца были получены снимки поверхности в разных точках и при различном увеличении. На основе данных сканирования находили совокупность характеристик микрорельефа поверхности. Основным определяемым параметром являлась наношероховатость поверхности (среднеквадратичное отклонение Rq), рассчитываемое по всем точкам скана.

3.3. Метод рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии Рентгеновские фотоэлектронные спектры регистрировали на спектрометре XSAM800 фирмы Kratos (Великобритания). Источником возбуждения служил магниевый анод с энергией характеристического излучения MgK= 1253.6 эВ. Мощность, выделяемая на аноде во время регистрации спектров, не превышала 90 Вт. Измерения проводили при давлении ~5*10-10 торр.

3.4. Метод краевого угла смачивания Степень гидрофильности поверхности пленочных образцов определяли по изменению краевого угла смачивания по воде. Исследуемый образец располагался на дне оптической кюветы. С помощью микрошприца на поверхность образца наносится капля смачивающей жидкости ~ 2 мкл. Для аппроксимирования формы капли дугой окружности и вычисления краевого угла смачивания (по воде) изображение капли с телекамеры передавалось в компьютер с необходимым программным обеспечением.

-9 § 4. Методы исследования биологических свойств наноструктурированной поверхности полимерных материалов 4.1. Методика регистрации количества необратимо адсорбированного белка методом флуоресценции полного внутреннего отражения (ФПВО).

В качестве параметра, определяющего характер взаимодействия поверхности с сывороточным альбумином человека (САЧ), было выбрано количество необратимо адсорбированного белка.

Мечение САЧ раствором ФИТЦ проводили по стандартной методике, разработанной в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО. Адсорбцию белка на поверхность исходных и модифицированных образцов проводили из раствора фосфатного буфера с 0,1 мг/мл САЧ-ФИТЦ в пластиковых кюветах (объем 3 мл) в течение 60 минут в статических условиях с последующей отмывкой ФБ (5 мин.). Максимальное значение сигнала флуоресценции меченого белка САЧ-ФИТЦ ( = 523 нм) регистрировали на спектрометре Perkin Elmer LS55 (США) при длине волны возбуждения 495 нм.

Абсолютное количество необратимо адсорбированного белка СCАЧнеобр вычисляли по следующей формуле:

СCАЧнеобр. = (СCАЧ-I131необр )ПЭНП / (I фл.)ПЭНП) * (I фл.)обр, (СCАЧ-I131необр)ПЭНП где вычисляли по значениям количества необратимо адсорбированного САЧ с помощью метода ФПВО для оптически прозрачных образцов ПЭНП на спектрофлуориметре SLM 4800, Perkin Elmer, США.

Согласно адсорбционному критерию гемосовместимости, поверхность материала должна адсорбировать минимальное количество прочно связанного белка, то есть должна легко обмениваться с белками плазмы крови. Следовательно, чем ниже значение СCАЧнеобр, тем выше вероятность гемосовместимости медицинского изделия.

4.2. Количество и морфология адгезированных тромбоцитов Для проведения экспериментов по изучению взаимодействия тромбоцитов с поверхностью материалов использовали кровь здоровых взрослых доноров мужского пола в возрасте 20-50 лет. Исследования проводили с информированного согласия доноров.

Плазму, обогащенную тромбоцитами (ПОТ), получали из крови, стабилизированной 3.8 % цитратом натрия, центрифугированием при 100 g в течение мин. Концентрация тромбоцитов в ПОТ составляла (3,0 ± 0,5)*105 мкл-3.

Исследуемые образцы инкубировали с ПОТ в статических условиях 15 минут, фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида и обезвоживали в растворах - 10 этилового спирта возрастающих концентраций. Визуализацию адгезированных клеток проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM 6360LA, (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 5 кВ и увеличениях до х2000 - 3500.

Количество адгезированных тромбоцитов оценивали по значению относительного показателя адгезированных тромбоцитов – ОПАТ:

N обр ОПАТ=, N контр где Nобр и Nконтр – количества клеток, адгезированных на поверхности образца и контроля соответственно. В качестве контрольной поверхности использовался медицинский полиэтилен низкой плотности (ПЭНП). Чем выше значение ОПАТ, тем выше возмущающее действие материала на тромбоциты.

Кроме того, определяли процент сильно активированных тромбоцитов на поверхности образцов по показателю степени активации на поверхности – Какт. по формуле:

N агр + N расп Какт = N общ где Nобщ – общее количество клеток, адгезированных на поверхность материала, Nагр – количество агрегатов среди них, Nрасп – количество распластанных тромбоцитов.

Чем ниже значение Какт, тем меньше доля сильно активированных форм в общем количестве адгезированных тромбоцитов, а, следовательно, выше вероятность гемосовместимости образца.

4.3. Оценка адгезии фибробластов мыши линии NIH 3T Стерильные образы исследуемых материалов площадью 1.5 см2 помещали на дно лунок 24 – луночной планшеты (d = 15 мм), фибробласты засевали в концентрации клеток/см2. Клетки культивировали при 37°С в СО2- инкубаторе, во влажной (95% влажности) атмосфере, содержащей 5 ± 1 % СО2 в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 0.58 г/л глутамина, 50 мкг/л гентамицина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Perbio-Plerce, Бельгия) и 10 мМ HEPES (ПанЭко, Россия).

Для анализа количества, морфологии и процессов пролиферации культивируемых на поверхности образцов фибробластов мыши линии NIH 3T3 использовали СЭМ JSM 6360LA (JEOL, Япония). Интенсивность пролиферации оценивали по увеличению количества фибробластов, адгезированных на поверхность исходного и модифицированного материала на 1, 3 и 6 сутки культивирования клеток.

Статистическая обработка результатов исследования Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Находили средние значения вариант и - 11 среднеквадратичные отклонения. Достоверность различий определяли, используя критерий t- Стьюдента с уровнем значимости 0.05 и 0.01.

§ 5. Результаты и их обсуждение 5.1. Физико-химические свойства наноструктурированной поверхности образцов ПТФЭ, ПЭТ и ПОБ-со-ПОВ 5.1.1. Сканирующая электронная микроскопия Поверхность образцов ПТФЭ, модифицированных ионно-плазменным методом, (Рис. 1, б-г), в отличие от исходной поверхности (Рис. 1, а), имеет четко выраженные упорядоченные фибриллярные микроструктуры с размером фибрилл порядка 0.2 0. мкм. Размер микронеоднородностей не зависел от наличия и толщины углеродного покрытия, т.е., характерная рельефная микроструктура поверхности задавалась уже на первой стадии обработки ПТФЭ.

a) ПТФЭконтр б) ПТФЭобр(30) в) ПТФЭобр(30)/С10 г) ПТФЭобр(30)/С Рисунок 1. Микрофотографии поверхности исходного и модифицированного ПТФЭ.

Маркер – 2 мкм. Сканирующий электронный микроскоп JSM-6360 LA (JEOL, Япония).

В отличие от ПТФЭ ионно-плазменная обработка поверхности ПЭТ в атмосфере воздуха не изменяла микроструктуру образцов (Рис. 2 а, б) Магнетронное нанесение высокопористых пленок алюминия на поверхность ПЭТ приводит к формированию глобулярной микроструктуры ~ 0.5 мкм, параметры которой остается неизменной при напылении углерода (Рис. 2 в, г).

- 12 а) ПЭТконтр б) ПЭТобр(10)/С в) ПЭТ/Al(Al2O3) г) ПЭТ/Al(Al2O3)обр(3)/С Рисунок 2. Микрофотографии поверхности исходного и модифицированного ПЭТ.

Маркер – 2 мкм. Сканирующий электронный микроскоп JSM 6360LA (JEOL, Япония).

Исследования поверхности сополимера ПОБ-со-ПОВ методом СЭМ не выявили наличия упорядоченной микроструктуры на поверхности исходного и ВУФ-облученного полимеров.

5.1.2. Атомно-силовая микроскопия АСМ-анализ наноструктуры поверхности образцов ПТФЭ показал, что наноразмерная шероховатость (Rq) поверхности после обработки ПТФЭ ионно плазменным травлением изменяется с (24 ± 1) нм для исходного образца до (31 ± 2) нм для образца ПТФЭобр(30мин). При нанесение углеродного покрытия значения Rq достоверно увеличиваются до (37 ± 2) нм и (67 ± 4) нм для толщины -С:Н 10 и 100 нм, соответственно.

Ионно-плазменная обработка поверхности ПЭТ также ведет к росту Rq от (2,7 ± 0,3) нм до (10.3 ± 0.8) нм. Последующее напыление -C:H–покрытия вызывает незначительный рост шероховатости до (12.4 ± 1.1) нм и (12.2 ± 1.0) нм для образцов ПЭТобр(10)/С10 и ПЭТобр(10)/С100 соответственно, рис. 3 а.

Нанесение высокопористого алюминиевого слоя на поверхность ПЭТ, естественно, вызывает резкий рост шероховатости (Rq) с 2.7 ± 0.3 нм для исходного ПЭТ до 148 ± 15 нм для образца ПЭТ/Al(Al2O3). После ионно-плазменной обработки поверхности в атмосфере воздуха и напыление слоя углерода было обнаружено снижение величины шероховатости (Rq равно 125 ± 13 нм для образца ПЭТ/Al(Al2O3)обр(1)/С50 (рис. 3 б) и 93 ± 8 нм для образца ПЭТ/Al(Al2O3)обр(3)/С50).

- 13 а) ПЭТобр(10)/С100 б) ПЭТ/Al(Al2O3)обр(1)/С Рисунок 3. Микрофотографии поверхностей образцов ПЭТ с «гладкой» и «глобулярной» структурой. Атомно-силовой микроскоп «ФемтоСкан» («Центр перспективных технологий», МГУ, Москва). Размер изображения 10х10х2 мкм.

Наноразмерная шероховатость поверхности исходных образцов ПОБ-со-ПОВ составляла 81 ± 8 нм. После ВУФ-обработки при давлении рабочей камеры 0.02 торр значение Rq снижалось до 57 ± 6 нм. При увеличении давления до 2.5 торр шероховатость продолжала снижаться, принимая свое минимальное значение (Rq=22 ± 2 нм).

а) ПОБ-со-ПОВ б) 0.02 торр г) 10 торр в) 2.5 торр Рисунок 4. Микрофотографии поверхностей образцов исходного и ВУФ-облученного при разных давлениях ПОБ-со-ПОВ. Размер изображений 12х12х3 мкм. Зондовый микроскоп NTegra Tomo (NT-MDT, Москва).

Последующий рост давления до 10 торр приводит к росту Rq до 40 ± 4 нм и увеличению ее периодичности.

Таким образом, зависимость величины Rq от давления, при котором проходило ВУФ-облучение ПОБ-со-ПОВ, имеет нелинейный характер. Минимальное значение Rq было отмечено для поверхности, облученной при давлении 2.5 торр.

5.1.3. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия Результаты РФС-анализа исследования поверхности ПТФЭ и ПЭТ, наноструктурированных ионно-плазменным обработкой, представлены в таблице 1.

- 14 Таблица 1. Элементный состав поверхностей исследуемых и модифицированных синтетических полимерных материалов.

С, ат % F, ат % O, ат % ПТФЭконтр 35.2 ± 0.3 64.8 ± 0.3 ПТФЭобр(30) 33.9 ± 0.1 66.1 ± 0.3 ПТФЭобр(30)/С10 61.9 ± 0.2 28.2 ± 0.1 9.9 ± 0. ПТФЭобр(30)/С100 81.0 ± 0.4 8.5 ± 0.2 10.5 ± 0. ПЭТконтр 76.4 ± 0.1 - 23.6 ± 0. ПЭТобр(10) 73.8 ± 0.1 - 22.5 ± 0. ПЭТобр(10)/С100 86.8 ± 0.1 - 13.2 ± 0. Для поверхности ПТФЭ при обработке ионами CF4 и нанесении - С:Н покрытия отмечено увеличение процентного содержания углерода и уменьшение процентного содержания фтора. При ионно-плазменной обработке в атмосфере воздуха поверхности ПЭТ наблюдали увеличение процентного содержания углерода и уменьшение процентного содержания кислорода.

Для образцов ВУФ-облученного сополимера ПОБ-со-ПОВ установлено, что при разложении пика C1s (285 эВ) можно выделить три составные части, отвечающие следующим химическим связям: C-C, C-Н (285 эВ), С-О-С, С-ОН (286.5 эВ) и C=О (289 эВ). Общее количество этих связей для данного спектра принято за 100%.

Процентное содержание химических связей, образующихся при обработке вакуумным ультрафиолетовым излучением, от величины остаточного давления воздуха для ПОБ-со ПОВ представлено на рисунке 5.

C=O относительное количество связей, % C-C, C-H C-O-C, C-OH 0 2 4 6 8 P0, торр Рисунок 5. Зависимость относительного количества функциональных групп на поверхности ПОБ-со-ПОВ от величины давления остаточного воздуха в реакционной ячейке при 30 минутах ВУФ-облучения.

- 15 Таким образом, для ВУФ-облученных образов сополимера при всех значениях давления отмечено снижение относительного количества связей C-C, C-Н, С=О и повышение относительного количества связей С-О-С, С-ОН, что и является причиной гидрофилизации поверхности. Наибольший эффект наблюдается при давлении 2.5 торр.

5.1.4. Краевой угол смачивания Обработка ионной плазмой CF4 приводит к еще большей гидрофобизации поверхности ПТФЭ. Краевой угол смачивания по воде ° возрастал от (111 ± 2)° до (138 ± 4)°. Следующее за травлением нанесение углеродного покрытия толщиной 10 нм ведет к незначительной гидрофилизации поверхности (° = 123.5 ± 4), что, вероятно, обусловлено наличием непокрытых углеродом участков ПТФЭ. При толщине углеродного слоя 100 нм краевой угол смачивания изменяется до 86 ± 6°.

Известно, что значения краевого угла смачивания по воде для сплошных углеродных покрытий на основе ПЭНП составляют (81.7 92.8)°. Следовательно, в отличие от образца ПТФЭобр(30)/С10, при толщине углеродного слоя 100 нм на поверхности обработанного ионной плазмой ПТФЭ формируется сплошное гидрофильное покрытие.

Ионно-плазменная обработка поверхности ПЭТ в атмосфере воздуха также приводит к гидрофобизации поверхности: краевой угол смачивания растет с (66 ± 3) до (93 ± 6). Последующее нанесение углеродного покрытия толщиной 10 нм практически не меняет значения краевого угла смачивания: °(ПЭТобр(10)/С10) = (88 ± 5). При увеличении углеродного слоя до 100 нм значение краевого угла смачивания уменьшается до уровня исходного ПЭТ (71 ± 5).

При ВУФ-облучении образцов ПОБ-со-ПОВ и минимальном давлении (0.02 торр) в рабочей камере изменения краевого угла смачивания поверхности (82 ± 3)° статистически не достоверны. Увеличение давления в рабочей камере ведет к гидрофилизации поверхности (° = 62 ± 6 для 2.5 торр и °=70 ± 4° для 10 торр). Следовательно, максимальное значение гидрофильности поверхности выявлено для обработки сополимера при давлении 2.5 торр, что соответствует данным РФС.

5.2. Биологические свойства наноструктурированной поверхности образцов ПТФЭ, ПЭТ и ПОБ-со-ПОВ 5.2.1. Адсорбция белка Обработка поверхности ПТФЭ плазмой CF4 ведет к росту количества необратимо адсорбированного САЧ (СCАЧнеобр) с (63.6 ± 5.8) нг/см2 до (106.4 ± 12,0) нг/см2.

Формирование углеродного покрытия уменьшает количества адсорбированного белка с - 16 (50.9 ± 12.1) нг/см2 для покрытий толщиной 10 нм до (10.8 ± 2.2) нг/см2 для углеродного слоя 100 нм.

Наименьшее количество альбумина (10.8 ± 2.2 нг/см2) адсорбируется на поверхность (ПТФЭобр(30)/С100) с наибольшими значениями гидрофильности (° = 86 ± 6), рис. 6 и наношероховатости Rq = (67 ± 4) нм в ряду исследуемых образцов ПТФЭ.

, нг/см необр ССАЧ 80 90 100 110 120 130 краевой угол, ° Рисунок 6. Зависимость количества необратимо адсорбированного сывороточного альбумина человека от краевого угла смачивания поверхности.

Ионно-плазменная обработка поверхности ПЭТ в атмосфере воздуха ведет к уменьшению СCАЧнеобр с (49.8 ± 5.8) нг/см2 до (14.7 ± 4,1) нг/см2. Нанесение –C:H – покрытия толщиной 100 нм вызывает понижение количества необратимо адсорбированного САЧ до (5.4 ± 2.2) нг/см2. В ряду модифицированных поверхностей ПЭТ образец ПЭТобр(10)/С100 имеет наибольшую гидрофильность.

Известно, что гидрофилизация гидрофобной поверхности приводит как к уменьшению общего количества адсорбированного белка, так и доли необратимо адсорбированных молекул. Действительно, наименьшие значения необратимо адсорбированного САЧ для поверхности ПТФЭ и ПЭТ обнаружены для образцов с наименьшим краевым углом смачивания, ° = 86 ± 6 и ° = 71 ± 5, соответственно.

Количество необратимо адсорбированного САЧ уменьшается с нанесением на поверхность ПЭТ слоя Al(Al2O3) с (49.8 ± 5.8) нг/см2 до (21.7 ± 4.7) нг/см2. Последующая обработка в ионной плазме воздуха и напыление алмазоподобного покрытия толщиной - 17 нм ведет к еще более заметному уменьшению количества САЧ: (12.5 ± 1.3) нг/см2 и (10. ± 2.6) нг/см2 для 1 и 3 мин обработки соответственно.

ВУФ-облучение поверхности ПОБ-со-ПОВ ведет к понижению количества необратимо адсорбированного альбумина с (63.4 ± 7.3) нг/см2 до (35.6 ± 4.7) нг/см2 при всех значениях давления в рабочей камере. При этом, наименьшее СCАЧнеобр было отмечено также для наиболее гидрофильного образца с ° = 62 ± 6, облученного при давлении 2.5 торр, с наименьшим значением значением Rq = (22 ± 2) нм в ряду исследуемых образцов сополимера.

Кроме того, из рисунка 5 видно, что зависимость количества С=О-групп на поверхности ВУФ-облученного ПОБ-со-ПОВ от давления воздуха в реакционной ячейке принимает максимальное значение при давлении 2.5 торр. Таким образом, можно сделать вывод, что минимизация адсорбции альбумина человека обусловлена наличием на поверхности сополимера С=О-групп. Можно предположить, что наличие минимума связано с тем, что в результате генерации на гидрофобной поверхности полярных С=О групп достигается гидрофобно-гидрофильный баланс, обеспечивающий минимальное взаимодействие поверхности с белковыми и клеточными элементами крови.

5.2.2. Адгезия тромбоцитов Морфологический анализ образцов показал, что доля сильно активированных форм (распластанных и агрегатов) тромбоцитов одинакова для исходной и травленой поверхности ПТФЭ, Какт = 0.73 ± 0.07 и Какт = 0.71 ± 0.07, соответственно. В то же время, нанесение –С:Н покрытия уменьшает количество распластанных тромбоцитов и агрегатов, но увеличивается число клеток с псевдоподиями (Какт = 0.56 ± 0.06 для образца ПТФЭ обр(30мин)/С10 и Какт = 0.42 ± 0.04 для образца ПТФЭ обр(30мин)/С100). Полученные результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о преобладании слабо активированных форм в общем количестве адгезированных тромбоцитов и отсутствии перераспределения в сильно активированные формы на углеродные фибриллярные структуры (в сравнении с гладкими и глобулярными).

Из данных исследования можно сделать вывод, что поверхность ПТФЭ после 30 минутной обработки ионной плазмой CF4 и последующего нанесения углеродного слоя толщиной 100 нм в наименьшей степени провоцирует поверхностную агрегацию тромбоцитов человека (p 0.05), что говорит о ее лучшей гемосовместимости относительно других образцов ПТФЭ.

Было обнаружено, что ионно-плазменная обработка поверхности ПЭТ в плазме воздуха с последующим нанесением –C:H - покрытия не влияет на значение ОПАТ - 18 (0.73 ± 0.11) по сравнению с 0.65 ± 0.09 для исходного ПЭТ), но, в то же время, понижает количество сильно активированных клеток. Наименьшее значение параметра Какт отмечено для образца с толщиной углеродного покрытия 100 нм (0.45 ± 0.06 по сравнению с 0.72 ± 0.11 для исходного ПЭТ).

Наличие слоя высокопористого алюминия на поверхности ПЭТ ведет к увеличению общего количества адгезированных тромбоцитов (ОПАТ растет от 0.65 ± 0. до 0.81 ± 0.12), что можно объяснить ростом истинной площади поверхности ПЭТ/Al(Al2O3), контактирующей с тромбоцитарной плазмой. Последующая ионно плазменная обработка поверхности ПЭТ/Al(Al2O3) и нанесение –C:H - покрытия не влияет на значения ОПАТ. Однако морфологический анализ адгезированных на поверхности тромбоцитов показал, что количество сильно активированных тромбоцитов уменьшается после микро- и наноструктурирования поверхности (Какт = 0.60 ± 0.09 по сравнению с 0.72 ± 0.11 для исходного ПЭТ).

Для всех ВУФ-модифицированных образцов ПОБ-со-ПОВ было установлено достоверное снижение значения ОПАТ. Наименьшее количество адгезированных тромбоцитов по сравнению с поверхностью исходного сополимера (рис. 7 а) (ОПАТ = 0.81 ± 0.12) наблюдалось на поверхностях, облученных при 2.5 (рис. 7 б) и 10 торр (ОПАТ = 0.12 ± 0.02 и 0.16 ± 0.02 соответственно).

а) ПОБ-со-ПОВ б) 2.5 торр Рисунок 7. Микрофотографии адгезированных тромбоцитов на поверхности исходного и ВУФ-облученного ПОБ-со-ПОВ. Маркер – 10 мкм. Сканирующий электронный микроскоп JSM-6360 LA (JEOL, Япония).

Морфологический анализ адгезированных тромбоцитов показал, что ВУФ обработка приводит к достоверно значимому уменьшению количества сильно активированных форм адгезированных тромбоцитов при всех значениях давления в рабочей камере (Какт = 0.30 ± 0.05 для облученных образцов по сравнению с 0.75 ± 0. для исходного ПОБ-со-ПОВ).

- 19 5.2.3. Культивирование фибробластов мыши линии NIH 3T Из данных литературы известно, что поверхность ПТФЭ обладает низкой гистосовместимостью, т.е. клетки тканей плохо адгезируют на нее и медленно растут. Это свойство, в частности, вызывает затруднение при изготовлении сосудистых протезов из ПТФЭ. Было установлено, что разработанный двухстадийный способ модифицирования поверхности ПТФЭ улучшает ее биосовместимые свойства на клеточной уровне. Для этих образцов отмечено быстрое прикрепление и рост клеток, причем фибробласты были распластаны и имели полигональную форму (Рис. 8, в, г), а не веретенообразную и треугольную как для исходного ПТФЭ (Рис. 8, а).

а) ПТФЭконтр б) ПТФЭобр(30) в) ПТФЭобр(30)/С10 г) ПТФЭобр(30)/С Рисунок 8. Микрофотографии адгезированных фибробластов мыши линии NIH 3T3 на поверхности исходного и модифицированного ПТФЭ. Время культивирования – 3 суток.

Маркер – 50 мкм. Сканирующий электронный микроскоп JSM-6360 LA (JEOL, Япония).

В отличие от образцов ПТФЭ, ионно-плазменная обработка поверхности ПЭТ в атмосфере воздуха незначительно улучшала пролиферацию фибробластов.

Было показано, что наличие слоя высокопористого Al(Al2O3) увеличивает адгезию и пролиферацию фибробластов мыши линии NIH 3T3 к поверхности ПЭТ (Рис. 9 б, a).

Последующая обработка поверхности ионной плазмой воздуха и нанесение –C:H – покрытия ускоряет рост клеток и улучшает их распластывание (Рис. 9 в, г).

- 20 а) ПЭТконтр б) ПЭТ/Al(Al2O3)контр в) ПЭТ/Al(Al2O3)обр(1)/С50 г) ПЭТ/Al(Al2O3)обр(3)/С Рисунок 9. Микрофотографии адгезированных фибробластов мыши линии NIH 3T3 на поверхности исходного и модифицированного ПЭТ. Время культивирования – 3 суток.

Маркер – 50 мкм. Сканирующий электронный микроскоп JSM-6360 LA (JEOL, Япония).

В экспериментах по культивированию фибробластов на поверхности сополимера ПОБ-со-ПОВ, а также его модификаций, полученных с помощью ВУФ-облучения показали, через 3 часа после посева клетки хорошо прикреплялись к поверхности всех субстратов, кроме поверхности исходного ПОБ-со-ПОВ. На 3-и сутки наблюдали визуальное увеличение количества фибробластов на поверхности сополимера, облученного при давлении рабочей камеры 2.5 торр по сравнению с поверхностью необработанного ПОБ-со-ПОВ.

Результаты культивирования фибробластов мыши линии NIH 3T3 на исследуемых наноструктурированных образцах в условиях in vitro показали, что модифицирование полимерных материалов положительно влияет на их биосовместимые свойства. Это дает основание предположить перспективность использования предложенных методов наноструктурирования поверхности для разработки имплантируемых изделий с высокими гемо- и биосовместимыми характеристиками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основным результатом проведенной работы явилась изучение взаимосвязи между физико-химическими и биологическими свойствами полимерных материалов искусственного и биологического происхождения с наноструктурированной поверхностью, полученной двумя методами модифицирования: применением ионно плазменных технологий и вакуумного ультрафиолетового облучения.

- 21 Проведенные исследования физико-химических и биологических свойств модифицированных поверхностей ПТФЭ, ПЭТ, а также сополимера ПОБ-со-ПОВ бактериального происхождения позволили найти оптимальные условия модифицирования физико-химических свойств поверхности полимерных материалов методами ионно плазменной обработки с последующим нанесением углеродных покрытий и вакуумным ультрафиолетовым излучением. Модифицирование полимерных материалов данными методами изменяет степень гидрофильности их поверхности и размер наноразмерной наношероховатости, кроме того, приводит как к уменьшению степени необратимости адсорбции альбумина, так и к снижению относительной доли сильно активированных клеток, что свидетельствует об улучшении гемосовместимых свойств выбранных объектов исследования. Исследования адгезии, роста и пролиферации фибробластов мыши линии NIH 3T3 показали, что наноструктурирование поверхности ведет к быстрому прикреплению клеток, их активному росту и высокой степени распластанности, что говорит об улучшении биосовместимых свойств поверхности.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что каждый материал проявляет наилучшие биологические свойства при определенном значении наноразмерной шероховатости.

Найдены оптимальные режимы обработки ионно-плазменной методами поверхностей политетрафторэтилена и полиэтилентерефталата, а также оптимальные режимы ВУФ-облучения образцов сополимера 3-оксибутирата и 3-оксивалерата, улучшающие их гемо- и биосовместимые свойства на белковом и клеточном уровне.

ВЫВОДЫ 1. Показано, что модифицирование пленок ПТФЭ и ПЭТ, соответственно, ионно плазменной обработкой поверхности ионами CF4 и в атмосфере воздуха с последующим нанесением алмазоподобного углеродного покрытия сопровождается увеличением наноразмерной шероховатости поверхности и ее гидрофильности. Для сополимера ПОБ-ПОВ гидрофилизирующее действие ВУФ обработки сопровождается уменьшением наношероховатости поверхности.

2. Установлено, что гидрофилизация поверхности ПТФЭ, ПЭТ и ПОБ-ПОВ положительно влияет на их биологические свойства, однако наилучшие гемо- и биосовместимые свойства наноструктурированных образцов достигаются при различных значениях наноразмерной шероховатости.

- 22 3. Обнаружено, что наименьшее количество сывороточного альбумина человека, необратимо адсорбированного на поверхности ПОБ-со-ПОВ, соответствует максимальной поверхностной концентрации кислородсодержащих групп.

4. Наноструктурирование поверхности ПТФЭ, ПЭТ и ПОБ-со-ПОВ уменьшает количество необратимо адсорбированного сывороточного альбумина человека и долю сильно активированных тромбоцитов (распластанных и агрегатов) по сравнению с исходными образцами, что свидетельствует о повышение их гемосовместимости.

5. Процессы прикрепления и пролиферации фибробластов мыши линии NIH 3T3 на поверхностях трех исследованных наноструктурированных полимерных материалов протекают активнее, чем на исходных поверхностях, что доказывает повышение их биосовместимости.

6. Показано, что предварительное формирование на поверхности ПЭТ слоя высокопористого алюминия способствует увеличению адгезии и пролиферации клеточной культуры фибробластов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При выборе способа наноструктурирования поверхности необходимо учитывать природу полимерных материалов.

2. Найденные для каждого способа наноструктурирования оптимальные режимы обработки поверхности могут быть рекомендованы для разработки технологий физического модифицирования с целью улучшения медико-технических свойств имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии (системы искусственного и вспомогательного кровообращения, катетеры, протезы кровеносных сосудов и др.).

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1) Е.А. Ремеева, Влияние чужеродной поверхности на реакцию высвобождения АТФ из тромбоцитов человека. Материалы XLV научной конференции МФТИ (секция физики живых систем), 2002, С. 7.

2) I.B. Rozanova, E.A. Nemets, E.A. Remeeva, V.I. Sevastianov, Influence of biomaterials surface on platelets release ATP in vitro. The International Journal of Artificial Organs, 2003, 26, № 7, P. 634.

3) Е.А. Ремеева, Е.А. Немец, И.Б. Розанова, В.И. Севастьянов, Влияние различных олигосилоксанов на реакцию высвобождения АТФ из тромбоцитов человека Материалы XLVI научной конференции МФТИ (секция физики живых систем), 2003, С. 93.

- 23 4) Е.А. Ремеева, Е.А. Немец, И.Б. Розанова, В.И. Севастьянов, Методика измерения активации тромбоцитов в присутствии чужеродной поверхности. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2004, № 1, С. 19-23.

5) E.A. Remeeva, E.A. Nemets, I.B. Rozanova, V.I. Sevastianov Platelet activation:

aggregation, ATP release and adhesion induced by biomaterial surface. The International Journal of Artificial Organs, 2004, 27, № 7, P. 605.

6) Е.О. Дуплякин, Е.А. Ремеева, И.Б. Розанова Методы исследования взаимодействия тромбоцитов с чужеродной поверхностью. Материалы IX Научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника», изд. МГИЭМ, 2004, С. 250-255.

7) Е.А. Ремеева, И.Б. Розанова, Е.А. Немец, В.И. Севастьянов, Роль гидрофильности органосилоксанов в процессах взаимодействия поверхности материалов с тромбоцитами человека. Перспективные материалы, 2005, № 5, С. 60-67.

8) E.A. Remeeva, E.A. Nemets, I.B. Rozanova, V.I. Sevastianov, The Study of Platelet Haemostatic Reactions in the Presence of the Model Surfaces with Different Hydrophilicity Degree. Proceedings of 19th Conference on Biomaterials, 2005, P 516.

9) E.A. Remeeva, I.B. Rozanova, V.M. Elinson, V.I. Sevastianov, Platelet adhesion on nanostructured surfaces (NSS) formed by ion-plasma methods. The International Journal of Artificial Organs, 2005, 28, № 9, P. 89.

10) Е.А. Ремеева, И.Б. Розанова, В.М. Елинсон, В.И. Севастьянов, Влияние способа формирования углеродного покрытия на физико-химические и биологические свойства полиэтилентерефталата. Перспективные материалы, 2006, № 2, с. 56-62.

11) Е.А. Ремеева, В.М. Елинсон, И.Б. Розанова, В.И. Севастьянов, Исследование адсорбции белка, адгезии тромбоцитов и роста фибробластов на поверхности ПТФЭ, модифицированного ионно-плазменной обработкой с последующим нанесением углеродных пленок. Материалы 4 Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Экспо-биохим-технологии, 2007, c. 119-121.

12) Е.А. Ремеева, И.Б. Розанова, В.М. Елинсон, В.И. Севастьянов, Влияние физико химических свойств наноструктурированной поверхности политетрафторэтилена на характер его взаимодействия с сывороточным альбумином и тромбоцитами человека.

Перспективные материалы, 2007, № 5, c. 56-64.

13) E.A. Remeeva, A.E. Efimov, V.M. Elinson, E.A. Nemets, A.G. Tonevitsky, V.I.

Sevastianov, Nanoscale modification of synthetic and biological polymer surface via ion-plasma treatment and vacuum ultraviolet irradiation. Материалы 9-го Российско-Китайского Симпозиума «Новые материалы и технологии», 2007, с. 493-497.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.