авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 ||

Механизмы инициации транскрипции у мезофильных и термофильных бактерий

-- [ Страница 2 ] --

выше, раздел 3), который также может вносить вклад в стабилизацию связывания РНКП с промотором. Для анализа возможной роли GGGA-элемента в стабилизации промоторных комплексов мы сравнили стабильность промоторных комплексов РНКП E. coli и T. aquaticus на двух вариантах промотора sTap2, содержащих - элемент и различающихся наличием или отсутствием GGGA-элемента (sTap2+35 и sTap2+35-GGGA). Измерение кинетики диссоциации промоторных комплексов РНКП E. coli в присутствии гепарина (конкурентного ингибитора связывания ДНК) показало, что наличие GGGA-элемента обеспечивает значительную стабилизацию комплексов. Было показано, что замена GGGA на CCCT приводит к уменьшению времени полужизни комплексов примерно в 100 раз, с 60 минут до 40 секунд (Рис.

4.5). Удаление GGGA из промотора также приводит к значительному уменьшению стабильности промоторных комплексов РНКП T. aquaticus (данные не приведены).

Таким образом, проведенные нами эксперименты позволили установить, что GGGA-элемент играет важную роль в инициации транскрипции РНКП разных бактерий, за счет усиления контактов РНКП с промотором.

Стоит отметить, что некоторые промоторы E. coli (в частности, промоторы рибосомальной РНК, генов биосинтеза аминокислот и нуклеотидов) содержат справа от -10 элемента, в районе, соответствующем GGGA-элементу, C/G-богатый участок (с преобладанием С в нематричной цепи ДНК), который получил название дискриминатора (Travers, 1980). Ранее было показано, что наличие дискриминатора определяет низкую стабильность комплексов, образованных РНКП на таких промоторах (Gourse et al., 1998). Полученные нами данные позволяют утверждать, Рис. 4.5. Роль GGGA-элемента в стабилизации промоторных комплексов РНКП. Показана кинетика диссоциации промоторных комплексов РНКП E. coli на промоторах sTap2+35 (содержит GGGA) и sTap2+35-GGGA (не содержит GGGA) в присутствии гепарина. Активность РНКП измеряли по синтезу полноразмерной РНК через увеличивающиеся промежутки времени после добавления гепарина что нестабильность промоторных комплексов в данном случае определяется неоптимальной последовательностью ДНК в участке дискриминатора и отсутствием стабилизирующих контактов района 1.2 -субъединицы с нематричной цепью ДНК. Аналогичный вывод был сделан недавно при исследовании механизмов взаимодействий РНКП E. coli с промоторами рибосомальной РНК (Haugen et al., 2006;

Haugen et al., 2008b).

4.3.2. Роль контактов кор-фермента РНКП с ДНК в стабилизации промоторных комплексов Неспецифические контакты кор-фермента РНКП с различными участками промотора, вероятно, также играют важную роль в стабилизации промоторных комплексов. В то же время, экспериментальные данные о роли данных контактов достаточно фрагментарны. Было показано, что делеция домена jaw («челюсть») субъединицы и мутации в домене 2 -субъединицы в кор-ферменте РНКП E. coli приводят к заметному снижению стабильности промоторных комплексов (Ederth et al., 2002;

Martin et al., 1992;

Nechaev et al., 2000). Эти домены, вероятно, контактируют с промоторной ДНК спереди по ходу транскрипции (см. Рис. 1.5 и Рис. 2.1). Кроме того, было обнаружено, что РНКП B. subtilis, которая образует нестабильные промоторные комплексы, имеет более короткий футпринт спереди от стартовой точки транскрипции, чем РНКП E. coli (Artsimovitch et al., 2000). Это позволяет предположить, что в стабилизацию промоторных комплексов основной вклад вносят контакты кор-фермента с ДНК спереди по ходу транскрипции.

Для поверки этой гипотезы мы исследовали мутации в двух участках кор фермента РНКП, которые, согласно данным рентгеноструктурного анализа и молекулярного моделирования, контактируют с ДНК спереди от активного центра РНКП (Рис. 2.1). Нами были изучены следующие мутации в кор-ферменте РНКП E.

coli: (1) инсерция восьми аминокислот (His6GlnLeu) в домене clamp («зажим») субъединицы (), затрагивающая петлю, которая контактирует с передним дуплексом ДНК в +10, +11 положениях относительно активного центра (Рис. 2.1);

(2) точечные замены остатка Arg339 на Lys, Ala и Glu в участке switch2 субъединицы;

этот остаток контактирует с 5-фосфатом +2 нуклеотида в матричной цепи ДНК в элонгационном комплексе (Рис. 2.1;

см. также ниже, Рис. 5.1). Функции данных участков во взаимодействиях РНКП с промоторами ранее не исследовались.

Анализ транскрипции РНКП на промоторе Т7А1 показал, что инсерция в домене clamp приводит к значительной дестабилизизации промоторных комплексов (Рис. 4.6 А). Транскрипционные свойства РНКП с заменами остатка Arg339 в районе switch2 -субъединицы были исследованы на промоторе PR (Рис. 4.6 Б).

Было установлено, что замены Arg339 на Glu и Ala в сильно снижают стабильность промоторного комплекса (время полужизни уменьшается более чем в 100 раз), а замена на Lys имеет более слабый эффект (время полужизни уменьшается в 20 раз).

Полученные данные показывают, что район switch2, вероятно, напрямую контактирует с ДНК в промоторном комплексе. Более сильный эффект первых двух замен, по-видимому, связан с тем, что они полностью нарушают контакты района switch2 с ДНК, в то время как в случае третьей замены, оставляющей положительно заряженную аминокислоту в позиции 339, контакты с ДНК сохраняются. В целом, полученные данные указывают на важную роль контактов кор-фермента РНКП с передним дуплексом ДНК в стабилизации промоторных комплексов.

Рис. 4.6. Влияние мутаций в -субъединице РНКП E. coli на стабильность промоторных комплексов. (А) Влияние инсерции 6 остатков His в домене clamp -субъединицы () на стабильность комплексов РНКП на Т7А1-промоторе. Активность РНКП измеряли в отсутствие гепарина или через 5 минут после добавления гепарина (50 мкг/мл). Показан РНК-продукт длиной 20 нт. (Б) Влияние замен остатка Arg339 в районе switch2 на стабильность комплексов РНКП на PR-промоторе. К промоторным комплексам добавляли гепарин и измеряли активность РНКП через увеличивающиеся промежутки времени. Активность показана в процентах от активности в отсутствие гепраина 4.3.3. Различия между РНКП E. coli, T. aquaticus и D. radiodurans Следующей задачей нашей работы был поиск структурных элементов РНКП, которые могли бы определять межвидовые различия в стабильности промоторных комплексов. В качестве модельных ферментов были использованы РНКП E. coli, D.

radiodurans и T. aquaticus. Было установлено, что РНКП T. aquaticus образует гораздо менее стабильные промоторные комплексы, чем РНКП E. coli. Так, время полужизни промоторных комплексов T. aquaticus РНКП на Т7А1 промоторе составляет менее 1 минуты, по сравнению с ~60 минутами для РНКП E. coli (Рис.

4.7 А). Аналогичный результат был получен при исследовании транскрипции РНКП T. aquaticus на других промоторах, в том числе на природных промоторах данной РНКП (dnaK) и на синтетических промоторах, полученных на основе аптамеров (sTap2). Данная особенность не связана с термофильной адаптацией, так как РНКП мезофильной бактерии D. radiodurans также образует нестабильные промоторные комплексы. Вероятно, низкая стабильность промоторных комплексов РНКП T.

aquaticus и D. radiodurans может быть связана с особенностями регуляции транскрипции у этих бактерий.

Чтобы установить, какой из компонентов холофермента – кор-фермент или субъединица, – определяет обнаруженные различия в стабильности промоторных комплексов, мы исследовали гибридные холоферменты, состоящие из кор фермента E. coli и -субъединиц T. aquaticus или D. radiodurans. Было установлено, что промоторные комплексы гибридных РНКП обладают промежуточной стабильностью (Рис. 4.7 А). Таким образом, различия в стабильности комплексов РНКП E. coli, D. radiodurans и T. aquaticus определяются как -субъединицей, так и кор-ферментом РНКП. Различия, определяемые кор-ферментом РНКП, могут быть Рис. 4.7. Стабильность комплексов РНКП E. coli и T. aquaticus на Т7А1-промоторе. (А) Кинетика диссоциации промоторных комплексов РНКП E. coli, T. aquaticus и гибридной РНКП, состоящей из кор-фермента E. coli и А-субъединицы T. aquaticus (при температурах 37, 60 и °С, соответственно). К преформированным комплексам РНКП с Т7А1-промотором добавляли гепарин (до 10 мкг/мл) и измеряли активность РНКП через увеличивающиеся промежутки времени. (Б) Стабильность промоторных комплексов РНКП E. coli, содержащей различные субъединицы (70, А, ЕЕТ, ЕТЕ и ТЕЕ), в присутствии гепарина (при температуре 45 °С). К промоторным комплексам добавляли гепарин в увеличивающихся концентрациях, образцы инкубировали 10 минут и измеряли активность РНКП. Уровень активности показан в процентах от активности в отсутствие гепарина связаны с особенностями структуры районов clamp и switch2 -субъединицы, контактирующих с ДНК спереди по ходу транскрипции (см выше, раздел 4.3.2).

Действительно, было установлено, что, по сравнению с РНКП E. coli, РНКП T.

aquaticus в промоторных комплексах имеет укороченный футпринт спереди по ходу транскрипции (Kuznedelov et al., 2003).

Для выявления районов -субъединицы, участвующих в стабилизации промоторных комплексов и определяющих различия в стабильности комплексов между РНКП E. coli и T. aquaticus, мы исследовали холоферменты, состоящие из кор-фермента E. coli и мозаичных -субъединиц ЕЕТ, ЕТЕ и ТЕЕ (см. выше, раздел 4.2.2). В результате было установлено, что сниженной стабильностью промоторных комплексов обладает только РНКП, содержащая ТЕЕ (Рис. 4.7 Б), в то время как остальные две РНКП не отличаются по стабильности от холофермента E. coli. субъединица ТЕЕ содержит N-концевую часть -субъединицы T. aquaticus, включающую консервативные районы 1.1 и 1.2. Таким образом, межвидовые различия в стабильности промоторных комплексов могут определяться различиями в структуре данных районов -субъединицы.

Стоит отметить, что ранее было показано, что на стабильность промоторных комплексов влияют мутации консервативных аминокислот в районе 2 (Fenton et al., 2000), а также мутации в районах 1.1 и 1.2 70-субъединицы РНКП E. coli (Vuthoori et al., 2001). Эффект мутаций в районе 2 был объяснен изменением контактов с - элементом и нарушением плавления ДНК, в то время как возможная функциональная роль районов 1.1 и 1.2 в стабилизации промоторных комплексов оставалась неясной.

Район 1.1 в холоферменте РНКП располагается в ДНК-связывающем канале спереди по ходу транскрипции (Рис. 2.1) (Mekler et al., 2002;

Vassylyev et al., 2002).

Можно предположить, что этот район влияет на стабильность комплексов за счет конкуренции с передним дуплексом ДНК при образовании промоторного комплекса. Роль района 1.2 в стабилизации комплексов может объясняться его контактами с кор-ферментом РНКП, а также с промоторной ДНК в области GGGA элемента (см. Рис. 2.1). Действительно, как было установлено в нашей работе, контакты района 1.2 -субъединицы с GGGA обеспечивают значительную стабилизацию промоторных комплексов (раздел 4.3.1). Различия в структуре контактов района 1.2 с ДНК, вероятно, могут определять различия в стабильности промоторных комплексов РНКП разных бактерий.

Резюме. РНКП E. coli, D. radiodurans и T. aquaticus различаются по температуре открывания промоторов и стабильности промоторных комплексов.

Данные различия не связаны с термофильной адаптацией. Для поиска функционально-важных участков РНКП разработан новый методический подход, который заключается в анализе химерных ферментов, содержащих последовательности, взятые от разных бактерий. Показано, что различия в температуре открывания промоторов разными РНКП определяются неконсервативными аминокислотами консервативного района 2 -субъединицы и N-концевой частью -субъединицы;

различия в стабильности промоторных комплексов определяются N-концевой частью -субъединицы, а также кор ферментом РНКП. Важную роль в стабилизации промоторных комплексов играют специфические контакты -субъединицы с участком ДНК правее -10 элемента (в области GGGA-элемента), а также неспецифические контакты кор-фермента с ДНК спереди по ходу транскрипции.

5. Механизм инициации синтеза РНК 5.1. Роль -субъединицы в инициации синтеза РНК Важнейшим отличием РНКП от ДНК-полимераз является способность к инициации синтеза РНК de novo, то есть в отсутствие затравки. Одной из главных задач нашей работы была расшифровка механизма беззатравочной инициации синтеза РНК в активном центре РНКП. Анализ трехмерной структуры холофермента РНКП T. thermophilus показал, что в непосредственной близости от активного центра фермента располагается петля, образованная районом 3.2 субъединицы (Рис. 5.1). На основании этого было предположено, что данный район может принимать непосредственное участие в инициации синтеза РНК (Murakami et al., 2002b;

Vassylyev et al., 2002). Для проверки этого предположения мы получили и исследовали 70-субъединицу E. coli с делецией аминокислот 513- (DDEDSHL) в центральной части петли, образованной районом 3.2 (Рис. 5.1).

Активность РНКП, содержащей мутантную -субъединицу, была исследована на промоторе Т7А1, а также на варианте данного промотора, содержащем консенсусные -10 и -35 элементы (Т7А1cons). Было показано, что РНКП дикого типа активна на обоих промоторах, при этом в случае Т7А1cons образуется значительно большее количество абортивных продуктов (Рис. 5.3, дор. 1 и 2). В то же время, РНКП, содержащая 513-519, практически неактивна на обеих матрицах (Рис. 5.3, дор. 5 и 6). Контрольные эксперименты показали, что мутация не влияет на открывание промотора (данные не приведены), и, следовательно, Рис. 5.1. Модель активного центра РНКП в процессе инициации (на основе модели промоторного комплекса РНКП T. thermophilus, (Artsimovitch et al., 2004)). Два иона Mg2+ в активном центре изображены сферами алого цвета, темно-красным показана F-спираль субъединицы. Матричная цепь ДНК – темно-синяя, 3’-инициаторный нуклеотид в "i+1"-сайте активного центра – зеленый, 5’-инициаторный нуклеотид в "i"-сайте – голубой. -субъединица изображена желтым, район 3.2 показан в виде объемной атомной модели. Снизу изображен район switch2 -субъединицы;

белым показана структура данного района в кор-ферменте (Zhang et al., 1999), красным – в холоферменте РНКП. Остаток Arg339 (нумерация E. coli) контактирует с фосфатом в +2 положении матричной цепи ДНК. Синтезируемая молекула РНК показана красным отсутствие активности у мутантной РНКП должно объясняться дефектами непосредственно в инициации синтеза РНК.

Для проверки этой гипотезы мы измерили активность РНКП с делецией в районе 3.2 в присутствии динуклеотидной затравки, соответствующей стартовой точке транскрипции. Наличие затравки значительно стимулировало активность мутантной РНКП (Рис. 5.3, дор. 7 и 8). Таким образом, эффект мутации должен быть связан с нарушением связывания инициаторных субстратов и образования первой фосфодиэфирной связи в ходе инициации.

Для анализа влияний делеции в районе 3.2 на связывание субстратов мы измерили кажущиеся КМ для инициаторных нуклеотидов в реакции динуклеотидного синтеза на Т7А1 промоторе (ATP+UTPpppApU). Было установлено, что делеция практически не влияет на связывание 5’-инициаторного нуклеотида (АТР) (КМ 450 мкМ по сравнению с 470 мкМ для РНКП дикого типа, Рис. 5.2). Это согласуется с имеющимися в литературе данными о том, что сайт связывания 5’-инициаторного нуклеотида полностью сформирован кор-ферментом РНКП (Naryshkina et al., 2001). В то же время, делеция района 3.2 приводит к существенному, почти 100-кратному увеличению КМ для 3’-инициаторного нуклеотида (UTP) (КМ 250 мкМ по сравнению с 3,3 мкМ для РНКП дикого типа, Рис. 5.2). Таким образом, район 3.2 -субъединицы играет важную роль в инициации синтеза РНК в активном центре РНКП и стимулирует связывание 3' инициаторного нуклеотида.

Рис. 5.3. Транскрипционные свойства РНКП E. coli, содержащей 70-субъединицу с делецией 513-519 в районе 3.2. Активность РНКП дикого типа (WT) и РНКП с делецией 513-519 в районе 3.2 измеряли на промоторе Т7А1 дикого типа (W) и на промоторе Т7А1cons (С). Транскрипцию прово-дили в отсутствие (дор. 1,2,5,6), либо в присутствии динуклеотидной затравки (СрА) (дор. 3,4,7,8). 5’ концевая последовательность синтезируемой РНК показана под рисунком. Справа приведены длины абортивных РНК-продуктов, образующихся в процессе инициации, RO – полноразмерная РНК Анализ трехмерной структуры холофермента РНКП T. thermophilus и существующих моделей промоторного комплекса показывает, что район 3.2 субъединицы, хотя и находится поблизости, но непосредственно не контактирует с 3’-инициаторным нуклеотидом в активном центре РНКП (Рис. 5.1). Таким образом, данный район, вероятно, влияет на структуру активного центра по аллостерическому механизму, способствуя формированию сайта связывания инициаторных нуклеотидов.

Рис. 5.2. Влияние делеции в районе 3.2 70 субъединицы на связывание инициаторных нуклеотидов. КМ для инициаторных субстратов для РНКП дикого типа (WT) и РНКП с делецией 513-519 в районе 3.2 -субъединицы () были измерены в реакции динуклеотидного синтеза на Т7А1-промоторе (схема реакции приведена сверху рисунка). Концентрацию одного из субстратов в ходе каждого эксперимента сохраняли постоянной (1000 мкМ), а концентрацию второго варьировали от 0,1 до 6000 мкМ. По оси ординат показана скорость реакции 5.2. Роль района switch2 -субъединицы в инициации синтеза РНК Район 3.2 -субъединицы контактирует с участком switch2 -субъединицы РНКП, который, в свою очередь, располагается поблизости от матричной цепи ДНК (Рис. 5.1). Как было показано в нашей работе, контакты данного района с ДНК важны для стабилизации промоторного комплекса (см выше, раздел 4.3.2).

Рис. 5.4. Активность РНКП E. coli с заменами остатка Arg339 в -субъединице. На рисунке показаны полноразмерные РНК-продукты, синтезируемые на Т7А1-промоторе РНКП дикого типа (R) и РНКП с заменами Arg339 на Glu, Ala и Lys. Реакцию транскрипции проводили в отсутствие (дорожки 1-4), либо в присутствии динуклеотидной затравки (дор. 5-8) Сравнение имеющихся данных о структуре РНКП показывает, что район switch имеет разную конформацию в кор-ферменте и в холоферменте РНКП, что, вероятно, объясняется связыванием -субъединицы и контактами switch2 с районом 3.2 (Рис. 5.1) (Vassylyev et al., 2002;

Zhang et al., 1999). Это позволяет предположить, что -субъединица влияет на структуру активного центра и на связывание нуклеотидов за счет изменения контактов района switch2 с матричной цепью ДНК, что может как непосредственно влиять на связывание субстратов, так и изменять конформацию других участков активного центра, задействованных в катализе (в частности, F-спирали, Рис. 5.1).

Для проверки этого предположения мы исследовали транскрипционные свойства РНКП E. coli с мутациями остатка Arg339 в районе switch2, который контактирует с фосфатом в +2 положении матричной цепи ДНК (Рис. 5.1). Было показано, что РНКП с заменами Arg399 на Glu или Ala не способны к синтезу РНК в отсутствие затравки, в то время как РНКП, содержащая в данном положении Lys, не отличается от РНКП дикого типа по эффективности транскрипции (Рис. 5.4, дор.

1-4). Наличие динуклеотидной затравки значительно стимулирует активность РНКП с заменами Arg339 на Glu и Ala (дор. 6 и 7). Следовательно, эти две мутации, как и делеция района 3.2 -субъединицы, нарушают образование первой фосфодиэфирной связи РНК, что подтверждает роль района switch2 субъединицы в передаче конформационных изменений от -субъединицы в активный центр РНКП.

Следует отметить, что на стадии элонгации транскрипции роль, аналогичную району 3.2 -субъединицы, может выполнять РНК-транскрипт, который в районе 5 8 нуклеотидов от 3’-конца располагается в том же месте, что и район 3.2 в холоферменте РНКП. Вероятно, контакты синтезируемой РНК с районом switch могут вызывать аналогичные конформационные изменения в активном центре РНКП, необходимые для связывания нуклеотидных субстратов.

Резюме. Сигма-субъединица влияет на структуру активного центра РНКП на стадии инициации и аллостерически способствует связыванию 3’-инициаторного нуклеотида. Район switch2 -субъединицы, взаимодействующий с районом 3.2 и с матричной цепью ДНК в области активного центра, также важен для образования первой фосфодиэфирной связи РНК и, вероятно, участвует в передаче аллостерического сигнала от -субъединицы в активный центр РНКП.

6. Механизм ухода РНКП с промотора 6.1. Роль -субъединицы в уходе РНКП с промотора В процессе ухода с промотора при переходе к элонгации транскрипции РНКП должна разорвать специфические контакты с ДНК, которые образовались на стадии инициации. Наличие этих контактов значительно затрудняет переход к элонгации, результатом чего является абортивная инициация – диссоциация коротких РНК продуктов без отрыва РНКП от промотора (Hsu, 2002;

McClure, 1985). До настоящего времени механизм абортивной инициации и механизмы структурных перестроек РНКП, происходящих при переходе к элонгации, остаются неизвестны.

Молекулярное моделирование показывает, что положение синтезируемого РНК-транскрипта в инициаторном комплексе перекрывается с положением района 3.2 -субъединицы в холоферменте РНКП (Рис. 5.1). Это позволяет предположить, что столкновение синтезируемой РНК с данным районом может, с одной стороны, являться причиной абортивной инициации, а с другой – способствовать уходу РНКП с промотора, за счет выталкивания -субъединицы из главного канала РНКП. Для проверки данной гипотезы мы исследовали процесс перехода к элонгации РНКП E. coli, содержащей 70-субъединицу с делецией района 3.2 (513 519). Для анализа синтеза абортивных продуктов различной длины был использован промотор Т7А1cons (раздел 5.1). Данный промотор характеризуется очень высоким уровнем абортивного синтеза, что, вероятно, объясняется сильными специфическими взаимодействиями РНКП с консенсусными промоторными элементами (см. раздел 6.2).

Было установлено, что РНКП, содержащая -субъединицу с делецией района 3.2, синтезирует на промоторах T7A1 и T7A1cons заметно меньшее количество полноразмерных РНК-транскриптов, чем РНКП дикого типа (Рис. 5.3 и Рис. 6.1 А), что свидетельствует о нарушении ухода РНКП с промотора. Мутантная РНКП также синтезирует на промоторе Т7А1cons значительно меньшее количество коротких абортивных продуктов длиной 5-7 нуклеотидов, чем РНКП дикого типа (Рис. 5.3 и Рис. 6.1 Б). Следовательно, район 3.2 в ферменте дикого типа стимулирует диссоциацию коротких РНК-транскриптов, по-видимому, за счет блокирования канала выхода РНК. В то же время, мутантная РНКП с высокой эффективностью синтезирует более длинные абортивные продукты (длиной 10- нуклеотидов), количество которых не отличается от РНКП дикого типа (Рис. 5.3).

Анализ соотношения абортивных транскриптов длиной 10-16 нуклеотидов и полноразмерной РНК показывает, что у данной РНКП значительно снижена эффективность перехода к элонгации транскрипции (Рис. 6.1 Б). Таким образом, район 3.2 играет важную роль в уходе РНКП с промотора.

Чтобы установить, взаимодействует ли район 3.2 -субъединицы с 5’-концом синтезируемой РНК в активном центре РНКП, мы провели эксперименты по образованию ковалентных сшивок РНКП с модифицированным аналогом 5’ инициаторного нуклеотида, содержащим реакционно-способную алкилирующую группу в 5’-положении. Было установлено, что в случае холофермента дикого типа 70-субъединица образует сшивку с модифицированным нуклеотидом (Рис. 6.2, дор.

2). В то же время, сшивка не образуется в случае с делецией района 3.2 (Рис. 6.2, дор. 3). Полученные данные подтверждают, что район 3.2 находится в непосредственной близости от 5’-конца РНК-транскрипта в ходе инициации.

Рис. 6.1. Влияние делеции в 513-519 в районе 3.2 70 на эффективность ухода РНКП E. coli с промотора. (А) Эффективность синтеза полноразмерной РНК на промоторах Т7А1 и Т7А1cons РНКП дикого типа (WT) и РНКП с делецией 513-519. Активность измерена в присутствии динуклеотидной затравки (данные из Рис. 5.3, дор. 3,4,7,8). Активность показана в процентах от активности РНКП дикого типа на промоторе Т7А1. (Б) Эффективность синтеза абортивных продуктов различной длины на промоторе Т7А1cons РНКП дикого типа и РНКП с делецией в 513-519. По оси ординат показано отношение количества каждого из РНК-продуктов к количеству полноразмерной РНК (анализ данных из Рис. 5.3) Рис. 6.2. Ковалентная сшивка -субъединицы с 5’-концом РНК транскрипта в процессе инициации транскрипции. Показаны результаты сшивки 5’-инициаторного нуклеотида с РНКП E. coli дикого типа (WT) и РНКП с делецией 513-519. Сшивку проводили в комплексе РНКП с Т7А1-промотором, после чего добавляли радиоактивно-меченый 3’-инициаторный нуклеотид (UTP).

Положение модифицированных субъединиц указано слева Итак, конкуренция растущей РНК с районом 3.2 в ходе инициации является необходимым условием для эффективного перехода к элонгации транскрипции.

Вероятно, вытеснение района 3.2 из главного канала РНКП приводит к ослаблению контактов -субъединицы с кор-ферментом РНКП, что способствует диссоциации -субъединицы и разрыву контактов РНКП с промотором в ходе инициации.

6.2. Стабильность промоторных комплексов и эффективность перехода к элонгации Так как переход от инициации к элонгации транскрипции сопровождается разрывом контактов РНКП с промотором, эффективность ухода с промотора должна определяться силой данных контактов. Ранее было установлено, что интенсивность абортивной инициации зависит от структуры промотора (Hsu, 2002;

Hsu, 2008), однако, систематических исследований взаимосвязи между наличием в промоторе разных типов консенсусных элементов и эффективностью перехода к Рис. 6.3. Синтез абортивных и элонгации не проводилось.

полноразмерных транскриптов Полученные нами данные на промоторах Т7А1 и Т7А1cons показывают, что усиление РНКП E. coli и T. aquaticus.

контактов РНКП с Положение абортивных и промотором при введении в полноразмерного (RO) РНК его состав консенсусных продуктов указано слева от рисунка. Реакцию транскрипции элементов затрудняет переход проводили при 37 °С для РНКП E.

к элонгации. Так, на coli и при 60 °С для РНКП T.

промоторе Т7А1cons, aquaticus содержащем консенсусные - и -35 элементы, РНКП E. coli синтезирует гораздо большее количество абортивных продуктов различной длины и меньшее количество полноразмерной РНК, чем на T7A1-промоторе дикого типа, содержащем неконсенсусные элементы (Рис. 6.3, дор. 1 и 2).

Аналогичное явление наблюдается при сравнении промоторов sTap2+35 и sTap2+35-GGGA, различающихся наличием GGGA-элемента (см. выше, Рис. 3.3 Б).

Измерение стабильности промоторных комплексов показывает, что в случае промоторов, характеризующихся высоким уровнем абортивного синтеза, РНКП E.

coli образует гораздо более стабильные комплексы (Рис. 4.5, данные не приведены).

В случае РНКП T. aquaticus, как и в случае РНКП E. coli, введение в промотор консенсусных элементов также приводит к стимуляции абортивного синтеза и увеличению стабильности комплексов (Рис. 3.3 Б и Рис. 6.3). В то же время, эффективность перехода к элонгации РНКП T. aquaticus оказывается заметно выше (ср. количество абортивных РНК на дор. 2 и 4 на Рис. 6.3). РНКП D. radiodurans также характеризуется более высокой эффективностью перехода к элонгации, чем РНКП E. coli (данные не приведены). Вероятно, это связано с тем, что промоторные комплексы РНКП T. aquaticus и D. radiodurans менее стабильны, чем комплексы РНКП E. coli.

В целом, результаты работы позволяют утверждать, что усиление контактов РНКП с промотором, за счет введения в него консенсусных элементов, приводит к увеличению стабильности промоторного комплекса и, как следствие, к снижению эффективности перехода к элонгации.

Резюме. Разрыв контактов РНКП с промотором является необходимым условием для перехода к элонгации транскрипции. Конкуренция синтезируемой РНК с районом 3.2 -субъединицы способствует уходу РНКП с промотора, вероятно, за счет ослабления контактов -субъединицы с кор-ферментом РНКП.

Эффективность перехода к элонгации транскрипции на разных промоторах определяется силой взаимодействий РНКП с промотором и уровнем стабильности промоторных комплексов.

7. Сравнение структуры активного центра РНКП мезофильных и термофильных бактерий 7.1. Различия в скорости синтеза РНК у мезофилов и термофилов Известно, что ферменты термофилов обычно проявляют сниженную активность по сравнению с гомологичными ферментами мезофилов при одних и тех же температурах. Это, вероятно, является следствием увеличения жесткости структуры белка, необходимого для повышения термостабильности (Fields, 2001;

Golding and Dean, 1998). Таким образом, сравнение каталитических характеристик РНКП мезофилов и термофилов открывает возможность для поиска функционально-важных участков РНКП, задействованных в катализе. Однако, до настоящего времени детальных исследований по сравнению каталитических свойств РНКП родственных термофильных и мезофильных бактерий не проводилось.

Анализ транскрипционных свойств РНКП E. coli, D. radiodurans, T. aquaticus и T. thermophilus показал, что большинство их различий РНКП в ходе инициации транскрипции (различия в температуре плавления ДНК, стабильности промоторных комплексов и эффективности перехода к элонгации) не связаны с разной температурной адаптацией данных бактерий (разделы 4, 5, 6). В частности, несмотря на различия в температурной адаптации, РНКП D. radiodurans и T.

aquaticus проявляют сходную холодочувствительность в открывании промоторов (раздел 4.2.1). Однако, температурные профили активности данных РНКП значительно различаются (Рис. 7.1). В то время как РНКП мезофильных бактерий E.

coli и D. radiodurans проявляют максимальную активность при 37-45 °С, РНКП термофильных бактерий T. aquaticus и T. thermophilus оказываются практически неактивны при этих температурах, оптимум их активности составляет 60-70 °С.

Столь сильные различия не могут быть связаны только с холодочувствительностью открывания промоторов, а должны объясняться особенностями каталитических свойств РНКП, которые проявляются на всех стадиях синтеза РНК и являются следствием термофильной адаптации данных бактерий.

Для точного измерения скорости катализа различных РНКП мы использовали минимальную матрицу (Рис. 1.4 А), которая позволяет исследовать удлинение РНК транскрипта на один нуклеотид, происходящее в ходе единичного каталитического цикла РНКП. Было показано, что РНКП D. radiodurans присоединяет нуклеотид с Рис. 7.1. Активность РНКП E. coli (Eco), D. radiodurans (Dra) и T. aquaticus (Taq) при различных температурах.

Активность РНКП определяли по синтезу полноразмерной РНК на фрагменте ДНК, содержащем Т7А1-промотор. Для каждой РНКП, активность приведена в процентах от максимальной активности в температурном оптимуме Рис. 7.2. Скорость синтеза РНК различными РНКП. Для определения скорости измеряли кинетику присоединения нуклеотидов на минимальной матрице в реакции: 8 нт РНК + UTP9 нт РНК. По оси абсцисс отложено время, по оси ординат – % РНК-продукта длиной 9 нт. Taq – РНКП T. aquaticus, Dra – РНКП D. radiodurans, Dra F – РНКП T. aquaticus заменой участка F-петли на последовательность D. radiodurans, Dra Jaw – РНКП с заменой домена jaw, Dra G – РНКП с заменой G-петли, F – РНКП T. aquaticus с делецией F-петли. Измерения проводили при [UTP]= мМ и температуре 20 °С на аппарате по измерению быстрой кинетики гораздо большей скоростью, чем РНКП T. aquaticus (Рис. 7.2): время, необходимое для удлинения половины РНК при насыщающей концентрации UTP, составляет примерно 10 миллисекунд для РНКП D. radiodurans и 3 с для РНКП T. aquaticus.

Различия в скорости катализа оказываются особенно заметны при низких температурах (20 °С и ниже). Следует подчеркнуть, что столь заметная разница в скоростях синтеза РНК является практически единственным различием в транскрипционных свойствах РНКП T. aquaticus и D. radiodurans, выявленным в наших экспериментах.

7.2. Структурные элементы РНКП, определяющие скорость синтеза РНК Различия в скоростях катализа РНКП T. aquaticus и D. radiodurans были использованы нами для поиска функционально-важных районов активного центра, участвующих в катализе. Проведенный недавно анализ трехмерной структуры элонгационного комплекса РНКП T. thermophilus позволил предположить, какие структурные элементы фермента могут быть задействованы в синтезе РНК (Рис.

7.3) (Vassylyev et al., 2007a;

Vassylyev et al., 2007b). Собственно реакция образования фосфодиэфирной связи катализируется двумя ионами магния, связанными в активном центре. Участок связывания ионов магния (NADFDGD мотив -субъединицы) абсолютно консервативен в РНКП всех организмов. В связывании нуклеотида в активном центре РНКП в ходе катализа главную роль играют участки G-петли и F-спирали -субъединицы (показаны на Рис. 7. красным и зеленым, соответственно). Изменение структуры данных участков в ходе Рис. 7.3. Структурные элементы активного центра РНКП, влияющие на скорость присоединения нуклеотидов. На рисунке показана структура активного центра РНКП T.

thermophilus в закрытой конформации в процессе присоединения нуклеотида (согласно данным (Vassylyev et al., 2007b). Два иона магния в активном центре РНКП показаны сферами красного цвета, матричная ДНК окрашена светло-коричневым, присоединяемый нуклеотид (АТР) – черным. F-спираль показана фиолетовым цветом, G-петля – зеленым, F-петля – красным, участок домена jaw – синим. Остатки аминокислот в F-петле, различающиеся в РНКП T. aquaticus и D.

radiodurans, показаны желтым. Остаток Gln1046 (который у D. radiodurans заменен на Ala) находится поблизости от остатка Val1246 в G-петле катализа приводит к формированию «закрытой» конформации активного центра, обеспечивающей правильную ориентацию нуклеотида (Рис. 7.3). Мутации в G петле и F-спирали приводят к значительному снижению скорости катализа (Temiakov et al., 2005;

Toulokhonov et al., 2007). С G-петлей контактирует домен jaw -субъединицы (его фрагмент показан на Рис. 7.3 синим цветом), который может влиять на конформационную подвижность G-петли. Делеция домена jaw в РНКП E.

coli снижает скорость элонгации транскрипции (Ederth et al., 2002). Рядом с G петлей и F-спиралью располагается участок РНКП, образованный консервативным районом F -субъединицы, причем центральный фрагмент данного участка, F петля, контактирует с G-петлей в закрытой конформации (Рис. 7.3). Функции F петли в транскрипции ранее исследованы не были.

Мы предположили, что различия в скорости синтеза РНК РНКП T. aquaticus и D. radiodurans могут определяться различиями в структуре перечисленных выше элементов активного центра. Поскольку последовательности участков связывания магния и F-спирали идентичны у T. aquaticus и D. radiodurans, основной вклад в различия в скорости данных РНКП могут вносить различия в участках G-петли ( аминокислотные замены), F-петли (9 замен) и jaw-домена (36 замен) субъединицы. Для анализа функциональной роли данных участков были получены химерные варианты РНКП T. aquaticus, в которых эти участки были заменены на соответствующие последовательности D. radiodurans.

Было показано, что все полученные химерные варианты РНКП являются активными, обладают высокой термостабильностью и не отличаются от РНКП T.

aquaticus на стадиях узнавания промоторов и инициации транскрипции (данные не приведены). В то же время, измерение скорости присоединения нуклеотидов химерными РНКП выявило значительные различия в скорости катализа (Рис. 7.2).

Было установлено, что замена G-петли (аминокислотные остатки 1246-1254 в РНКП T. aquaticus) практически не оказывает влияния на скорость катализа. Замена домена jaw (остатки 1267-1325) приводит к незначительному ускорению синтеза РНК (примерно в 2-3 раза, Рис. 7.2). Наибольший эффект оказывает замена F-петли (остатки 1039-1074), которая приводит к ускорению катализа РНКП T. aquaticus примерно в 50 раз (Рис. 7.2). Для дальнейшего анализа роли F-петли в катализе был получен мутантный вариант РНКП T. aquaticus с делецией центрального фрагмента F-петли. Было показано, что эта делеция приводит к сильному снижению скорости синтеза РНК, более чем в 100 раз (Рис. 7.2).

Полученные данные показывают, что участок F-петли играет важнейшую роль в катализе присоединения нуклеотидов РНКП. Вероятно, что F-петля способствует образованию закрытой конформации активного центра РНКП в ходе катализа, за счет контактов с G-петлей (Рис. 7.3 и Рис. 7.4). Замены неконсервативных аминокислотных остатков, различающихся в РНКП T. aquaticus и D. radiodurans, могут либо непосредственно влиять на контакты с G-петлей, либо изменять структуру и конформационную подвижность F-петли. Таким образом, скорость работы активного центра РНКП аллостерически регулируется элементами, не принимающими непосредственного участия в связывании нуклеотидов и в катализе образования фосфодиэфирной связи. Изменения в структуре данных участков приводят к значительным изменениям в скорости катализа, что может являться адаптивным механизмом, обеспечивающим различия в активности РНКП разных бактерий.

Рис. 7.4. Механизм синтеза РНК в активном центре РНКП. РНК и присоединяемый нуклеотид (NTP) показаны красным, матричная цепь ДНК – черным цветом. F-спираль, G-петля и F-петля изображены фиолетовым, зеленым и темно красным цветами, соответственно;

направление движения G-петли в ходе катализа показано пунктирной стрелкой, общее направление транскрипции – сплошной стрелкой.

Аминокислотные замены в F-петле, влияющие на скорость синтеза РНК, схематично показаны желтыми кружками Резюме. Различия в скорости синтеза РНК РНКП термофильных и мезофильных бактерий определяются различиями в участках РНКП, оказывающих аллостерическое воздействие на структуру активного центра в ходе катализа. В частности, район F-петли -субъединицы важен для формирования закрытой конформации активного центра в процессе присоединения нуклеотидов.

ВЫВОДЫ 1. Исследован механизм инициации транскрипции РНКП мезофильных и термофильных бактерий. Показано, что, при сохранении консервативного механизма инициации, РНКП разных бактерий проявляют значительные различия в узнавании промоторов, свойствах промоторных комплексов и каталитической активности.

2. Разработан новый подход к изучению структуры РНКП и механизмов инициации транскрипции с использованием аптамеров. Получены высокоаффинные и высокоспецифичные оцДНК аптамеры к -субъединице, холоферменту и кор-ферменту РНКП, которые взаимодействуют с участками связывания нуклеиновых кислот, транскрипционных факторов и антибиотиков.

Показано, что аптамеры являются удобным инструментом для изучения взаимодействий РНКП с нуклеиновыми кислотами и регуляторными факторами, а также для создания новых ингибиторов фермента.

3. Открыт новый элемент промоторов бактерий (GGGA-элемент), который располагается справа от -10 элемента. Данный элемент узнается районом 1.2 субъединицы и увеличивает стабильность промоторных комплексов РНКП.

Промоторы, содержащие GGGA, узнаются РНКП разных бактерий с разной специфичностью. Видоспецифические различия в узнавании GGGA содержащих промоторов определяются различиями в неспецифических контактах РНКП с промоторной ДНК.

4. Свободная -субъединица РНКП содержит функционально-активные участки связывания ДНК и способна узнавать -10, TG и GGGA-элементы промотора в составе аптамеров, соответствующих нематричной цепи промотора. ДНК связывающая активность -субъединицы стимулируется -субъединицей кор фермента РНКП.

5. Холофермент РНКП обладает высокой аффинностью к шпилечным структурам ДНК, содержащим TG-элемент промотора в двунитевом состоянии и - элемент промотора в однонитевом состоянии. Данное свойство РНКП, вероятно, лежит в основе механизма плавления ДНК при образовании открытого промоторного комплекса.

6. Контакты кор-фермента РНКП с промоторной ДНК спереди по ходу транскрипции необходимы для стабилизации промоторных комплексов.

7. Сигма-субъединица влияет на структуру активного центра РНКП на стадии инициации транскрипции. Сигма-субъединица способствует связыванию 3’ инициаторного нуклеотида в активном центре РНКП, в частности, за счет контактов района 3.2 с районом switch2 -субъединицы, который, в свою очередь, взаимодействует с матричной цепью ДНК в области активного центра.

8. Сигма-субъединица РНКП принимает участие в процессе перехода от инициации к элонгации транскрипции, за счет конкуренции района 3.2 с синтезируемой РНК, что, с одной стороны, является причиной абортивной инициации, а с другой – способствует разрыву контактов РНКП с промотором.

9. Выявлены элементы РНКП, определяющие различия свойств промоторных комплексов РНКП разных бактерий. Установлено, что различия в температуре плавления промоторов определяются аминокислотными остатками района 2 субъединицы, контактирующими с -10 элементом промотора и с кор-ферментом РНКП, а различия в стабильности промоторных комплексов – N-концевым районом -субъединицы, а также кор-ферментом РНКП. Данные различия не связаны с температурной адаптацией бактерий.

10. Выявлены структурные элементы активного центра РНКП, определяющие адаптивные различия в скорости катализа РНКП термофильных и мезофильных бактерий. Показано, что район F-петли -субъединицы аллостерически способствует формированию закрытой конформации активного центра в процессе присоединения нуклеотидов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи:

Barinova N., Kuznedelov K., Severinov K., Kulbachinskiy A. 2008. Structural modules of RNA polymerase required for transcription from promoters containing downstream basal promoter element GGGA. J. Biol. Chem. 283: 22482-22489.

Пупов Д.В., Баринова Н.А., Кульбачинский А.В. 2008. Анализ РНК расщепляющей активности РНК-полимераз E. coli и D. radiodurans. Биохимия т. 73: – 908.

Barinova N., Zhilina E., Bass I., Nikiforov V., Kulbachinskiy A. 2008. Lineage-specific amino acid substitutions in region 2 of the RNA polymerase subunit affect the temperature of promoter opening. J. Bacteriol. 190: 3088-3092.

Kulbachinskiy A.V. Methods for selection of aptamers to protein targets. 2007.

Biochemistry (Moscow) 72: 1505-1518.

Sevostyanova A, Feklistov A, Barinova N, Heyduk E, Bass I, Klimasauskas S, Heyduk T, Kulbachinskiy A. 2007. Specific recognition of the -10 promoter element by the free RNA polymerase sigma subunit. J. Biol. Chem. 282: 22033-22039.

Zenkin N., Kulbachinskiy A., Yuzenkova Y., Mustaev A., Bass I., Severinov K., Brodolin K. 2007. Region 1.2 of the RNA polymerase sigma subunit controls recognition of the -10 promoter element. EMBO J. 26: 955-964.

Feklistov A., Barinova N., Sevostyanova A., Heyduk E., Bass I., Vvedenskaya I., Kuznedelov K., Merkien E., Stavrovskaya E., Klimaauskas S., Nikiforov V., Heyduk T., Severinov K., Kulbachinskiy A. 2006. A basal promoter element recognized by free RNA polymerase sigma subunit determines promoter recognition by RNA polymerase holoenzyme. Mol. Cell. 23: 97-107.

Kulbachinskiy A., Mustaev A. 2006. Region 3.2 of the sigma subunit contributes to the binding of the 3'-initiating nucleotide in the RNA polymerase active center and facilitates promoter clearance during initiation. J. Biol. Chem. 281: 18273-18276.

Кульбачинский А.В. 2006. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням.

Успехи биологической химии т. 46: 193-224.

Кульбачинский А.В., Никифоров В.Г., Бродолин К.Л. 2005. Различия контактов РНК-полимераз Е. соli и T. aquaticus с lacUV5-промотором определяются кор ферментом РНК-полимеразы. Биохимия т. 70: 1493 – 1497.

Zenkin N., Kulbachinskiy A., Bass I., Nikiforov V. 2005. Different rifampin sensitivities of Escherichia coli and Mycobacterium tuberculosis RNA polymerases are not explained by the difference in the beta-subunit rifampin regions I and II. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 1587-1590.

Kulbachinskiy A., Feklistov A., Krasheninnikov I., Goldfarb A., Nikiforov V. 2004.

Aptamers to E. coli core RNA polymerase that sense its interaction with rifampicin, subunit and GreB. Eur. J. Biochem. 271: 4921-4931.

Kulbachinskiy A., Bass I., Bogdanova E., Goldfarb A., Nikiforov V. 2004. Cold sensitivity of thermophilic and mesophilic RNA polymerases. J. Bacteriol. 186: 7818-7820.

Кульбачинский А.В., Ершова Г.В., Коржева Н.В., Бродолин К.Л., Никифоров В.Г..

2002. Мутации в ’-субъединице РНК-полимеразы Esherichia coli, влияющие на взаимодействие с передним дуплексом ДНК в элонгационном комплексе. Генетика т.

38: 1207-1211.

Kulbachinskiy A., Mustaev A., Goldfarb A., Nikiforov V. 1999. Interaction with free beta' subunit unmasks DNA-binding domain of RNA polymerase sigma subunit. FEBS Lett.

454: 71-74.

Материалы всероссийских и международных конференций:

Kulbachinskiy A., Pupov D., Barinova N. “Analysis of promoter recognition by bacterial RNA polymerase using model DNA substrates.” XX International Congress of Genetics. “Genetics – understanding living systems”. July 12-17, 2008, Berlin, Germany.

Миропольская Н.А., Кульбачинский А.В. «РНК-полимераза как молекулярная машина: поиск структурных элементов фермента, определяющих скорость транскрипции.» 1-й Международный форум по нанотехнологиям. 3-5 декабря 2008 г., Москва, Россия.

Кульбачинский А.В., Пупов Д.В., Баринова Н.А. «Исследование структуры РНК полимеразы и механизмов узнавания промоторов при помощи аптамеров.» IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск, Россия.

Barinova N., Klimaauskas S., Nikiforov V., Kulbachinskiy A., Artsimovitch I.

“Comparison of mesophilic and thermophilic RNA polymerases reveals a structural element controlling catalysis allosterically”. FASEB Summer Research Conference "Mechanisms & Regulation of Prokaryotic Transcription". June 23-28, 2007, Vermont Academy in Saxtons River, Vermont, USA..

Epshtein V., Kulbachinskiy A., Nikiforov V., Mustaev A. “Catalytic mechanism of transcription initiation”. FASEB Summer Research Conference "Mechanisms & Regulation of Prokaryotic Transcription". June 23-28, 2007, Vermont Academy in Saxtons River, Vermont, USA.

Кульбачинский А. «Роль сигма-субъединицы РНК-полимеразы в связывании инициаторных нуклеотидов и в уходе с промотора при инициации транскрипции.» 8-я Международная конференция им. Энгельгардта по молекулярной биологии. «РНК белковые взаимодействия». 19-24 августа 2006 г., Москва, Россия.

Feklistov A., Kulbachinsky A., Nikiforov V. “DNA aptamers unveil sequence specificity of free sigma factor.” FASEB Summer Research Conference "Nucleic Acids Enzymes". June 12 - June 17, 2004, Vermont Academy in Saxtons River, Vermont, USA.

Ивановская М.Г., Анцыпович С.И., Рудакова Е.А., Кульбачинский А.В.

«Взаимодействие РНК-полимеразы E. coli с олигонуклеотидами-фрагментами lacUV5 промотора». III Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. июня – 1 июля 2002 г., Санкт-Петербург, Россия.

Korzheva N., Mustaev A., Kuznedelov K., Severinov K., Kulbachinskiy A., Kozlov M., Malhotra A., Nikiforov V., Goldfarb A., Darst S. “DNA and RNA-protein contacts in transcription elongation complex.” 17th Annual meeting of the French Biophysical Society «Nucleic acid recognition by enzymes. The case of DNA-dependent polymerases».

September 13 – 16, 2000, Nouan-le-Fuzelier, France.

Brodolin K.L., Zaychikov E., Denissova L., Heumann H., Kulbachinsky A., Nikiforov V. “Contacts of RNA polymerase with transcription bubble in open promoter complex.” 17th Annual meeting of the French Biophysical Society «Nucleic acid recognition by enzymes.

The case of DNA-dependent polymerases». September 13 – 16, 2000, Nouan-le-Fuzelier, France.

Brodolin K.L., Kulbachinsky A., Severinov K., Nikiforov V. “Formaldehyde as a probe for RNA polymerase-promoter complexes structure.” FASEB Summer Research Conference «Transcription initiation in Prokaryotes». July 19 - July 24, 1997, Vermont Academy in Saxtons River, Vermont, USA.



Pages:     | 1 ||
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.