авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина nsp4 ротавирусов

на правах рукописи

Пономарева Наталья Вячеславовна Исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина NSP4 ротавирусов 03.01.04. – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород – 2010 2

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Нижегородском государственном университете им.

Н.И. Лобачевского» и ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора доктор биологических наук,

Научный консультант:

профессор Новикова Надежда Алексеевна доктор биологических наук,

Официальные оппоненты:

профессор Корягин Александр Сергеевич доктор медицинских наук, Лавровский Сергей Николаевич

Ведущая организация:

Нижегородская государственная медицинская академия

Защита состоится: «»_2010 г. в_час_мин на заседании диссертационного совета Д. 212.166.15. при Нижегородском госуниверситете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ.

Автореферат разослан: «»_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук С.В. Копылова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Гликопротеин ротавируса обладает NSP Актуальность проблемы.

свойствами энтеротоксина и играет ведущую роль в патогенезе ротавирусной инфекции, которая обусловливает до 70% случаев госпитализаций детей с острой кишечной инфекций в возрасте до 5 лет и является частой причиной смертности детей в развивающихся странах [Glass R.I., 2005]. Энтеротоксин NSP4 имеет молекулярную массу 20,2 кДа и представляет продукт трансляции 10 сегмента днРНК генома ротавируса [Estes M.K., Cohen J.,1989].

Ротавирусы характеризуются широким антигенным и генетическим разнообразием. У ротавирусов группы А человека и животных установлено существование 14 G-серотипов (детерминирован гликопротеином VP7) и 27 Р генотипов (детерминирован протеазочувствительным белком VP4) [Khamrin P. et al., 2007]. Полиморфизм по гену NSP4 отражает существование 11-ти генотипов NSP ротавирусов человека и животных [Matthijnssens J. et al., 2008]. Изучение генетического разнообразия NSP4 представляет важную и актуальную задачу – в плане расширения информации о спектре NSP4-генотипов, циркулирующих на территории России и современной классификации ротавирусов, основанной на свойствах каждого геномного сегмента.

NSP4 влияет на жизненноважные процессы, протекающие в инфицированных клетках кишечника: дезорганизует микроструктуру цитоскелета энтероцитов, ингибирует транспорт клеточных белков, аминокислот и дисахаридаз, нарушает ионный баланс в клетках кишечника посредством повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция, что приводит к нарушению ресорбции воды энтероцитами и, как следствие, к диарее. Высвобождение ионов кальция из внутриклеточных хранилищ (ЭПР) объясняется разрушением их мембран в результате мембранодестабилизирующей активности ротавирусного энтеротоксина [Tian P. et al., 1996]. Но и на сегодняшний день до конца не ясны молекулярные основы вирулентности ротавирусов, не существует четких представлений о механизме развития патогенеза ротавирусной инфекции в целом и роли в нем энтеротоксина NSP4. Исследование биологической активности функционально значимых участков белковой молекулы NSP4 ротавирусов разных генотипов в модельной бактериальной векторной системе может внести новые аспекты в изучение влияния биологических особенностей NSP4 на выраженность проявлений ротавирусной инфекции и способствовать разработке альтернативных ротавирусных вакцин на основе NSP4.

Поэтому изучению биохимических и молекулярно-биологических свойств данного белка и кодирующего гена является чрезвычайно важной и актуальной задачей.

исследование мембранодестабилизирующих свойств Цель исследования:

гликопротеина NSP4 ротавирусов группы А различных антигенных типов и NSP4 генотипов.

Задачи исследования:

Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для амплификации полноразмерной 1.

последовательности и открытой рамки считывания гена NSP4 ротавируса группы А.

2. Установить нуклеотидные последовательности гена NSP4 российских изолятов ротавирусов разных G[P]-типов и определить их NSP4 генотипы.

Изучить генетические взаимосвязи исследуемых изолятов ротавируса с 3.

ротавирусами группы А человека, выделенными на разных территория земного шара, и ротавирусами животных.

Охарактеризовать мембранодестабилизирующую активность разных 4. NSP генотипов в модельной бактериальной векторной системе на основе способности ротавирусного энтеротоксина лизировать мембраны клеток Escherichia coli.

5. Провести сравнительный анализ аминокислотной последовательности NSP4, установить наличие/отсутствие взаимосвязи аминокислотных замен в функционально-активных консервативных и вариабельных регионах белковой молекулы с мембранодестабилизирующей активностью NSP4 разных генотипов.

Научная новизна и практическая значимость работы:

Подобраны и апробированы праймеры для универсальной амплификации гена NSP4 ротавирусов группы А разных генотипов, что может быть использовано при разработке тест-систем на основе ПЦР для диагностики ротавирусного гастроэнтерита. Разработанная методика амплификации гена NSP4 применяется при проведении НИР по изучению штаммов ротавирусов.

Впервые установлена первичная структура гена NSP4 15-ти российских изолятов ротавируса с доминирующими антигенными типами. Нуклеотидные последовательности NSP4 данных изолятов ротавируса депонирваны в GenBank под номерами DQ270104 - DQ270118, что расширяет международную базу данных последовательностей генома ротавирусов.

Определены генотипы энтеротоксина NSP4 новых российских изолятов ротавирусов группы А: NSP4-А (Е2), -В(Е1) и С (Е3). Показано доминирование изолятов ротавируса, характеризующихся генотипом NSP4-В (Е1).

Впервые установлены филогенетические связи по гену NSP4 ротавируса G1P[8] типа со штаммами, выделенными на территории Скандинавских стран, а G3P[8] и G3P[9] типов со штаммами из стран Юго-Восточной Азии. Установлено, что ротавирусы генотипов G1, G3, G4 и P[8] типа по гену NSP4 фиогенетически родственны ротавирусам свиней;

G3P[6], G3P[9] и G2P[4] типов ротавирусам крупного рогатого скота, G3P[9] типа ротавирусам кошек.

Эти результаты дополняют представления о распространении штаммов ротавируса на разных территориях земного шара и свидетельствуют об эволюционных связях между ротавирусами животных и человека, подчеркивая необходимость их одновременного мониторинга.

На основе вектора pET22b+ создано три авторских генетических конструкции (pET22b-G3P[9]-NSP4-C, pET22b-G1P[8]-2-NSP4-B, pET22b-G9P[6]-NSP4-A), экспрессирующие в клетках Escherichia coli энтеротоксин NSP4 разных генотипов.

Впервые проведен сравнительный анализ мембранодестабилизирующей активности NSP4 штаммов ротавирусов разных G[P]-типов, выделенных от детей с гастроэнтеритом (G1P[8], G3P[9]) и бессимптомной формой инфекции (G9P[6]).

Впервые в сравнительном плане охарактеризованы аминокислотные последовательности NSP4 российских изолятов ротавирусов с разной выраженностью клинических проявлений инфекции. Полученные в ходе настоящего исследования результаты имеют значение для разработки альтернативной ротавирусной вакцины.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана методика синтеза и амплификации кДНК полноразмерной последовательности и открытой рамки считывания гена энтеротоксина NSP4, позволившая охарактеризовать NSP4-генотипы ротавирусов группы А, актуальных для территорий России. Спектр NSP4 генотипов ротавируса представлен тремя генотипами – А (Е2), В (Е1) и С (Е3).

2. Ротавирус G1P[8] типа, циркулирующий на территории Н.Новгорода, проявляет филогенетическое родство по гену NSP4 со штаммами из Скандинавских стран, а G3P[8,9] типа со штаммами из стран Юго-Восточной Азии. Ротавирусы G1, G3, G4 и P[8] типов генетически родственны ротавирусам свиней, G3P[6,9] и G2P[4] типов ротавирусам крупного рогатого скота, G3P[9] типа ротавирусам кошек.

3. Создано три генетические конструкции (pET22b-G3P[9]-NSP4-C, pET22b G1P[8]-2-NSP4-B, pET22b-G9P[6]-NSP4-A), экспрессирующие в клетках E.coli энтеротоксин NSP4 генотипов А, В и С. Экспрессия сопровождается торможением экспоненциального роста культуры что свидетельствует о сходных E.coli, мембранодестабилизирующих свойствах ротавирусов разных NSP4-генотипов Ротавирусы, обнаруженные у детей с диареей и бессимптомной формой 4.

инфекции, не имеют значимых аминокислотных замен в важных для проявления энтеротоксических свойств доменах NSP4.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены:

• на VII Нижегородской сессии молодых ученых (г. Н. Новгород, 2009 г.);

на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и • микробиологии имени академика И.Н. Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института.

• на юбилейной Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», посвященной 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД (г. Н. Новгород, 2009 г.);

диссертация апробирована на заседания кафедры молекулярной биологии и • иммунологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского (02 февраля 2010 г.).

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 152 источников литературы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 10 таблицами.

По результатам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Работа поддержана грантом Н204 в рамках программы «Развитие научного потенциала высшей школы», 2005 г.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования В работе использовали:

ротавируссодержащие образцы фекалий детей, госпитализированных в • инфекционные стационары г. Нижнего Новгорода в период 1992-2004 гг. и Городской клинический перинатальный центр г. Омска в период 2002-04 гг.;

штамм ротавируса SA11. Всего исследовано 30 проб.

• нуклеотидные последовательности геномных кДНК ротавирусов, собранных в базе данных Всего GenBank /EMBL/ DDBJ [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/].

использовано 75 последовательностей.

бактериальные штаммы: E.coli Тор 10 F';

E.coli BL21gold (DE3);

E.coli BL21gold • (DE3) codon plus (любезно предоставлены Институтом Вирусологии им. Д.И.

Ивановского, Москва).

• питательные среды: LB, 2xYT, SOC • компьютерные программы «Oligo 4,0», 1989-91 (США);

«GeneDoc, версия 2.5.000», 1997 (США), «MegAline», «ClustalW» » из набора программ MEGA v.3.1, BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/].

Экстракцию РНК ротавируса и её электрофоретипирование методом электрофореза в ПААГ осуществляли, как описано [Новикова Н.А., Епифанова Н.В., 1994]. РНК ротавирусов для постановки ОТ-ПЦР выделяли методом высокосолевой очистки (патент №2313792) и с использованием комплекта реагентов «РИБО-сорб» производства ФГУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции по применению.

Олигонуклеотидные праймеры для постановки ОТ-ПЦР синтезировали в фирме «Литех», Москва. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-боратной буферной системе.

Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли по алгоритму Neighbor-joning в двухпараметрической модели Kimura-2 в программе MEGA v.3.1. Достоверность топологии филограмм оценивали методом повторных выборок на основании анализа 1000 псевдореплик [Kumar S. et al., 2004].

Экстракцию ДНК из 1%-го агарозного геля проводили с использованием набора реагентов «РИБО-сорб» производства ФГУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции производителя.

Определение нуклеотидной последовательности гена NSP4 осуществляли с использованием праймеров: NSP4R и NSP4F, набора реагентов ABI PRISM BigDye Terminator v.3.1, в автоматическом режиме на приборе ABI Prism Avant 3130, согласно рекомендациям производителя. Работа проведена на базе Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в совместной работе с к.б.н. Д.В.

Новиковым. и д.б.н. Г.А. Прилиповым.

Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli осуществляли с использованием набора реагентов «Miniprep Kit» (США, 1997) согласно инструкции производителя.

Компетентные клетки E.coli трансформировали в электропораторе BioRad (США) согласно инструкции производителя. Экспрессию белка индуцировали 1 мМ ИПТГ.

Детекцию NSP4, экстрагированного из культуры клеток E.coli, проводили методом электрофореза в ПААГ с использованием буферных растворов Лэммли [Laemmli U.K., 1970].

Результаты и их обсуждения Оптимизация методики ОТ-ПЦР для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4 ротавируса группы А. Последовательность NSP кодируется 10-м геномным сегментом днРНК, имеющим у ротавирусов группы А размер 754 н.о. Синтез кДНК гена NSP4 и определение ее нуклеотидной последовательности обеспечивают базис для изучения вариабельности гена NSP4 и энтеротоксических свойств белковой молекулы в целом и ее отдельных доменов. К началу наших исследований в научной зарубежной литературе были представлены праймеры для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4, подобранные более 10 лет назад [Zhang M, Zeng C.Q.-Y., Dong Y., 1998]. Расширение информации о последовательностях гена NSP4, и вариабельность генома ротавирусов послужили основанием для модификации праймеров с целью их адаптации к современным штаммам ротавирусов.

На первом этапе работы с использованием программы Mega 3.1. проведен сравнительный анализ 27 полных нуклеотидных последовательностей гена NSP разных генотипов, представленных в GenBank/ЕMBL/DDBJ к настоящему времени, по результатам которого сконструированы собственные версии праймеров для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4: NSP4-F 1-[5 н.о., ggCTTTTAAAAgTTCTgT-3]-18 NSP4-R 729-[5 ggTCACRYTAAgACCRTTCCTTC-3]-752 н.о. Регион 5-конца, соответствующий области прямого праймера, предложенного Zhang M. с соавт., не имеет нуклеотидных замен, поэтому мы сократили его последовательность до 18 н.о. Регион 3-конца, соответствующий обратному праймеру, предложенному Zhang M. с соавт., характеризуется вариабельностью нуклеотидов. С целью повышения специфичности обратного праймера мы модифицировали его путем введения вырожденных оснований (R – A/G;

Y – C или T/U) и увеличением последовательности до 23 н.о.

Модифицированные праймеры фланкируют участок гена NSP4 размером 752 н.о., что соответствует полноразмерной кДНК 10-го сегмента генома ротавирусов.

Для эффективной амплификации кДНК гена NSP4 были оптимизированы условия постановки ПЦР с учетом температуры плавления праймеров, установленной при помощи компьютерной программы «OLIGO 4.0» (США). На основе проведенного анализа температура отжига праймеров составила 55°С.

Теоретически подобранные условия проведения ПЦР и специфичность модифицированных праймеров были экспериментально подтверждены на пробах, содержащих РНК ротавируса разных G[P] типов. ПЦР осуществляли в режиме: 94 оС 3 мин;

45(94°С-30 с, 55°С-30 с, 72°С-1 мин);

72оС – 5 мин. С использованием оптимизированной методики амплификации была синтезирована кДНК полноразмерной последовательности 10-го сегмента генома 15 природных изолятов ротавируса человека с доминирующими и необычными электрофоретипами РНК, относящихся к различным G[P] типам и SG подгруппам. Электрофоретипы РНК и субгрупповая принадлежность изолятов ротавируса были определены в совместной работе с сотрудниками лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной. При проведении многолетних наблюдений в период 1997-05 гг. на территории Нижегородской области была установлена циркуляция ротавирусов семи G[P] типов: G1P[8], G1P[6], G2P[4], G3P[8], G3P[6], G3P[9] и G4P[8] с доминированием типа G1P[8]. В сезон 2004-05 гг.

зафиксировано перераспределение генотипов ротавируса, что отразилось в доминировании типа G2P[4].

Рис. 1. Схема электрофоретипов РНК ротавирусов группы А, использованных в настоящей работе Сверху цифрами обозначены номера ЭФ-типов РНК;

внизу указаны G[P]-типы ротавирусов.

SA11 – обозначение референтного штамма ротавируса обезьян Тип G4P[8] являлся минорным на протяжении всего периода наблюдения [Новикова Н.А. и др., 2007;

Федорова О.Ф., 2006]. Спектр G[P]-типов ротавирусов, исследуемых в настоящей работе, определен на основании предыдущих наблюдений и охватывает все перечисленные G[P]-типы, распространенные на территории Нижегородской области. Профили миграции сегментов РНК изучаемых вариантов ротавируса показаны на рисунке 1.

Разработанная методика явилась базой для изучения первичной структуры гена NSP4 у различных штаммов ротавируса человека, актуальных для территории России.

Синтезированные с применением данной методики полноразмерные последовательности 10-го сегмента генома ротавирусов также использовали в качестве матриц для амплификации открытой рамки считывания гена NSP4 с целью клонирования ее в экспрессирующей бактериальной векторной системе.

Изучение вариабельности гена NSP4 ротавируса группы А разных G[P] типов. На следующем этапе работы определена первичная структура 10-го сегмента генома исследуемых изолятов ротавируса.

Установленные последовательности гена депонированы в NSP GenBank/ЕMBL/DDBJ по номерами DQ270104 – DQ270118. Известно, что 10-й сегмент генома ротавирусов характеризуется высоким уровнем вариабельности, что отражает существование различных NSP4 генотипов. По последним данным установлено существование 11-ти NSP4-генотипов (Е-enterotoxin 1-11).

Нуклеотидные последовательности гена NSP4 15-ти российских изолятов ротавируса, установленные в настоящей работе, использовали для множественного выравнивания и филогенетического анализа с соответствующими последовательностями типовых штаммов различных NSP4-генотипов и штаммов ротавирусов человека известных G[P] типов, выделенных на территориях разных стран, и представленных в GenBank/ЕMBL/DDBJ. Гомологию последовательностей определяли с помощью программы BLAST. На рисунке 2 видно, что при построении филогенетического дерева нижегородские штаммы РВ образовали три кластера, соответствующие NSP4-A (Е2), В (Е1) и С (Е3) генотипам. Различия в нуклеотидных последовательностях РВ разных генотипов достигали 25% и не превышали 7,9% для последовательностей одного генотипа в пределах субкластера и 13,7% - в пределах кластера.

Большинство геновариантов ротавируса, обладающих «длинным» ЭФ-типом РНК и SGII специфичностью, группировались с референтным штаммом Wa (AF200224), имеющим NSP4-B генотип. Данный генотип установлен у штаммов с доминирующими антигенными типами и электрофоретипами РНК в 73,3% и представлен в основном типом G1P[8], генотип G4 являлся минорным, что соответствовало спектру распределения геновариантов ротавируса на территории Нижегородской области в период 1997-2004 г [Новикова Н.А. и др., 2007].

Кластер Wa-подобных штаммов состоит из 3-х субкластеров (I, II и III), различия в нуклеотидных последовательностях которых по отношению к штамму Wa достигали 2,6%, 6,2% и 7,7%. Генетические варианты ротавируса серотипа G1 и субгенотипов и входящие в данный кластер, образовали P[8]-1 P[8]-2, самостоятельные группы (Iа и Iб).

61 N.N.392 G1P[6]-(86) 71 N.N.12813 G1P[8]-2-(72) Iа 86 N.N.12705 G1P[8]-2-(61) N.N.13518 G4P[8]-2-(85) N.N.83117 G1P[8]-2-(46) N.N.131 G1P[8]-1-(4) NSP4-E1(B) N.N.6932 G1P[8]-1-(4) Iб генотип N.N.6919 G1P[8]-1-(3) Wa 100 N.N.623 G3P[8]-2-(88) I 100 N.N.13286 G3P[8]-(87) N.N.12908 G4P[9]-(90) III A G4 NSP4-Е9 генотип CMP 100 N26-02P6 NSP4-Е6 генотип RV176- N.N.12871G3P[9]-(10) NSP4-Е3 (С) генотип 87 AU 40 PP-1 NSP4-Е8 генотип 100 RV52/ Е5 генотип BAP N.N.11825 G3P[6]-(19) 67 N.N.13144 G3P[9]-(68) Е3 (A) генотип N.N.12698 G2P[4]-(70) DS- EW NSP4-Е10(F) генотип NSP4-Е4(E) генотип Ch- NSP4-Е11 генотип Ty- 92 AvRV-1 NSP4-Е7 (D) генотип 0. Рис. 2. Определение генотипа NSP4 изолятов ротавирусов группы А Показаны индексы поддержки 60;

названия референтных штаммов выделены жирным шрифтом Названия референтных штаммов выделены жирным шрифтом Римскими цифрами I, II и III указаны субкластеры в кластере, сформированном ротавирусами, принадлежащих генотипу NSP4-B;

Ia –группа, образованная субгенотипом P[8]-2;

Iб – группа, образованные субгенотипом P[8]- Генетические варианты ротавируса с «коротким» и «широким» ЭФ-типами РНК (подгруппа SGI), составили единый кластер с референтным штаммом DS- (AF174305), имеющим генотип NSP4-A. Эти результаты подтверждают данные зарубежных авторов о связи NSP4-генотипа ротавируса с VP6-субгруппой, а именно, связи генотипа NSP4-A с подгруппой SGI, а генотипа NSP4-B с подгруппой SGII [Iturriza-Gomara M. et al., 2002]. Высокий уровень различий (13,7%) между нуклеотидными последовательностями гена NSP4 исследуемых изолятов ротавируса, входящих в разные субкластеры в кластере, сформированном ротавирусами генотипа NSP4-A, позволяет предположить существование новых генотипов NSP4.

Необычный вариант ротавируса N.N.12871-G3P[9]-(10)/SGI с «широким» 10-м ЭФ-типом РНК группировался с референтным штаммом Au-1 (D89873), имеющим генотип NSP4-С. Гомология нуклеотидных последовательностей составила 99,8%.

Проведен филогенетический анализ по гену NSP4, позволивший проследить родство штаммов ротавируса, циркулирующих среди населения центральной России (Н.Новгород), со штаммами, выделенными на других территориях земного шара (рис.3). Генетический вариант ротавируса G1P[8]-1-(3) типа, доминировавший на территории европейской части России в 1984-96 гг., и ассоциирующийся с тяжелой формой ротавирусного гастроэнтерита с выраженным респираторным синдромом Н.А. и др., 1992,1998,2007], оказался генетически близкородственным [Новикова штамму ротавируса G1P[8]-1, выделенному в Финляндии [Maunula L. et al., 2002].

Представляется вероятным, что российский доминирующий генетический вариант ротавируса имел общее происхождение со штаммом, G1P[8]-1-(3)/NSP4-B циркулировавшим на территории Скандинавских стран, или являлся тем же штаммом. Другие генетические варианты (4-й, 34-й ЭФ-типы РНК) ротавируса G1P[8]-1 типа циркулировали в более поздние сроки и, по всей вероятности, являются дериватами штамма G1P[8]-1-(3). В то же время генетические варианты ротавируса G1P[8]-2 (46-й, 61-й и 72-й ЭФ-типы), G4P[8]-2 (85-й ЭФ-тип), а также G1P[6] (86-й ЭФ-тип) могут иметь самостоятельное происхождение.

Варианты ротавируса генотипа NSP4-B типов G3P[8]-2 (88-й и 87-й ЭФ-типы РНК) и G4P[9]-(90), а также необычный вариант G3P[9]-(10)-NSP4-C группируются со штаммами из Тайваня и Китая. Эти данные могут свидетельствовать о заносе штаммов ротавируса на территорию России из стран Юго-Восточной Азии.

Штаммы G3P[6]-(19) и G3P[9]-(68) подгруппы SGI с ЭФ-типом РНК, характеризующимся широким разбегом 5-6 сегмента РНК в ПААГ, что характерно для ротавирусов крупного рогатого скота, составили субкластер в кластере DS- подобных штаммов. Ротавирусы G2P[4]-NSP4-A типа, выделенные на территориях различных стран и континентов, в том числе и на территории России, образовали самостоятельную группу близкородственных штаммов, что свидетельствует об устойчивости данной генетической комбинации серотипа и генотипа.

N.N.392 G1P[6]-(86) 68 N.N.12813 G1P[8]-2-(72) 93 N.N.12705 G1P[8]-2-(61) N.N.13518 G4P[8]-2-(85) N.N.83117 G1P[8]-2-(46) Fin-G4-91-Major Finland Fin-G1-97-Major Finland Wa G1P[8] NSP4-B генотип N.N.131 G1P[8]-1-(4) N.N.6932 G1P[8]-1-(34) N.N.6919 G1P[8]-1-(3) TI25 G3P[8] Taiwan TG59 G1P[8] Taiwan 100 N.N.623 G3P[8]-2-(88) N.N.13286 G3P[8]-2-(87) N.N.12908 G4P[9]-(90) 97SZ37 G9 China CMH134/04 G3P[9] Tailand N.N.12871 G3P[9]-(10) NSP4-C AU1 G3P[9] N.N.11825 G3P[6]-(19) N.N.13144 G3P[9]-(68) DS-1 G2P[4] 92H102 G2 Japan NSP4-A 100 S2 G2 Australia N.N.12698 G2P[4]-(70) 97SZ8 G2 China 1040 G2P[4] India 0. Рис. 3. Филограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей гена NSP4 российских изолятов РВ-А разных G[P]-типов и NSP4-генотипов и штаммов ротавирусов человека, выделенных на территориях других стран Показаны индексы поддержки 60.

Указаны названия штаммов, их географическое происхождение, G[P]-типы, в скобках указан номер ЭФ-типа РНК. Названия референтных штаммов выделены жирным шрифтом Проведен филогенетический анализ ротавирусов человека и штаммов ротавирусов животных, представленных в базе данных GenBank. Установлено, что основная масса изучаемых вариантов ротавируса, образует самостоятельный геномный кластер «истинных» ротавирусов человека, включающий штаммы типов G1P[8]-1, G1P[8]-2, G3P[8]-2 и G4P[8]-2 (Wa-геногруппа) (рис.4). Эта группа штаммов РВ человека по последовательности гена NSP4 близка к ротавирусам свиней. Идентичность нуклеотидных последовательностей составила 87,7-91%.

Штаммы ротавируса человека G3P[6]/NSP4-А и G3P[9]/NSP4-А, принадлежащие геногруппе DS-1, кластеризовались со штаммами ротавируса крупного рогатого скота. Идентичность нуклеотидных последовательностей составила 90,4-90,8%. По всей вероятности данные штаммы ротавируса или их предки являются реассортантами с ротавирусами крупного рогатого скота и приобрели от них ген NSP4.

Штамм G3P[9]/NSP4-С, имеющий ЭФ-тип РНК, характерный для геногруппы Au-1, оказался в кластере, формируемом ротавирусами кошек. Уровень гомологии нуклеотидных последовательностей составил 97,5%. Данный вариант вируса может являться реассортантом между ротавирусами кошек и человека, возникшим вследствие трансмиссии генов.

N.N.392 G1P[6]-(86) 84 N.N.12813 G1P[8]-2-(72) N.N.12705 G1P[8]-2-(61) N.N.13518 G4P[8]-2-(85) N.N.83117 G1P[8]-2-(46) РВ-А N.N.131 G1P[8]-1-(4) человека N.N.6932 G1P[8]-1-(34) N.N.6919 G1P[8]-(3) N.N.12908 G4P[9]-(90) N.N.623 G3P[8]-2-(88) 100 N.N.13286 G3P[8]-2-(87) RU172 porcine A34 porcine РВ-А свиней A2 porcine 99 OSU porcine FRV384 feline РВ-А N.N.12871 G3P[9]-(10) 77 100 кошек FRV1 feline WC3 bovine CBNU-2 bovine N.N.11825 G3P[6]-(19) N.N.13144 G3P[9]-(68) РВ-А телят MF66 bovine N.N.12698 G2P[4]-(70) CP-1 bovine EC murine РВ-А мышей Ch-1 Avian РВ-А птиц 0. Рис. 4. Филограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей гена NSP4 нижегородских изолятов РВ-А разных G[P]-типов и штаммов ротавирусов животных Показаны индексы поддержки 60.

Указаны названия штаммов, их видовая принадлежность, G[P]-типы, в скобках указан номер ЭФ-типа РНК Таким образом, в результате проведенной работы впервые установлена нуклеотидная последовательность гена NSP4 российских (Нижний Новгород) изолятов ротавирусов группы А доминирующих антигенных G[P] типов и показана вариабельность по гену NSP4. На основе проведенного анализа подобраны варианты ротавируса для изучения мембранодестабилизирующих свойств NSP4 разных генотипов. Особый интерес представляли изоляты ротавируса, выделенные от детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции.

Изучение энтеротоксических свойств NSP4 ротавирусов группы А разных генотипов. Выраженность диареи при инфицировании различными геновариантами ротавирусов, возможно, объясняется молекулярно-биологическими свойствами энтеротоксина NSP4. Экспрессия NSP4 в бактериальной векторной системе может служить моделью для оценки токсических свойств на основе способности NSP перфорировать мембраны бактериальных клеток. Возможность применения в качестве модели для изучения токсических свойств NSP4 цитоплазматической мембраны E.coli объясняется тем, что мембраны кишечной палочки по липидному составу идентичны мембранам эндоплазматического ретикулума [Browne E.P., 2000].

Схема эксперимента по изучению мембранодестабилизирующей активности NSP4 разных генотипов, разработанная в ходе данного исследования, включала:

синтез кДНК открытой рамки считывания гена NSP4, создание экспрессирующей NSP4 генетической конструкции на основе вектора pET22b, трансформацию компетентных клеток рекомбинантными плазмидами, несущими вставку последовательности гена NSP4, и индуцируемую экспрессию энтеротоксина в культуре клеток E.coli. (рис. 5).

Для получения экспрессии NSP4 в клетках E.coli необходимо было получить кДНК открытой рамки считывания (ОРС) гена энтеротоксина. С этой целью на основе сравнительного анализа 42-х нуклеотидных последовательностей NSP разных генотипов, были сконструированы собственные версии праймеров для амплификации ОРС гена NSP4, удовлетворяющие условиям клонирования: NSP4 F(ОРС) 33-[5–TGCggACATATggATAAgCTTgCCgACCTC–3]-64 н.о., NSP4-R(ОРС) 549-[5–TCAACCTCgAgCATKgATgCAgTCACTTC–3]-577 н.о.

Так как целью работы являлось получение векторной системы для экспрессии ОРС, при конструировании праймеров в их последовательности были внесены сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции NdeI (cat atg внесен в прямой праймер), XhoI (ctc gag внесен в обратный праймер), что необходимо для корректной ориентации вставки последовательности ОРС NSP4 при постановке ее под экспрессию.

Рис. 5. Схема проведения эксперимента по экспрессии NSP4 в E.coli Регион 5-концевого участка последовательности, соответствующего области прямого праймера, представляет собой консервативный участок, что и определило выбор праймера. Нуклеотидные замены в регионе участка 3-концевого последовательности, соответствующего области обратного праймера, определили необходимость введения вырожденных оснований (К – G/T). Сконструированные нами праймеры, NSP4-F (ОРС) и NSP4-R (ОРС), фланкируют фрагмент гена NSP размером 544 н.о., расположенный с 33 по 577 н.о. Температура отжига праймеров, выбранная с использованием программы «OLIGO 4.0» (США), составила 55°С.

Теоретически подобранные условия проведения ПЦР и специфичность сконструированных праймеров экспериментально апробованы в реакции, где в качестве матрицы для амплификации открытой рамки считывания гена NSP4 служила полноразмерная кДНК энтеротоксина ротавирусов человека. ПЦР осуществляли в режиме: 94 оС-3 мин;

(94 оС-10 с, 55 оС-10 с, 72 оС-10 с)42;

72 оС - 5 мин.

С использованием разработанной нами методики синтезированы последовательности ОРС гена NSP4 ротавируса геновариантов G1P[8]-2-NSP4-B, G3P[9]-NSP4-C, вызывающих симптоматическую инфекции, и G9P[6]-NSP4-A типа, выделенного от новорожденного с бессимптомной формой инфекции. Для экспрессии ОРС гена NSP4 перечисленных изолятов ротавируса в клетках E.coli штамма BL21(DE3) codon plus выбран вектор pET22b+, обладающий сильным промотором гена 10 фага Т7, подходящей для вставки емкостью и простотой селекции. В результате генетических манипуляций получена кольцевая форма рекомбинантной ДНК, содержащая вставку последовательности ОРС гена NSP4, и пригодная для трансформации: pET22b-NSP4-G1P[8]-2, pET22b-NSP4-G3P[9], pET22b-NSP4-G9P[6] (рис.6).

Рис. 6. Схема генетической конструкции pET22b-NSP4(ОРС) Компетентные клетки E.coli BL21(DE3) codon plus трансформировали полученными рекомбинантными плазмидами и индуцировали ИПТГ. В качестве контроля использовали клетки, трансформированные плазмидой pET22b без вставки гена NSP4.

Контроль экспрессии проведен методом электрофореза в NSP полиакриламидном геле, где показано присутствие искомого белка в бактериальной культуре после индукции экспрессии (рис.7).

1 2 3 4 5 6 7 8 20, 14, Рис. 7. Электрофореграмма белков, полученных из клеточного дебриса культуры E.coli, индуцированной для экспрессии NSP 1, 7 – NSP4, экспрессированный в составе рекомбинантной плазмиды pET22b-G1P[8]-2-NSP4-B;

2, 8 – NSP4, экспрессированный в составе рекомбинантной плазмиды pET22b-G3P[9]-NSP4-C;

3, 9 – NSP4, экспрессированный в составе рекомбинантной плазмиды pET22b-G9P[6]-NSP4-A;

1,2,3 – NSP4, экстрагированный из жидкой культуры E.coli;

7,8,9 – NSP4, экстрагированный из клеточного дебриса E.coli;

5 – протеинкиназа К – 14,3 кДт;

6 – лизоцим – 28 кДт После индукции экспрессии NSP4 была проведена серия замеров оптической плотности трансформированных бактериальных культур, результаты которой показали статистически значимое по сравнению с контролем (р 0.05) нарушение способности E.coli к наращиванию биомассы (рис. 8).

геноварианта ротавируса типа, близкородственного NSP4-С G3P[9] ротавирусам кошек, при экспрессии в модельной системе E.coli вызывал угнетение роста бактериальной культуры. Приобретение генов ротавируса кошек не снизило вирулентность исследуемого изолята для человека.

эпидемически значимого варианта ротавируса типа, NSP4-B G1P[8]- вызывающего гастроэнтерит, характеризующийся интенсивным диарейным синдромом и высокой частотой госпитализаций, проявил одинаковую способность нарушать рост бактериальной культуры наряду с NSP4 генотипов А и С.

NSP4-A ротавируса генотипа G9P[6], выделенного от новорожденного с бессимптомной формой инфекции, при экспрессии в клетках E.coli вызывал угнетение роста бактериальной культуры, подобно ротавирусам генотипов G1P[8]-2 NSP4-B и G3P[9]-NSP4-C ротавирусов, выделенных от детей с гастроэнтеритом.

Рис. 8. Изменение оптической плотности культур-продуцентов E.coli после индукции экспрессии NSP Таким образом, установлено, что NSP4 разных генотипов ротавирусов, обнаруженных у детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции, при экспрессии в клетках характеризуются эффектом торможения роста E.coli бактериальной культуры, что свидетельствует об их сходных мембранодестабилизирующих свойствах. Эти результаты могут свидетельствовать, что бессимптомное течение ротавирусной инфекции, вероятно, обусловлено не молекулярно-биологическими свойствами вирусного энтеротоксина NSP4, а иными факторами вирусной природы, либо факторами организма хозяина.

С целью подтверждения отсутствия связи молекулярно-биологических свойств NSP4 разных генотипов с выраженностью диарейного синдрома у инфицированных ротавирусами детей проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей исследуемых изолятов ротавируса в регионах NSP трансмембранного и цитоплазматического доменов белковой молекулы (табл. 1).

Таблица Сравнение аминокислотных последовательностей NSP4 разных генотипов в регионе цитоплазматического домена белковой молекулы 140 150 160 обобщенная HDNLIVRPVD VIDMSKEFNQ KNIKTLDEWE SGKNPYEPKE VTASM последовательность NSP4 G[P]-тип генотип _T G1P[8]-1 B S_ _ G1P[8]-2 B K_ S_ _ G3P[8]-2 B Y_ T_T_ N_ _ _ _ _ _ _ I _ _ G4P[8]-2 B _AK_ S_ _ G4P[9] B K_A_ S_ _ G1P[6]-2 B K_ S_ _ G2P[4] A Y_KST_ E_TI VRE_ _A_ G3P[6] A K_M_T_ D_TI _ _ V _ _ _E _ _ _ _T _A_ G9P[6] A K_M_T_ E_TI _ _ V _ _ _E _ _ _ _A_ G3P[9] C MIK_ K _ _ _ T Q _I _ _ R Q F _ _ _N _ _ T E_ E _ _ _ _ _ _ _ L Обобщенная последовательность, составлена из наиболее часто встречающихся аминокислотных оснований Известно, что регион, соответствующий цитоплазматической части белковой молекулы обладает выраженной функциональной активностью, NSP4, характеризуется высокой вариабельностью и отвечает за проявление энтеротоксических свойств NSP4, а аминокислотные замены в нем могут изменять (снижать) способность энтеротоксина индуцировать диарею и обуславливать различные клинические проявления ротавирусной инфекции [Huang H. et al., 2004;

Обнаружено, что и в цитоплазматической части, и в Deepa R.,2007].

трансмембранном регионе молекулы NSP4 имеются специфичные, свойственные определенному NSP4-генотипу, а также уникальные замены аминокислот. Однако обнаруженные замены не влияли на мембранодестабилизирующую активность энтеротоксина.

Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что разработанная нами методика ПЦР с использованием сконструированных праймеров явилась методической базой для изучения первичной структуры гена NSP4 у различных штаммов ротавируса человека, актуальных для территории России. С использованием оптимизированной методики синтезированы кДНК полноразмерного гена NSP4 и его открытой рамки считывания ротавирусов группы А человека. Впервые показана принадлежность российских изолятов ротавирусов к трем из 11-ти известных NSP4 генотипов – А (Е2), В (Е1), С (Е3), c доминированием штаммов, относящихся к генотипу NSP4-В. Проведенный на основе последовательности гена NSP сравнительный анализ, выявил филогенетическое родство ротавирусов типа G1P[8] со штаммами из Скандинавских стран, а G3 cеротипа – со штаммами из стран Юго Восточной Азии. Установлено, что изоляты ротавируса G1-, G3-, G4- и P[8] типов являются близкородственными ротавирусам свиней, G3P[6]-, G3P[9]- и G2P[4] типов – ротавирусам крупного рогатого скота и G3P[9] типа – ротавирусам кошек. Эти данные свидетельствуют об эволюционных связях между ротавирусами человека и животных. Созданы генетические конструкции на основе вектора pET22b, содержащие открытую рамку считывания гена NSP4 разных генотипов. Получена экспрессия NSP4 в составе рекомбинантных плазмид в бактериальной культуре E.coli шт.BL21(DE3)codon plus. Присутствие NSP4 в культуре E.coli после индукции экспрессии подтверждено методом элетрофореза в полиакриламидном геле.

Установлено, что экспрессия NSP4 исследуемых изолятов ротавируса, выделенных от детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции, характеризовалась эффектом торможения роста бактериальной культуры, что свидетельствует о сходных мембранодестабилизирующих свойствах разных генотипов ротавируса.

NSP Обнаруженные замены аминокислот в трансмембранном и цитоплазматическом доменах белковой молекулы NSP4 исследуемых изолятов ротавируса были генотипспецифическими и не влияли на способность энтеротоксина перфорировать мембраны клеток E.coli.

ВЫВОДЫ 1. Разработаны оригинальные версии праймеров для универсальной амплификации кДНК полноразмерного гена энтеротоксина NSP4 ротавирусов группы А и его открытой рамки считывания.

2. Впервые установлены NSP4-А (Е2), -В (Е1) и С (Е3) генотипы российских изолятов ротавирусов группы А разных G[P]-типов. Изоляты ротавируса, характеризующиеся генотипом NSP4-В (Е1), доминировали.

3. Установлены филогенетические связи по гену NSP4 российских изолятов ротавируса G1P[8] типа со штаммами ротавируса из Скандинавских стран, а G cеротипа со штаммами из стран Юго-Восточной Азии.

4. Впервые установлено родство по гену NSP4 российских изолятов ротавирусов G1, G3, G4 генотипов и P[8] типа с ротавирусами свиней, G3P[6], G3P[9] и G2P[4] типов с ротавирусами крупного рогатого скота и G3P[9] типа с ротавирусами кошек.

5. Созданы генетические конструкции pET22b-NSP4-G1P[8]-2, pET22b NSP4-G3P[9], pET22b-NSP4-G9P[6], экспрессирующие NSP4 в культуре E.coli, штамм BL21(DE3) codon plus. Экспрессия сопровождалась торможением экспоненциального роста культуры E.coli независимо от типа NSP4.

6. Установлено, что замены аминокислот в вариабельных регионах белковой молекулы NSP4 не влияют на способность ротавирусного энтеротоксина дестабилизировать мембраны клеток E.coli.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Пономарева Н.В. Синтез полноразмерной кДНК гена NSP4 ротавируса группы А / Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Савельев Р.С., Новикова Н.А. // Вестник ННГУ.

2006. № 11. С. 139-141.

2. Пономарева Н.В. Изучение связи клинических проявлений ротавирусной инфекции с аминокислотными заменами в последовательности энтеротоксина NSP4 / Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Новикова Н.А. // Вестник военно-медицинской академии. Санкт-Петербург. 2008. № 22. C. 546-547.

3. Новикова Н.А. Анализ нуклеотидных последовательностей гена NSP ротавирусов группы А, изолированных в Нижнем Новгороде / Новикова Н.А., Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Прилипов Г.А., Епифанова Н.В., Голицына Л.Н. // Вопросы Вирусологии. 2008. №6. C. 35-39.

II. Статьи, доклады, тезисы докладов региональных и всероссийских конференций:

1. Пономарева Н.В. Анализ последовательностей гена энтеротоксина NSP штаммов ротавируса человека / Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Новикова Н.А. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». СПб. 2006. С. 254-254.

2. Пономарева Н.В. Вариабельность гена энтеротоксина NSP4 ротавирусов человека // Докл. ХI нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины). Нижний Новгород. 2006. С. 196-197.

3. Пономарева Н.В. Генетические взаимосвязи ротавирусов человека и животных // Материалы Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (X Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»). СПб. 2007. С. 355-356.

4. Пономарева Н.В. Генетические взаимоотношения между ротавирусами человека, выделенными в России и других регионах мира // Докл. ХII нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины). Нижний Новгород. 2007.

С. 24-25.

5. Пономарева Н.В. Энтеротоксин и его роль в патогенезе ротавирусной инфекции / Пономарева Н.В., Новикова Н.А. // Материалы юбилейной Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения». Нижний Новгород. 2009. С. 158-162.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.