авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Биохимические и генетические аспекты регуляции пролактином овариальной функции коров на молекулярном и клеточном уровнях

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВА ИРИНА ЮРЬЕВНА БИОХИМИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛАКТИНОМ ОВАРИАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ КОРОВ НА МОЛЕКУЛЯРНОМ И КЛЕТОЧНОМ УРОВНЯХ 03.01.04 – Биохимия 03.02.07 – Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы 2010

Работа выполнена на кафедре генетики, разведения и биотехнологии живот ных зооинженерного факультета Федерального государственного образова тельного учреждения высшего профессионального образования Санкт Петербургский государственный аграрный университет.

доктор сельскохозяйственных наук, Научные консультанты:

профессор, академик РАСХН Эрнст Лев Константинович;

доктор биологических наук, профессор Голубев Александр Константинович доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич;

доктор биологических наук Маленко Галина Петровна;

доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич Ведущее учреждение: ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится 14 декабря 2010 года, в 10 часов, на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государст венном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский ин ститут животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубро вицы, ГНУ ВИЖ РАСХН, т/факс (4967) 65-11-01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЖ РАСХН.

Автореферат разослан « » _2010 года.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03 И.В. Гусев 1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы воспроизводительная способность коров с высокой молочной продуктивностью неуклонно снижается, что связано с нарушением у них различных физиологических функций, в том числе овариальной (Chagas et al., 2007;

Dobson et al., 2007). Дисфункция яичников у высокопродуктив ных животных приводит к неполноценному развитию доминантных фолликулов, изменению стероидогенеза, снижению жизнеспособности ооцитов и их компетен ции к эмбриональному развитию. Как известно, гонадотропные гормоны являются ключевыми регуляторами фолликуло- и оогенеза у млекопитающих, однако харак тер их секреции изменяется лишь незначительно у молочных коров с пониженной воспроизводительной способностью (Gong, 2002). В качестве основных эндокрин ных факторов, связанных с ослаблением овариальной активности у высокоудойных коров, обычно рассматриваются метаболические гормоны (Gong, 2002;

Chagas et al., 2007). Важную роль в этих условиях также может играть гипофизарный гормон ПРЛ, основной функцией которого является регуляция репродукции млекопитаю щих (Bachelot, Binart, 2007). Ряд данных указывает на то, что нарушения в прове дении сигнала ПРЛ в овариальные клетки на рецепторном или пострецепторном уровне приводят к ухудшению фертильности самок, в том числе к неадекватному развитию фолликулов, снижению качества ооцитов, оплодотворяемости яйцекле ток и их способности к дальнейшему развитию (Jinno et al., 1997;

Bole-Feysot et al., 1998;

Bartke, 1999). Таким образом, становится актуальным вопрос о роли ПРЛ в регуляции овариальной функции у крупного рогатого скота, в том числе на моле кулярном и клеточном уровнях. Особый интерес представляет изучение влияния ПРЛ на развитие биологически полноценных яйцеклеток, что связано с возможно стью его использования при экстракорпоральном созревании ооцитов коров для повышения их компетенции к эмбриональному развитию (Кузьмина и др., 2001).

В настоящее время имеется лишь незначительное число работ, затрагивающих вопросы влияния ПРЛ на созревание фолликулов и ооцитов у крупного рогатого скота (КРС). Поэтому комплексное исследование путей и механизмов действия ПРЛ на соматические и половые клетки овариальных фолликулов коров имеет ак туальное значение как для понимания фундаментальных принципов гормональной регуляции фолликуло- и оогенеза, так и для оптимизации методов биотехнологии репродукции у КРС.

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлось ис следование биохимических и генетических аспектов регуляции пролактином ова риальной функции коров на молекулярном и клеточном уровнях и создание на этой основе теоретической модели, описывающей механизмы влияния ПРЛ на мейоз ооцитов и функциональную активность фолликулярных клеток. В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать физиологические факторы, связанные с репродуктив ным статусом животных и стадией развития/атрезии фолликулов, детерминирую щие содержание ПРЛ в фолликулярной жидкости.

2. Охарактеризовать взаимодействие ПРЛ со своими рецепторами на клетках гранулезы и его зависимость от интрафолликулярных компонентов и степени зре лости фолликулов.

3. Оценить роль онтогенетических и гормональных факторов в регуляции компетентности гранулезных клеток к связыванию ПРЛ.

4. Провести анализ экспрессии альтернативных изоформ рецептора ПРЛ в овариальных клетках различного типа.

5. Изучить характер действия ПРЛ на экспрессию собственного рецептора в фолликулярных клетках в зависимости от их сопряжения с ооцитом.

6. Выполнить сравнительный анализ индивидуального и совместного влияния ПРЛ и метаболических гормонов in vitro на функциональную активность соматиче ских клеток из антральных фолликулов.



7. Исследовать регуляторные эффекты ПРЛ при созревании ооцитов, окру женных клетками кумулюса, в различных системах культивирования.

8. Провести сравнительную оценку участия клеток гранулезы в опосредова нии действия ПРЛ и соматотропного гормона in vitro на ооцит-кумулюсные ком плексы.

9. Охарактеризовать влияние ПРЛ in vitro на цАМФ-зависимый механизм ре гуляции созревания изолированных и окруженных кумулюсом ооцитов.

10. Изучить участие клеток кумулюса в проведении сигналов ПРЛ в половые клетки и оценить роль протеинкиназ как медиаторов гормонального действия на ооциты и ооцит-кумулюсные комплексы.

11. Идентифицировать сигнальный каскад, опосредующий влияние ПРЛ на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза.

12. Исследовать функцию клеток кумулюса в реализации влияния ПРЛ на приобретение ооцитами способности к эмбриональному развитию в присутствии гонадотропных гормонов.

Научная новизна. Диссертационная работа является первым комплексным исследованием характера, путей и механизмов влияния ПРЛ на половые и сомати ческие клетки антральных фолликулов коров, а также факторов, детерминирующих реализацию и степень гормонального воздействия. При выполнении работы впер вые были получены следующие результаты:

Установлена зависимость содержания ПРЛ в фолликулярной жидкости от фа зы полового цикла животных и степени атрезии антральных фолликулов. Опреде лены параметры взаимодействия ПРЛ со своими рецепторами на клетках грануле зы и обнаружено снижение концентрации лактогенных рецепторов на заключи тельной стадии созревания фолликулов. Охарактеризовано влияние репродуктив ного статуса животных, лютеальной дифференцировки и воздействия соматотро пина на компетентность клеток гранулезы к связыванию ПРЛ. Выявлено присутст вие мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в ооцитах и клетках куму люса и гранулезы и показан тканеспецифический характер экспрессии этих альтер нативных изоформ в яичнике коров. Продемонстрировано регуляторное влияние ПРЛ in vitro на экспрессию собственного рецептора в ооцит-кумулюсных комплек сах на уровне транскрипции соответствующего гена и в клетках гранулезы – на уровне альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Показана зависимость ростостиму лирующего эффекта ПРЛ в культуре гранулезных клеток от степени зрелости ан тральных фолликулов и выявлена модуляция соматотропином регуляторного дей ствия ПРЛ на синтез ДНК в этих клетках. Обнаружено ингибирующее влияние ПРЛ на деструктивные процессы в культивируемых клетках гранулезы из атрети ческих фолликулов. Продемонстрировано in vitro стимулирующее действие ПРЛ на ядерное созревание окруженных кумулюсом ооцитов, а также его тормозящее дей ствие на дегенеративные изменения ядерного материала в яйцеклетках, связанное с освобождением ионов кальция из внутриклеточных депо. Охарактеризована роль клеток гранулезы как медиаторов влияния ПРЛ на мейотические преобразования хромосом в ооцитах. Установлено участие тирозинкиназ в реализации прямого и опосредованного клетками кумулюса действия ПРЛ на мейоз ооцитов. Выявлено взаимодействие сигнальных каскадов, активируемых ПРЛ и цАМФ в половых и соматических клетках фолликулов. Идентифицирован механизм индуцирующего влияния ПРЛ на реинициацию мейоза при повышении внутриклеточного уровня цАМФ, включающий активацию фосфодиэстеразы 3 и последующее снижение уровня цАМФ в ооцитах. Показано участие клеток кумулюса в опосредовании стимулирующего влияния ПРЛ на цитоплазматическое созревание ооцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Основной конструк тивной характеристикой работы является полученная информация, необходимая для понимания фундаментальных механизмов, лежащих в основе регуляции про лактином созревания фолликулов и ооцитов у крупного рогатого скота, которая может быть использована при оптимизации методов вспомогательных репродук тивных технологий. На основании полученных данных предложена и научно обос нована теоретическая модель, описывающая механизмы действия ПРЛ на мейоз ооцитов и функциональную активность клеток кумулюса. Модернизирована сис тема созревания in vitro ооцит-кумулюсных комплексов коров посредством пред варительной синхронизации мейоза с помощью изобутилметилксантина и после дующего одновременного введения в среду гонадотропных гормонов и ПРЛ, обу словливающая повышение качества цитоплазматического созревания ооцитов и эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота. Разработаны сис темы культивирования ооцит-кумулюсных комплексов в средах, кондициониро ванных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ и соматотропина, позволяющие снижать частоту хромосомных нарушений при созревании ооцитов. Предложено использование ПРЛ для снятия блокады мейоза, вызванной цАМФ-повышающими реагентами.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Содержание ПРЛ в фолликулярной жидкости коров зависит от фазы полового цикла, степени зрелости и атрезии фолликулов.

• Компетентность клеток гранулезы к связыванию ПРЛ детерминируется уров нем цитодифференцировки и не зависит от репродуктивного статуса живот ных и воздействия соматотропина.

• В ооцитах, клетках кумулюса и гранулезы коров присутствует мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ;

экспрессия альтернативных изоформ но сит тканеспецифический характер и регулируется гомологичным гормоном.

• ПРЛ оказывает in vitro ростостимулирующее действие на клетки гранулезы, которое определяется степенью зрелости фолликулов и модулируется сомато тропином и инсулином, а также тормозящее действие на деструктивные про цессы в этих клетках.

• У коров функционируют три автономных пути реализации влияния ПРЛ на ооцит: 1) прямой, 2) через сопряженные с ооцитом клетки кумулюса и 3) опо средованный клетками гранулезы.

• Прямое и опосредованное кумулюсом влияние ПРЛ на ооциты достигается путем активации тирозинкиназ при базальном уровне внутриклеточного цАМФ.

• цАМФ играет роль триггера специфического сигнального каскада, индуци руемого пролактином непосредственно в ооцитах, который вовлекает актива цию фосфодиэстеразы 3 и последующее снижение уровня цАМФ, что приво дит к реинициации мейоза.

• Клетки кумулюса опосредуют стимулирующее влияние ПРЛ в присутствии гонадотропных гормонов на компетенцию ооцитов к последующему эмбрио нальному развитию.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 23 меж дународных научных конференциях: «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных» (С.-Петербург– Пушкин, 1994), «Селекционно-биотехнологические методы повышения генетиче ского потенциала с.-х. животных» (Киев, 1994), «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 1995;

2000), 1-й центральной европейской конферен ции по репродукции животных и сателлитном симпозиуме (Ольштын, Польша;

Думмерсторф, Германия, 1996), «Проблемы индивидуального развития с.-х. жи вотных» (Киев, Украина, 1997), ежегодной конференции Международного Обще ства по трансплантации эмбрионов (Бостон, США, 1998;

Сан Диего, США, 2009), 3-й конференции по эндокринологии сельскохозяйственных животных (Брюссель, Бельгия, 1998), ежегодной конференции Европейской Ассоциации Животноводства (Цюрих, Швейцария, 1999;

Рим, Италия, 2003), 8-м и 11-м конгрессе по биотехно логии в репродукции животных (Бернбург, Германия, 2001;

Велке Лосины, Чехия, 2004), 8-й Балтийской конференции по разведению и генетике животных (Каунас, Литва, 2002), ежегодной конференции Европейского Общества по репродукции домашних животных (Парма, Италия, 2002), «Рецепция и внутриклеточная сигна лизация» (Пущино, 2005;

2009), «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (Дубровицы, 2007), «Проблемы повышения эффективности производ ства животноводческой продукции» (Жодино, Белоруссия, 2007), «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (Дубро вицы, 2008), «Новые аспекты биотехнологии репродукции животных» (С. Петербург, 2008), «Актуальные проблемы ветеринарной биологии» (Москва, 2009), а также на 1-ом съезде общества генетиков и селекционеров России (Саратов, 1994), Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» и «Культиви руемые клетки как основа клеточных технологий» (С.-Петербург, 1999, 2009).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опуб ликовано 65 научных работ, из них 18 – в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК («Биохи мия», «Журнал эволюционной биохимии и физиологии», «Онтогенез», «Цитоло гия», «Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова», «Сельскохозяй ственная биология», «Theriogenology»).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 371 странице, содержит 43 таблицы, 51 рисунок и состоит из следующих разделов: введения, об зора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических предложений и библиографического списка, включающего 575 цитируемых источников.

Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность своим научным консультантам профессору Голубеву А.К. и академику РАСХН Эрнсту Л.К. за не оценимую помощь и поддержку. Автор искренне признателен сотрудникам ГНУ ВНИИГРЖ профессору Кузьминой Т.И., Денисенко В.Ю., Кибардиной Т.В., Скот ти О.С., сотрудникам ГНУ ВИЖ Волковой Н.А., Гладырь Е.А., Сингиной Г.Н., Та радайник Т.Е., а также сотруднику БиНИИ СПбГУ Гойло Т.А. за помощь в прове дении исследований. Особую благодарность автор выражает чл.-корр. РАСХН Зи новьевой Н.А. за всестороннюю поддержку и ценные советы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа была выполнена в период с 1993 по 2009 гг. Экспериментальные ис следования проводились на кафедре генетики, разведения и биотехнологии живот ных Санкт-Петербургского государственного аграрного университета (СПбГАУ), в отделе биотехнологии ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии, в Центре биотехноло гии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии и в от деле ветеринарной репродукции Копенгагенского университета. Схема исследова ний представлена на рисунке 1.

Яичники коров Желтое Морфологическая Антральные тело (ЖТ) оценка фолликулы Ооцит-кумулюсные Фолликуляр- РИА Клетки комплексы (ОКК) ная жидкость концентрации гранулезы (ФЖ) пролактина (ПРЛ) (КГ) Клетки Культиви Денудиро Монослойная ОТ-ПЦР кумулюса рование ванные культура анализ мРНК (КК) ОКК ооциты (ДО) рецептора ПРЛ Цитогенетиче Культивиро Суспензион- ский анализ Анализ Получение вание ДО ное культиви- ооцитов интенсивно- кондицио рование сти синтеза нированных Оплодотворе Культивирова ДНК сред ние ооцитов ние эмбрионов Бессыворо точная РИА концентрации инкубация эстрадиола и Цитогенетиче- Морфо прогестерона ский анализ функциональная зигот и характеристика Оценка эмбрионов КК жизнеспособно Радиорецептор сти КГ и цито- ИФА содержа- Флуоресцентный ный анализ генетический ния цАМФ в анализ содержа лактогенных анализ КГ ооцитах и ния депонирован рецепторов ного Са2+ ОКК Рис. 1. Общая схема исследований.

Объектом исследований служили антральные фолликулы, ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК), клетки гранулезы (КГ) и жидкость из антральных фолликулов, а также желтое тело (ЖТ) яичников коров и телок. Во всех экспериментах исполь зовали половозрелых животных с эстральным циклом, что подтверждалось присут ствием функционального или регрессирующего желтого тела в одном из яичников.

В отдельном исследовании (раздел 3.3.1) использовали коров на ранней стадии стельности (до 3-х месяцев) и неполовозрелых 2–6-месячных телок. Фазу эстраль ного цикла животных (раздел 3.1.1) определяли путем обследования попарно яич ников, основываясь на наличии и состоянии желтого тела (Голубев и др., 1989).

Качество антральных фолликулов (раздел 3.1.2) оценивали на основании известных морфологических критериев (Kruip, Dieleman, 1982). Фолликулярную жидкость (ФЖ) и КГ получали из фолликулов диаметром 1–2, 3–5, 6–10 и 11–20 мм, объеди ненных в группы на основании предложенной ранее классификации (Savio et al., 1990). Сразу после выделения из фолликулов и в конце культивирования проводи ли оценку жизнеспособности КГ и исследование их ядерного статуса. Долю живых клеток в суспензии определяли с помощью окрашивания 0,1 %-ным трипановым синим. Цитогенетический анализ состояния ядерного материала в КГ проводили после их фиксации смесью метанола и уксусной кислоты (3:1) и окрашивания азу ром-эозином. Наличие деструктивных изменений в клетках оценивали на основа нии морфологических критериев, разработанных ранее для клеток гранулезы, под вергающихся апоптозу (Jolly et al., 1997). Концентрацию ПРЛ в ФЖ и сыворотке крови определяли твердофазным радиоиммунологическим методом (Тараненко и др., 1975). ОКК выделяли из фолликулов диаметром 2-8 мм и промывали в среде ТС-199, содержащей 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 10 мкг/мл гепарина. В некоторых экспериментах в промывочную среду добавляли изобутил метилксантин (ИБМК) до конечной концентрации 0,5 мМ (разделы 3.11 и 3.12).

Для исследований отбирали ооциты округлой формы, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компакт ным кумулюсом. Диссоциацию клеток кумулюса (КК) проводили путем обработки ОКК коллагеназой II (2 мг/мл) в течение 20 мин при 37 °С. Для анализа экспрессии рецепторов ПРЛ использовали развитое ЖТ, которое хранили при –70°С.

В экспериментах применяли препараты гипофизарного бычьего ПРЛ (Эндок ринологический научный центр РАМН, Москва), рекомбинантного бычьего сома тотропного гормона (СТГ;

Monsanto, США) и бычьего инсулина (Sigma, США).

Изучение специфического связывания 125I-ПРЛ и 125I-СТГ с КГ выполняли стандартным методом, основанным на образовании комплекса: меченый гормон рецептор (Варфоломеев, Зайцев, 1982). Реакционную смесь, состоящую из 100 мкл клеточной суспензии (от 0,2х106 до 3,0х106 клеток), 50 мкл инкубационного буфера и 50 мкл 125I-ПРЛ (5–7 нг, 500000–700000 имп/мин) или 125I-СТГ (5–7 нг, 350000– 600000 имп/мин), инкубировали 42 ч при температуре 37°С. В качестве основного служил буфер следующего состава: 10 мМ Tris-HCl, 1 мг/мл БСА, 5 мМ MgCl2, 0, мг/мл мертиолата, рН 7,1. Дополнительно использовали тот же буфер, содержащий MgCl2 в различной концентрации (0, 1, 5, 35 и 70 мМ). Радиоиодирование гормонов проводили модифицированным хлораминовым методом (Тараненко и др., 1975).





Неспецифическое связывание меченых гормонов определяли в присутствии избыт ка соответствующих немеченых гормонов в концентрации 250 мкг/мл. Кривые за мещения получали при инкубации клеточной суспензии (1х106–2х106 клеток) с ме ченым ПРЛ (в фиксированной концентрации) в присутствии возрастающих кон центраций немеченого ПРЛ (2,5–50 мкг/мл). Связывающие характеристики рецеп торов ПРЛ определяли путем обработки данных замещения с помощью графиче ского метода Скэтчарда (Scatchard, 1949). Для изучения конкурентного связывания ПРЛ и СТГ с гранулезными клетками смесь суспензии клеток и 125I-ПРЛ (в фикси рованной концентрации) инкубировали с немеченым ПРЛ или СТГ в возрастающей концентрации (5–125 мкг/мл). Кроме того, было определено специфическое связы вание 125I-ПРЛ с клетками в присутствии 125 мкг/мл овечьего ФСГ (NIAMDD, США), бычьего ЛГ (USDA-Reproduction Lab., США) и инсулина.

Для получения монослойной культуры КГ предварительно культивировали при 38,5°С в атмосфере с 5 % СО2 в течение 24 ч в среде ТС-199, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС), затем в течение последующих 24 ч – в среде ТС-199, содержащей 10 % ФБС и 0–500 нг/мл ПРЛ (раздел 3.5.2) или 48 ч – в среде ТС-199, содержащей 10 % ФБС и 50 нг/мл ПРЛ или 10 нг/мл СТГ (раздел 3.8). Для вызывания лютеинизации гранулезных клеток (раздел 3.3.2) последние инкубиро вали в среде ТС-199, содержащей 6 мг/мл БСА, в течение 24 или 48 ч. В опытные группы вносили 5, 10 или 50 нг/мл СТГ. Культивирование клеток в суспензии (раз дел 3.6.3) проводили в стеклянных флаконах при непрерывном встряхивании ( об/мин) в течение 24 и 48 ч в среде ТС-199, содержащей 2 мг/мл БСА, в отсутствие и в присутствии 50 нг/мл ПРЛ, 50 нг/мл СТГ или 100 нг/мл инсулина. Во всех экс периментах была использована суспензия с начальной концентрацией КГ от 1х до 2,5х106 на 1 мл среды. Доля живых клеток в суспензии составляла более 60 %, за исключением исследования фолликулов на ранней стадии атрезии (раздел 3.6.3).

Концентрацию эстрадиола-17 и прогестерона в средах, полученных после культи вирования КГ, определяли в институте биологии сельскохозяйственных животных (Думмерсторф, Германия) методом радиоиммуноанализа (РИА). Интенсивность синтеза ДНК в КГ оценивали по интенсивности включения в их ДНК 3Н-тимидина.

Для этого по (510)х104 клеток высевали в лунки 96-луночных планшетов и инку бировали в течение 1 суток в среде ТС-199, содержащей 5 % ФБС, затем в течение 2 суток – в той же среде, содержащей 0,1 % ФБС. Далее среду со сниженной кон центрацией сыворотки заменяли средами, содержащими ПРЛ в различных концен трациях (от 5 нг/мл до 50 мкг/мл). В качестве сред использовали ТС-199 без доба вок или ТС-199, содержащую 5 % ФБС или инсулин (100 нг/мл) или СТГ (5 и нг/мл). Одновременно с гормонами в лунки вносили 3Н-тимидин (37 кБк/мл), клет ки инкубировали 24 ч и определяли включение в них изотопа (Адамс, 1983).

Анализ экспрессии мРНК выполняли методом обратной транскрипции, со вмещенной с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Синтез комплементарной ДНК (кДНК) осуществляли на матрице тотальной РНК (тотРНК). Для получения тотРНК использовали (1-2)х106 КГ или КК, 70-100 денудированных ооцитов (ДО), 100-150 ОКК или 25-50 мг ткани желтого тела. Выделение тотРНК осуществляли с применением реактива TRI Reagent (Sigma) в соответствии с инструкцией фирмы производителя. Процедуру синтеза первой цепи кДНК выполняли с помощью на бора “RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit” (Fermentas) согласно ин струкции фирмы-производителя при использовании случайных 6-мерных прайме ров (0,2 мкг праймеров на 2 мкг тотРНК). ПЦР проводили в инкубационной смеси объемом 15 мкл, содержащей однократный буфер для Taq-полимеразы, 200 мкМ dNTP, 1 ед.акт. Taq-полимеразы, 1,5 мМ MgCl2 и 2 мкл смеси реакции ОТ или воды (отрицательный контроль). В пробы добавляли по 5 пМ прямого и обратного прай меров для амплификации кДНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ (табл. 5) или -актина быка (Degen et al., 1983). Амплификацию кДНК проводили в следующих режимах: 95 С 30 с, 54 С 30 с, 72 С 90 с, 40 циклов (рецептор ПРЛ) и 95 С 30 с, 60 С 30 с, 72 С 90 с, 40 циклов (-актин). В случае ооцитов был приме нен метод ПЦР с внутренними праймерами. Первый раунд ПЦР проводили в соот ветствии с вышеописанной методикой. Во втором раунде ПЦР в реакционную смесь вносили 1 мкл амплификата, полученного в ходе первого раунда для длин ной или короткой изоформы рецептора ПРЛ (вместо продуктов реакции ОТ), и по пМ прямого и обратного праймеров (табл. 5). Амплификацию проводили в течение 30 циклов в вышеуказанном режиме. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в %-ном агарозном геле и фотодокументировали. Соотношение уровней длинной и короткой изоформ мРНК рецептора ПРЛ в соматических клетках определяли кине тическим методом, основанным на анализе накопления продуктов конкурентной ПЦР. С этой целью в реакционную смесь вносили комбинацию праймеров одно временно для обеих изоформ. Амплификацию проводили в вышеуказанном режиме в течение 34–40 циклов. Относительную интенсивность полос на геле, соответст вующих ПЦР-продуктам, определяли с помощью компьютерной программы Total Lab v2.01. Полученные данные были нормализованы на длину фрагментов. В каж дом эксперименте вычисляли среднее значение соотношения продуктов конку рентной амплификации для нескольких циклов ПЦР. Для полуколичественной оценки содержания мРНК рецептора ПРЛ в культивируемых КГ и ОКК проводили анализ кинетики амплификации. С этой целью параллельно амплифицировали уча сток кДНК рецептора ПРЛ, общий для обеих изоформ, участки кДНК рецептора ПРЛ, специфичные для длинной или короткой изоформ, и фрагмент кДНК актина (внутренний стандарт). В реакционную смесь добавляли по 20 пМ прямого и обратного праймеров для рецептора ПРЛ (табл. 5) или по 2 пМ соответствующих праймеров для -актина (прямой праймер: 5'-AGATGACCCAGATCATGT-3', об ратный праймер: 5'-AGGTAGTTTCGTGAATGC-3'). Амплификацию кДНК выпол няли в следующем режиме: 95 С 30 с, 54 С 30 с, 72 С 60 с, 34–40 циклов. Относи тельную интенсивность полос на геле определяли по вышеописанной методике.

Содержание мРНК рецептора ПРЛ выражали в относительных единицах (о.е.) ин тенсивности сигнала ПЦР-продуктов для -актина.

Культивирование ОКК и ДО проводили при температуре 38,5°С в атмосфере с 5 % СО2 и 90%-ной влажностью. Время инкубации составляло от 2,5 до 24 ч. В ка честве контроля применяли несколько систем культивирования: 1) среду ТС-199, содержащую 10 % ФБС, 2,5 мМ лактата кальция, 2 мМ пирувата натрия и мкг/мл гентамицина (основная среда), 2) основную среду, содержащую 500 нг/мл эстрадиола-17 (Serva, Германия) и 15 мкг/мл свиного ФСГ (Sigma), 3) основную среду, содержащую 500 нг/мл эстрадиола-17, 15 мкг/мл свиного ФСГ и 6 мг/мл БСА (вместо 10 % ФБС), 4) основную среду, кондиционированную клетками гра нулезы. В зависимости от цели эксперимента в среду вносили: ПРЛ (от 5 до нг/мл;

20 МЕ/мг), дибутирил цАМФ (0,5;

1 или 2 мМ;

Sigma), форсколин (5, 10 или 20 мкМ;

Sigma), теофиллин (2,5;

5 или 10 мМ;

ICN, США), генистейн (5, 10 или мкг/мл;

ICN), калпостин С (100 нМ;

Calbiochem, Германия), ИБМК (0,5 мМ;

Sigma), цилостамид (20 мкМ;

Biomol, США), ролипрам (100 мкМ;

Biomol). В серии экспериментов по оплодотворению ооцитов ОКК и ДО культивировали в течение 22 ч в 500 мкл среды ДМЕМ, содержащей 10 МЕ/мл лошадиного ХГ и 5 МЕ/мл че ловеческого ХГ (Intervet Scandinavia, Дания), 1 мг/мл глюкозы, 1 мМ пирувата на трия, 4 мМ глутамина, 5 % эстральной сыворотки коров и 50 мкг/мл гентамицина.

Среда в опытных группах содержала дополнительно 50 нг/мл ПРЛ. В конце 24 часового периода культивирования ОКК оценивали морфологически на основании известных критериев степени экспансии кумулюса (Calder et al., 2001). Цитогене тический анализ состояния ядерного материала в КК проводили, как описано выше для КГ. Содержание Са2+ во внутриклеточных депо ооцитов определяли по интен сивности флуоресценции комплекса Са-хлортетрациклин при облучении ультра фиолетовым излучением (Engelmann et al., 1990). Интенсивность свечения измеря ли с помощью люминесцентного микроскопа, снабженного фотометрической на садкой. Флуоресценцию возбуждали при длине волны 380-400 нм, излучение реги стрировали при длине волны 520±10 нм. Перед проведением анализа морфологиче ски нормальные ооциты очищали от кумулюса, помещали в кварцевые ячейки с физиологическим раствором, содержащим 40 мкМ хлортетрациклина, и инкубиро вали при 37°С в течение 5 мин. Интенсивность флуоресценции ооцитов измеряли как электрический сигнал. Из полученных значений вычитали величину фонового излучения. Содержание депонированного Са2+ выражали в условных единицах (у.

е.) интенсивности флуоресценции ооцитов. Концентрацию цАМФ в ОКК и ооцитах определяли методом иммуноферментного анализа (Bilodeau-Goeseels, 2003). Каж дый образец для анализа содержал группы из 20-40 ДО, 5-10 ОКК диаметром 0,35– 0,40 мм или 20-40 ооцитов, изолированных из ОКК после культивирования. Все манипуляции с клетками до и после 3,5-часового культивирования проводили в промывочной среде, содержащей 0,5 мМ ИБМК. Перед анализом ДО, ОКК или ооциты, изолированные из ОКК, инкубировали при комнатной температуре в тече ние 20 мин в 200 мкл 0,1 М HCl. Образцы центрифугировали при 12000 g 5 мин, супернатант хранили при –20 °С. Концентрацию цАМФ в образцах измеряли с по мощью наборов “Cyclic AMP Plus Enzyme Immunoassay Kit” после процедуры аце тилирования согласно инструкции фирмы Biomol. Оплодотворение ооцитов вы полняли по методу Парриша и соавт. (Parrish et al., 1986). Культивирование эм брионов проводили в синтетической жидкости яйцевода, содержащей 5 % эстраль ной сыворотки коров, 0,3 мМ цитрата натрия, 2,8 мМ миоинозитола, 0,2 мМ глута мина и комплекс аминокислот (Holm et al., 1999), при температуре 38,5°С в атмо сфере с 5 % СО2, 5 % О2 и 90 % N2. Через 48 ч после процедуры оплодотворения определяли выход эмбрионов, на 5-й и 8-й день – выход морул и бластоцист. Для цитогенетического исследования ядерного материала ооцитов, зигот и эмбрионов готовили суховоздушные препараты по методу Тарковского (Tarkowski, 1966).

Все эксперименты были выполнены в 3-7 независимых повторностях. Данные обрабатывали методом 2 или дисперсионным анализом при помощи программы SigmaStat. Достоверность различия сравниваемых значений оценивали с использо ванием критерия 2 или Тьюки, при этом был принят уровень значимости p 0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Идентификация физиологических факторов, детерминирующих ин трафолликулярное содержание пролактина у коров. Концентрация ПРЛ в ФЖ является одним из биохимических показателей степени гормонального влияния на фолликулярные клетки. В свою очередь, вариации в интрафолликулярном содер жании ПРЛ могут быть следствием различных физиологических изменений, про исходящих в процессе развития или регрессии фолликулов.

3.1.1. Содержание пролактина в фолликулярной жидкости и сыворотке крови в разные фазы эстрального цикла. Интенсивность процессов, связанных с развитием или регрессией антральных фолликулов в яичниках КРС, в значительной степени зависит от фазы полового цикла (Driancourt, 2001). В этой связи был про веден сравнительный анализ содержания ПРЛ у коров в жидкости фолликулов раз личного диаметра в разные фазы эстрального цикла. Концентрация ПРЛ в ФЖ воз растала (p 0,05) в фолликулярную фазу при увеличении диаметра фолликулов от 3–5 до 11–20 мм (табл. 1). В лютеальную фазу не было выявлено достоверных раз личий в интрафолликулярном содержании гормона между фолликулами разного размера. Также было обнаружено, что концентрация ПРЛ в жидкости малых фол ликулов выше в лютеальную, чем в фолликулярную фазу цикла (p 0,01). При этом концентрация ПРЛ в сыворотке крови коров в лютеальную фазу в 2 раза пре вышала таковую в фолликулярную фазу (60,0±8,3 против 29,7±5,9 нг/мл, p 0,05).

Таблица 1. Концентрация ПРЛ у коров в жидкости антральных фолликулов в фолликулярную и лютеальную фазы эстрального цикла Диаметр Число Концентрация ПРЛ в Число Концентрация ПРЛ в фолликулов, исследо- ФЖ в фолликулярную исследо- ФЖ в лютеальную фазу (x ± m), нг/мл фазу (x ± m), мм ванных ванных яичников яичников нг/мл а 7,0 ± 0,5в 3 – 5 (малые) 13 3,7 ± 0,7 6 – 10 (средние) 13 5,4 ± 0,5 29 7,2 ± 0, б 11 – 20 (большие) 9 6,1 ± 0,3 24 6,5 ± 0, а,б а,в Примечание. Достоверные различия: p 0,05;

p 0,01.

Таким образом, характер изменения концентрации ПРЛ в ФЖ в процессе рос та и развития фолликулов различается в разные фазы эстрального цикла. Выявлен ные отличия связаны в первую очередь с повышением содержания гормона в жид кости малых фолликулов в лютеальную фазу, что может быть обусловлено, по крайней мере частично, повышением секреции ПРЛ гипофизом в этот период.

3.1.2. Концентрация пролактина в жидкости фолликулов с различными признаками атрезии. В качестве основных причин гетерогенности антральных фолликулов по содержанию гормонов в ФЖ рассматриваются различия в их мик роваскуляризации и секреторной активности фолликулярных клеток, которые обу словлены разной интенсивностью протекания атретических процессов (Roche, 1996). Взаимосвязь между различными морфологическими признаками атрезии и концентрацией ПРЛ в ФЖ была исследована при использовании антральных фол ликулов диаметром 10–20 мм из яичников на стадии фолликулярного роста. Кон центрация ПРЛ в жидкости нормальных фолликулов с высокой степенью васкуля ризации была в 1,7 раза выше, чем в жидкости атретических фолликулов с низкой степенью васкуляризации (9,5±0,9 против 5,6±0,4 нг/мл, p 0,001). Содержание ПРЛ в ФЖ также уменьшалось в 1,5 раза (с 9,0±1,1 до 6,2±0,8 нг/мл, p 0,05) при увеличении доли пикнотических гранулезных клеток от 0–20 % до 40 %. Полу ченные данные показывают, что у коров снижение концентрации ПРЛ в ФЖ сопут ствует усилению атретических процессов в больших антральных фолликулах.

3.1.3. Изменение интрафолликулярного содержания пролактина и уровня его связывания с клетками в процессе роста антральных фолликулов. Спо собность клеток связывать гормон является одним из физиологических факторов, влияющих на его концентрацию в биологических жидкостях. В яичниках коров на стадии фолликулярного роста концентрация ПРЛ в ФЖ возрастала с 3,7±1,1 до 6,6±0,6 нг/мл при увеличении диаметра фолликулов от 1–2 до 6–10 мм (p 0,05).

Вместе с тем специфическое связывание 125I-ПРЛ с КГ из фолликулов диаметром 1–2, 3–5 и 6–10 мм не различалось. Увеличение фолликулярного диаметра до 11– мм приводило к значительному уменьшению уровня этого связывания (с 45,6±3, до 30,1±2,2 фМ на 106 клеток, p 0,05). Следовательно, в процессе созревания фолликулов в яичниках коров происходят разнонаправленные изменения двух ос новных параметров, характеризующих степень воздействия ПРЛ на КГ. При этом снижение ПРЛ-связывающей способности клеток имеет место на более поздней стадии развития фолликулов, чем повышение содержания гормона в ФЖ.

3.2. Биохимическая характеристика лактогенных рецепторов на клетках гранулезы из антральных фолликулов коров. Важным условием реализации влияния ПРЛ на фолликулярные клетки является наличие у них соответствующих специфических рецепторов, связывающие свойства которых определяют эффек тивность гормонального воздействия.

3.2.1. Анализ специфического связывания пролактина с клетками грану лезы. В этих экспериментах была использована смешанная популяция КГ из ан тральных фолликулов диаметром 1–10 мм. Было обнаружено, что специфическое связывание 125I-ПРЛ с клетками приближается к насыщению через 42 ч инкубации при 37°С. Линейная зависимость между специфическим связыванием и количест вом КГ наблюдалась при внесении от 0,5х106 до 3х106 клеток на пробу. Немеченые гонадотропные гормоны (ФСГ и ЛГ) и инсулин в концентрации 125 мкг/мл прояв ляли лишь незначительную способность вытеснять меченый ПРЛ из связывающих участков на клетках, что свидетельствовало о специфичности рецепторов. В то же время структурно родственный пролактину СТГ (5-125 мкг/мл) эффективно подав лял специфическое связывание 125I-ПРЛ с гранулезными клетками. Константы ин гибирования IC50, вычисленные на основании кривых замещения 125I-ПРЛ немече ным ПРЛ или СТГ, различались лишь незначительно, составляя соответственно 13,8±1,5 и 20,4±2,5 мкг/мл. Это позволяет предположить, что СТГ может модули ровать степень влияния ПРЛ на КГ коров.

3.2.2. Параметры взаимодействия пролактина с рецепторами на клетках из фолликулов различного диаметра. Связывающие характеристики гормональ ных рецепторов могут изменяться в процессе дифференцировки клеток, которая сопутствует созреванию антральных фолликулов (Fortune, 1994). Анализ данных замещения меченого ПРЛ немеченым в координатах Скэтчарда показал прямоли нейную зависимость специфического связывания гормона с КГ из фолликулов всех исследованных диаметров. Это предполагает существование одного типа ПРЛ связывающих участков на гранулезных клетках с различной степенью дифферен цировки. При увеличении диаметра фолликулов от 1–2 до 6–10 мм не было выяв лено существенных изменений в константах диссоциации ПРЛ-рецепторных ком плексов ((4,58±0,79)х10-7 М против (4,37±0,26)х10-7 М) и в концентрациях лакто генных рецепторов на клетках (11,30±1,60 против 11,07±1,50 пМ на 106 клеток). В то же время число ПРЛ-связывающих участков было значительно ниже (p 0,05) на клетках из фолликулов диаметром 11–20 мм, чем 3–5 мм, тогда как константы диссоциации не имели достоверных различий (табл. 2). Следовательно, у коров на заключительной стадии созревания фолликулов происходит снижение способности КГ связывать ПРЛ вследствие уменьшения концентрации лактогенных рецепторов.

Таблица 2. Параметры взаимодействия 125I-ПРЛ с рецепторами на клетках гранулезы из малых и больших антральных фолликулов коров Диаметр Концентрация Число Константа фолликулов, связывающих участков экспери- диссоциации Кd (x ± m), пМ на 106 клеток (x ± m), М мм ментов (5,13 ± 0,33) х 10-7 14,40 ± 1,08а 3–5 (5,61 ± 0,29) х 10-7 8,10 ± 1,21б 11 – 20 Примечание. Достоверные различия: а,бp 0,05.

3.2.3. Регуляторное влияние ионов магния на специфическое связывание пролактина с гранулезными клетками. Взаимодействие ПРЛ со своими рецеп торами на клетках-мишенях может зависеть не только от свойств самих рецепто ров, но и от состава внеклеточной среды, в том числе от концентрации двухвалент ных катионов (Ciccia-Torres, Dellacha, 1985). В этой связи было исследовано влия ние ионов Mg2+ на специфическое связывание ПРЛ с гранулезными клетками из фолликулов диаметром 1–10 мм. В реакционной смеси без добавления ионов Mg2+ было выявлено лишь незначительное специфическое связывание 125I-ПРЛ с клет ками. Внесение 1 мМ MgCl2 приводило к резкому возрастанию уровня этого связы вания (с 2,4±0,3 до 9,4±1,3 %, p 0,001), который продолжал достоверно повы шаться при дальнейшем увеличении концентрации двухвалентных катионов до мМ (по крайней мере, p 0,05). Вычисленные на основании кривых замещения па раметры связывания при разных концентрациях MgСl2 (0 и 5 мМ) свидетельствова ли о том, что снижение уровня специфического связывания 125I-ПРЛ в отсутствие экзогенных ионов Mg2+ обусловлено уменьшением числа активных связывающих участков на клетках (2,35±0,72 против 13,80±2,87 пМ на 106 клеток, p 0,05). Та ким образом, взаимодействие ПРЛ со своими рецепторами на КГ в высокой степе ни зависит от присутствия и концентрации ионов Mg2+ в окружающей среде.

3.3. Оценка роли онтогенетических и гормональных факторов в регуля ции пролактин-связывающей способности клеток гранулезы. К числу факто ров, влияющих на содержание рецепторов ПРЛ в клетках различного типа, отно сится возраст и репродуктивный статус животных, стадия развития и физиологиче ское состояние ткани. При этом основную роль в регуляции содержания лактоген ных рецепторов в клетках играют различные гормоны, в первую очередь половые стероидные гормоны, ПРЛ и структурно родственный ему СТГ (Kelly et al., 1991).

3.3.1. Связывание пролактина с клетками гранулезы при разном репро дуктивном состоянии животных. Периодическая инициация синхронного роста группы антральных фолликулов и их последующая атрезия происходят в яичниках КРС не только во время эстрального цикла, но также до половой зрелости и во время ранней стельности, однако при этих состояниях отсутствует овуляция доми нантного фолликула и уменьшается его максимальный диаметр (Ginther et al., 1989;

Adams et al., 1994). При проведении исследований не было обнаружено достовер ных различий в уровне специфического связывания 125I-ПРЛ с КГ коров, находя щихся в разном репродуктивном состоянии (табл. 3). Константа диссоциации ПРЛ рецепторных комплексов ((5,34±0,49)х10-7 М) и концентрация рецепторов ПРЛ (11,07±1,35 пМ на 106 клеток) на клетках из фолликулов диаметром 1–2 мм у непо ловозрелых животных также не отличались от таковых, полученных ранее у коров с эстральным циклом (раздел 3.2.2). Эти данные показывают, что у КРС компе тентность клеток гранулезы в антральных фолликулах к связыванию ПРЛ приоб ретается до половой зрелости и не изменяется во время ранней стельности.

Таблица 3. Специфическое связывание 125I-ПРЛ c клетками гранулезы из антральных фолликулов при разном репродуктивном состоянии КРС Специфическое связывание (x ± m), Репродуктивное Число фМ на 106 клеток из фолликулов диаметром:

состояние экспери животных ментов 1 – 2 мм 3 – 5 мм 6 – 10 мм 36,9 ± 0,9 38,0 ± 1,0 36,0 ± 1, Половая зрелость 34,7 ± 1,6 38,8 ± 1,1 36,5 ± 1, До половой зрелости 37,6 ± 1,8 39,0 ± 1,8 38,2 ± 1, Ранняя стельность 3.3.2. Пролактин-связывающая активность клеток гранулезы при лю теинизации и воздействии соматотропина in vitro. Лютеинизация гранулезных клеток является особым типом цитодифференцировки, которую индуцирует пре овуляторное повышение уровня ЛГ в крови млекопитающих (Fortune, 1994). В свя зи с этим было проведено сравнительное исследование уровней специфического связывания 125I-ПРЛ с КГ из фолликулов диаметром 3–5 мм до и после инициации спонтанной лютеинизации клеток, вызванной путем их культивирования в отсутст вие сыворотки. Инициация in vitro лютеальной дифференцировки КГ подтвержда лась повышением продукции прогестерона на 2-е сутки инкубации (табл. 4). ПРЛ связывающая активность клеток также возрастала в процессе культивирования (по крайней мере p 0,05). При этом СТГ не оказывал влияния на уровень специфиче ского связывания 125I-ПРЛ как с нативными, так и с лютеинизирующимися клетка ми. Таким образом, процесс лютеальной дифференцировки клеток гранулезы коров индуцирует повышение их ПРЛ-связывающей активности.

Таблица 4. Секреция прогестерона и специфическое связывание 125I-ПРЛ клетками гранулезы коров, культивируемыми в присутствии СТГ Концентрация СТГ Число Секреция прогестерона Специфическое связывание 125I-ПРЛ экспери- (x ± m), нг/10 клеток (x ± m), фМ на 106 клеток ментов 1-е сутки 2-е сутки 1-е сутки 2-е сутки 0,60 ± 0,08 1,40 ± 0,19*** 11,3 ± 1,4 18,5 ± 2,2** 0 нг/мл (контроль) 0,60 ± 0,18 1,64 ± 0,29* 11,7 ± 1,3 19,2 ± 2,6* 5 нг/мл 0,55 ± 0,06 1,07 ± 0,09** 14,4 ± 3,0 28,0 ± 3,5* 10 нг/мл 0,77 ± 0,14 1,54 ± 0,26* 8,1 ± 1,2 17,8 ± 3,0* 50 нг/мл Примечание. Среда ТС-199, содержащая 6 мг/мл БСА. Достоверные различия между 1-ми и 2-ми сутками культивирования: *p 0,05;

**p 0,01;

***p 0,001.

3.4. Анализ экспрессии альтернативных изоформ рецептора пролактина в клетках яичников коров. У КРС в различных тканях, включая желтое тело яич ника, обнаружена мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ, которые различаются длиной цитоплазматического домена и биологической активностью (Schuler et al., 1997). Основываясь на этих данных, был проведен анализ экспрессии мРНК альтернативных изоформ рецептора ПРЛ в половых и соматических клетках антральных фолликулов диаметром 28 мм.

3.4.1. Выявление мРНК длинной и короткой изоформ рецептора пролак тина в половых и соматических клетках антральных фолликулов. В первой серии экспериментов было исследовано присутствие мРНК альтернативных изо форм лактогенного рецептора в клетках кумулюса и гранулезы. При использовании комбинации праймеров одновременно для длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ (табл. 5) на матрице тотРНК для всех типов исследованных клеток были по лучены два ПЦР-продукта размером 347 и 250 пар нуклеотидных оснований (п.о.), что соответствовало ожидаемым значениям (рис. 2). В случае ооцитов для повы шения выхода продуктов амплификации был применен метод ПЦР с внутренними праймерами (табл. 5). В ходе двух раундов ПЦР во всех случаях были выявлены продукты амплификации ожидаемого размера 217 п.о. (рис. 3). Результаты ОТ-ПЦР свидетельствуют о том, что обе изоформы рецептора ПРЛ участвуют в трансдук ции гормонального сигнала в половые и соматические клетки антральных фолли кулов. Данные также указывают на наличие двух путей реализации влияния ПРЛ на ооциты: 1) прямого, через взаимодействие с рецепторами в самих ооцитах и 2) опосредованного, через рецепторы в клетках кумулюса, сопряженных с ооцитами.

Таблица 5. Последовательности олигонуклеотидов для амплификации кДНК длинной (ПРЛ-Рд) и короткой (ПРЛ-Рк) изоформ рецептора ПРЛ кДНК Прямой праймер Обратный праймер Длина фрагмен тов (п.о.) Первый раунд ПЦР ПРЛ-Рд 5'-GCTGGTCCTCACAGTCATCT-3' 5'-CAAGCCAGACCATGGATACT-3' ПРЛ-Рк 5'-GCGAGAAGGCTGTGATATCT-3' Второй раунд ПЦР (ПЦР с внутренними праймерами) ПРЛ-Рд и 5'-ATACTGGAGTGAGTGGAGCC-3' 5'-CTCCAGCAGATGAACATCAA-3' ПРЛ-Рк Рис. 2. ОТ-ПЦР 1 3 5 2 4 9 анализ экспрессии мРНК длинной и ко роткой изоформ ре цептора ПРЛ в ова риальных клетках.

Дорожки: 1 – маркеры длины в парах нуклеотидных оснований;

2-4 – ПЦР-продук ты, соответствующие длинной (верхняя полоса) и короткой (нижняя полоса) изо формам рецептора ПРЛ;

5-7 – ПЦР-продукт, соответствующий -актину;

8 – ОТ ПЦР, отрицательный контроль;

9 – ПЦР, отрицательный контроль;

2, 5 – клетки гранулезы;

3, 6 – клетки кумулюса;

4, 7 – желтое тело (позитивный контроль).

Рис. 3. Анализ экс 3 2 5 6 1 7 прессии мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в ооцитах при 300 использовании ПЦР с внутренними праймерами (nested PCR).

Дорожки: 1 – маркеры длины в парах нуклеотидных оснований;

2, 3 – ПЦР продукт второго раунда, полученный при использовании амплификата, соответ ствующего длинной изоформе рецептора ПРЛ;

4, 5 – ПЦР-продукт второго раун да, полученный при использовании амплификата, соответствующего короткой изоформе рецептора ПРЛ;

6, 7 – отрицательный контроль для длинной и корот кой рецепторной изоформы соответственно;

8, 9 – ПЦР-продукт первого раунда, соответствующий -актину;

2, 4, 8 – клетки гранулезы (позитивный контроль);

3, 5, 9 – ооциты.

3.4.2. Соотношение мРНК альтернативных изоформ рецептора пролак тина в овариальных клетках различного типа. Характер и эффективность гор монального влияния на клетки зависят не только от общей концентрации в них со ответствующего рецептора, но и от соотношения его альтернативных изоформ (Смирнова, Богорад, 2004). Соотношение уровней экспрессии мРНК длинной и ко роткой изоформ рецептора ПРЛ в соматических овариальных клетках было опре делено на основании данных конкурентного кинетического анализа. Было установ лено, что в фолликулах диаметром 28 мм это соотношение в клетках кумулюса сходно с таковым в клетках гранулезы, прилегающих к антральной полости (0,58±0,07 и 0,57±0,02 соответственно). В то же время соотношение мРНК альтер нативных изоформ рецептора ПРЛ в фолликулярных клетках было почти в два раза ниже, чем в развитом желтом теле яичника (1,09±0,04, p 0,01). Полученные дан ные указывают на тканеспецифический характер экспрессии длинной и короткой изоформ лактогенного рецептора в яичниках коров.

3.5. Изучение модулирующего действия пролактина на экспрессию собст венного рецептора в фолликулярных клетках. ПРЛ может регулировать содер жание своих рецепторов в различных клетках, в том числе овариальных, как на уровне транскрипции соответствующего гена, так и на посттранскрипционном уровне (Russell, Richards, 1999;

Bowen et al., 2000). В этой связи было исследовано in vitro влияние ПРЛ на уровень мРНК длинной и короткой изоформ лактогенного рецептора в ОКК и гранулезных клетках из антральных фолликулов коров.

3.5.1. Влияние пролактина на содержание мРНК длинной и короткой изоформ своего рецептора в культивируемых ооцит-кумулюсных комплексах.

При проведении экспериментов было обнаружено, что внесение 500 нг/мл ПРЛ в среду культивирования ОКК обусловливает снижение (p 0,05) уровней экспрес сии длинной и короткой изоформ лактогенного рецептора в клетках по сравнению с таковым на 0 ч (табл. 6). Суммарное содержание мРНК рецептора ПРЛ в ОКК было ниже (по крайней мере p 0,05) при воздействии 50 и 500 нг/мл ПРЛ, чем до культивирования. Кроме того, общий уровень экспрессии рецептора уменьшался (p 0,05) в процессе культивирования ОКК в присутствии 500 нг/мл ПРЛ по сравне нию с этим уровнем в контроле. Гормон не влиял на соотношение уровней мРНК длинной и короткой изоформ своего рецептора, которое составляло до культивиро вания 0,55± 0,09 и было сходно с таковым, полученным для изолированных клеток кумулюса (раздел 3.4.2). Таким образом, ПРЛ в высокой концентрации может ин гибировать экспрессию гена своего рецептора, но не влияет на альтернативный сплайсинг соответствующего первичного транскрипта в культивируемых ОКК.

Таблица 6. Влияние ПРЛ in vitro на экспрессию длинной (ПРЛ-Рд) и короткой (ПРЛ-Рк) изоформ своего рецептора в ооцит-кумулюсных комплексах коров (n = 3) Содержание мРНК изоформ рецептора ПРЛ (x ± m), о.е.

Экспериментальная группа ПРЛ-Рд ПРЛ-Рк ПРЛ-Рд + ПРЛ-Рк До культивирования 0,73 ± 0,07 1,36 ± 0,11 2,09 ± 0, 1,73 ± 0,08а 0 нг/мл ПРЛ (контроль) 0,56 ±0,05 1,17 ± 0, 50 нг/мл ПРЛ 0,48 ± 0,08 1,00 ± 0,14 1,49 ± 0,20* 1,36 ± 0,10**б 500 нг/мл ПРЛ 0,41 ± 0,04* 0,95 ± 0,09* Примечание. 1Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Достоверные различия:

а,б p 0,05;

по сравнению с группой до культивирования: *p 0,05;

**p 0,01.

3.5.2. Уровни экспрессии мРНК альтернативных изоформ лактогенного рецептора в клетках гранулезы при воздействии пролактина. Содержание мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в гранулезных клетках снижа лось в процессе 48-часового культивирования (по крайне мере p 0,01) во всех экспериментальных группах (табл. 7). Это свидетельствовало о регулируемом ха рактере экспрессии обеих изоформ мРНК. Содержание мРНК длинной изоформы лактогенного рецептора в КГ не зависело существенно от концентрации ПРЛ в среде культивирования. Напротив, уровень мРНК короткой изоформы рецептора в клетках был выше в присутствии 500 нг/мл ПРЛ, чем в отсутствие гормона (p 0,05). Тем не менее ПРЛ не влиял на суммарное содержание мРНК альтернативных изоформ собственного рецептора в КГ. В то же время ПРЛ (500 нг/мл) понижал по сравнению с контролем соотношение уровней мРНК длинной и короткой изоформ своего рецептора в клетках (с 0,63±0,06 до 0,26±0,04, p 0,01). Также была обна ружена негативная корреляция между концентрацией гормона в культуральной среде и соотношением альтернативных изоформ мРНК рецептора ПРЛ (r = 0,67;

p 0,01). Полученные результаты показывают, что ПРЛ регулирует in vitro экс прессию собственного рецептора в КГ на уровне альтернативного сплайсинга пре мРНК и не влияет на активность транскрипции соответствующего гена. Следова тельно, ПРЛ может участвовать в детерминации проведения своего сигнала в гра нулезные клетки, повышая долю короткой изоформы лактогенного рецептора.

Таблица 7. Влияние ПРЛ на экспрессию длинной (ПРЛ-Рд) и короткой (ПРЛ-Рк) изоформ своего рецептора в культивируемых клетках гранулезы коров (n = 4) Содержание мРНК изоформ рецептора ПРЛ (x ± m), о.е.

Экспериментальная группа ПРЛ-Рд ПРЛ-Рк ПРЛ-Рд + ПРЛ-Рк До культивирования 1,06 ± 0,14 2,00 ± 0,04 3,06 ± 0, 0 нг/мл ПРЛ (контроль)1 0,81 ± 0,11***а 0,49 ±0,08** 1,29 ± 0,22*** 5 нг/мл ПРЛ 0,44 ± 0,04*** 0,86 ± 0,10*** 1,28 ± 0,14*** 50 нг/мл ПРЛ 0,38 ± 0,09*** 0,95 ± 0,10*** 1,31 ± 0,22*** б 500 нг/мл ПРЛ 0,33 ± 0,06*** 1,24 ± 0,10** 1,56 ± 0,18*** Примечание. Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Достоверные различия:

а,б p 0,05;

по сравнению с группой до культивирования: **p 0,01;

***p 0,001.

3.6. Сравнительный анализ влияния пролактина и метаболических гор монов на функциональную активность соматических клеток из антральных фолликулов коров. Способность гормона вызывать физиологические изменения в клетках является важным критерием его функциональной активности. Регулятор ное действие ПРЛ на пролиферативную активность, интенсивность деструктивных процессов и стероидогенез в культивируемых клетках гранулезы коров было оха рактеризовано в связи с соответствующим действием двух метаболических гормо нов – структурно родственного пролактину СТГ и несходного с ним инсулина.

3.6.1. Влияние пролактина на синтез ДНК в культивируемых клетках гранулезы. ПРЛ оказывал стимулирующее влияние на интенсивность синтеза ДНК в культуре КГ из фолликулов различного диаметра (рис. 4, А и Б). Характер дейст вия ПРЛ на пролиферативную активность гранулезных клеток определялся стадией созревания фолликулов. Митогенный эффект ПРЛ в клетках из средних фоллику лов (610 мм) был одинаковым при всех концентрациях гормона независимо от на личия сыворотки в среде культивирования. В то же время чувствительность к ПРЛ у клеток из малых фолликулов (12 и 35 мм) повышалась в присутствии сыворот ки, а характер их ответа был связан с концентрацией гормона. При этом была обна ружена двухфазная зависимость ростостимулирующего влияния ПРЛ от его кон центрации. С увеличением содержания гормона до 500 нг/мл в среде без сыворотки (рис. 4, А) или до 50 нг/мл в среде с сывороткой (рис. 4, Б) интенсивность синтеза ДНК в клетках возрастала, дальнейшее повышение гормональной концентрации приводило к снижению этой интенсивности (по крайней мере p 0,05).

250 * А Б Включение 3Н-тимидина, Включение 3Н-тимидина, *** 200 *** % от контроля % от контроля 300 ** * * 200 ** ** *** ** *** 50 * 0 5 50 500 5000 0 5 50 500 5000 Концентрация ПРЛ, нг/мл Концентрация ПРЛ, нг/мл Рис. 4. Влияние ПРЛ на интенсивность включения 3Н-тимидина в ДНК клеток гра нулезы из фолликулов различного диаметра при культивировании в отсутствие (А) и в присутствии (Б) фетальной бычьей сыворотки.

Диаметр фолликулов: 1–2 мм (1), 3–5 мм (2), 6–10 мм (3). За 100 % во всех случаях принято включение 3Н-тимидина в ДНК клеток, культивируемых в среде ТС-199, содержащей 5 % ФБС. Число экспериментов: n=3–5. Достоверное различие по сравнению с предыдущим значением: *p 0,05;

**p 0,01;

***p 0,001.

3.6.2. Совместное действие пролактина и метаболических гормонов на пролиферативную активность гранулезных клеток. При проведении сравни тельного исследования влияния СТГ и инсулина на ростостимулирующий эффект ПРЛ были использованы КГ из фолликулов диаметром 35, которые культивиро вали в среде без сыворотки. Оба метаболических гормона оказывали митогенное влияние на гранулезные клетки (рис. 5, А и Б). Совместное действие ПРЛ и инсу лина на синтез ДНК было в целом аддитивным (рис. 5, А), при этом инсулин по вышал чувствительность клеток к ПРЛ при концентрации последнего 50 нг/мл (p 0,001). В то же время СТГ даун-модулировал митогенное влияние ПРЛ, что приво дило к уменьшению общего эффекта гормонов, который был ниже (p 0,05) суммы д 500 Включение Н-тимидина, А Включение 3Н-тимидина, Б 2 е 400 % от контроля % от контроля 300 г в в вж в аж б б а а а а а бб б аб бб б 200 г а г д б д е е 5 50 500 5000 5 50 500 5000 Концентрация ПРЛ, нг/мл Концентрация ПРЛ, нг/мл Рис. 5. Интенсивность включения 3Н-тимидина в ДНК клеток гранулезы, культиви руемых в присутствии ПРЛ и инсулина (А) или соматотропного гормона (Б).

1 – инсулин (100 нг/мл), 2 – ПРЛ, 3 – инсулин + ПРЛ (А);

1 – СТГ (50 нг/мл), 2 – ПРЛ, 3 – СТГ + ПРЛ (Б). Контроль (100 %) тот же, что и на рис. 5. Число экспе риментов: n=4–5. Надписи над столбиками, не содержащие одинаковые буквы, показывают достоверные различия (по крайней мере p 0,05).

отдельных эффектов в среде, содержащей 5 и 50 нг/мл ПРЛ (рис. 5, Б). Кроме того, в присутствии СТГ максимально эффективная концентрация ПРЛ возрастала до мкг/мл. Полученные результаты свидетельствуют о том, что СТГ может ослаблять, тогда как инсулин – усиливать стимулирующее действие ПРЛ в физиологических концентрациях на пролиферативную активность клеток гранулезы коров.

3.6.3. Влияние пролактина, соматотропина и инсулина in vitro на дест руктивные процессы в фолликулярных клетках. В этих экспериментах были использованы КГ из фолликулов диаметром 35, подвергшихся атрезии in vivo.

Внесение ПРЛ, СТГ или инсулина в среду приводило к повышению относительно го числа клеток без признаков деструкции ядерного материала по сравнению с кон тролем как на 1-е, так и на 2-е сутки культивирования (рис. 6). При этом ПРЛ и СТГ не влияли на стероидогенную активность КГ, тогда как инсулин стимулировал (p 0,05) секрецию эстрадиола-17 клетками в течение 1-х суток инкубации.

Рис. 6. Изменение числа клеток 1-е сутки гранулезы с нормальным хрома хроматином от их числа до 2-е сутки % клеток с нормальным тином, выделенных из атретиче культивирования ских фолликулов, при культиви б* в ровании в присутствии ПРЛ ( бд д е а ** нг/мл), СТГ (50 нг/мл) или инсу г лина (100 нг/мл).

Контроль: среда ТС-199, содер 20 жащая 2 мг/мл БСА. n=5–10.

Достоверные различия: а,бp 0,05;

а,вp 0,001;

г,дp 0,001;

г,еp Контроль ПРЛ СТГ Инсулин 0,05;

между 1-ми и 2-ми сут ками культивирования: *p Среда культивирования клеток 0,05;

**p 0,01.

3.7. Исследование эффектов пролактина при созревании ооцитов, окру женных клетками кумулюса, в различных системах культивирования. При сутствие мРНК лактогенного рецептора в ооцитах и кумулюсных клетках указыва ет на непосредственное влияние ПРЛ на ОКК. В связи с этим было изучено дейст вие ПРЛ на преобразования хромосом в мейозе ооцитов. При культивировании ОКК в среде, содержащей 10 % ФБС (система 1), было обнаружено два эффекта ПРЛ: стимуляция (p 0,01) завершения ядерного созревания ооцитов и снижение Таблица 8. Влияние ПРЛ на преобразования хромосом в ооцитах при созревании ОКК в различных культуральных системах (время культивирования – 24 ч) Система Экспери- Общее Число (%) ооцитов Частота число на стадиях культивирования ментальная хромосомных ооцитов TI–MII мейоза нарушений, % группа 25,0 ± 4,0а Контроль 116 72 (62,1 ± 4,5) 1. ТС-199+10 % ФБС 50 нг/мл ПРЛ 132 103 (78,0 ± 3,6)** 13,6 ± 3,0* 12,2 ± 3,8б 2. ТС-199+10 % ФБС Контроль 74 49 (66,2 ± 5,5) 7,1 ± 3,0г +эстрадиол-17+ФСГ 50 нг/мл ПРЛ 70 61 (87,1 ± 4,0)** 40,2 ± 4,9в 3. ТС-199+6 мг/мл БСА Контроль 102 72 (70,6 ± 4,5) 23,9 ± 5,1*д + эстрадиол-17+ФСГ 50 нг/мл ПРЛ 71 56 (78,9 ± 4,8) Примечание. Число экспериментов: n=3-4. Достоверные различия в пределах системы культивирования: *p 0,05;

**p 0,01;

между системами культивиро вания: а,бp 0,05;

б,вp 0,001;

а,вp 0,05;

г,дp 0,05.

Таблица 9. Содержание депонированного Ca2+ в ооцитах при созревании ОКК в различных культуральных системах с ПРЛ (n=4) Содержание Ca2+ во внутриклеточных депо Система Экспери ооцитов (x ± m), у.е.

культивирования ментальная группа Время культивирования 0ч 2,5 ч 24 ч аб в 2,01±0,06гд Контроль 1,35±0,03 1,67±0, 1. ТС-199+10 % ФБС 1,35±0,03аб 1,27±0,06а 1,62±0,04ве 50 нг/мл ПРЛ 1,34±0,02а 1,33±0,03а 2,16±0,02гж 2. ТС-199+10 % ФБС Контроль +эстрадиол-17 +ФСГ 50 нг/мл ПРЛ 1,34±0,02а 1,44±0,07ае 2,19±0,04ж 1,34±0,02а 1,52±0,02бве 2,21±0,02ж 3. ТС-199+6 мг/мл БСА Контроль + эстрадиол-17 +ФСГ 50 нг/мл ПРЛ 1,34±0,02а 1,27±0,07а 1,97±0,03д Примечание. Число ооцитов в группах: 1539. Надписи, не содержащие оди наковые буквы, показывают достоверные различия (по крайней мере p 0,05).

(p 0,05) частоты хромосомных нарушений (табл. 8). Предварительно было уста новлено, что оба гормональных эффекта наблюдаются при концентрации ПРЛ нг/мл, которая была использована во всех дальнейших экспериментах. Характер действия ПРЛ на мейоз зависел от состава системы культивирования (табл. 8). При добавлении ПРЛ в среду, содержащую 10 % ФБС, ФСГ и эстрадиол-17 (система 2) был выявлен только один из двух гормональных эффектов, наблюдаемых в системе 1 – повышение доли ооцитов, достигших стадий телофазы I (ТI) или метафазы II (MII) (p 0,01). При этом ПРЛ не влиял на реинициацию мейоза. Замена сыворотки на БСА в среде с ФСГ и эстрадиолом-17 (система 3) приводила к отсутствию влияния ПРЛ на завершение ядерного созревания ооцитов. В то же время в системе 3 ПРЛ оказывал тормозящее действие на процессы, связанные с деструктивными изменениями хромосом (p 0,05).

Как известно, ПРЛ может индуцировать освобождение Ca2+ из внутриклеточ ных депо клеток-мишеней (Bole-Feysot et al., 1998). Поэтому в ооцитах, созреваю щих во всех трех системах культивирования, было определено содержание депони рованного Ca2+ (табл. 9). Было обнаружено ингибирующее влияние ПРЛ (p 0,05) на аккумуляцию этого катиона через 2,5 ч инкубации ооцитов в тех культуральных системах, в которых гормон снижал частоту хромосомных нарушений в яйцеклет ках (в системах 1 и 3). В процессе 24-часового культивирования содержание Ca2+ во внутриклеточных депо ооцитов, тем не менее, возрастало во всех эксперименталь ных группах (по крайней мере p 0,01). При этом ингибирующее влияние ПРЛ на содержание депонированного Ca2+ в половых клетках сохранялось до конца куль тивирования ОКК. Таким образом, тормозящее действие ПРЛ на деструктивные изменения хромосом связано с гормональной стимуляцией освобождения Ca2+ из внутриклеточных депо ооцитов на ранней стадии их созревания.

3.8. Сравнительная оценка участия клеток гранулезы в опосредовании действия пролактина и соматотропина на ооцит-кумулюсные комплексы ко ров in vitro. Вышеперечисленные эффекты ПРЛ наблюдались при его непосредст венном влиянии на ОКК коров (раздел 3.7). В отдельной серии экспериментов была подвергнута верификации выдвинутая ранее гипотеза о функционировании опо средованного гранулезными клетками пути регуляторного влияния ПРЛ на ооциты (Кузьмина и др., 2001). С этой целью была применена модель культивирования ОКК в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ, ко торая позволяла исключить прямое действие гормона на окруженные кумулюсом ооциты. В этих условиях был проведен сравнительный анализ регуляторного влия ния ПРЛ (50 нг/мл) и родственного ему СТГ (10 нг/мл) на созревание ОКК.

3.8.1. Ядерное созревание ооцитов в средах, кондиционированных грану лезными клетками в присутствии пролактина и соматотропина. Обработка гранулезных клеток ПРЛ или СТГ приводила к повышению по сравнению с кон тролем доли ооцитов, остающихся на стадии диплотены через 6 ч инкубации ОКК в кондиционированных средах (с 57,2±5,0 % до 80,3±5,3 или 80,5±6,0 % соответст венно, p 0,05). Это мейоз-тормозящее влияние сред, кондиционированных клет ками гранулезы при воздействии гормонов, было кратковременным и не наблюда лось через 12, 18 и 24 ч культивирования. Внесение ПРЛ и СТГ в культуру клеток гранулезы также обусловливало снижение по сравнению с контролем доли ооцитов с дегенеративными изменениями хромосом во время последующего культивирова ния ОКК в кондиционированных средах (рис. 7). При этом содержание прогестеро на и эстрадиола-17 в средах было сходным во всех экспериментальных группах.

Полученные данные показывают, что в ответ на действие и ПРЛ, и СТГ клетки гранулезы продуцируют растворимые паракринные факторы, которые, в свою оче редь, оказывают регуляторное влияние на состояние хромосом в мейозе ооцитов.

Рис. 7. Частота хромосомных на Контроль нарушений в ооцитах, % рушений в ооцитах при инкуба ПРЛ Частота хромосомных СТГ ции ОКК в средах, кондициони рованных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ или СТГ.

Число экспериментов: n=5 (6 ч), 20 ** *** ** *** n=4 (12 ч), n=4 (18 ч), n=6 (24 ч).

** *** *** *** Число ооцитов: 5185. Кон троль: среда ТС-199, содержа щая 10 % ФБС. Достоверные 6 12 18 различия по сравнению с контро Время культивирования ОКК, ч лем: **p 0,01;

***p 0,001.

3.8.2. Морфофункциональное состояние клеток кумулюса при культиви ровании в средах, кондиционированных клетками гранулезы при воздействии пролактина и соматотропина. Окружающие ооцит клетки кумулюса являются особой субпопуляцией клеток гранулезы, дифференцировка которой направляется и поддерживается ооцитом (Li et al., 2000). При созревании ОКК в средах, полу ченных после культивирования клеток гранулезы с ПРЛ или СТГ, было обнаруже но повышение по сравнению с контролем доли клеток кумулюса в стадии митоза (с 7,80±0,26 % до 10,88±0,25 или 9,65±0,38 % соответственно, p 0,001). Кроме того, инкубация КГ в присутствии СТГ приводила к снижению процента кумулюсных клеток с признаками деструкции хроматина при последующем культивировании ОКК в соответствующей кондиционированной среде (с 2,44±0,16 % до 1,95±0, %, p 0,05). В то же время экспансия кумулюса не зависела от гормональной обра ботки клеток гранулезы. Результаты экспериментов свидетельствуют об участии клеток гранулезы в проведении регуляторных сигналов ПРЛ и СТГ в клетки куму люса, причем последние по-разному отвечают на сигналы этих гормонов.

3.9. Характеристика влияния пролактина in vitro на цАМФ-зависимый механизм регуляции созревания изолированных ооцитов и ооцит кумулюсных комплексов коров. Циклический АМФ играет ключевую роль в ре гуляции созревания ооцитов млекопитающих, а также выполняет функцию вторич ного посредника в передаче сигналов гонадотропных гормонов в фолликулярные клетки (Mattioli, 1994;

Conti et al., 2002). Для активации цАМФ-зависимого сиг нального каскада в ооцитах, приводящего к ингибированию мейоза, в среду созре вания ОКК и денудированных ооцитов (ДО) вносили 1 мМ дибутирил цАМФ (дбцАМФ), 20 мкМ активатора аденилатциклазы форсколина (ФК), или 5 мМ несе лективного ингибитора фосфодиэстераз теофиллина (ТФ). Все реагенты были ис пользованы в минимально эффективной концентрации.

3.9.1. Анализ ядерного созревания ооцитов в присутствии пролактина и цАМФ-повышающих или поддерживающих реагентов. При инкубации ОКК в течение 24 ч в среде, содержащей дбцАМФ, было выявлено уменьшение (p 0,01) по сравнению с контролем доли ооцитов, завершивших первое деление мейоза (рис. 8, А). Внесение ПРЛ в культуральную среду обусловливало повышение выхо да созревших яйцеклеток как в отсутствие (p 0,05), так и в присутствии дбцАМФ (p 0,01), однако в последнем случае гормональный эффект был более значитель ным. Сходные результаты были получены при инкубации ОКК с ФК или ТФ вме сто дбцАМФ. При культивировании ДО в среде, содержащей форсколин, наблюда лось снижение (p 0,001) по сравнению с контролем относительного числа клеток, достигших стадий телофазы I или метафазы II (рис. 8, Б). ПРЛ повышал выход ДО на завершающих стадиях созревания до уровня контроля в присутствии активатора аденилатциклазы (p 0,01), хотя не влиял на этот выход в контрольной среде. Та ким образом, ПРЛ тормозит ингибирующее влияние цАМФ-повышающих реаген тов на завершение ядерного созревания как изолированных, так и окруженных ку мулюсом ооцитов. В то же время в отсутствие этих реагентов для реализации сти мулирующего эффекта ПРЛ на мейоз ооцитов необходимы клетки кумулюса.

без ПРЛ Доля ооцитов на стадиях без ПРЛ Б А Доля ооцитов на стадиях 100 50 нг/мл ПРЛ 50 нг/мл ПРЛ а б г б 80 г а в TI-MII, % TI-MII, % в 40 20 0 Контроль дбцАМФ Контроль ФК Среда культивирования ДО Среда культивирования ОКК Рис. 8. Влияние ПРЛ на завершение ядерного созревания ооцитов при культивиро вании ОКК (А) и ДО (Б) в течение 24 ч в отсутствие и в присутствии цАМФ повышающих реагентов.

Контроль: среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Число экспериментов: n=4–5.

Число ооцитов: 58–94. Достоверные различия: а,бp 0,05;

а,вp 0,01;

б,вp 0,001;

в,г p 0,01 (А);

а,вp 0,001;

б,вp 0,01;

в,гp 0,01 (Б).

3.9.2. Сравнительное исследование влияния пролактина и цАМФ повышающих или поддерживающих реагентов на реинициацию мейоза. При проведении экспериментов было обнаружено возрастание по сравнению с контро лем доли ооцитов, находящихся на стадии диплотены (Дп) через 6 ч инкубации ОКК (p 0,01) или 7,5 ч инкубации ДО (p 0,001) в среде, содержащей цАМФ повышающие реагенты (рис. 9, А и Б). Добавление ПРЛ в среду с дбцАМФ или ФК приводило к уменьшению относительного числа ооцитов, не возобновивших мей оз, независимо от наличия сопряженных с ними клеток кумулюса (по крайней мере p 0,05). В то же время при базальном уровне цАМФ ПРЛ оказывал тормозящее действие на реинициацию мейоза в изолированных ооцитах (p 0,05) и не влиял на этот процесс в окруженных кумулюсом ооцитах. Следовательно, кумулюсные клетки могут модулировать прямое регуляторное влияние ПРЛ на ооциты.

без ПРЛ без ПРЛ Б А Доля ооцитов на стадии Доля ооцитов на стадии 50 нг/мл ПРЛ 50 нг/мл ПРЛ в 80 в б г б а Дп, % Дп, % а а Контроль ФК Контроль дбцАМФ Среда культивирования ОКК Среда культивирования ДО Рис. 9. Влияние ПРЛ на реинициацию мейоза при культивировании ОКК (А) и ДО (Б) в отсутствие и в присутствии цАМФ-повышающих реагентов.

Контроль тот же, что и на рис. 8. Число экспериментов: n=4–6. Число ооцитов:

57–73. Время культивирования: 6 ч (ОКК) и 7,5 ч (ДО). Достоверные различия: а,вp 0,01;

б,вp 0,05 (А);

а,бp 0,05;

а,вp 0,001;

б,вp 0,05;

в,гp 0,05 (Б).

3.9.3. Морфофункциональная характеристика соматических клеток при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов в среде, содержащей про лактин и дбцАМФ, форсколин или теофиллин. Было установлено, что дбцАМФ и ФК стимулируют экспансию кумулюса при культивировании ОКК в течение 24 ч (p 0,001), тогда как ТФ оказывает на нее ингибирующее действие (p 0,001). Об работка клеток пролактином обусловливала уменьшение (p 0,01) относительного числа ОКК с высокой степенью разрыхления кумулюса в присутствии дбцАМФ (с 82,1 до 62,9 %) или ФК (с 72,4 до 55,3 %). Напротив, внесение ПРЛ в контрольную среду или в среду с ТФ приводило соответственно к возрастанию доли ОКК с вы сокой степенью кумулюсной экспансии (с 36,9 до 51,3 %, p 0,05) или к снижению доли ОКК с низкой степенью этой экспансии (с 46,5 до 26,7 %, p 0,05). В кон трольной среде ПРЛ также повышал долю клеток кумулюса в стадии митоза (с 3, ±0,20 до 5,42±0,28 %, p 0,001) и уменьшал долю клеток с признаками дегенера ции ядерного материала (с 8,06± 0,41 до 4,74±0,31 %, p 0,001). ДбцАМФ подав лял ингибирующее действие ПРЛ на деструктивные процессы в клетках (p 0,01), но не влиял на его митогенное действие. Эти результаты указывают на пересечение сигнальных каскадов, индуцированных ПРЛ и цАМФ в клетках кумулюса.

3.10. Изучение роли протеинкиназ в проведении сигнала пролактина в ооцитах и ооцит-кумулюсных комплексах коров. ПРЛ может активировать раз личные сигнальные каскады в фолликулярных клетках млекопитающих, в том чис ле зависящие от тирозинкиназ и протеинкиназы С (Villanueva et al., 1996;

Ciereszko et al., 2003). Поэтому была охарактеризована роль этих протеинкиназ в опосредо вании влияния ПРЛ на ДО и ОКК коров при базальном уровне цАМФ. Для блоки рования в клетках соответствующих сигнальных путей использовали ингибитор тирозинкиназ генистейн (ГНТ) и ингибитор протеинкиназы С калпостин (КП).

3.10.1. Анализ участия тирозинкиназ и протеинкиназы С в опосредовании влияния пролактина на мейоз ооцитов. Генистейн и калпостин были использо ваны в концентрациях, при которых они не оказывали влияния на состояние хро мосом в мейозе при культивировании ОКК и ДО в контрольной среде. Было обна ружено, что ГНТ (10 мкг/мл) подавляет (p 0,05) стимулирующее действие ПРЛ на завершение ядерного созревания окруженных кумулюсом ооцитов (рис. 10). В то же время КП (100 нМ) не блокировал этот мейоз-стимулирующий эффект ПРЛ.

Кроме того, ГНТ ингибировал тормозящее влияние гормона на реинициацию мейо за в ДО, уменьшая долю клеток, остающихся на стадии диплотены через 7,5 ч ин кубации с ПРЛ (с 41,1±2,8 до 27,5±4,1 %, p 0,05), тогда как КП в этих условиях не оказывал никакого действия. Полученные данные свидетельствуют об участии ти розинкиназ в опосредовании влияния ПРЛ на мейоз при базальном уровне цАМФ.

без ПРЛ Рис. 10. Влияние ПРЛ на завершение Доля ооцитов на стадиях 50 нг/мл ПРЛ 100 ядерного созревания ооцитов при куль б б тивировании ОКК коров течение 24 ч в 80 a a a а присутствии 10 мкг/мл генистейна TI-MII, % (ГНТ) или 100 нМ калпостина (КП).

Контроль тот же, что и на рис. 8.

Число экспериментов: n=5. Число ооцитов: 94–120. Достоверные разли Контроль ГНТ КП чия: а,бp 0,05.

Среда культивирования ОКК 3.10.2. Реализация регуляторного действия пролактина на морфофунк циональное состояние клеток кумулюса в присутствии ингибиторов протеин киназ. ПРЛ повышал в 1,3-1,4 раза долю ОКК с высокой степенью разрыхления кумулюса при культивировании комплексов в течение 24 ч и в отсутствие, и в при сутствии КП (p 0,05). Этот стимулирующий эффект гормона не наблюдался в среде с ГНТ. ПРЛ также увеличивал долю клеток кумулюса в стадии митоза в кон трольной среде (с 2,23±0,18 до 3,71±0,24 %, p 0,01), но не оказывал митогенного действия на клетки в среде, содержащей КП или ГНТ. В то же время регуляторное влияние гормона, связанное со снижением доли кумулюсных клеток с признаками дегенерации ядерного материала (с 7,53±0,27 до 3,76±0,30 %, p 0,01), было бло кировано только в присутствии КП. Эти данные предполагают участие сигнальных каскадов, зависящих как от тирозинкиназ, так и от протеинкиназы С, в реализации эффектов ПРЛ в клетках кумулюса.

3.11. Идентификация сигнального каскада, опосредующего влияние про лактина на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза. Задача данного этапа работы состояла в изучении механизма реализации стимулирующего дейст вия ПРЛ на реинициацию мейоза при повышенном уровне внутриклеточного цАМФ. В этих экспериментах промывочная среда для ДО и ОКК содержала 0,5 мМ ИБМК.

3.11.1. Зависимость регуляторного действия пролактина на мейоз от со держания цАМФ в ооцитах и ооцит-кумулюсных комплексах. Для достижения высокого уровня цАМФ в ооцитах в среду культивирования вносили одновременно 0,5 мМ изобутилметилксантина (ИБМК) и 20 мкМ форсколина (ФК). Через 7 ч ин кубации ДО или ОКК в присутствии этих реагентов доля ооцитов, остающихся на стадии диплотены, была в 2,6 или в 3,8 раза выше, чем в соответствующих кон трольных группах (p 0,001). ПРЛ уменьшал (p 0,001) относительное число ооцитов на стадии диплотены при культивировании и ДО (с 92,8±1,2 % до 61,8±3, %), и ОКК (с 88,2±3,2 % до 63,7±2,6 %) в среде, содержащей ИБМК и ФК. Через 3,5 ч инкубации концентрация цАМФ в ДО, ОКК и ооцитах, изолированных из комплексов после культивирования, была во много раз выше (p 0,001) в присут ствии, чем в отсутствие ИБМК и ФК (табл. 10). Внесение ПРЛ в среду, содержа щую цАМФ-повышающие реагенты, приводило к 2-кратному уменьшению уровня цАМФ в ДО (p 0,01). При этом концентрация цАМФ в ДО была позитивно связа на с долей ооцитов, не возобновивших мейоз (r = 0,99;

p 0,001). Вместе с тем ПРЛ не влиял на общий уровень цАМФ в ОКК и их ооцитах в среде с ИБМК и ФК, хотя и стимулировал в этой группе реинициацию мейоза. Таким образом, ПРЛ по нижает in vitro повышенное содержание цАМФ в ДО, что обусловливает мейоз стимулирующий эффект гормона. В то же время ПРЛ не влияет на содержание цАМФ в кумулюсе и не блокирует его поступление в ооцит.

Таблица 10. Влияние ПРЛ на содержание цАМФ в ДО, окруженных кумулюсом ооцитах и ОКК при их культивировании в течение 3,5 ч в отсутствие или в присутствии изобутилметилксантина (ИБМК) и форсколина (ФК) Содержание цАМФ (x ± m) Среда Число культивирования ооцитов экспери- в ДО, в ОКК, в ооцитах ОКК, ментов фМ на ооцит фМ на комплекс фМ на ооцит 0,19 ± 0,04а 2,5 ± 0,2г 0,19 ± 0,04ж До культивирования Контроль1 0,30 ± 0,10а 8,6 ± 2,3д 1,01 ± 0,20*з 0,25 ± 0,06а 9,6 ± 2,2д 1,22 ± 0,25**з 50 нг/мл ПРЛ 3,16 ± 0,26б 425,7 ± 101,6е 6,79 ± 0,71*и 0,5 мМ ИБМК+20 мкМ ФК 1,56 ± 0,45в 546,8 ± 146,3е 7,92 ± 1,56**к ИБМК +ФК+ПРЛ Примечание. Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Достоверные различия:

а,б p 0,001;

а,вp 0,01;

б,вp 0,01;

г,дp 0,05;

г,еp 0,001;

д,еp 0,001;

ж,зp 0,05;

ж,и p 0,001;

ж,кp 0,001;

з,иp 0,001;

з,кp 0,01. Достоверные различия между ДО и ооцитами в ОКК: *p 0,05;

**p 0,01.

3.11.2. Исследование роли фосфодиэстераз как медиаторов пролактин зависимого сигнального пути, индуцирующего возобновление мейоза. Было охарактеризовано участие фосфодиэстеразы 3, отвечающей за деградацию цАМФ в ооцитах коров (Thomas et al., 2002), в опосредовании мейоз-стимулирующего дей ствия ПРЛ. С этой целью ДО и ОКК культивировали в течение 7 ч в присутствии 20 мкМ цилостамида (ЦЛС), селективного ингибитора фосфодиэстеразы 3. В каче стве дополнительного контроля был применен селективный ингибитор фосфодиэс без ПРЛ Рис. 11. Влияние ПРЛ на реинициацию Доля ооцитов на стадии 50 нг/мл ПРЛ 100 мейоза при культивировании денуди б рованных ооцитов (ДО) в отсутствие и в в присутствии 20 мкМ цилостамида Дп, % (ЦЛС) или 100 мкМ ролипрама (РЛП).

г г а а Контроль тот же, что и на рис. 8.

20 Время культивирования: 7 ч. Число экспериментов: n=4. Число ооцитов:

81–91. Достоверные различия: а,бp Контроль ЦЛС РЛП 0,001;

а,вp 0,05;

б,вp 0,01;

б,гp 0,001.

Среда культивирования ДО теразы 4 ролипрам (100 мкМ). Было установлено, что ЦЛС повышает (p 0,001) по сравнению с контролем относительное число ооцитов, остающихся на стадии дип лотены через 7 ч инкубации ДО (рис. 11) и ОКК (с 20,4±3,6 % до 82,4±4,7 %). Вне сение ПРЛ в среду, содержащую ЦЛС, приводило к снижению (p 0,01) доли ДО, не возобновивших мейоз (рис. 11). В то же время гормон не влиял на реинициацию мейоза при культивировании ОКК в присутствии ЦЛС. Кроме того, ингибитор ти розинкиназ генистейн не блокировал мейоз-индуцирующее действие пролактина на ДО в среде с ЦЛС. Следовательно, стимулирующее влияние ПРЛ на реинициацию мейоза достигается, по крайней мере частично, путем активации фосфодиэстеразы 3 в ооцитах. Тирозинкиназы не участвуют в реализации этого действия ПРЛ.

3.12. Характеристика функции клеток кумулюса в реализации влияния пролактина на приобретение ооцитами способности к эмбриональному разви тию в присутствии гонадотропных гормонов. У КРС способность к эмбриональ ному развитию окруженных кумулюсом ооцитов зависит от внутриклеточного уровня цАМФ (Luciano et al., 2004). ПРЛ оказывает модулирующее действие на функционирование цАМФ-зависимого сигнального каскада в ОКК коров (раздел 3.9). Этот каскад опосредует влияние гонадотропных гормонов, действующих на ооциты через клетки кумулюса (Hillier, 2001). На основании этих данных было проведено сравнительное исследование влияния ПРЛ на приобретение ооцитами способности к дальнейшему развитию при культивировании ОКК и ДО в присут ствии гонадотропных гормонов после синхронизации мейоза с помощью ИБМК.



Pages:   || 2 |
 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.