авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Термофильные железовосстанавливающие прокариоты

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

СЛОБОДКИН Александр Игоревич ТЕРМОФИЛЬНЫЕ ЖЕЛЕЗОВОССТАНАВЛИВАЮЩИЕ ПРОКАРИОТЫ Специальность 03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

МОСКВА – 2008

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научный консультант – д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловская

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Л.В. Калакуцкий Доктор биологических наук, профессор Г.А. Дубинина Доктор биологических наук, профессор О.В. Карначук Ведущая организация – кафедра микробиологии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 28 апреля 2008 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 002.224.01 при Институте микробиологии им. С.Н.

Виноградского РАН по адресу: 117312 Москва, проспект 60-летия Октября д. 7, кор. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Автореферат разослан «_» 2008 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу 117312 Москва, проспект 60-летия Октября д. 7, кор. 2, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Учёному секретарю диссертационного совета Т.В. Хижняк. Факс (499) 135-65-30.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Железо - четвёртый по распространённости элемент земной коры и первый на Земле в целом. Биогенный цикл железа, включающий в себя энзиматические и биотически опосредованные реакции, осуществляется прокариотами разных филогенетических и физиологических групп (Кузнецов и др. 1962, Ehrlich 2002). Процессы микробного восстановления Fe(III) сопряжены с биогеохимическими циклами углерода, кислорода и серы и могут оказывать значительное экологическое воздействие на современную окружающую среду (Lovley 1991, Lovley et al. 2004). В некоторых морских, пресноводных и почвенных экосистемах диссимиляционное восстановление железа(III) микроорганизмами - основной процесс, обеспечивающий окисление органического вещества (Nealson & Saffarini 1994, Thamdrup 2000). Микробная железоредукция способна ингибировать процессы сульфатредукции и метаногенеза и вызывать образование ряда минералов, в частности магнетита и сидерита. Ещё большую роль микробное восстановление трёхвалентного железа могло играть в древнейшей биосфере, где Fe(III), вероятно, являлось первым и некоторое время основным окислителем органического углерода (Walker 1987). Предполагается, что диссимиляционные железоредукторы участвовали в формировании такого глобального геологического феномена как месторождения докембрийских железистых кварцитов. Выдвинута гипотеза о том, что диссимиляционное восстановление Fe(III) могло быть первым возникшим типом метаболизма (Lovley 2005). Способность микроорганизмов использовать соединения металлов в метаболических процессах привлекает внимание астробиологов (Nealson et al. 2002). Микробная железоредукция оказывает влияние на хозяйственную деятельность человека. Биокоррозия, оглеение почв, удаление органических загрязнителей и иммобилизация токсичных металлов в грунтовых водах, микробные топливные элементы – далеко не полный список прикладных аспектов железоредукции (Lovley 2004).

Большой интерес представляет восстановление Fe(III) термофильными прокариотами. Современные гидротермальные экосистемы рассматриваются как реликты древнейшей биосферы Земли;

процессы, протекающие в них, могут служить моделью для реконструкции древних биоценозов (Заварзин 2001). Гипотеза о существовании горячей подземной биосферы, с суммарным количеством биомассы, превосходящим наземную, предполагает активное участие термофильных микроорганизмов в современных глобальных биогеохимических процессах (Gold 1992). Термофильные прокариоты могут использовать различные неорганические акцепторы электронов в катаболических реакциях, однако, способность термофилов к диссимиляционному восстановлению Fe(III) к началу наших исследований не была известна.

Железовосстанавливающие микроорганизмы способны восстанавливать и ряд других элементов переменных валентностей, включая токсичные металлы и радионуклиды. При восстановлении хрома, технеция, урана образуются слаборастворимые соединения, что может быть использовано для их иммобилизации в биотехнологических процессах или при биоремедиации.

Минералы, формирующиеся при микробном восстановлении металлов, имеют потенциал для применения в современных нанотехнологиях (Lloyd 2003).

Таким образом, изучение термофильных железовосстанавливающих микроорганизмов является актуальным для решения фундаментальных проблем, связанных с возникновением и эволюцией метаболических путей прокариот, вероятно, имевших термофильного предшественника. Исследования термофильных железоредукторов важны для понимания функционирования биосфер Архея и Протерозоя, характеризовавшихся повышенными температурами и наличием значительных количеств Fe(III), а также биогеохимических процессов, происходящих в современных термальных экосистемах. Процессы, осуществляемые железоредуцирующими термофилами, могут быть использованы при разработке новых природоохранных технологий, а также для получения биогенных минералов с новыми свойствами.

Состояние вопроса Участие микроорганизмов в процессах восстановления соединений железа известно с конца XIX начала XX веков (Рунов 1926). Долгое время считалось, что основной причиной понижения степени окисления Fe(III) является изменение физико-химических параметров среды за счёт жизнедеятельности микроорганизмов. Существование энзиматических механизмов восстановления Fe(III) было продемонстрировано в 40-70 годы XX века. Объектом этих исследований, в основном, были бактерии с бродильным типом метаболизма, для которых наличие трёхвалентного железа не являлось необходимым условием роста (Roberts 1947, Bromfield 1954, Ottow 1968).

Способность микроорганизмов к облигатной железоредукции («железному дыханию») была впервые показана Балашовой и Заварзиным в 1979 г. В этих экспериментах бактерия, идентифицированная как Pseudomonas sp., восстанавливала гидроксид железа и ферригидрит молекулярным водородом. В конце 80-х годов появились работы Лавли и др. (Lovley et al. 1987, Lovley & Phillips 1988) и Майерса и Нильсона (Myers & Nealson 1988), демонстрировавшие использование Fe(III) и Mn(IV) в качестве конечного акцептора электронов при росте микроорганизмов на несбраживаемых органических соединениях. Бактерии, выделенные в результате этих исследований и отнесённые к родам Geobacter и Shewanella, стали в дальнейшем модельными объектами для изучения биохимических и физиологических аспектов микробной металлоредукции. В случае с Geobacter интерес к исследованиям подогревался ещё и тем, что этот организм преобразовывал слабокристаллический оксид железа во внеклеточный магнетит. До этого считалось, что формировать магнитные минералы, в виде относительно небольших по массе внутриклеточных включений, способны лишь магнетотактические бактерии (Blakemore 1975). Открытие способности микроорганизмов к образованию значительных количеств магнетита в результате диссимиляционного процесса в анаэробных условиях заставило по новому взглянуть на проблемы, связанные с генезисом древних железистых кварцитов и магнетизацией современных почв. Перед исследователями сразу встал вопрос, насколько широко может быть распространено диссимиляционное восстановление Fe(III) в различных физико-химических условиях. Верхняя температурная граница микробной железоредукции была особенно интересна в связи с выдвинутой гипотезой о том, что в микробных сообществах Архея и Протерозоя, вероятно, состоявших в значительной степени из термофильных микрорганизмов и формировавших основу древнейшей биосферы;

восстановление трёхвалентного железа могло быть первым глобально значимым механизмом окисления органического вещества (Walker 1987).

К началу наших исследований в 1993 г. о существовании микробных процессов диссимиляционного восстановления Fe(III), идущих при повышенных температурах известно не было. О восстановлении трёхвалентного железа термофильным археоном Sulfolobus acidocaldarius в микроаэрофильных условиях сообщалось Броком и Густафсоном в 1976 году (Brock & Gustafson 1976). Полученные данные демонстрировали биотический характер восстановления железа, однако, не позволяли однозначно судить об использовании Fe(III) в качестве акцептора электронов при росте данного микроорганизма. В 1995 г. нами были опубликованы данные, доказывающие существование диссимиляционного процесса восстановления Fe(III) термофильными микроорганизмами, идущего с образованием магнетита (Слободкин и др. 1995). В том же году появилось сообщение о выделении облигатно анаэробной бактерии Bacillus infernus, способной восстанавливать растворимые формы Fe(III) (Boone et al 1995). В последующие годы круг организмов, осуществляющих диссимиляционную железоредукцию, был расширен термофилами, выделенными из различных мест обитания (Greene et al. 1997, Slobodkin et al 1997, Slobodkin et al. 1999). Способность к восстановлению Fe(III) была выявлена у некоторых коллекционных культур гипертермофильных микроорганизмов, относящихся к различным физиологическим и филогенетическим группам бактерий и архей (Vagras et al.

1998). На основании этого была выдвинута гипотеза о том, что такое широкое распространение способности к железоредукции среди гипертермофильных прокариот, которых принято считать филогенетически близкими к последнему общему предку всех живых организмов, указывает на то, что восстановление Fe(III) является древнейшим типом метаболизма.

К настоящему времени известно около 30 видов железовосстанавливающих термофилов, относящихся к 19 родам. Важными открытиями последних лет явились обнаружение способности гипертермофильных архей к использованию ацетата, ароматических соединений и длинноцепочечных жирных кислот за счёт восстановления Fe(III) (Tor et al. 2001, Tor & Lovley 2001, Kashefi et al. 2002) и выделение железоредуктора, способного развиваться при температуре 121oC (Kashefi & Lovley 2003). Быстрыми темпами увеличиваются знания о филогенетическом разнообразии термофильных железоредукторов (Reysenbach et al. 2006, Johnson et al. 2006, Zavarzina et al. 2007, Sokolova et al. 2007).

Кроме Fe(III) термофильные микроорганизмы восстанавливают и ряд других переменно-валентных металлов - Mn(IV), Cr(VI), U(VI), Tc(VII), Co(III), Mo(VI), Au(I, III), Hg(II). Марганец(IV) и молибден(VI), используются в качестве акцептора электронов при росте (Greene et al. 1997, Brierley & Brierley 1982). Использование шестивалентного урана в качестве терминального акцептора электронов при росте показано нами в 2005 г. (Khijniak et al., 2005).

Физиологическая роль восстановления остальных металлов остаётся в основном невыясненной (Kashefi & Lovley 2000, Roh et al. 2002).

Цель и задачи исследования Целью настоящего исследования являлось выявление и изучение термофильных микроорганизмов, способных к восстановлению трёхвалентного железа.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Показать принципиальную возможность диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильными микроорганизмами.

2. Исследовать распространение микроорганизмов, способных к восстановлению нерастворимых соединений трёхвалентного железа, в различных типах термальных экосистем.

3. Выделить чистые культуры термофильных Fe(III)-восстанавливающих микроорганизмов, исследовать их фенотипические и генотипические свойства и установить таксономический статус.

4. Изучить физиологические и биохимические механизмы восстановления железа(III) термофилами и определить функции железоредукции в процессах микробного метаболизма.

5. Исследовать способность термофильных железоредукторов к восстановлению токсичных и радиоактивных металлов переменных валентностей.

Научная новизна и значимость работы Впервые показано, что термофильные микроорганизмы могут осуществлять процесс диссимиляционного восстановления трёхвалентного железа. Данный факт расширяет круг возможных биогеохимических процессов, идущих с участием термофильных прокариот в наземных и глубинных системах современной биосферы, и может служить основой для моделирования микробных процессов, протекавших в древнейшие эпохи существования Земли или во внеземных условиях. Открытие термофильного микробного окисления молекулярного водорода и ацетата, сопряжённого с использованием Fe(III) в качестве акцептора электронов, позволяет предположить значительную роль железоредукторов в трофических взаимодействиях в термальных биотопах, содержащих соединения трёхвалентного железа.

Продемонстрировано, что продуктом микробного восстановления слабокристаллических форм Fe(III) в термофильных условиях является внеклеточный магнетит. Полученные данные могут служить обоснованием участия термофильных железоредукторов в образовании месторождений докембрийских железистых кварцитов.

Установлено, что термофильные прокариоты, способные к восстановлению нерастворимых соединений Fe(III), широко распространены в термальных экосистемах. Сообщения об обнаружении железоредуцирующих микроорганизмов в континентальных и глубоководных морских гидротермах являются приоритетными.

Выделены в чистую культуру, охарактеризованы и валидированы новые таксоны железовосстанавливающих термофильных бактерий:

sp. nov., Thermoterrabacterium/Carboxydothermus ferrireducens Thermoanaerobacter siderophilus sp. nov., Thermovenabulum ferriorganovorum gen. nov., sp. nov., Deferribacter abyssi sp. nov., Tepidimicrobium ferriphilum gen.

nov., sp. nov.

Впервые охарактеризованы физиологические стратегии восстановления нерастворимых форм Fe(III) и мембраносвязанные железоредуктазные активности у диссимиляционного железоредуктора с грамположительным типом клеточной стенки (Carboxydothermus ferrireducens). Обнаружено, что экзогенный сидерофор может стимулировать диссимиляционное восстановление Fe(III) в отсутствие свободного доступа клеток к нерастворимому акцептору по челночному механизму. Впервые показана возможность трансформации слабокристаллического оксида Fe(III) в магнетит в результате образования низких концентраций сульфида гипертермофильными сульфатвосстанавливающими микроорганизмами.

Впервые продемонстрировано восстановление технеция(VII) термофильными бактериями. Впервые обнаружена возможность микробного использования минерала урана в качестве акцептора электронов и продемонстрирована способность термофильных микроорганизмов получать энергию для роста при восстановлении U(VI).

Практическая ценность Создана коллекция термофильных микроорганизмов, способных к восстановлению Fe(III), Cr(VI), Tc(VII), U(VI). Полученные штаммы могут служить основой для разработки биотехнологий иммобилизации растворимых соединений хрома, технеция и урана путём их энзиматического восстановления в менее токсичные и слаборастворимые формы.

Обнаруженная способность Carboxydothermus ferrireducens восстанавливать минералы U(VI) показывает принципиальную возможность взаимодействия микроорганизмов с твёрдофазными соединениями урана, которая может происходить в уран-содержащих рудах или местах, загрязнённых радионуклидами. Эта возможность ранее была неизвестна и должна учитываться при разработке новых биоремедиационных технологий.

Образование внеклеточных кристаллов магнетита термофильными прокариотами может быть использовано при создании новых наноматериалов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1. International Conference on The Biology, Ecology and Biotechnology of Thermophilic Microorganisms. Athens, GA, USA. 1996.

2. International Conference "Thermophiles' 98". Brest, France. 1998.

3. 3th International Congress on Extremophiles. Hamburg, Germany. 2000.

4. International Conference “Thermophiles’ 2001”. New Delhi, India. 2001.

5. 4 th International Congress on Extremophiles. Naples, Italy. 2002.

6. Всероссийской конференции «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии» Улан-Удэ. 2003.

7. International Symposium on Environmental Biogeochemistry. Oirase, Japan.

2003.

8. 8th International Conference on Thermophiles Research. Gold Coast, Australia.

2005.

9. 2nd FEMS Congress of European Microbiologists. Madrid, Spain. 2006.

Публикации Материалы диссертации содержатся в 57 печатных работах, включающих 26 экспериментальных статей, 3 обзора и 28 тезисов.

Структура диссертации Диссертация состоит из введения, 3 частей, включающих 14 глав, заключения и выводов, изложенных на 374 страницах, включая 42 таблицы, рисунков и списка литературы из 574 наименований, из них 58 на русском и 516 на английском языке.

Место проведения работы Основная часть работы была выполнена в Институте микробиологии им.

С.Н. Виноградского РАН. Работы по термофильной микробной железоредукции были начаты в отделе микробных сообществ ИНМИ РАН под руководством академика РАН Г.А. Заварзина в 1993 г. В 1995-1996 гг. часть работы проводилась в Университете штата Джорджия, США в лаборатории проф. Ю. Вигеля (J. Wiegel). С 1997 г. основным местом исследований является лаборатория гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН, руководимая д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской. В отдельных этапах работы принимали участие сотрудники и аспиранты лаборатории: М.Л.

Мирошниченко, Г.Б. Слободкина, Д.Г. Заварзина, С.Н. Гаврилов. Электронно микроскопические исследования были выполнены в ИНМИ РАН Н.А.

Кострикиной. Геносистематические исследования проводились Т.П. Туровой, Н.А. Черных, А.М. Лысенко и Б.Б. Кузнецовым. В исследованиях микробной железоредукции в нефтяных месторождениях принимала участие д.б.н. Т.Н.

Назина. Изучение глубоководных гидротерм стало возможным благодаря участию соискателя в рейсе французского научно-исследовательского судна “Atalante” с глубоководным спускаемым аппаратом “Nautile” (руководитель миссии – К. Жантон (C. Jeanthon)). Мёссбауэровские исследования минералов железа проводились Н.И. Чистяковой и В.С. Русаковым (Физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова). Биохимические исследования железоредуктазы выполнялись в Технологическом Университете г. Дельфт, Нидерланды совместно с проф. С. де Врисом (S. de Vries). Восстановление соединений урана исследовалось совместно с Т.В. Хижняк (ИНМИ РАН) и Д. Ллойдом (J. Lloyd) в Университете г. Манчестер, Великобритания. Исследования восстановления технеция проводили совместно с К.Э. Германом и В.В. Перетрухиным в Институте физической химии РАН и в лаборатории проф. М. Симонофф (M.

Simonoff) в Университете г. Бордо, Франция. Помощь на разных этапах работы была также оказана со стороны проф. Б. Джонса (B. Jones) Нидерланды;

Б.

Кампбелл (B. Campbell) Университет штата Делавер, США;

профессоров Н.-К.

Биркеланда (N.-K. Birkeland) и Т. Лиена (T. Lien) Университет г. Бергена, Норвегия;

проф. И. Шрёдер (I. Shroeder) Университет Калифорнии, Лос Анджелес, США и проф. Ф. Робба (F. Robb) Университет штата Мэриленд, США. Соискатель выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы.

Основные защищаемые положения 1. Термофильные микроорганизмы способны использовать трёхвалентное железо в качестве акцептора электронов для роста.

2. Термофильные прокариоты, способные к восстановлению нерастворимых соединений Fe(III), распространены в различных типах термальных экосистем.

3. Термофильные железовосстанавливающие микроорганизмы не являются единой филогенетической группой.

4. Железовосстанавливающие термофилы сопрягают восстановление Fe(III) с окислением широкого спектра органических и неорганических веществ.

5. Tермофильные железовосстанавливающие бактерии способны энзиматически восстанавливать токсичные и радиоактивные металлы переменных валентностей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Образцы осадков, воды, минеральных и биологических образований из различных природных и антропогенных систем, характеризующихся повышенными температурами, были отобраны автором в ходе экспедиций (Камчатка 1993, 1994 гг., о-в Кунашир 1998 г., Йеллоустонский национальный парк 1999 г., глубоководные гидротермы Восточно-Тихоокеанского поднятия 1999 г., Баргузинская долина 2003 г.), либо любезно предоставлены соавторами публикаций или сотрудниками Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН.

Для получения и культивирования накопительных и чистых культур термофильных микроорганизмов использовали несколько сред разного минерального состава: низкоминерализованная среда (модифицированная среда Пфеннига (Pfennig 1965), солоноватая среда, среда морской солёности (модифицированная DSMZ medium 399 [http://www.dsmz.de]). Если не оговорено отдельно, во все среды добавляли 200 мг/л дрожжевого экстракта, мл/л раствора микроэлементов (Slobodkin et al. 1997) и 1 мл/л раствора витаминов (Wolin et al. 1963). Все среды готовили анаэробно с применением модифицированной техники Хангейта под CO2 (100% в газовой фазе). При использовании соединений Fe(III) в качестве потенциального акцептора электронов восстанавливающие агенты в среды не вносили. Если использовались среды, предварительно восстановленные Na2S*9H2O, в них добавляли резазурин. Нерастворимый оксид Fe(III) готовили путём титрования раствора FeCl3*6H2O (60 г/л) раствором NaOH (10% (вес/об.)) до pH 8.0-9.0.

Анализ образующегося в этих условиях нерастворимого осадка методом микродифракции электронов показал, что он представляет собой смесь минералов - ферригидрита (5Fe2O3*9H2O) и протоферригидрита. В дальнейшем в настоящей работе для обозначения данного вещества используется наиболее общий термин «слабокристаллический оксид Fe(III)», или иногда для краткости «ферригидрит». Культивирование накопительных и чистых культур проводили в пробирках Хангейта (Bellco Glass) объёмом 17 мл с 10 мл жидкой среды.

Газовую фазу заполняли 100% CO2. Среды стерилизовали автоклавированием при 135oC (2 ати) в течение 60 мин. Пересевы осуществляли анаэробно стерильными одноразовыми шприцами.

Накопительные культуры железоредукторов получали путём инокуляции (10% об./об.) образца в анаэробную среду, содержащую слабокристаллический оксид Fe(III) в качестве акцептора электронов. В качестве донора электронов использовали молекулярный водород, ацетат или пептон. О развитии железовосстанавливающих микроорганизмов в первичных накопительных культурах судили по образованию чёрного магнитного осадка после инкубации культур в течение 7-14 суток. При дальнейших пересевах проводили микроскопические исследования роста и химическое определение образующегося Fe(II). Численность культивируемых Fe(III) восстанавливающих микроорганизмов определяли методом последовательных 10-кратных серийный разведений в жидких средах, содержащих слабокристаллический оксид Fe(III).

Чистые культуры выделяли методом предельных разведений на жидкой среде с последующим получением отдельных колоний в анаэробной агаризованной среде. Диапазоны температуры, pH, концентрации NaCl, использование доноров и акцепторов электронов, чувствительность к антибиотикам определяли по описанным методикам (Slobodkin et al. 1997, 1999). Описание новых таксонов железовосстанавливающих микроорганизмов осуществляли в соответствии с правилами, предъявляемыми Международным комитетом по систематике прокариот к описанию новых таксонов микроорганизмов.

Количество клеток определяли прямым подсчётом с помощью световой микроскопии. При подсчете клеток на средах со слабокристаллическим оксидом Fe(III) пробу разводили раствором оксалата аммония (рН 3,5) для растворения осадков соединений железа. В некоторых экспериментах вместе с подсчётом клеток определяли также оптическую плотность культур при 600 нм.

Восстановление Fe(III) в культурах микроорганизмов контролировали путём измерения концентраций образующегося Fe(II). Двухвалентное железо измеряли спектрофотометрически с 2,2’-дипиридилом или феррозином после 24-часовой экстракции образца объёмом 0,5 мл в 5 мл 0,6 N HCl. Анализ короткоцепочечных органических кислот, спиртов, сахаров, проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Летучие жирные кислоты, спирты и молекулярный водород определяли методами газовой хроматографии.

Применённые в работе биохимические, молекулярно-биологические, электронно-микроскопические, физические и радиохимические методы описаны в полном тексте диссертации и соответствующих публикациях.

РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Обнаружение способности термофильных микроорганизмов к диссимиляционному восстановлению Fe(III) К началу наших исследований о способности термофильных микроорганизмов диссимиляционно восстанавливать Fe(III) не сообщалось. Мы решили выяснить, существует ли при повышенных температурах микробный процесс окисления одного из ключевых метаболитов разложения органического вещества - ацетата, сопряжённый с использованием нерастворимых оксидов Fe(III), являющихся наиболее вероятными формами трёхвалентного железа в гидротермальных системах. В диапазоне температур развития мезофильных микроорганизмов подобный процесс идёт с образованием магнетита (Lovley et al. 1986);

формирование каких минералов будет происходить при более высоких температурах, известно не было.

Для получения культуры термофильных железоредукторов были использованы пробы осадков термальных источников Долины Гейзеров (Камчатка). Анаэробно приготовленная среда, содержащая ацетат в качестве потенциального донора электронов и слабокристаллический оксид Fe(III) в качестве потенциального акцептора электронов, была инокулирована 10% (об.) пробы и инкубирована в темноте при 70oC. Через 48-72 часа культивирования наблюдалось уменьшение объема осадка слабокристаллического оксида Fe(III) и изменение его цвета с коричневого на черный. Образовавшийся осадок был магнитным и содержал значительные количества Fe(II). Полученная накопительная культура микроорганизмов была очищена методом последовательных серийных разведений на среде того же состава. Культура не теряла способности к образованию магнитного осадка после более последовательных 5% пересевов. Образование магнитного осадка и восстановление Fe(III) в культуре наблюдалось в интервале температур 55 76oC, с оптимумом при 70oC. Восстановления Fe(III) не происходило при 80oC и ниже 50oC. Потребление ацетата и сопутствующее накопление Fe(II) происходило в соотношении примерно 1:6 и согласовывалось с ростом числа клеток (Рис. 1), при этом наблюдалось образование молекулярного водорода и его последующее потребление. Культура образовывала магнитный осадок также при росте в среде, содержащей слабокристаллический оксид Fe(III) и пептон (5 г/л), дрожжевой экстракт (0,6 г/л) или молекулярный водород (от 3 до 100% в газовой фазе) в качестве доноров электронов (Слободкин и др. 1995).

Рис. 1. Рост (1) и концентрации ацетата (2), Fe(II) (3) и H2 (4) в культуре. Начальная концентрация CH3COO- – 7,3 mM (CH3COONa*3H2O -1 г/л).

Рис. 2. Сканирующая электронная микрография магнитного осадка. Ионное напыление Pt Pd. JEOL JSM-T300, 25 kV. Длина масштабной линейки - 100 мкм.

Филогенетический анализ фрагментов генов 16S рРНК, разделённых методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) показал, что полученная устойчивая железовосстанавливающая накопительная культура состоит из двух микроорганизмов – Caldanaerobacter sp. с ближайшим родственником Caldanaerobacter subterraneus (Fardeau et al. 2004) и Thermolithobacter sp. c ближайшим родственником Thermolithobacter ferrireducens (Sokolova et al. 2007);

степень гомологии нуклеотидной последовательности в обоих случаях составила 99%. Caldanaerobacter sp.

штамм SC44, был получен в чистой культуре и оказался способным восстанавливать Fe(III) с пептоном или молекулярным водородом, однако не использовал ацетат в качестве донора электронов для железоредукции.

Преобладающий рост Thermolithobacter sp. был получен в литоавтотрофных условиях с H2/Fe(III). Очевидно, разложение ацетата бинарной культурой осуществляется при синтрофном взаимодействии двух микроорганизмов.

Известна способность бактерий группы Thermoanaerobacter-Caldanaerobacter к синтрофному разложению ацетата в ассоциации с водород-использующим метаногеном (Шестакова 2007). Можно предположить, что Thermolithobacter sp. удаляет молекулярный водород, используя его в качестве донора электронов при восстановлении Fe(III) и делая термодинамически возможным разложение ацетата, которое осуществляет Caldanaerobacter SC44.

По данным дифракционного рентгеновского анализа чёрное вещество осадка слагается магнетитом и сидеритом. Среднее отношение магнетит/сидерит составляет 5:1. Электронномикроскопические наблюдения магнитного осадка установили, что он в основном представлен октаэдрическими и кубическими кристаллами, размером от 15 до 40 мкм (Рис.

2). Кристаллы магнетита слагаются отдельными призматическими блоками кристаллитов (Слободкин и др. 1995).

Таким образом, в исследованной культуре магнетит образуется за счет диссимиляционного восстановления слабокристаллического оксида Fe(III) железовостанавливающими микроорганизмами.

2. Распространение железовосстанавливающих микроорганизмов в различных типах термальных экосистем 2.1. Наземные континентальные гидротермы. Основным источником трёхвалентного железа в континентальных гидротермах являются отложения слабокристаллических оксидов Fe(III), как абиогенные, так и биогенные, образующиеся в местах выхода на поверхность глубинных гидротермальных вод, содержащих Fe(II). В водах геотермальных районов Камчатки общая концентрация растворённого железа может достигать нескольких десятков миллиграммов в литре для кислых источников и обычно не превышает одного миллиграмма в литре для вод со значением pH близким к нейтральному (Чудаев и др. 2000). Мы показали присутствие термофильных железоредукторов, использующих молекулярный водород, ацетат или пептон в качестве донора электронов, в осадках пресноводных горячих ручьёв, гидротермальных источниках и геотермально нагреваемой почве, расположенных в различных географических регионах (Рис. 3).

Микроорганизмы, восстанавливающие слабокристаллический оксид Fe(III), были обнаружены не только в термальных системах с нейтральной реакцией среды, но и в кислых и слабо щелочных условиях (Slobodkin & Wiegel 1997, Бонч-Осмоловская и др. 1999). Численность железоредукторов в наземных пресноводных гидротермах достигала 107 клеток/см3. Из континентальных источников Камчатки, Баргузинской долины и Йеллоустонского национального парка нами были выделены железовосстанавливающие термофилы отнесённые к новым таксонам Thermoterrabacterium ferrireducens, Thermoanaerobacter siderophilus, Thermovenabulum ferriorganovorum, Tepidimicrobium ferriphilum (Slobodkin et al. 1997, Slobodkin et al. 1999b, Zavarzina et al. 2002, Slobodkin et al.

2006a).

100 18 5 12 26 15 14 80 9 8 24 21 4 T, C 3 2 22 60 50 11 2 3 4 5 6 7 8 9 pH Рис. 3. Температура и pH образцов пресноводных гидротермальных осадков, из которых были получены устойчивые накопительные или чистые культуры термофильных железоредукторов. Цифрами указаны места отбора проб.

1 - Камчатка, Долина Гейзеров;

2-7 - Камчатка, кальдера Узон;

8 - Камчатка, влк.

Карымский;

9-10 - о-в Кунашир;

11 - Баргузинская долина;

12 - Исландия, Fludiv;

13 Исландия, Hveradge;

14 - Новая Зеландия, Waimangu;

15 - Новая Зеландия, Rotorua;

16-17 Фиджи, о-в Vanua Levu;

20-26 – Йеллоустонский нац. парк.

2.2. Высокотемпературные нефтяные месторождения. Оксиды железа могут входить в состав геотермально нагреваемых нефтеносных пород, а концентрация растворённого железа в пластовых водах иногда достигает десятков миллиграммов в литре. Термофильные микроорганизмы, способные к диссимиляционному восстановлению Fe(III), были найдены в пластовых водах морских нефтяных месторождений и в осадочных породах, которые были изолированы от поверхностных геологических и гидрологических процессов на протяжении миллионов лет (Boone et al., 1995, Greene et al. 1997). Мы исследовали нефтяное месторождение Самотлор (Западная Сибирь), расположенное в глубине континента. Присутствие термофильных железоредукторов было обнаружено в образцах пластовой воды, отобранных из трёх различных горизонтов, во всём диапазоне исследованных температур от 85oC до (Табл. 1). Численность водород-использующих железовосстанавливающих термофильных микроорганизмов была относительно невелика и составляла от единиц до сотен кл/мл. Чистые культуры термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Thermotoga и архей рода Thermococcus, выделенные из пластовых вод месторождения Самотлор, также оказались способными к восстановлению слабокристаллического оксида Fe(III) с образованием магнетита (Slobodkin et al. 1999a).

Таблица 1. Восстановление Fe(III) накопительными культурами и численность железовосстанавливающих термофилов в образцах пластовой воды из различных горизонтов нефтяного месторождения Самотлор Горизонт, Темпера- Количество Количество образцов, в Численность H2 глубина, тура исследован которых обнаружено использующих температура инкуба- -ных восстановление Fe(III) Fe(III) o ции, C образцов редукторов, кл/мл с H2 с пептоном A4-5 60 3 3 0 10- н/о a 1799-1801 м 65 3 3 45-60oC 70 1 1 0 10- B8-10 60 2 0 2 2090-2220 м 65 2 1 1 н/о o 70-72 C 70 2 1 1 10- J 60 3 2 2 2274-2536 м 65 3 2 2 н/о o 75-84 C 70 3 3 2 85 3 3 0 10- a н/о – не определялось 2.3. Глубоководные морские гидротермы. Поверхность активных гидротермальных построек часто бывает покрыта отложениями оксидов железа различного цвета - от чёрного до светло-коричневого, а содержание железа в гидротермальном флюиде достигает молярных концентраций. Образование Fe(III) в этих системах может происходить в результате окисления оксигенированной холодной водой геотермально выщелачиваемого Fe(II) или за счёт идущей при температурах выше 300oC реакции восстановления сульфатов морской воды двухвалентным железом, содержащимся в базальте (Jannasch & Mottl 1985). Несмотря на распространённость соединений Fe(III) в глубоководных гидротермах и их потенциальную доступность для использования в качестве акцептора электронов, до наших работ информация о наличии и численности термофильных железоредукторов в этих экосистемах отсутствовала. Мы исследовали образцы, отобранные с гидротермальных полей Восточно-Тихоокеанского поднятия (ВТП) в районе 13o Северной широты с глубины около 2600 м во время научной экспедиции AMISTAD (июнь 1999 г.).

Термофильные железоредукторы были обнаружено в гидротермальных постройках («чёрные курильщики»), разбавленном морской водой гидротермальном флюиде и чехлах альвинелид (Alvinella spp.) (Табл. 2).

Таблица 2. Численность культивируемых железовосстанавливающих микроорганизмов в образцах из глубоководных морских гидротерм ВТП Образец Численность железоредукторов, использующих различные доноры электронов (клеток/см3) Пептон Ацетат H o o Т инкубации, oC Т инкубации, C Т инкубации, C 52 65 80 90 52 65 80 90 52 65 80 Внешняя часть 103 103 107 107 103 103 - 102 103 103 гидротермальной постройки с Alvinella spp.

Внешняя часть 102 103 105 107 - 102 102 101 - 101 103 гидротермальной постройки Внутренняя часть 101 102 103 103 - 101 101 гидротермальной - - - постройки Чехлы Alvinella 1 1 - - - - - - - - - Чехлы Riftia - - - н/о - - - н/о - - - н/о Разбавленный гидротермальный н/о - 1 1 н/о - - - н/о - - флюид н/о – не определялось - отсутствие образования Fe(II) через 14 суток инкубации Оценка численности железовосстанавливающих термофильных микроорганизмов показала, что их количество в разных частях гидротермальной постройки варьирует от 10 до 107 клеток/см3. Наибольшая численность наблюдалась на внешней стороне «чёрного курильщика», покрытой колониями полихеты Alvinella pompejana, т.е. в присутствии значительного количества органического вещества. Во всех исследованных образцах численность железовосстанавливающих микроорганизмов, способных использовать пептон, превышала численность ацетат- и водород-использующих железоредукторов. Последние разведения каждого образца, в которых наблюдалось восстановление Fe(III), были проанализированы методом ДГГЭ.

Секвенирование и филогенетический анализ генов 16S рРНК показали присутствие в них микроорганизмов, родственных археям рода Thermococcus, и бактериям родов Deferribacter, Bacillus, Ralstonia, Marinitoga, а также клонам некультивируемых представителей Clostridiaceae и -Proteobacteria. Из разбавленного морской водой гидротермального флюида 13oN ВТП выделен гипертермофильный железовосстанавливающий археон Thermococcus sp.

штамм SN531 (Slobodkin et al. 2001). Из другой глубоководной гидротермальной системы (Срединно-Атлантический хребет, поле Rainbow) нами был выделен новый ацетат-использующий термофильный железоредуктор, Deferribacter abyssi (Miroshnichenko et al. 2003). Параллельно, американскими исследователями из глубоководных гидротерм были получены термофильные железовосстанавливающие археи Geoglobus ahangari и Aciduliprofundum boonei, а также бактерия Geothermobacter ehrlichii (Kashefi et al. 2002, 2003, Reysenbach et al. 2006).

2.4. Мелководные морские гидротермы. Мелководные морские гидротермы также являются местообитанием термофильных железоредуцирующих прокариот. У некоторых микроорганизмов, выделенных из мелководных гидротерм без применения Fe(III), была обнаружена способность к диссимиляционному восстановлению трёхвалентного железа (Vargas et al.

1998). Из прибрежных морских гидротерм о. Кунашир нами были выделены чистые культуры Thermococcus SM402 и Thermococcus SM4022, восстанавливающие слабокристаллический оксид Fe(III) с пептоном в качестве донора электронов (Slobodkina et al. 2004). По нашим данным, численность культивируемых литоавтотрофных железоредукторов в мелководных гидротермах Курильских островов составляет не менее 103 клеток/см3.

Получены устойчивые ассоциации микроорганизмов, литоавтотрофно восстанавливающие слабокристаллический оксид Fe(III) с молекулярным водородом в качестве донора электронов при 65 и 85oC. ДГГЭ анализ показал, что эти термофильные и гипертермофильные культуры содержали архей рода Thermococcus.

2.5. Антропогенные экосистемы. Термофильные железоредукторы обнаружены в саморазогревающихся угольных и рудных отвалах, в анаэробных биореакторах, а также в воде и коррозионных отложениях труб тепловых сетей г. Москвы (Bridge & Johnson 1998, Balk et al. 2002, Розанова и др. 2003). Из проб сброженного осадка из метантенка, работающего в термофильном режиме (Курьяновская станции аэрации, Москва), нами была получена устойчивая ассоциация гипертермофильных микроорганизмов, восстанавливающая слабокристаллический оксид Fe(III) с пептоном в качестве донора электронов при 82oC и состоящая из архей рода Sulfophobococcus и бактерий родов Thermotoga и Thermodesulfobacterium (Слободкина и др. 2004). Из муниципальных сточных вод той же станции нами была выделена бинарная культура бактерий (Thermincola sp. + Petrobacter sp.), растущая при 50oC и способная к окислению ацетата, сопряженному с восстановлением слабокристаллического оксида Fe(III) при относительно высокой начальной концентрации кислорода (14-18% O2 в газовой фазе). По мере удаления кислорода факультативно-аэробным Petrobacter sp., неспособным к железоредукции, в среде создавались анаэробные условия, необходимые для роста и восстановления Fe(III) Thermincola sp.

Таким образом, наши исследования показали, что термофильные прокариоты, способные к восстановлению нерастворимых соединений Fe(III), распространены в большинстве известных к настоящему времени типов термальных экосистем, расположенных в различных географических регионах.

Местообитания термофильных железоредукторов включают континентальные и островные пресноводные горячие источники, мелководные и глубоководные морские гидротермы, высокотемпературные нефтяные месторождения, пустынные почвы и антропогенные экосистемы. Численность культивируемых железовосстанавливающих микроорганизмов варьирует от нескольких десятков клеток на миллилитр в пластовых водах Самотлора до 107 кл/мл в чёрных курильщиках Тихого океана (Табл. 3).

Таблица 3. Максимальная численность культивируемых микроорганизмов, восстанавливающих слабокристаллический оксид Fe(III), в различных типах термальных экосистем Термальная система Донор Численность, Т инкубации, 3 o электронов (кл/см ) C Наземные континентальные Ацетат 10 гидротермы Водород Пептон 10 Нефтяные месторождения Водород 60- Морские глубоководные Ацетат 50- гидротермы Водород 65- Пептон 10 80- Морские мелководные Водород 10 гидротермы Водород Антропогенные экосистемы Ацетат 10 Пептон 3. Таксономия термофильных железовосстанавливающих микроорганизмов 3.1. Таксономическое положение термофильных прокариот, способных к железоредукции. Термофильные железовосстанавливающие микроорганизмы не представляют собой специфическую филогенетическую группу и обнаружены в 8 типах домена Bacteria и в двух типах домена Archaea. К настоящему времени способность к диссимиляционному восстановлению Fe(III) показана для 31 вида термофилов, относящихся к 19 родам (Lovley et al.

2004, Слободкин 2005). Наибольшее количество видов термофильных железоредукторов относятся к фирмикутам. Нами была установлена способность к восстановлению слабокристаллического оксида Fe(III) для штаммов термофильных микроорганизмов, относящихся к 21 виду и 10 родам (Рис. 3).

Clostridiales Carboxydothermus ferrireducens JW/AS-Y7T Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901T ‘Carboxydothermus organotrophus’ SNA Firmicutes Bacteria Caloramator coolhaasii SP Tepidimicrobium ferriphilum SB91T Thermincola sp. SBA Thermotogae Thermoanaerobacteriales Thermotoga maritima М Thermoanaerobacter siderophilus SR4T Thermotoga subterranea SL1T Thermoanaerobacter wiegelii Rt8.B1T Thermoanaerobacter sulfurophilus L-64T Thermoanaerobacter acetoethylicus SL 26, SL Thermoanaerobacter brockii M Caldanaerobacter subterraneus SEBR 7858T, SP47, 2707, SC Deferribacteres ‘Caldanaerobacter uzonensis’ K- Thermovenabulum ferriorganovorum Z-9801T Deferribacter abyssi JRT ‘Deferribacter autotrophicus’ SL Thermococcales Thermococcus sibiricus 739T, 642, Euryarchaeota Archaea Thermococcus sp. SN Thermococcus sp. SM Рис. 3. Таксономическое положение штаммов термофильных микроорганизмов, у которых была выявлена способность к железоредукции.

Пять штаммов были описаны и узаконены как новые таксоны – Thermoterrabacterium ferrireducens gen. nov., sp. nov., Thermoanaerobacter siderophilus sp. nov., Thermovenabulum ferriorganovorum gen. nov., sp. nov., Deferribacter abyssi sp. nov. и Tepidimicrobium ferriphilum gen. nov., sp. nov.

Восемь штаммов термофильных железовосстанавливающих прокариот были идентифицированы как ‘Carboxydothermus organotrophus’ SNA, Thermincola sp.

SBA6, ‘Deferribacter autotrophicus’ SL50, Thermococcus spp. SN531 и SM 4022, Caldanaerobacter subterraneus spp. SP47, SC44, Caloramator coolhaasii sp. SP610.

Способность к железоредукции была установлена также для 14 коллекционных штаммов, выделенных без использования трёхвалентного железа (рр.

Thermoanaerobacter, Caldanaerobacter, Thermotoga, Thermococcus). Следует подчеркнуть, что способность к железоредукции была выявлена нами у архей рода Thermococcus и бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter.

Представители этих таксономических групп являются космополитными видами, достигающими высокой численности популяции во многих местообитаниях (Miroshnichenko et al. 2001, Slobodkin et al. 2001) и, следовательно, их вклад в процесс восстановления железа(III) в термальных экосистемах может быть значимым.

3.2. Новые таксоны железовосстанавливающих бактерий. Основные характеристики типовых видов микроорганизмов, представляющих собой новые таксоны, приведены в Таблицах 4-6. Все бактерии имеют клетки палочковидной формы различного размера. Thermoanaerobacter siderophilus и Thermovenabulum ferriorganovorum образуют округлые терминально расположенные эндоспоры. Клеточная стенка у всех микроорганизмов, кроме Deferribacter abyssi, грамположительного типа. Tepidimicrobium ferriphilum – умеренный термофил с температурным оптимумом около 50oC;

остальные организмы - истинные термофилы с оптимумом температуры роста от 60 до 70oC. Почти все организмы имеют оптимум pH в диапазоне 6-7, т.е. являются нейтрофильными, только Tepidimicrobium ferriphilum может расти до pH 9, (оптимум pH 7,6).

Все выделенные нами организмы относятся к домену Bacteria.

Deferribacter abyssi и ‘Deferribacter autotrophicus’ относятся к типу Deferribacteres, а остальные к типу Firmicutes, классу Clostridia и порядкам Clostridiales и Thermoanaerobacteriales.

Таблица 4. Морфологические и физиологические характеристики новых железоредукторов Тип клеточной T роста, oC pH роста Организм, статус Морфология стенки/споро- min-opt- min-opt образование max max Прямые или Г+/не 50-65-74 5,5-6,2-7, Thermoterrabacterium ferrireducens gen. nov., sp. слабо изогнутые обнаружено nov. (Slobodkin et al. 1997) палочки, 0,3-0,4 х реклассифицирован как 1,6-2,7 мкм.

Рис. 4.

Carboxydothermus ferrireducens comb. nov.

(Slobodkin et al. 2006b) Прямые или Г+/округлые 39-70-78 4,8-6,4-8, Thermoanaerobacter siderophilus sp.nov. слабо изогнутые эндоспоры в (Slobodkin et al. 1999b) палочки, 0,4-0,6 х терминальном 3,5-9,0 мкм. спорангии Рис. 6.

Прямые или Г+/округлые 45-64-76 4,8-6,8-8, Thermovenabulum ferriorganovorum gen. nov., разветвлённые эндоспоры в sp. nov. (Zavarzina et al. 2002) палочки, 0,5-0,6 терминальном мкм х 1,5-7,0 мкм. спорангии Рис. 7.

Deferribacter abyssi sp. nov Прямые или Г-/не 45-60-65 6.0-6.5-7. (Miroshnichenko et al. 2003) изогнутые обнаружено палочки, 0,4-0,5 х 1.5-2,0 мкм.

Рис. 9.

Прямые или Г+/не 26-50-62 5,5-7,6-9, Tepidimicrobium ferriphilum gen. nov., sp. nov. (Slobodkin слабо изогнутые обнаружено et al. 2006a) палочки, 0,5-0,6 х 3,0-7,0 мкм.

Рис. 11.

Процессы восстановления Fe(III) играют различную роль в метаболизме выделенных нами термофильных прокариот. У Deferribacter abyssi восстановление Fe(III) является формой анаэробного дыхания сопряжённого с окислением органических веществ. «Железное дыхание» осуществляет также Carboxydothermus ferrireducens при литотрофном росте с использованием неорганических доноров электронов - молекулярного водорода или моноксида углерода. При органотрофном росте Carboxydothermus ferrireducens, Fe(III) стимулирует неполные окисления несбраживаемых органических веществ, идущих у этого организма по гомоацетатному пути. Thermoanaerobacter siderophilus, Thermovenabulum ferriorganovorum и Tepidimicrobium ferriphilum имеют преимущественно бродильный тип метаболизма. Однако, в присутствии Рис. 4. Электронные микрографии ультратонких срезов клеток Carboxydothermus ferrireducens. Рост в среде со слабокристаллическим оксидом Fe(III) в качестве акцептора электронов.

Таблица 5. Таксономическое положение и местообитание новых железоредукторов Организм Г+Ц Таксономическое положение Местообитание (Bergey's Manual 2004) 41 Горячий ручей, Carboxydothermus ‘Firmicutes’ – ‘Clostridia’ Йеллоустонский ferrireducens Clostridiales - Peptococcaceae национальный парк 32 Гидротермальный Thermoanaerobacter ‘Firmicutes’ – ‘Clostridia’ источник влк. Карымский, siderophilus ‘Thermoanaerobacteriales’ Камчатка ‘Thermoanaerobacteriaceae’ 36 Гидротермальный Thermovenabulum ‘Firmicutes’ – ‘Clostridia’ источник, кальдера Узон, ferriorganovorum ‘Thermoanaerobacteriales’ Камчатка ‘Thermoanaerobacteriaceae’ 31 Глубоководная Deferribacter abyssi ‘Deferribacteres’ гидротермальная постройка, Срединно Атлантический хребет 33 Гидротермальный Tepidimicrobium ‘Firmicutes’ – ‘Clostridia’ Clostridiales (XII кластер) источник, Баргузинская ferriphilum долина трёхвалентного железа, оно используется в качестве внешнего акцептора электронов, при этом значительно стимулируется рост и изменяется состав продуктов брожения. Данный процесс может быть охарактеризован как «брожение с экзогенным акцептором электронов» или «облегчённое брожение». Помимо брожения Thermoanaerobacter siderophilus и Thermovenabulum ferriorganovorum могут расти, потребляя молекулярный водород и используя Fe(III) в качестве акцептора электронов, а Tepidimicrobium ferriphilum окисляет несбраживаемые аминокислоты и спирты в присутствии трёхвалентного железа.

Carboxydothermus ferrireducens JW/AS-Y7T Рис. 5. Дендрограмма, показывающая филогенетическое положение Carboxydothermus ferrireducens и ближайших родственных организмов. Масштабная линейка - 10% различия последовательностей.

Таблица 6. Метаболические характеристики новых железоредукторов Организм Доноры электронов Акцепторы Метаболизм электронов Глицерин, лактат, 1,2- Fe(III), Гомоацетатное Carboxydothermus пропандиол, глицерат, АХДС, использование ferrireducens 2 пируват, дрожжевой экстракт, S2O3, органических глюкоза, фруктоза, манноза, фумарат субстратов.

H2, моноксид углерода Литоавтотрофный рост с H2/ Fe(III).

Литотрофный рост с CO/ Fe(III).

Thermoanaerobacter Пептон, дрожжевой экстракт, Fe(III), Брожение.

2 мясной экстракт, казеин, АХДС, SO3 Облегчённое брожение siderophilus 2- крахмал, глицерин, пируват, S2O3, S, с Fe(III).

глюкоза, сахароза, фруктоза, MnO2 Использование H2 при мальтоза, ксилоза, восстановлении Fe(III).

целлобиоза, сорбит, H Пептон, дрожжевой экстракт, Fe(III), Брожение.

Thermovenabulum мясной экстракт, казаминовые АХДС, NO3, Использование H2 при ferriorganovorum SO32-, S2O32-, восстановлении Fe(III).

кислоты, крахмал, пируват, S0, MnO2, мелибиоза, сахароза, фруктоза, мальтоза, ксилоза, фумарат рибоза, H Fe(III), NO3-, Анаэробное дыхание Deferribacter abyssi Ацетат, сукцинат, пируват, S пептон, триптон, дрожжевой экстракт, H Пептон, триптон, Fe(III), Брожение.

Tepidimicrobium казаминовые кислоты, АХДС, Облегчённое брожение ferriphilum 2- дрожжевой экстракт, мясной S2O3, S, с Fe(III). Неполное 2 экстракт, L-валин, DL-аланин SeO3, окисление + глицин, DL-аланин + L- фумарат аминокислот и спиртов пролин, н-пропанол при восстановлении Fe(III).

Рис. 6 Рис. (a) (b) Рис. 6. Электронные микрографии Thermoanaerobacter siderophilus SR4T. (a) Препарат негативно окрашенных клеток. (b) Клетка с перитрихальным жгутикованием (негативное окрашивание). Длина масштабной линейки – 1 мкм.

Рис. 7. Электронные микрографии ультратонких срезов вегетативной (a) и спорулирующей (b) клетки Thermovenabulum ferriorganovorum Z-9801T. Длина масштабной линейки – 1 мкм.

Рис. 8. Дендрограмма, показывающая филогенетическое положение Thermovenabulum ferriorganovorum Z-9801T. Масштабная линейка - 5% различия последовательностей.

Рис. 9. Электронные микрографии негативно окрашенных клеток Deferribacter abyssi T JR. Длина масштабной линейки – 0,5 мкм.

Рис. 10. Дендрограмма, показывающая филогенетическое положение Deferribacter abyssi JRT. Масштабная линейка - 10% различия последовательностей.

Рис. 11. Электронные микрографии ультратонких срезов штамма Tepidimicrobium ferriphilum SB91T, выращенного в среде с пептоном и Fe(III)-ЭДТА. (a) Делящаяся клетка.

Длина масштабной линейки – 0,5 мкм. (b) Поперечный срез, показывающий слои клеточной стенки. Длина масштабной линейки – 0,1 мкм.

Рис. 12. Дендрограмма, показывающая филогенетическое положение Tepidimicrobium ferriphilum SB91T внутри XII кластера клостридий. Масштабная линейка - 5% различия последовательностей.

Таким образом, как и многие другие физиологические группы прокариот, термофильные железоредукторы - это группа, состоящая из микроорганизмов, не объединённых общностью происхождения. Не являются железовосстанавливающие организмы и строго специфичными в физиологическом отношении: все известные мезофильные и большинство термофильных железоредукторов, в том числе и «Fe(III)-дышащие», могут расти за счёт других метаболических процессов. Исключения составляют гипертермофилы Geoglobus ahangari (Kashefi et al. 2002a) и ‘Geothermobacterium ferrireducens’ (Kashefi et al. 2002b) не использующие другие акцепторы электронов, кроме Fe(III). Хотя многие микроорганизмы, способные восстанавливать Fe(III), принадлежат к широко распространённым родам культивируемых термофильных бактерий и архей, таких как Thermoanaerobacter, Caldanaerobacter, Thermotoga и Thermococcus, применение трёхвалентного железа в качестве потенциального акцептора электронов позволяет выделить и новые таксоны термофилов.

4. Физиологические и биохимические механизмы восстановления Fe(III) термофильными прокариотами Исследование взаимодействия микробной клетки с поверхностью твёрдого минерала представляет собой одну из наиболее интригующих и сложных задач современной физиологии микроорганизмов. Детальные исследования физиологии и биохимии диссимиляционной железоредукции до настоящего времени проводились лишь для представителей мезофильных родов Shewanella и Geobacter, имеющих грамотрицательный тип клеточной стенки. В ходе этих работ были открыты фундаментальные механизмы передачи электронов на нерастворимый акцептор с помощью веществ переносчиков или электропроводящих пилей, контактирующих с минералами железа (Lovley et al. 1998, Newman & Kolter 2000, Gorby et al. 2006). К настоящему времени описано более 20 содержащих гем с белков, участвующих в транспорте электронов к Fe(III), однако, не известно ни одного фермента, которому может быть приписана функция терминальной железоредуктазы in vivo. Информация о физиологии и биохимии диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильными микроорганизмами ограничена единичными сообщениями (Vadas et al. 1999, Childers & Lovley 2001, Feinberg & Holden 2006).

4.1. Литоавтотрофный рост Carboxydothermus ferrireducens с Fe(III) в качестве акцептора электронов. Первичная продукция органического вещества за счёт литоавтотрофных микроорганизмов является основой существования автономных микробных сообществ. Выделенный нами C.

ferrireducens оказался способным к устойчивому росту в среде, содержащей слабокристаллический оксид Fe(III) (ферригидрит) в качестве акцептора электронов, молекулярный водород в качестве донора электронов, CO2 в качестве единственного источника углерода. Рост числа клеток сопутствовал образованию Fe(II) и уменьшению концентрации H2 в газовой фазе (Рис. 13).

Максимальная концентрация клеток достигала 6,0*107 кл/мл. Среднее стехиометрическое отношение образовавшегося Fe(II) к потребленному H составляло 2,4. Минимальный порог потребления H2 в выросших 7-дневных культурах составлял 0,3 p.p.m.v. (3,0*10-5 % об.) и далее не снижался.

Слабокристаллический оксид Fe(III) восстанавливался в черный сильномагнитный осадок. При отсутствии молекулярного водорода (газовая фаза 100% N2) или CO2/NaHCO3 (газовая фаза 100% H2) роста и восстановления Fe(III) не происходило. Таким образом, C. ferrireducens способен к железному дыханию и автотрофной фиксации CO2 (Slobodkin et al. 1997, Гаврилов и др.

2003).

16 Рис. 13. Литоавтотрофный рост Содержание Н2 в среде и Концентрация Fe(II), мМ Рост, 107клеток/мл C. ferrireducens в среде с 5 ферригидритом, Н2 и CO 1 – рост;

2 – потребление водорода;

3 – образование Fe(II).

2 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Время, час 4.2. Влияние Fe(III) на органотрофный рост термофильных бактерий.

Причинами стимуляции органотрофного роста микроорганизма при железоредукции, кроме использования железа(III) в энергетических процессах, могут быть ассимиляция дополнительного количества железа, либо снижение окислительно-восстановительного потенциала среды вследствие образования Fe(II) (Takai et al. 2000). Анализ влияния этих факторов проводится крайне редко. Наши эксперименты с растущими культурами C. ferrireducens JW/AS Y7T и T. siderophilus SR4T показали, что стимуляция органотрофного роста этих микроорганизмов в присутствии Fe(III) вызвана использованием трёхвалентного железа в качестве акцептора электронов в катаболических процессах и не связана с влиянием на метаболизм образующегося Fe(II) или изменением окислительно-восстановительного потенциала среды. В присутствии Fe(III), максимальная концентрация клеток C. ferrireducens увеличивалась в 3 раза, а T. siderophilus - в 2 раза (Рис. 14);

у обоих организмов изменялись также состав и соотношение продуктов брожения в сторону образования более окисленных метаболитов (Рис. 15) (Slobodkin et al. 1997, Гаврилов и др. 2003). Экономический коэффициент роста C. ferrireducens увеличивался в присутствии экзогенных акцепторов электронов, но не коррелировал со стандартными свободными энергиями Гиббса реакций (Табл.

7). Таким образом, C. ferrireducens способен не только к железному дыханию, но и к использованию Fe(III) в качестве дополнительного акцептора электронов при органотрофном росте, сопряжённом с неполным окислением углеродного субстрата.

Рост, 107клеток/мл Рис. 14. Влияние Fe(III) на органотрофный рост C. ferrireducens с глицерином и CO2.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 Время, час 1 – среда с ферригидритом;

2 – среда с химически синтези рованным магнетитом;

Рост, 10 клеток/мл 3 – среда с добавлением FeSO4;

4 – среда без железа, восстано 24 вленная сульфидом Na (Eh0);

– 16 невосстановленная среда без железа (Eh~0).

0 20 40 60 80 100 120 140 160 Время, час Таблица 7. Экономический коэффициент (Y) и стандартная свободная энергия Гиббса 0’ (G ) реакций окисления глицерина с использования различных акцепторов электронов при росте C. ferrireducens Условия Дополнительные акцепторы электронов, кроме СО культивирования без доп. акцептора фумарат АХДС цитрат Fe(III) ферригидрит Y, 10 кл/моль 5,43 10,2 7,01 5,55 7, потреблённого глицерина G0’ а, кДж/моль -151,5 -193,0 -194,2 -248,3 -251, глицерина а Уравнения предполагаемых реакций окисления глицерина до ацетата:

без доп. акцептора 4С3H8O3 + 2HCO3- 7C2H3O2- + 5H+ + 4H2O 8С3H8O3 + 2HCO3- + 4C4H2O42- 13C2H3O2- + 11H+ + 4H2O + 4C4H4O42 с фумаратом 8С3H8O3 + 2HCO3- + 4АХДС 13C2H3O2- + 11H+ + 4H2O + 4АХДСH с АХДС с цитратом Fe(III) 8С3H8O3 + 2HCO3- + 8FeC6H5O7 13C2H3O2- + 11H+ + 4H2O + 8FeC6H6O с ферригидритом 8С3H8O3 + 2HCO3- + 24Fe(OH)3 13C2H3O2- + 11H+ + 44H2O + 8Fe3O 45 Рост Этанол Ацетат 40 Пропионат Изобутират Изовалерат 35 Водород Fe(II) Продукты метаболизма, мМ 30 Рост, 10 клеток/мл 25 20 15 10 5 0 Пептон Пептон + Fe(III) Пептон Пептон + Fe(III) А Б Рис. 15. Влияние Fe(III) на рост и образование продуктов метаболизма у C.

ferrireducens (А) и T. siderophilus (Б). Показана максимальная концентрация клеток, наблюдавшаяся за 180 часов культивирования при подсчёте клеток каждые 24 часа.

4.3. Физиологические стратегии восстановления нерастворимого Fe(III) Carboxydothermus ferrireducens. Исследование восстановления различных форм Fe(III) суспензиями целых клеток C. ferrireducens показало, что данный организм обладает несколькими железовосстанавливающими активностями с различной специфичностью к растворимым и нерастворимым формам Fe(III).

На проявление той или иной железовосстанавливающей активности влияют условия культивирования клеток, однако, способность к восстановлению нерастворимого слабокристаллического оксида Fe(III) является конститутивной. Наиболее эффективное восстановление нерастворимого оксида Fe(III) растущими культурами C. ferrireducens происходит в условиях пространственной близости клетки к поверхности минерала (Рис. 16).

Обнаружено, что добавление сидерофора десферриоксамина B (ДФО) может стимулировать диссимиляционное восстановление Fe(III) в отсутствие свободного доступа клеток к ферригидриту. Механизм стимуляции заключается в многократном использовании сидерофора в качестве челночного медиатора, переносящего ион Fe3+.

120 А Б 50 Рост, 10 кл/мл Рост, 10 кл/мл 3 60 30 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 120 140 1 А Б Fe(II), mM Fe(II), mM 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 140 Время (час) Время (час) Рис. 16. Рост и образование Fe(II) культурой C. ferrireducens при наличии (А) и в отсутствие (включение Fe(III) в гранулы альгината) (Б) контакта клеток с ферригидритом, на средах: 1 – с 0,2 мМ АХДС;

2 – с 0,2 мМ ДФО;

3 – без экзогенных медиаторов железоредукции.

4.4. Биохимические механизмы восстановления Fe(III) у Carboxydothermus ferrireducens. У железовосстанавливающих бактерий с грамотрицательным типом клеточной стенки большую роль в транспорте электронов к Fe(III) играют периплазматические белки (Myers & Myers 1992, Lovley et al 2004).

Биохимические механизмы диссимиляционной железоредукции у грамположительных железоредукторов, лишённых периплазмы, практически не исследовались. В нашей работе мы исследовали грамположительную железоредуцирующую бактерию C. ferrireducens. После разрушения клеток наибольшая железовосстанавливающая активность отмечалась с Fe(III)-ЭДТА в качестве акцептора и НАД(Ф)Н в качестве доноров электронов. Около 80% НАД(Ф)Н-зависимых Fe(III)-ЭДТА-редуктазных активностей содержалось в мембранной фракции клеток (Табл. 8). Обработка мембран лаурил мальтозидом приводила к полной солюбилизации белков обладающих НАДН-зависимой и 70%-й солюбилизации белков обладающих НАДФН-зависимой Fe(III)-ЭДТА редуктазной активностью. После очистки с помощью ионообменной хроматографии, фракция, содержащая НАДН-зависимую активность, была сконцентрирована в 8, а фракция, содержащая НАДФН-зависимую активность – в 11 раз, при выходе порядка 10% для обеих активностей. В состав ферментного комплекса, восстанавливающего Fe(III)-ЭДТА, входят цитохромы c-типа и белок с молекулярной массой около 115 кДа, состоящий из двух полипептидов (Гаврилов и др. 2007).

Таблица 8. Распределение Fe(III)-ЭДТА-редуктазной активности по клеточным фракциям C.

ferrireducens Фракция Белок, НАДН-зависимая активность НАДФН-зависимая активность мг Удельная, Общая % Удельная, Общая % Е*/мг белка Е Е/мг белка Е Целые и разрушенные клетки Целые клетки 4060 0,0 0 0 0,0 0 Разрушенные клетки 4172 32,92 137336 100 52,07 217205 Растворимая и мембранная фракции Растворимая фракция 310 43,07 13361 21 27,27 8460 Мембранная фракция 1942 25,61 49734 79 33,11 64309 Растворимая и нерастворимая фракции лаурилмальтозидного экстракта мембран Растворимая фракция 250 20,33 5079 100 19,93 4977 экстракта Нерастворимая 100 0,0 0 0 21,8 2180 фракция экстракта *Е- количество фермента, катализирующее образование 1 наномоль Fe(II) за мин. при 65C 4.5. Неэнзиматическое восстановление Fe(III): образование магнетита в результате гипертермофильной микробной сульфатредукции.

Восстановление Fe(III) может происходить как вследствие энзиматических процессов, так и за счёт химического восстановления трёхвалентного железа продуктами микробного метаболизма. Хорошо известно образование сульфидов железа в результате диссимиляционной сульфатредукции.

Формирование оксидов железа, в частности магнетита, при восстановлении слабокристаллического оксида Fe(III) растущими культурами микроорганизмов до последнего времени однозначно рассматривалось как указание на деятельность диссимиляционных железоредукторов. Мы обнаружили, что при повышенной температуре образование магнетита может быть вызвано также деятельностью сульфатвосстанавливающих микроорганизмов и происходить в результате восстановления слабокристаллического оксида Fe(III) образующимися ионами сульфида.

I,% Fe(III) (лактат) Рис. 17. Относительные интенсивности (I) парциальных спектров ядер 57Fe в Fe(III) слабокристаллическом оксиде Fe(III) и магнетите (Fe3O4), образованном при росте A. fulgidus в присутствии и отсутствие лактата в среде культивирования и разных Fe3O концентрациях сульфата.

Fe3O4 (лактат) 0 2 4 6 8 10 12 M, мМ SO42- (ммоль/л) В наших экспериментах гипертермофильный археон Archaeoglobus fulgidus рос в среде, содержащей сульфат и слабокристаллический оксид Fe(III), используя молекулярный водород в качестве единственного донора электронов, при этом происходило образование чёрного сильномагнитного осадка. A. fulgidus рос только в присутствии сульфата. Роста микроорганизма и образования Fe(II) не происходило, если в среде присутствовал молибдат, специфический ингибитор ферментов диссимиляционного восстановления сульфата. Исследование осадка методом мессбауэровской спектроскопии показало присутствие в нём магнетита и сидерита. Образования сульфидов железа обнаружено не было. С увеличением начальной концентрации сульфата относительное содержание магнетита возрастало пропорционально этой концентрации и уменьшалось при добавлении лактата. (Рис. 17). Контрольные эксперименты показали, что в исследованных условиях образование магнетита происходит при добавлении в стерильную среду раствора Na2S.9H2O. Для образования магнетита кроме сульфида были необходимы также повышенная температура (80oC) и наличие молекулярного водорода (Слободкин и др. 2004, Chistyakova et al. 2004, 2005, Чистякова и др. 2005).

Таким образом, результаты проведённых нами исследований позволяют сделать ряд заключений о потенциальной экологической функции термофильных железоредукторов и механизмах восстановления нерастворимых оксидов Fe(III) в термальных экосистемах. Важным физиологическим свойством железоредуцирующих термофилов является наличие у них способности к литоавтотрофному росту, неизвестной для мезофильных нейтрофильных железовосстанавливающих микроорганизмов. Следовательно, железоредукторы могут быть не только деструкторами, но и продуцентами органического вещества. Порог потребления H2 чистой культурой Carboxydothermus ferrireducens составляет 0,3 p.p.m.v., что, вероятно, позволяет водородиспользующим железовосстанавливающим микроорганизмам успешно конкурировать за этот субстрат с другими группами термофильных гидрогенотрофов.

Наиболее эффективное восстановление нерастворимого оксида Fe(III) грамположительным железоредуктором Carboxydothermus ferrireducens происходит в условиях пространственной близости клетки к поверхности минерала. Челночные переносчики электронов, а также экзогенный сидерофор ДФО стимулируют диссимиляционное восстановление Fe(III) в отсутствие свободного доступа клеток к ферригидриту. Способность к восстановлению слабокристаллического оксида Fe(III) у Carboxydothermus ferrireducens является конститутивной, основная часть Fe(III)-восстанавливающей активности локализована в мембранах, в переносе электронов к Fe(III) участвуют цитохромы c-типа. Восстановление нерастворимых соединений Fe(III) у этого микроорганизма осуществляется, очевидно, сложным мультиферментным комплексом. К настоящему времени нам удалось солюбилизировать и частично охарактеризовать мембраносвязанную белковую фракцию, обладающую Fe(III)-ЭДТА-редуктазной активностью. Очистка белка, выполняющего функцию терминальной Fe(III)-редуктазы in vivo, затруднена, в частности, из-за практически полной потери Fe(III)-восстанавливающей активности со слабокристаллическим оксидом железа(III), происходящей при разрушении клеток.

Восстановление железа(III) микроорганизмами может происходить не только в результате прямых энзиматических, но и биотически опосредованных процессов. Нами обнаружено, что при повышенной температуре, в присутствии слабокристаллического оксида Fe(III), в результате продукции ионов сульфида сульфатвосстанавливающими микроорганизмами, происходит не образование сульфидов железа, как этого можно было бы ожидать, а формирование магнетита. Этот феномен должен учитываться при объяснении возможных путей генезиса магнетита в термальных, особенно морских экосистемах, а также в лабораторной практике при исследованиях микробной железоредукции.

5. Восстановление хрома(VI), технеция(VII) и урана(VI) термофильными бактериями Многие диссимиляционные железоредукторы способны также энзиматически восстанавливать ряд других металлов с переменной валентностью, однако функции восстановления этих металлов в метаболизме клетки остаются, в основном, неизвестными (Lloyd 2003). Наши исследования восстановления Cr(VI), Tc(VII) и U(VI) термофильными микроорганизмами были вызваны, главным образом, задачами прикладного характера, имеющими целью иммобилизацию токсичных металлов и радионуклидов путём их перевода в менее растворимую восстановленную форму.

5.1. Восстановление Cr(VI). Растущие культуры грамположительных железоредукторов Carboxydothermus ferrireducens и Thermoanaerobacter siderophilus оказались неспособны восстанавливать Cr(VI). Однако клеточные суспензии этих организмов восстанавливали Cr(VI) в Cr(III) с пептоном, сорбитом и пируватом в качестве донора электронов. Суспензии клеток термофильных микроорганизмов, неспособных к диссимиляционному восстановлению Fe(III) - Moorella glycerini, Archaeoglobus fulgidus и Thermococcus pacificus, также могли восстанавливать хромат с различными донорами электронов.

Из муниципальных сточных вод нами была выделена умеренно термофильная, факультативно-анаэробная бактерия, способная к восстановлению Cr(VI) (штамм SKC1), идентифицированная как Bacillus thermoamylovorans. В процессе роста штамм SKC1 восстанавливал хромат, используя L-арабинозу в качестве донора электронов. Увеличение начальной концентрации Cr(VI) приводило к увеличению лаг-фазы, снижению скорости роста и уменьшению конечного числа клеток. Штамм SKC1 восстанавливал Fe(III) цитрат и Fe(III)-ЭДТА, но не слабокристаллический оксид Fe(III), при этом стимуляции роста микроорганизма не происходило (Слободкина и др.

2007).

Восстановление Tc(VII). Растущие культуры железоредуктора Carboxydothermus ferrireducens и другой грамположительной бактерии Tepidibacter thalassicus (Slobodkin et al. 2003), неспособной к диссимиляционному восстановлению Fe(III), не восстанавливали семивалентный технеций с молекулярным водородом или органическими донорами электронов. Однако суспензии клеток этих организмов, в присутствие молекулярного водорода, восстанавливали Tc(VII) в Tc(V) и Tc(IV) с образованием серо-чёрного нерастворимого материала (Рис. 18).

Рис. 18. Удаление 99Tc из раствора суспензией клеток T. thalassicus (1) Tc в растворе, % и C. ferrireducens (2) с H2 в 60 качестве донора электронов.

Концентрация белка – 220 мкг/мл (1,2*109 кл/мл). 3 - клетки без донора;

4 – неинокулированная среда (H2). Начальная концентрация Tc(VII) – мкмоль/л.

0 4 8 12 16 20 24 Время, час Кроме молекулярного водорода C. ferrireducens восстанавливал пертехнетат с лактатом, глицерином и дрожжевым экстрактом, а T. thalassicus - с пептоном в качестве доноров электронов. Основная часть (82-84%) 99Tc была связана с биомассой клеток. Сканирующая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ выявили присутствие на поверхности клеток технеций содержащих частиц, размером 0,2-0,4 мкм, вероятно, представляющих собой агрегаты более мелких кристаллов. Tc-содержащие частицы наблюдались только на поверхности бактериальных клеток;

элементный состав клеток с прикреплёнными к ним Tc-содержащими частицами указывал на то, что клетки не были лизированы (Chernyh et al. 2007).

5.3. Восстановление урана(VI). Растущие культуры железоредуктора Carboxydothermus ferrireducens восстанавливали растворимый уранилсульфат с образованием нерастворимого осадка, содержащего четырёхвалентный уран.

Кроме растворимых форм урана, использовал C. ferrireducens слаборастворимый фосфат урана(VI) в качестве акцептора электронов при росте с глицерином в качестве донора электронов. (Рис. 19).

Рис. 19. Рост и восстановление U(VI) U(VI) C.

U(VI) + Na2S 10 ferrireducens.

Рост, *108 кл/мл Урамфит (2, без акцептора ммоль U(VI)/л), ферригидрит ( б/а + Na2S мМ Fe(III)), Fe(III) фумарат (20 мМ).

фумарат 0 20 40 60 2, U(VI), ммоль/л Без бактерий 1, T.ferrireducens 0, 0 20 40 60 Время, час Восстановлению U(VI) сопутствовало увеличение числа клеток, а урожай клеток был примерно в 2,5 раза выше в присутствие урана, чем в его отсутствие. В отличие от роста C. ferrireducens с другими акцепторами электронов, рост с U(VI) начинался после лаг-фазы продолжительностью около 15 часов. Фосфат урана, используемый в качестве акцептора электронов, был идентифицирован с помощью дифракционного рентгеновского анализа как урамфит [(NH4)(UO2)(PO4)*3H2O], а серый осадок, образующийся в результате микробного восстановления этого минерала, - как минерал четырёхвалентного урана - нингиоит [CaU(PO4)2*H2O] (Khijniak et al. 2005).

Таким образом, термофильные прокариоты могут энзиматически восстанавливать соединения хрома(VI), технеция(VII) и урана(VI).

Восстановление Cr(VI) в метаболизме Bacillus thermoamylovorans SKC выполняет функцию детоксикации. Суспензии клеток диссимиляционного железоредуктора Carboxydothermus ferrireducens и бродильщика Tepidibacter thalassicus восстанавливают семивалентный технеций, вероятно в результате неспецифических биохимических реакций. При исследовании микробного восстановления шестивалентного урана нами было обнаружено, что Carboxydothermus ferrireducens использовал слаборастворимый фосфат U(VI), – минерал урамфит, в качестве акцептора электронов для роста. Ранее о возможности микробного восстановления нерастворимых соединений актинидов известно не было, и считалось, что в местах загрязнённых радионуклидами, твёрдофазный уран, присутствующий в осадках, устойчив к микробному восстановлению. Это первое сообщение о способности термофильного микроорганизма получать энергию для роста при восстановлении шестивалентного урана в диссимиляционном процессе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Восстановление трёхвалентного железа микроорганизмами - бурно развивающаяся область исследований. Открытый около 100 лет тому назад процесс микробного восстановления Fe(III) сейчас снова находится в фокусе интересов научного сообщества. Только за последние 5 лет опубликовано около 200 работ, посвящённых различным аспектам восстановления Fe(III). В настоящее время не вызывает сомнений, что микробная железоредукция является глобальным биосферным процессом и вносит значительный вклад в окисление органического вещества в водных, почвенных и подземных экосистемах.

Результаты наших исследований доказывают существование физиологической группы термофильных железовосстанавливающих прокариот.

Нами впервые обнаружено, что термофильные микроорганизмы могут осуществлять процесс диссимиляционного восстановления трёхвалентного железа. Открытие термофильного микробного окисления молекулярного водорода и ацетата, сопряжённого с использованием Fe(III) в качестве акцептора электронов, позволяет предположить значительную роль железоредукторов в трофических взаимодействиях в термальных биотопах, содержащих соединения трёхвалентного железа. Биогенное образование магнетита при повышенных температурах обосновывает возможность участия термофильных микроорганизмов в формировании месторождений железистых кварцитов.

В природных условиях, при нейтральной реакции среды, соединения трёхвалентного железа существуют в виде нерастворимых оксидов. Наши исследования показывают, что термофильные прокариоты, способные к восстановлению нерастворимых соединений Fe(III), распространены в большинстве известных к настоящему времени типов термальных экосистем и являются постоянным компонентом термальных биоценозов. Их численность в различных биотопах варьирует в широких пределах и очевидно лимитируется не только концентрацией доступных для использования соединений железа, но и наличием донора электронов.

В филогенетическом отношении термофильные железоредукторы не объединены общностью происхождения. Способность к восстановлению слабокристаллического оксида Fe(III) распространена среди представителей различных таксонов термофильных бактерий и архей. Использование трёхвалентного железа в качестве селективного фактора при получении накопительных и чистых культур приводит как к выделению микроорганизмов новых таксонов, так и к обнаружению железоредукторов, принадлежащих к известным родам, в том числе таким космополитным как Thermoanaerobacter и Thermococcus. Недостаток данных о биохимических механизмах не позволяет однозначно заключить, является ли железоредукция свойством, появившимся один раз и распространившимся за счёт латерального переноса генов, или оно многократно и независимо возникало в процессе эволюции микроорганизмов.

Железовосстанавливающие термофилы сопрягают восстановление Fe(III) с окислением широкого спектра органических и неорганических веществ.

Микроорганизмы этой физиологической группы используют в качестве доноров электронов все основные группы соединений, образующихся при распаде микробной мортмассы (Рис. 20). Таким образом, при повышенных температурах в зонах отложения окисного железа может происходить полная минерализация органического вещества. За счёт использования ювенильных газов, таких как молекулярный водород и моноксид углерода, автотрофные железовосстанавливающие микроорганизмы могут осуществлять и первичную продукцию органического вещества. Следовательно, термофильные железовосстанавливающие прокариоты могут создавать основу для устойчивого функционирования анаэробных микробных сообществ, в том числе и автономных.

Способность термофильных железоредукторов к восстановлению переменно-валентных металлов открывает возможности для практического использования этой микробной группы. Становится всё более очевидным, что термофильные железовосстанавливающие прокариоты, возможно, осуществлявшие процессы восстановления Fe(III) в значимых масштабах в древнейшие эпохи существования Земли, являются одновременно и перспективными кандидатами для применения в современных биотехнологических процессах.

ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО Белки Липиды Полисахариды (крахмал) Пептиды Жирные Глицерин Сахара кислоты Орг. кислоты, спирты Аминокислоты Ацетат З О Deferribacter Geoglobus Geoglobus Carboxydo- Thermoanae Deferribacter Bacillus Н Carboxydo- Geothermobacter thermus robacter Thermus Deferribacter А thermus Tepidimicrobium Geoglobus Geothermo Thermoanae- Carboxydo Thermoana- bacter robacter thermus erobacter Ж Anaerobranca Ferroglobus Thermus Thermotoga Е Geoglobus Thermoanae Thermococcus Автотрофы: Geothermo Гетеротрофы:

Л robacter Pyrobaculum Thermoanae bacter Geoglobus Е Geoglobus robacter Carboxydothermus Thermincola Geothermo Deferribacter Thermovena З Thermovena Geoglobus bacter Pyrobaculum bulum bulum О Geothermo Thermotoga Fe(III) Fe(II) Geothermobacter Geothermo bacterium Р Thermoanaero Anaerobranca bacter Thermodesulfo Е bacter Caldanaerobacter bacterium Thermococcus Д Tepidimicrobium Sulfurihydro- Carboxydothermus Thermovena У genibium Thermosinus bulum К Thermolithobacter Ц И CO2 H2 CO И ЮВЕНИЛЬНЫЕ ГАЗЫ Рис. 20. Восстановление Fe(III) термофильными прокариотами ВЫВОДЫ 1. Впервые показано, что термофильные микроорганизмы могут осуществлять процесс диссимиляционного восстановления трёхвалентного железа. Данный факт расширяет круг возможных биогеохимических процессов, идущих с участием термофильных прокариот, в наземных и глубинных системах современной биосферы и может служить основой для моделирования микробных процессов, протекавших в древнейшие эпохи существования Земли.



Pages:   || 2 |
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.