Евгений александрович динамические неустойчивости в кинетике роста и деполимеризации тубулиновых микротрубочек
на правах рукописи
УДК 577.31 Катруха Евгений Александрович ДИНАМИЧЕСКИЕ НЕУСТОЙЧИВОСТИ В КИНЕТИКЕ РОСТА И ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИИ ТУБУЛИНОВЫХ МИКРОТРУБОЧЕК 03.00.02 – биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва – 2007 Диссертация выполнена в Гематологическом научном центре РАМН и на кафедре физики живых систем Московского физико-технического института (ГУ)
Научный консультант:
Гурия Георгий Теодорович, доктор физико-математических наук
Официальные оппоненты:
Полежаев Андрей Александрович, доктор физико-математических наук Воробьев Иван Андреевич, доктор биологических наук, профессор
Ведущая организация:
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино) мая 2007 года в 10 oo часов в ауд. 204 НК МФТИ на заседании
Защита состоится « 24 » диссертационного совета К 212.156.03 в Московском физико-техническом институте по адресу: 141700, Московская обл., г.Долгопрудный, Институтский пер. 9.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.
Автореферат разослан « _ » апреля 2007 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук Брагин В.Е.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Тубулиновые микротрубочки (наряду с актиновыми и промежуточными филаментами) являются основными компонентами цитоскелета эукариотических клеток. По существующим представлениям динамические нестабильности в кинетике роста и деполимеризации микротрубочек лежат в основе крупномасштабных трансформаций цитоскелета, свойственных процессам пролиферации, дифференцировки и миграции клеток в норме и патологии1.
В частности, крупномасштабные пространственно-временные трансформации цитоскелета наблюдаются на стадии деления клеток. В этой связи большое значение приобретает вопрос о том, в какой мере процессы деления атипичных и/или трансформированных клеток обуславливаются условиями возникновения и особенностями развития динамических неустойчивостей микротрубочек2.
С момента открытия самого явления динамической нестабильности микротрубочек в 1984 году, накоплен обширный экспериментальный материал и предложено несколько теоретических моделей явления. Проведенный в работе анализ имеющихся данных и теоретических подходов показал, что динамические неустойчивости, свойственные отдельным микротрубочкам и их ансамблям, перспективно изучать в свете современной теории критических явлений и неравновесных структур3.
Целью настоящей работы являлось нахождение необходимых и достаточных условий параметрической дестабилизации микротрубочек, выяснение кинетических механизмов регуляции динамических нестабильностей при росте и деполимеризации микротрубочек.
В работе решались следующие задачи:
1. Методами стохастического анализа выяснить условия развития структурных неустойчивостей, сопровождающихся деполимеризацией или фрагментацией микротрубочек.
2. Построить кинетическую модель процессов сорбции молекул тубулина на плюс концы микротрубочек из раствора (десорбции в раствор).
3. Выяснить условия потери устойчивости стационарных распределений микротрубочек по длинам. Построить диаграммы состояния, позволяющие определять характер динамики микротрубочек при различных значениях параметров системы.
4. Исследовать механизмы формирования концентрационных колебаний и волн тубулина, ассоциированных с крупномасштабными трансформациями цитоскелета.
5. Проанализировать сочетанное действие биохимических агентов различных типов на смену динамических режимов, свойственных тубулиновым волокнам.
Научная новизна. Развит последовательный физико-математический подход к описанию катастроф в динамике микротрубочек. Наблюдаемые экспериментально катастрофы трактуются, как результат развития процессов нелинейного взаимодействия Jordan M.A., Wilson L., Nat. Rev. Cancer. 2004. V.4. P.253-265;
Watanabe T. et al., Trends Cell Biol. 2005.V.15 P.76-83.
Scholey J.M. et al., Nature. 2003. V.422 P.746-752.;
Канцерогенез, М.: Медицина. 2004. 576С.;
Honore S. et al, Cell. Mol. Life Sci. V.62 2005. P.3039-3056.
Haken H., Synergetics. Springer, 1977;
Николис Г., Пригожин И., Самоорганизация в неравновесных системах. М.:Мир.1979;
Эбелинг В., Образование структур при необратимых процессах. М.:Мир.1979.
структурных дефектов при их кластеризации в микротрубочках. При этом структурные катастрофы и эффекты фрагментации микротрубочек, подобно тому, как это имеет место в физике фазовых переходов первого рода, описываются в рамках феноменологических кинетических уравнений. Использование численных методов и компьютерных алгоритмов так называемой теории клеточных автоматов дало возможность довести результаты расчетов до стадий, допускающих прямое сопоставление с данными экспериментов.
Впервые удалось с единых позиций объяснить целый ряд нетривиальных эффектов, характерных для динамики микротрубочек: степенную зависимость частоты катастроф от скорости роста микротрубочек, дробно-линейную зависимость времени задержки деполимеризации микротрубочек от величины их длины и концентрации тубулина в растворе и т.д.
Впервые исследована обусловленность динамических нестабильностей роста и деполимеризации микротрубочек неустойчивостями кинетических процессов сорбции молекул тубулина из раствора (и десорбции с плюс-концов микротрубочек в раствор). При этом содержащая микротрубочки реконструированная система трактовалась, как существенно двуфазная, состоящая из реакционно-диффузионной части и собственно микротрубочек (тубулиновых волокон), выступающих в качестве конденсированной фазы.
Последняя характеризуется наличием черт дальнего порядка в пространственном упорядочении составляющих микротрубочку элементов (тубулиновых димеров), свойственных твердым телам.
Впервые не постулированы, а исследованы условия потери устойчивости этой двуфазной системы. Показано, что в рассмотренной системе при приближении к критическим условиям имеет место увеличение радиуса пространственно-временных корреляций. Концентрационные флуктуации в растворной части системы трансформируются в автоволны конечной амплитуды, управляющие крупномасштабными трепетаниями микротрубочек.
Впервые построена параметрическая диаграмма состояния, на которой отображены границы областей устойчивости, отвечающие стационарным и нестационарным режимам поведения системы. На основе диаграммы состояния дана классификация воздействий цитостатическими агентами на тубулиновые микротрубочки. Выделено четыре основных класса воздействий. Построена таблица, отражающая наличие эффектов взаимного усиления/ослабления действия цитостатических агентов при совместном применении агентов различных классов.
Научно-практическое значение. Полученные в работе результаты имеют важное значение для поиска эффективных режимов управления крупномасштабной трансформацией цитоскелета на ключевых стадиях клеточного цикла. Основные направления практического использования результатов таковы:
• построенная диаграмма состояний микротрубочек позволяет уже на стадии проектирования экспериментов in vitro целенаправленно проводить подбор необходимых параметров (концентрации тубулина, ГТФ, ГДФ), соответствующих искомому динамическому режиму системы микротрубочки-раствор;
• установленный характер сочетаемости одновременного воздействия биохимических агентов и цитостатических препаратов различных классов открыл принципиально новую возможность для поиска путей снижения побочного токсического действия.
Открылась возможность для целенаправленного поиска и разработки комплексных противоопухолевых препаратов, обладающих совместным (синергетическим) эффектом действия входящих в их состав компонентов.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на семинарах в лаборатории криобиофизики клеток крови ГНЦ РАМН, в лаборатории клеточной подвижности ИФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ, в лаборатории биоэлектрохимии Института электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, были представлены на конференциях: 13 ой Научной школе «Нелинейные волны-2006» (Нижний Новгород, 2006), 9-ой международной конференции по теории нуклеации и ее приложениям (ОИЯИ, Дубна, 2005), 48-ой научной конференции МФТИ (Долгопрудный, 2005), международной биофизической конференции “Динамика биологических систем: от молекул к сетям” (Крогеруп Ходжскол, Дания, 2002).
Публикации. За время работы над диссертацией опубликовано: 1 статья в реферируемом научном журнале, развернутый обзор в трудах конференции «Нелинейные волны-2006» и 7 тезисов докладов, представленных на российских и международных научных конференциях.
Объем и структура диссертации. Представленная работа состоит из введения, четырех глав, включая главу 1, обзор литературы, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 213 отечественных и зарубежных источников, а также двух математических приложений. Первое приложение включает в себя описание использованной в работе блок схемы алгоритма клеточных автоматов. Во втором приложении содержится подробное описание процедур дискретизации кинетических уравнений, вспомогательные формулы и преобразования, использованные при реализации компьютерных вычислительных процедур.
Общий объем работы составляет 124 страницы машинописного текста, содержащего таблиц и 20 рисунков.
CОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы Данная глава содержит обзор литературы, в котором кратко излагается физиологическая роль микротрубочек, история их изучения, описывается текущее состояние и основные направления теоретических исследований динамики микротрубочек. На основании изучения накопленного к настоящему времени экспериментального материала и трудностей его интерпретации делается вывод о том, что в настоящее время нестабильности в динамике микротрубочек и их возможная природа продолжают активно обсуждаться. К числу активно дискутируемых вопросов относятся:
природа пороговых эффектов роста микротрубочки, проявляющихся при изменении концентрации тубулина в растворе;
возможное влияние на стабильность микротрубочки гидролиза ассоциированной с тубулином молекулы ГТФ, происходящего после присоединения тубулина к микротрубочке (гипотеза ГТФ-крышки);
обусловленность нестабильностей роста микротрубочек накоплением микродефектов в структуре;
степень влияния концентрационных градиентов молекул тубулина в растворе на условия роста и деполимеризации микротрубочек.
Представленные в литературе теоретические подходы сводятся к аксиоматическому построению феноменологических математических моделей ad hoc, по каждой из вышеперечисленных проблем. Однако, на основании имеющихся в литературе данных и выдвинутых гипотез до сих пор исследователям не удалось сделать окончательный вывод о том, обуславливаются ли динамические нестабильности преимущественно внутренними – структурными или же внешними – кинетическими причинами. Для выяснения условий, при которых определяющую роль в развитии динамической нестабильности микротрубочек играют структурные (внутренние) неустойчивости или же внешние (обусловленные реакционно-диффузионными процессами в растворе), в литературном обзоре дан анализ всех основных эффектов и феноменов с кинетической точки зрения. Путем сопоставления характерных масштабов времен процессов сорбции (десорбции) тубулина на плюс-концы gr (dep), времени восстановления связанных с тубулином молекул ГТФ из ГДФ res и характерного времени диффузии тубулина в растворе D удалось выделить диапазоны условий, в которых должны иметь место представляющие наибольший интерес предельные случаи.
Кинетический подход к анализу данных позволил не только сгруппировать и расклассифицировать опубликованные в печати работы (точки зрения), но и выявить лакуны в существующих подходах. В рамках настоящей диссертационной работы ставилась цель по мере возможностей заполнить эти пробелы. Предпринята попытка построения физико математического подхода, позволяющего трактовать вышеперечисленные проблемы единообразно, с позиций теории неравновесных систем. Во второй главе основное внимание уделяется анализу внутренних структурных факторов динамических нестабильностей. В последующих главах внимание концентрируется на эффектах, связанных с процессами сорбции (десорбции) тубулина из раствора.
Глава 2. Структурно-кинетические механизмы динамических неустойчивостей микротрубочек Глава состоит из трех разделов. В первом разделе формулируются основные положения, используемые в дальнейшем. Согласно эти положениям, рост микротрубочки начинается с сорбции тубулиновых димеров из раствора на нуклеационную затравку4 (см.
рис.1). Процессы сорбции и десорбции молекул тубулина происходят постоянно. В случае, когда отсоединение тубулинового димера происходит непосредственно из области микротрубочки, прилегающей к плюс-концу, вакансия образуется на краю микротрубочки.
Если же димер деабсорбируется не с края микротрубочки, а из того или иного ее внутреннего участка, то вакансия (дефект структуры – «дырка») образуется на покидаемом димером месте. Вероятность образования нового дефекта на месте конкретного димера полагается тем выше, чем меньшее количество связей с соседними димерами удерживает его в стенке, то есть чем большее количество вакансий находится в его непосредственном По современным представлениям, в качестве затравки выступают белковые комплексы, состоящие из -формы тубулина, входящие в состав центросом [Jobs D. et al., Curr.Opin.Cell Biol., 2003. V.15, P.111-117].
окружении. Иными словами, мы исходим из того, что процесс возникновения дефектов в структуре микротрубочки содержит в себе элементы положительной обратной связи.
Полагается, что вакансии (дырки) способны стохастически перемещаться вдоль волокна, подобно движению дефектов в кристаллах5. Смещение дырки на одну позицию влево соответствует «перескоку» левой от вакансии молекулы вправо, на свободное место (см. рис.1). Вероятность передвижения дырки в разные стороны не одинакова, она зависит от положения в данный момент других дырок.
Рис.1. Основные кинетические процессы, происходящие в микротрубочке.
Использован измененный рисунок из работы [Semenov M.V., J. theor. Biol.
1996. V.179, P.91-117.].
Согласно принимаемым в данной работе предположениям динамические нестабильности могут происходить вследствие кластеризации структурных дефектов в микротрубочках6. При этом такого рода критические кластеры могут возникать как в окрестности плюс-конца, так и в теле микротрубочки. Размер критического кластера RC определяется кинетическими параметрами, характеризующими процессы рождения, гибели и миграции вакансий в микротрубочке.
Переходы микротрубочек от роста к деполимеризации могут происходить по двум основным механизмам. Согласно первому механизму, если в каком-то месте микротрубочки вакансии образуют перколяционный кластер, такой, что его характерный размер RC сопоставим с диаметром микротрубочки, в системе происходит «поперечная» перколяция.
Это приведет к отсоединению от микротрубочки целого ее фрагмента, расположенного между дырочным кластером и плюс-концом. Тем самым, в таких ситуациях мы имеем дело с фрагментацией микротрубочек, как формой ее крупноблочной деполимеризации.
Согласно второму механизму, достигнув в некоторый момент критического среднего «разрыхления»7, вся микротрубочка приобретет способность пороговым образом утрачивать устойчивость, как целое. При дальнейшем увеличении степени разрыхления с какого-то момента микротрубочка окажется в абсолютно неустойчивом состоянии. Для запуска стремительной деполимеризации достаточно любой сколь угодно малой флуктуации.
Характерный размер перколяционного кластера RC при этом сопоставим с длиной микротрубочки. Результатом потери устойчивости при этом является «объемное вскипание» Френкель Я.И. Кинетическая теория жидкостей. 1945. М.-Л.: АН СССР;
Гегузин Я.И.
Живой кристалл. 1981. М.:Наука.
Nucleation theory and applications. edited by J. W. P. Schmelzer, G. Ropke, V. R. Priezzhev.
1999. JINR. Dubna.
Под средним «разрыхлением» структуры мы здесь и далее понимаем отношение общего числа вакансий к числу тубулиновых димеров в микротрубочке.
(или «расплетание» филаментов), которое будет продолжаться до тех пор, пока отношение числа дефектов к общему числу тубулиновых димеров в микротрубочке не уменьшится до подпорогового уровня. Резкое уменьшение длины микротрубочки воспринимается, как проявление динамической нестабильности процесса роста. Таким образом, необходимым и достаточным условием катастрофы по второму сценарию является превышение средним разрыхлением микротрубочки определенного критического уровня.
Проходит ли динамическая нестабильность микротрубочек по тому или иному механизму, зависит от значения кинетических параметров, определяющих вероятности основных элементарных случайных событий, таких, как рождение вакансий, перемещение вакансий по структуре микротрубочки и т.д.
Вычислительные эксперименты. Для того, чтобы исследовать условия и характер параметрической неустойчивости микротрубочек, использовались вычислительные эксперименты. Моделирование коллективной динамики дефектов структуры микротрубочки и процессов их кластеризации проводилось при помощи методов современной теории клеточных автоматов, развитых в свете идей о кинетической природе эффектов «старения», проявляющихся при растрескивании и разрушении материалов.
Как известно, кинетические константы переходов структурных дефектов с места на место, представляют собой произведение Аррениусовского (энергетического) члена на так называемый предэкспоненциальный множитель8:
E# k = k 0 exp kT (2.1) где k0 определяется, главным образом, ориентационными столкновительными, то есть энтропийными эффектами:
S# kT exp k0 ~ (2.2) k h Компьютерные вычислительные эксперименты, в ходе которых изучались кинетические параметры ансамблей вакансий во время роста тубулинового волокна, показали, что если вероятность перехода определяется энергетическими факторами, то прослеживается тенденция к образованию дырочных кластеров. В этом случае развитие событий, как правило, происходило по первому из вышеописанных механизмов (фрагментация). Если же с большим весом входил энтропийный член, дырки распределялись по длине микротрубочки более равномерно, и развитие катастроф происходило по второму из описанных ранее механизмов (объемное вскипание).
Eyring H. J.Chem. Phys. 1935. V.3. P.107-115.
В отдельном подразделе данной главы исследовалась зависимость частоты катастроф от числа тубулиновых димеров во фрагментах, отсоединяющихся от микро-трубочки. Типичный вид этой зависимости удалось найти в результате численных экспериментов (см. рис.2).
Отчетливо выделяются два пика (локальных максимума).
Первый пик имеет место в области фрагментов небольшого размера.
Рис.2. Характерная зависимость частоты катастроф Соответствующие катастрофы деполимеризующегося развиваются преимущественно по от величины первому из вышеописанных фрагмента микротрубочки.
механизмов. Второй, более широкий пик, отражает катастрофы, в ходе которых динамические нестабильности развиваются согласно второму из нуклеационных механизмов. Форма второго пика может быть аппроксимирована функцией:
{ } f = A*exp (M M * ) 2 / 2 2 (2.3) где f – частота катастроф, при которых происходит отделение фрагмента, содержащего M тубулиновых димеров.
Отметим, что вид аппроксимационной зависимости (2.3) сохранялся при варьировании микроскопических параметров рассматриваемой модели в достаточно широких пределах.
Степень соответствия результатов теоретических расчетов и экспериментальных данных Рис.3. Зависимость частоты катастроф от скорости показана на рис.3.
роста микротрубочек. Экспериментальные «Феноменологическая данные приводятся по работе [Walker R.A. et ”огрубленная” модель». В данном al., J.Cell.Biol, 1988. V. 107, P.1437-1448.].
разделе построена простая феноменологическая модель, способная полуколичественно описывать вероятность развития динамической нестабильности в микротрубочках. Приведенные в предыдущем разделе результаты численного моделирования, основанные на учете стохастических микрособытий, присущих кинетике дефектов в структуре микротрубочек, в ряде случаев позволяют выделять процессы и явления в динамике микротрубочек, которые поддаются интерпретации в терминах статистически усредненных переменных, таких, как скорость роста микротрубочки, частота катастроф, размер фрагмента и т.д. Это послужило основанием для развития подхода, позволяющего трактовать спектры крупномасштабных катастроф9 в динамике микротрубочек, не выходя за рамки достаточно общих феноменологических предположений.
В рамках этого подхода поведение ансамбля микротрубочек характеризовалось двумя основными параметрами: усредненной по ансамблю и по времени скоростью роста микротрубочек и числом катастроф за единицу времени. Относительно динамики микротрубочки делались следующие допущения:
— скорость роста микротрубочек линейно зависит от концентрации свободного тубулина в растворе;
— в стенках микротрубочки могут существовать микронеоднородности – своеобразные дефекты;
— вероятность образования нового дефекта в микротрубочке тем выше, чем большее число дефектов в ней уже имеется.
В соответствии со сделанными допущениями, рост микротрубочки описывался уравнением:
dN = k g Tu - k d (2.4) dt где N = L [шт. димеров] – число димеров в микротрубочке (L – [мкм] ее длина, l = 8 нм – l характерный размер тубулинового димера), Tu [мкM] – концентрация свободного тубулина в растворе, k g [мкM-1мин-1] – константа скорости реакции полимеризации и k d [мин-1] – константа скорости реакции десорбции, не зависящая от концентрации тубулина в растворе.
Уравнение, описывающее накопление дефектов, имеет вид:
dD = k ap + k m D (2.5) dt где D [шт.] – число дефектов в микротрубочке. Первый член в правой части уравнения (2.5) – k ap, описывает среднее число дефектов, спонтанно образующихся в растущей микротрубочке за единицу времени как в ее объеме, так и на растущем конце. Второй член – k m D отображает наличие кооперативности в образовании дефектов.
Полагалось, что потеря устойчивости представляет собой событие, наступающее с вероятностью единица, когда отношение числа дефектов к числу составляющих микротрубочку тубулиновых димеров превышает некоторое критическое, предельно допустимое значение cr. Соответствующее критическое условие имеет вид:
D(t * ) = cr. (2.6) N(t * ) где t = t* – момент катастрофы (момент достижения критического условия).
То есть «огрубленная» модель представляется эффективной, условно говоря, применительно к крупноблочным катастрофам, происходящим по второму механизму Полагается, что катастрофы рассматриваемого типа влекут за собой полную деполимеризацию микротрубочек. Вероятность так называемого события «спасения»10 в рамках «огрубленной» модели считается нами пренебрежимо малой. В качестве начального выбирается момент, когда рост микротрубочки стартует с затравки, т.е. N(0)=N0=0, D(0)=D0=0. Уравнения (2.4-2.6) разрешимы аналитически. Анализ показал, что уравнение (2.6) имеет лишь тривиальное решение (t*=0), если концентрация свободного тубулина в растворе ниже порогового уровня:
Tu Tuth (2.7) th где критическая концентрация свободного тубулина Tu определяется выражением Tu th = (1 + )Tu* ( = k ap /( cr k d ), Tu * = k d /k g.) При выполнении условия (2.7) макроскопический рост микротрубочек невозможен, деполимеризация доминирует.
Если же выполняется условие Tu Tuth, то всегда существует как минимум два решения, причем ненулевое соответствует наличию в рассматриваемой системе режимов, которым свойственны катастрофы, периодически повторяющиеся с характерной частотой f = 1 / t *. Было установлено, что зависимость между частотой катастроф и концентрацией свободного тубулина в растворе дается уравнением:
km k = exp m 1 (2.8) f Tu * f Tu Соотношение (2.8) в неявном виде задает теоретическую зависимость средней частоты катастроф f, как функции концентрации свободного тубулина (см. рис.4). Построенные в соответствии с (2.8) зависимости были сопоставлены с данными, полученными в независимых экспериментах рядом авторов11, 12 (см. рис.4). В развитом в данном разделе подходе формально имеется всего один истинный параметр задачи –. Его численное значения определялось путем сопоставления теоретических кривых и экспериментальных данных. Отвечающие оптимальному значению численные значения прочих параметров представлены в таблице 1.
Таблица 1. Оценка параметров модели из результатов применения фиттинга теоретической зависимости к экспериментальным данным.
Пороговая k m x 10- скорость Литературный источник (мкм мкМ-1 с-1) (мкм/мин) 2.02 ± 0.15 29.61 ± 3.25 2.43 ± 0. Walker et al, 1988 Drechsel et al., 1992 11 0.28 ± 0.10 6.15 ± 1.37 1.77 ± 0. Представленные на рис.4 результаты свидетельствуют о наличии качественного согласия между теоретическими кривыми и экспериментальными данными.
Событие спасения (rescue event) – переход микротрубочки от стадии деполимеризации к стадии роста, в случае, если деполимеризация прошла не полностью.
Drechsel D.N. et al., Mol Biol Cell.1992. V.3, P.1141-1154.
Walker R.A. et al., J.Cell.Biol, 1988. V. 107, P.1437-1448.
Рис.4. Частота катастроф, как функция скорости роста (a) и концентрации тубулина (b). Кривые построены в соответствии с уравнением 2.8. Экспериментальные точки взяты из работ Drechsel et al. 1992 11 (a) и Walker et al. 1988 12 (b).
Уравнение (2.8) в предельном случае, когда = k m /f 1, принимает вид:
km f= (2.9) ) ( 2 Tu Tu th Исходя из вида зависимости (2.9), удалось получить оценку максимального времени между вымыванием тубулина из раствора13 и катастрофой. После несложных преобразований получается выражение:
1 Tu th Tu = + t max (2.10) th k m 2Tu 2Tu где Tu обозначает концентрацию тубулина до момента начала вымывания. После усреднения по всем концентрациям, для средней величины ожидания деполимеризации получаем значение tmax = 24c, что находится в согласии с данными эксперимента.
Таким образом, с помощью «огрубленной» модели удалось объяснить, почему превышение концентрацией тубулина в растворе порогового уровня является необходимым условием развития динамических нестабильностей в микротрубочках. Стоит также заметить, что степенные зависимости вида (2.9) характерны для круга процессов фрагментации14 и самоорганизованной критичности15.
Глава 3. Кинетические механизмы регуляции динамики микротрубочек В данной главе излагается физико-математический подход к описанию взаимодействия микротрубочек с реагентами в окружающем растворе. При этом ставится цель проследить влияние диффузионно лимитированных процессов в растворе на условия формирования динамических неустойчивостей в процессах роста и деполимеризации микротрубочек.
Полагается, что ключевую роль в кинетике роста и деполимеризации микротрубочек играют следующие реакции:
Скачкообразным снижением концентрации тубулина в растворе. Walker R.A. et al., J. Cell.
Biol.1991.V.107, P.1437-1448.
Колмогоров А.Н. (1941) ДАН СССР, Т. XXXI, Вып. 2, С.99-101.
Bak P. (1996) How nature works. Copernicus Press, New York.
k Tu-ГДФ + ГТФ Tu-ГТФ + ГДФ (3.1) k k MTn + Tu-ГТФ MTn+1 (3.2) k MTn MTn-1 + Tu-ГДФ (3.3) где MTn обозначает микротрубочку, содержащую n молекул тубулина, Tu-ГТФ и Tu-ГДФ обозначают растворенный тубулин, связанный соответственно с молекулами ГТФ и ГДФ. В ходе реакции с константой скорости k1 в растворе происходит обмен связанной с тубулином молекулы ГДФ на молекулу ГТФ. Обратная реакция характеризуется константой скорости k 1. Реакция (3.2) описывает удлинение микротрубочки при полимеризации тубулина. Реакция (3.3) соответствует деполимеризации, при которой из микротрубочек высвобождается тубулин, связанный с молекулой ГДФ. Предполагается, что молекулы тубулина способны диффундировать в растворе.
Полагается, что миграция плюс-концов, в силу жесткости микротрубочки, происходит радиально, от центра к периферии клетки. Система кинетических уравнений, учитывающая реакции (3.1)-(3.3), имеет вид:
r p ( r, t ) = div ( k3 p k2up ) (3.4) r t u (r, t ) = Du k 2 up + k 1[ГТФ]v k 1 [ГДФ]u (3.5) t v ( r, t ) = Dv + k 3 p k 1[ ГТФ ]v + k 1 [ ГДФ ]u (3.6) t где u ( r, t ) – соответствует значению концентрации молекул Tu-ГТФ в точке с радиус вектором r в момент времени t, v ( r, t ) – концентрации молекул Tu-ГДФ, p ( r, t ) – плотности вероятности нахождения плюс-конца микротрубочки, деленной на число Авогадро NA. Константы скоростей реакций (3.1)-(3.3) обозначаются, как k1 [M-1c-1], k- [M-1c-1], k2 [M-1c-1], k3 [c-1], через [м] обозначается стерический фактор, равный приращению длины микротрубочки при присоединении к ней одной молекулы тубулина. Концентрации молекул ГТФ и ГДФ выступают в качестве параметров.
На искомые распределения u (r, t ), v(r, t ) и p (r, t ) налагаются дополнительно условия нормировки:
N A p(r, t )dV = 1 (3.7) V r N u (r, t ) + v(r, t ) + p(r, t )dV = tot (3.8) NA V где Ntot обозначает общее количество молекул тубулина в системе, а V – общий объем системы. Уравнение (3.7) отображает полноту рассматриваемой системы событий.
Соотношение (3.8) отражает сохранение в ходе реакций (3.1)-(3.3) общего количества молекул тубулина. Инициация полимеризации предполагается происходящей на затравке, расположенной в начале координат, т.е. при r = 0. Рост микротрубочек происходит в радиальном направлении.
В наиболее простом псевдоодномерном приближении, рассматриваются процессы в области, параллельной оси абсцисс, сечением S и длиной L. Рост микротрубочек происходит в положительном направлении вдоль оси абсцисс. Правая граница x = L соответствует местоположению клеточной стенки, которая считается непроницаемой. Система кинетических уравнений (3.4)-(3.8), в этом случае принимает вид:
p( x, t ) = (k 3 p k 2 up ) (3.9) t x u ( x, t ) 2u = D 2 k 2 up + k 1[ ГТФ ]v k 1 [ ГДФ]u (3.10) t x v ( x, t ) 2v = D 2 + k 3 p k 1[ ГТФ ]v + k 1 [ ГДФ ]u (3.11) t x L N A S p( x, t )dx = 1 (3.12) L N x u( x, t ) + v( x, t ) + p( x, t )dx = tot (3.13) S NA В результате обезразмеривания модели удалось выявить два характерных параметра, отражающих состояние рассматриваемой системы. Это обезразмеренная «общая концентрация» тубулина в системе:
k 2 N tot Tu 0 = (3.14) k3 N A V и параметр:
k -1 [Г ДФ] = (3.15) k1 [Г ТФ] отражающий текущий энергобаланс в системе.
Таблица 2. Значения параметров модели и диапазон их изменений.
k 30, k2, Параметр k1, k-1, k2, k3, D, M-1c-1 M-1c-1 мкМ-1с-1 с- модели -1 -1 - Мс с нм2/с Значение 0,02 0,02 18 20 3000 20 N tot, Параметр L,, S, [ГТФ], [ГДФ], NA V M Мкм модели мкм нм мкМ мкМ мкМ 2 300 0 Значение 90 90 0,165 40 Стационарные решения системы (3.9)-(3.13) находились численно, при значениях параметров, приведенных в таблице 2. Для найденных решений был проведен анализ устойчивости по Ляпунову. Разработана компьютерная программа для нахождения областей устойчивости стационарных решений на параметрической плоскости (Tu0, ).
Для нахождения нестационарных решений проводилось численное интегрирование во времени системы уравнений (3.9)-(3.13), с перекрестной проверкой результатов несколькими численными методами различного порядка аппроксимации. При исследовании автоколебательных характеристик нестационарных решений применялись методы расчета кривизны решения в фазовом пространстве и построение отображения Пуанкаре.
Результаты расчетов представлены на диаграмме состояния, изображенной на рис. 5.
Легко видеть, что параметрическая плоскость (Tu 0, ) (см. рис. 5) разбивается семейством найденных кривых потери устойчивости на пять областей, каждой из которых соответствует конкретный тип динамического режима.
Области значений параметров, обозначенной на диаграмме символом “0”, соответствует наличие в системе единственного решения в виде устойчивого унимодального стационарного распределения микротрубочек по длинам, с выраженным максимумом на левой границе. Этот тип решений соответствует существованию в системе только затравки (центросомы) при полном отсутствии микротрубочек.
Рис.5. Диаграмма состояний, построенная в соответствии с системой уравнений (3.9)-(3.13).
Линии разбивают параметрическую плоскость на пять областей: зоны отвечающие стационарным режимам “0”, “I”, “III”, зону нестационарных режимов “II”, а также зону метастабильных режимов – “IV”.
Областям решений “I” и “III” соответствуют стационарные устойчивые решения (см. рис. 6а). В области значений параметров “I” распределение микротрубочек по размерам характеризуется наличием отчетливо выраженного пика на левом крае и локального максимума, расположенного на существенном удалении от левого края (см. рис. 6а). Этот тип решений, как несложно понять, отображает наличие большого числа коротких микротрубочек у центросомы и некоторого числа микротрубочек, сопоставимых с размером клетки. В области параметров “III” характерные распределения микротрубочек по размерам, как видно из рис. 6а (пунктирная кривая), имеют минимум на левой границе (x = 0), экстремум примерно в центре рассматриваемой области и локальный максимум у правой границы (x = L). Это говорит о том, что при значениях параметров из данной области в системе должны доминировать протяженные микротрубочки, сопоставимые с размером всей системы. Решения данного типа наиболее часто наблюдаются в системах in vivo, практически на всех стадиях клеточного цикла за исключением митоза.
Область “II” соответствует нестационарным режимам, проявляющимся в виде периодически бегущих справа налево волн деполимеризации микротрубочек, чередующихся с фазами их медленного роста (рис. 6б). При пересечении границы области “II” имеет место параметрическая неустойчивость стационарных решений. Отвечающие данной области параметров режимы наблюдаются в динамике реальных микротрубочек как in vitro, так и in vivo на определенных стадиях клеточного деления. В области “IV” рассматриваемая система имеет два типа решений. Наряду со стационарными метастабильными решениями, имеют место и нестационарные решения, схожие с наблюдаемыми в области “II”.
Рис. 6. а) решения, соответствующие областям “I” (сплошная линия) и “III” (пунктирная линия) на диаграмме состояний. б) изменение во времени положения максимума нестационарного распределения плотности плюс-концов микротрубочек, характерное для режимов, соответствующих области “II”. Периоды медленной полимеризации (пунктирная линия) чередуются с волнами быстрой деполимеризации (сплошная линия).
В зависимости от предыстории эволюции параметров в системе может установиться либо стационарный, либо нестационарный режим. Если параметры (Tu0, ) будут медленно изменяться так, что на диаграмме состояний (рис. 5) изображающая точка будет плавно перемещаться из области “I” в область “IV”, то система будет оставаться в стационарном метастабильном состоянии до тех пор, пока параметры не пересекут границу между областями “IV” и “II”. Пересечение последней повлечет за собой “жесткое” возбуждение пространственных осцилляций и волн, характерных для всей области “II”. Примечательно, что при изменении параметров в обратном направлении, то есть движении изображающей точки из зоны “II” в зону “IV”, система сохранит нестационарное поведение вплоть до границы между зоной “IV” и зоной “I”. Иными словами, при пересечении параметрами границ области “IV” система демонстрирует отчетливо выраженное гистерезисное поведение.
Рис. 7. a) Зависимость среднего радиуса кривизны R траектории решения системы (3.9)-(3.13) и б) периода предельного цикла T при изменении параметров Tu0 и вдоль вектора q (см. рис. 5).
Характерная бифуркационная диаграмма показана на рис. 7. Вдоль оси абсцисс отложено изменение параметров Tu0 и вдоль вектора q, проходящего через четыре разных области на диаграмме состояний (см. рис. 5). По оси ординат отложен средний радиус кривизны R решения системы (3.9)-(3.13), преобразованной к дискретному виду. При этом решение p m (t ), u m (t ), v m (t ), m {1, M}, представляет собой однопараметрическую кривую в 3M-мерном16 пространстве.
Из рис. 7a видно, что в области “I” величина R равняется нулю, что соответствует устойчивому стационарному решению. Дальнейшее медленное изменение параметров вдоль вектора q оставляет решение системы на нижней ветви R = 0, вплоть до границы с областью “II”. Как уже отмечалось, пересечение этой границы приводит к жесткому возбуждению колебаний, что выражается в скачкообразном увеличении величины R.
Система переходит на верхнюю ветвь (см. рис. 7a), отвечающую ненулевым значениям R.
Отметим, что во всей области значений параметров “II” стационарное решение системы (3.9)-(3.13) существует, но оно неустойчиво (обозначено горизонтальной пунктирной линией на рис. 7а).
При движении изображающей точки из области параметров “II” в противоположном вектору q направлении, система остается на верхней ветви до тех пор, пока изображающая точка не пересечет границу областей “IV” и “I”. При пересечении этой границы происходит потеря устойчивости нестационарного решения, и система возвращается на нижнюю ветвь.
Таким образом, история изменения параметров определяет ветвь, на которой будет находиться система при значениях параметров из области “IV”.
Легко видеть, что для режимов, характерных для областей параметров “I” и “III” на диаграмме состояний, имеет место R = 0. При проходе из области “III” в область параметров “II” в системе мягко возбуждаются автоколебания. О величине амплитуды соответствующего предельного цикла можно судить по среднему значению радиуса кривизны R за период. При этом амплитуда R растет, пропорционально квадратичному корню величины закритичности ( q* q ). Иными словами, при переходе параметров M – параметр дискретизации по пространству. Типичное значение M=90.
системы через границу между областями “III” и “II” имеет место закритическая бифуркация Андронова-Хопфа17.
При антипараллельном вектору q изменении параметров, в точке q = q1 происходит бифуркация удвоения цикла (см. рис. 7б). Однако сценарий перехода к каскаду последовательных удвоений по Фейгенбауму не наблюдается. Вместо этого, при q = q наблюдается бифуркация схлопывания “удвоившегося ранее цикла” к однопериодичному решению (уменьшение периода вдвое), которое продолжает существовать при дальнейшем изменении параметров вплоть до границы областей “IV” и “I”, при достижении которой имеет место бифуркация жесткого «схлопывания» предельного цикла.
Глава 4. Классификация регуляторных воздействий на тубулиновый цитоскелет Построенная диаграмма состояний может быть использована для качественного анализа механизмов влияния различных биохимических агентов на динамику цитоскелета. В таблице 3 представлены сведения об изменениях ключевых параметров модели Tu0 и при воздействии на систему ряда биохимических регуляторных факторов.
Таблица 3. Изменение параметров модели Tu0 и при воздействии на систему биохимических факторов. Стрелка вверх соответствует увеличению значения параметра при действии соответствующего фактора, вниз – уменьшению18.
[ГТФ] Tu Название фактора k1 [ГТФ] k2 k3 k-1 [ГДФ] Tu Класс [Г ДФ] Таксол, доцетаксел — — — — — E Tau, MAP2, MAP4 — — — — — E — Колхицин, — — — — W винбластин Op18/статмин — — — — — W Митохондриальные — — — — S факторы Факторы ГТФ-ГДФ — — — — S обмена (GEFs) Малые ГТФазы — — — — N (rho, ran, rac) Активирующие ГТФазы белки — — — — N (GAPs) Из таблицы 3 видно, что рассмотренные нами факторы могут быть разбиты на две группы. Одни оказывают влияние на параметр Tu0, а другие – на. Каждая из групп в свою очередь разбивается на два класса, в зависимости от того, к увеличению или уменьшению Андронов А.А., Витт А.А., Хайкин С.Э. Теория колебаний, 2-е изд. 1959. М.: Физматгиз.
926 С.
Сведения о характере изменения кинетических констант в колонках с первой по шестую получены из литературных источников. Полный список соответствующих ссылок представлен в тексте диссертации.
соответствующего параметра приводит действие входящих в данный класс агентов. Таким образом, в рамках рассмотренной модели действие агентов сводится к смещению изображающей точки на диаграмме состояний в направлениях, параллельных осям диаграммы состояния (см. рис. 5). Обозначения указанных четырех классов в работе соотносятся с направлениями, принятыми для указания сторон света (см. рис. 5). К первому классу, обозначаемому буквой E, относятся вещества (таксол, доцетаксел, см. табл. 3), вызывающие смещение изображающей точки вправо, условно говоря, на «восток».
Аналогичным образом колхицин и винбластин могут быть отнесены к классу W, а митохондриальные факторы и факторы ГТФ-ГДФ обмена – к классу S и так далее.
Таблица 4. Сочетаемость препаратов согласно предложенной классификации. Знаком “+” обозначены сочетания, при которых имеет место эффект взаимного усиления воздействия препаратов. Прочерк “–“ обозначает отсутствие эффекта.
N S E W + + N — — + + S — — + + E — — + + W — — Известно, что вещества, оказывающие цитостатическое действие (цитостатики), нарушают нормальное прохождение клеткой митоза. Эти агенты подавляют высокую лабильность микротрубочек, проявляющуюся в форме обусловленных динамическими нестабильностями трепетаний, необходимых для эффективного «поиска» плюс-концами кинетохоров хромосом. Иными словами, цитостатики блокируют именно те фазы митоза, которые по нашим представлениям соответствуют нестационарным режимам, отвечающим областям ”II” и “IV” на диаграмме состояния.
В рамках развитого в главе 3 подхода зоны “II” и “IV” отвечают режимам, при которых тубулиновые нити демонстрируют крупномасштабные трансформации. Ввиду того, что клетка на определенных стадиях митоза должна проходить через области нестационарного поведения, характеризующиеся крупномасштабными изменениями цитоскелета, более эффективными следует считать те цитостатические препараты (либо их сочетания), которые при прочих равных условиях вызывают большее смещение изображающей точки на диаграмме состояний из областей нестационарного поведения микротрубочек. Кратчайшим путем выхода из зон “II” и “IV” является смещение изображающей точки вдоль нормали к продольной оси этих областей (см. рис. 5). Например, за счет одновременного смещения вверх и влево (что характерно для совместного действия веществ из классов W и N), или же вниз и вправо (при сочетании веществ из классов S и E).
Это означает, что при использовании указанных веществ в приведенных сочетаниях требуемый цитостатический эффект будет достигаться при меньших дозировках.
Следовательно, сопутствующая побочная токсичность противоопухолевых цитостатических препаратов при совместном их применении также должна быть ниже, чем при раздельном. В таблице 4 представлены данные о совместном действии веществ, принадлежащих различным из перечисленных классов.
Следует заметить, что взаимное усиление (синергизм) действия цитостатических агентов достигается лишь в тех случаях, когда имеет место влияние одного агента на, условно говоря, “тубулиновую” составляющую (т.е. на изменение скорости реакций полимеризации/деполимеризации), а другого – на “энергетическую”, т.е. на баланс между концентрациями молекул ГТФ и ГДФ.
Проведенный анализ показывает, что построенная в работе диаграмма состояния тубулиновых волокон является весьма эффективным инструментом для прогнозирования поиска наиболее эффективных путей и способов комплексных цитостатических воздействий.
Заключение В заключении диссертации обсуждаются основные результаты работы, степень справедливости сделанных предположений и допущений. Проводится сравнительное сопоставление развитого подхода с подходами, известными ранее. Так, описанная во второй главе модель нестабильности динамики микротрубочек построена на основании последовательного рассмотрения молекулярного взаимодействия между структурными элементами микротрубочек: тубулиновыми димерами и вакансиями. Развитый подход не нуждается в гипотезе о существовании ГТФ-крышки. Динамическая нестабильность микротрубочек представляется при этом как процесс, подобный фазовому переходу первого рода, вызванный накоплением в системе структурных дефектов.
Построенная компьютерная программа позволяет алгоритмически эффективно использовать теорию клеточных автоматов для численной реализации статистических представлений и идей Я.И. Френкеля о кинетической природе механизмов разрушения материалов. Именно это позволило, отталкиваясь от кинетических характеристик поведения элементов, составляющих микротрубочки, делать выводы о стохастических аспектах поведения микротрубочек, как целого.
В результате требующего длительных вычислений численного моделирования динамической нестабильности микротрубочек удалось установить два типа наиболее характерных сценариев развития катастроф. Этот факт был положен в основу достаточно простой феноменологической модели, позволившей провести аналитическое исследование проблемы. С помощью феноменологической модели, основанной на достаточно общих предположениях о динамике дефектов и учитывающей только первые моменты соответствующих распределений, тем не менее, удалось описать целый ряд феноменов:
отсутствие макроскопического роста при концентрации тубулина ниже пороговой, степенную зависимость спектра катастроф системы от скорости роста микротрубочек.
Найдено аналитическое выражение для максимального значения времени задержки между вымыванием тубулина из раствора и катастрофой, проявляющейся в виде динамической нестабильности.
В рамках развитого в третьей главе подхода динамическая нестабильность микротрубочек трактуется как результат неравновесных реакций сорбции/десорбции молекул тубулина на плюс-конец. При этом скорость реакции сорбции полагалась зависящей от концентрации молекул тубулина, связанных с ГТФ, в окрестности плюс-конца. Тем самым, изменение размера микротрубочек полагалось зависящим от реакционно диффузионно-преципитационных процессов в окружающей микротрубочки системе.
Формирование стационарных и нестационарных микротрубочек, как видно из построенной диаграммы состояния, может иметь место только при достаточно высоком уровне ГТФ в системе. Иными словами, неравновесные процессы роста и деполимеризации микротрубочек являются энергетически лимитированными.
При нестационарных режимах фаза медленного роста микротрубочки периодически сменяется фазой быстрой деполимеризации. Пространственное перемещение плюс-конца микротрубочки при этом оказывается ассоциированным с распространением концентрационных автоволн молекул тубулина в растворе.
Вопрос о роли концентрационных автоволн в динамике микротрубочек не рассматривался ранее теоретически. В пользу влияния концентрационных градиентов на динамику микротрубочек и на свойственные этой динамике нестабильности in vivo свидетельствуют недавно опубликованные экспериментальные данные19. В свете этих данных полученные теоретические результаты представляют интерес не только для специалистов в области биофизики, но и клеточной биологии.
БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю Георгию Теодоровичу Гурия за содействие в выполнении работы.
Автор благодарит профессора И.А. Воробьева за ценные замечания и критическое обсуждение работы, О.В. Коваленко за любезно предоставленные фотографии тубулинового цитоскелета, А.П. Большакова за критические замечания и обсуждение работы, И.В. Казбанова за помощь в проверке результатов численного счета, Ю.Г. Горбунову, С.Г. Узлову, К.Е. Злобину и О.А. Дудченко за поддержку и техническое содействие. Также благодарю коллектив организаторов и участников зимних школ «Нелинейные волны» (2002 2006), проходящих в Нижнем Новгороде, за гостеприимство и подробное, благожелательное обсуждение работы в ходе школ. Кроме того, благодарю всех сотрудников лаборатории биофизики и криобиологии ГНЦ РАМН за поддержку, благожелательное отношение и помощь.
Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант № 04-04-49423а. (рук., Г.Т. Гурия).
Caudron M. et al., Science, 2005, V. 309. P.1373-1376;
Pearson C.G. et al., Mol Biol Cell.2006.
V.17. P.4069-4079.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что динамические нестабильности роста микротрубочек могут развиваться как вследствие кластеризации внутренних структурных микродефектов, так и вследствие лимитирования роста за счет исчерпания в растворе молекул тубулина и/или ГТФ.
2. Построена феноменологическая модель динамических неустойчивостей, обусловленных коллективной кластеризацией микродефектов. Модель позволила объяснить степенную зависимость частоты катастроф от скорости роста микротрубочек.
3. Построена реакционно-диффузионно-преципитационная модель динамики микротрубочек. Показано, что масштабные периодические изменения длины микротрубочек сопряжены с распространением в растворе концентрационных тубулиновых автоволн.
4. Построена параметрическая диаграмма состояний тубулинового цитоскелета, содержащая области, отвечающие устойчивым стационарным и нестационарным состояниям. Выделена область, отвечающая метастабильным состояниям.
5. Показано, что потеря устойчивости стационарных состояний при изменении параметров системы, сопровождается бифуркацией рождения предельного цикла по механизму Андронова-Хопфа. Обнаружена вторичная бифуркация удвоения предельного цикла.
6. Исходя из вида диаграммы состояний, предложена классификация регулирующих динамику микротрубочек биохимических агентов (клеточных факторов и цитостатических препаратов) на четыре класса. Проанализирована проблема взаимной сочетаемости цитостатических воздействий разных классов.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Е.А. Катруха, Г.Т. Гурия, Роль неустойчивостей, нелинейных колебаний и волн в регуляции тубулинового цитоскелета. // в сб. «Нелинейные волны-2006», отв. ред.
А.В. Гапонов-Грехов, В.И. Некоркин, Нижний Новгород: ИПФ РАН, 2007. с.111-140.
2. Е.А. Катруха, Г.Т. Гурия, Динамические нестабильности тубулинового цитоскелета.
Диаграмма состояния. // Биофизика, 2006, Т.51, вып.6, с.885-893.
3. Е.А. Катруха, Г.Т. Гурия, Роль неустойчивостей, нелинейных колебаний и волн в регуляции тубулинового цитоскелета. // Тезисы докладов XIII Научной школы «Нелинейные волны-2006», Нижний Новгород, 1-7 марта 2006, c. 11.
4. E.A. Katrukha, G.Th. Guria, Instabilities and catastrophes in microtubules dynamics // abstracts of “IX-th Workshop Nucleation Theory and Application”, Dubna, June 30, 2005, p.7.
5. Е.А. Катруха, Г.Т. Гурия, Нестабильности в динамике микротрубочек. Диаграмма состояний. // материалы XLVIII научной конференции МФТИ (секция физики живых систем), 2005, с.9-11.
6. Е.А. Катруха, Г.Т. Гурия, Феноменологический подход к нестабильностям роста микротрубочек. // труды конференции молодых ученых "Нелинейные волновые процессы", Нижний Новгород, 2004, c.61-62.
7. Е.А. Катруха, Г.Т. Гурия, Феноменологический подход к нестабильностям роста микротрубочек. // материалы XLV научной конференции МФТИ (секция физики живых систем), 2002, с.5-8.
8. E.A. Katrukha, G.Th. Guria, Phenomenological approach to microtubule growth instabilities. // abstracts of International Workshop: "Dynamic of Biological Systems: From Molecules To Networks", Denmark, Krogerup Hojskole, August 10-17, 2002, p.10.
9. Е.А. Катруха, Г.Т. Гурия, Нестабильности в динамике тубулиновых волокон.
// тезисы школы "Нелинейные волны-2002", Нижний Новгород, 2-9 марта 2002, c.22.