авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Прионные и неприонные амилоиды: изучение в дрожжевой модели

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КУШНИРОВ ВИТАЛИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ ПРИОННЫЕ И НЕПРИОННЫЕ АМИЛОИДЫ:

ИЗУЧЕНИЕ В ДРОЖЖЕВОЙ МОДЕЛИ Специальность 03.00.03 – молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в институте Экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий

Научный консультант: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Тер-Аванесян Михаил Давидович Официальные академик РАН, доктор биологических наук, оппоненты: профессор Гвоздев Владимир Алексеевич член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Донцова Ольга Анатольевна доктор биологических наук, профессор Фаворова Ольга Олеговна

Ведущая организация: Биологический факультет Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится " " _ 2008 года в часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 501.001.76 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Лабораторный корпус "А"

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Автореферат разослан " " _ 2008 г.

Ученый секретарь совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Некоторые белки человека и животных, растворимые в норме, могут иногда полимеризоваться и накапливаться в виде внутри- или внеклеточных агрегатов или бляшек, что приводит к болезни. У человека известно более 30 белков, образующих такие агрегаты, называемые амилоидами. Амилоидные болезни, или амилоидозы, не поддаются лечению. Они широко распространены, и их встречаемость возрастает с увеличением возраста. К их числу относятся, в частности, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Амилоидозы в большинстве случаев неинфекционны, за исключением прионных болезней, связанных с белком PrP.

Агрегаты PrP представляют уникальный пример инфекционного агента без генетической программы в виде ДНК или РНК. Прионные болезни редки, однако недавняя эпизоотия губчатой энцефалопатии коров в Великобритании нанесла многомиллиарный урон экономике, и поставила под угрозу жизни людей в связи с опасностью передачи этого заболевания человеку при употреблении в пищу говядины.

Амилоиды не всегда связаны с болезнью. Имеются данные, что образование амилоидов белком СРЕВ может составлять основу долговременной памяти. Некоторые исследователи предполагают, что амилоидный переход каких-то белков фиксирует схемы экспрессии генов при дифференцировке клеток. Образование амилоидов связано со старением, но может быть и одной из его движущих причин.

Более 10 лет назад прионная гипотеза была использована для объяснения необычных генетических свойств детерминантов [PSI+] и [URE3] дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Было предположено, что эти детерминанты отражают переход в прионную форму белков Sup35 и Ure2, соответственно. Это предположение, основанное на генетических данных, нуждалось в биохимических доказательствах.

Получение таких доказательств для [PSI+] явилось первой частью представленной работы. Следует отметить, что [PSI+] и [URE3] не причиняют дрожжам значительного вреда и могут считаться потенциально полезными. Эти детерминанты явились первыми примерами нового явления, зависимости фенотипа от наследуемого изменения структуры белка, а не от нуклеиновой кислоты. Поэтому представляло большой интерес изучить механизмы этого явления, чему посвящена оставшаяся часть работы.

Дрожжи оказались весьма удобны для изучения прионов благодаря простоте и скорости генетических и генно-инженерных манипуляций, удобству биохимического анализа и безопасности. Это позволило нам не только охарактеризовать природу прионных детерминантов дрожжей, но и сделать выводы, касающиеся прионного и амилоидного явлений в целом.

Дальнейшее развитие исследований прионов и амилоидов имеет важные общебиологические и медицинские перспективы. В будущем следует ожидать обнаружения новых механизмов связанных с амилоидами у самых разных организмов.

Вероятна разработка способов борьбы с амилоидными и прионными болезнями, которые пока являются неизлечимыми. Данная работа, в частности, предлагает возможные стратегии лечения таких болезней.

Цели и задачи исследования. Цели работы состояли в доказательстве существования прионов у дрожжей, исследовании их принципиальных свойств и использовании для анализа механизмов инфекционности амилоидов. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Показать прионные свойства белка Sup35, установить роли его доменов в прионообразовании;

2. Выявить клеточные факторы, противодействующие поддержанию приона [PSI+];

3. Разработать методы, позволяющие выделять и анализировать прионные агрегаты;

4. Охарактеризовать структуру прионных агрегатов;

5. Выявить роль шаперона Hsp104 в размножении прионов дрожжей;

6. Установить молекулярные основы вариабельности свойств прионов;

7. Исследовать амилоидную полимеризацию белков с протяженными полиглутаминовыми фрагментами (модель болезни Гентингтона);

8. Установить свойства амилоидных полимеров, определяющие их фрагментацию.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Работа существенна для понимания прионного и амилоидного явлений у дрожжей и значима для их понимания в целом у разных организмов. В работе установлена первичная структура белка Sup35, его доменная структура и роль доменов Sup35 в образовании прионных частиц и формировании фенотипа [PSI+]. Впервые получены биохимические доказательства существования прионного процесса у дрожжей, полимеризации белка Sup35. Показано, что Sup35 в клетках [PSI+] обладает свойствами, характерными для прионов: он агрегирует, имеет повышенную устойчивость к действию протеаз и способен катализировать переход растворимого Sup35 в агрегированную форму. Показано, что прионный домен Sup35 эволюционно удаленного вида дрожжей Pichia methanolica также способен к образованию приона, что указывает на консервативность прионных свойств Sup35. Предложена и доказана модель размножения прионов дрожжей, основанная на их фрагментации шапероном Hsp104. Разработаны методы очистки и анализа прионных полимеров, в частности, определение их размера с помощью электрофореза в агарозном геле. Установлена структура прионных частиц: показано, что прионные агрегаты в клетках дрожжей представляют собой конгломераты из прионных полимеров и ассоциированных неприонных белков. Показано, что размер полимеров Sup35 варьирует у различных вариантов приона [PSI+], причем меньшему размеру полимеров соответствует большая выраженность фенотипа [PSI+]. Данная связь была объяснена зависимостью размера полимеров и количества мономеров Sup35 от эффективности фрагментации полимеров шапероном Hsp104. Было обнаружено, что Sup35 может образовывать полимеры при сверхпродукции. Эти полимеры возникают гораздо чаще, чем прионные полимеры Sup35, однако гораздо хуже фрагментируются и поэтому не наследуемы. Такие отличия аналогичны отличиям амилоидов и прионов человека. Высказана и подтверждена гипотеза, что эффективность фрагментации амилоидных полимеров шапероном Hsp104 определяется наличием в составе полимеризационного домена гидрофобных аминокислотных остатков и их экспонированностью в цитозоль.

Показано существование слабой полимер-фрагментирующей активности в отсутствие Hsp104. Изучена зависимость полимеризационных свойств полиглутаминовых доменов от их размера, что важно для понимания механизмов развития амилоидозов, связанных с полимеризацией белков, содержащих полиглутаминовые фрагменты, например, болезни Гентингтона.

Выявлены и охарактеризованы белки, избыток которых противодействует прионной полимеризации Sup35. Повышение синтеза таких белков является возможной стратегией лечения прионных и амилоидных болезней. Разработаны методы выделения и анализа прионов и амилоидов, которые могут быть использованы при их изучении у различных организмов, включая человека.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: XV, XX, XXI Международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Гаага 1990, Прага 2001, Гётеборг 2003), конференции по трансляционным механизмам (лаборатория Колд Спринг Харбор 1995), I-III конференциях по прионам дрожжей (Кентербери 2000, Сан-Франциско 2002, Кембридж 2005), Международном симпозиуме по прионным болезням и подобным процессам (Аннеси, Франция, 2000) и других международных и отечественных конференциях.

Работа была официально апробирована 6 декабря 2007 г. на заседании Ученого совета Института экспериментальной кардиологии РКНПК Росмедтехнологий.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 33 статьи в рецензируемых научных изданиях. Список публикаций приведен в конце автореферата.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ВВЕДЕНИЕ Во введении рассмотрена история изучения прионов и амилоидов, актуальность и перспективы их дальнейшего исследования. Сформулированы цели и задачи работы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали лабораторные штаммы дрожжей S. cerevisiae. Применяли стандартные методы генетики дрожжей (Sherman, 1986). Дрожжи выращивали либо на полной среде YPD либо на синтетической среде с добавлением требуемых аминокислот. [PSI+] и другие прионы дрожжей устраняли выращиванием клеток в присутствии 3мМ гидрохлорида гуанидина (ГуГХ).

Конструирование, выделение и анализ плазмид, ПЦР-амплификацию фрагментов ДНК производили согласно стандартным методикам (Maniatis et al., 1982;

Sambrook et al., 1989). Для конструирования ДНК использовали штамм E. coli DH-5. Для экспрессии генов в дрожжах использовали интегративные, центромерные и эписомные (многокопийные) плазмиды серий Yplac (Gietz and Sugino, 1988) и pRS (Sikorski and Hieter, 1989). Для продукции и очистки белков в плазмидах серий pQE (Qiagen) или pET (Novagen) конструировали гены, кодирующие требуемый белок сшитый с гекса гистидиновым тэгом. Плазмидами трансформировали штамм E. coli BL-21, продукцию белка инициировали добавлением в среду 0,2 мМ IPTG. Белки выделяли по аффинности к хелатной смоле Talon (BD-Clontech).

Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ДСН-ПААГЭ) в присутствии додецил сульфата натрия (ДСН) проводили согласно Laemmli (1979). Перенос белков из геля на мембрану и окрашивание антителами (иммуноблоттинг) проводили согласно Towbin (1979). Электрофорез прионных полимеров в ДСН-агарозном геле и их иммуноблоттинг описаны в Гл. 7.

3. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПРИОННОЙ ГИПОТЕЗЫ ДЛЯ [PSI+] 3.1. Фактор [PSI+]: история вопроса Клетки дрожжей дикого типа способны расти в отсутствие аденина в среде и имеют белый цвет колоний. При возникновении нонсенс-мутаций ade2-1 (UAA) или ade1- (UGA) клетки теряют способность расти в отсутствие аденина и накапливают красный пигмент. Детерминант [PSI+], как и мутации в SUP35, SUP45 и некоторых других генах, был выявлен по способности супрессировать нонсенс-мутации (Cox, 1965), то есть восстанавливать исходный фенотип. Супрессия возникает вследствие ослабления терминации трансляции и увеличения вероятности прочтения терминирующих кодонов. Как и супрессорные мутации, независимые изоляты [PSI+] могут отличаться по эффективности нонсенс супрессии, что проявляется в белом ("сильные" [PSI+]) или розовом ("слабые" [PSI+]) цвете колоний.

Генетические свойства [PSI+] необычны. Для него характерен нехромосомный тип наследования. При цитодукции (тип скрещивания, при котором клетки дрожжей обмениваются цитоплазмой, но не ядерным материалом) происходит передача [PSI+] между клетками, что указывает на его цитоплазматическую, а не ядерную локализацию. Однако попытки обнаружить соответствующую цитоплазматическую ДНК или РНК в виде вируса или плазмиды оказались безуспешны. Кроме того, [PSI+] устойчив к мутагенам, действующим на ДНК, но исчезает при росте клеток в присутствии низких концентраций (3-5мМ) ГуГХ и может возникать вновь с низкой частотой при сверхэкспрессии гена SUP35.

Для объяснения природы [PSI+] Р. Викнер в 1994г. предположил, что [PSI+] отражает структурную трансформацию белка Sup35, подобную прионному превращению белка PrP млекопитающих (Wickner, 1994). Эта гипотеза лучше прочих объясняла свойства [PSI+], однако основывалось лишь на генетических наблюдениях и нуждалась в биохимических доказательствах. Их получение и явилось первой целью нашей работы.

3.2. N-домен Sup35 необходим и достаточен для поддержания [PSI+] Белки Sup35(eRF3) и Sup45(eRF1) являются факторами терминации трансляции эукариот. Мы секвенировали ген SUP35 и провели его делеционный анализ. Оказалось, что белок Sup35 имеет отчетливую трехдоменную структуру. С-концевой домен (аминокислоты 254-685) подобен фактору элонгации трансляции eEF1A и отвечает за жизненно важную функцию Sup35. N-концевая часть Sup35 несущественна для жизни, неконсервативна и может быть разделена на домены N (а.к. 1-123) и М (а.к.124-253), существенно различающиеся по аминокислотному составу. N домен Sup35 оказался необходим для поддержания [PSI+] (Ter-Avanesyan et al., 1994). В этом эксперименте [PSI+] передавали цитодукцией в тестируемый штамм, а оттуда в [psi-] тестер для проверки сохранения [PSI+]. Тестируемый штамм содержал хромосомный ген SUP35С и различные делеционные варианты SUP35 на плазмиде, но не позволял наблюдать фенотип [PSI+]. Оказалось, что в отсутствие N домена Sup35 [PSI+] не поддерживается, а его присутствие, даже отдельно от С домена Sup35, позволяет поддерживать [PSI+].

Наличие М домена не играло роли. Этот результат хотя и не позволил объяснить природу [PSI+], но указал на ключевую роль N-домена Sup35 в его существовании.

Следует отметить, что в этих экспериментах впервые фенотип [PSI+] был отделен от его поддержания: клетки с разделенными N и С доменами сохраняют [PSI+], но не проявляют супрессорного фенотипа.

3.3. Sup35 в клетках [PSI+] агрегирован и способен присоединять мономеры Sup Для приона человека PrPSc характерно образование крупных агрегатов растворимого в норме белка PrPС (Prusiner et al., 1998). Мы проверили, не обладает ли таким свойством Sup35, для чего фракционировали лизаты клеток [PSI+] и [psi-] гель-фильтрацией или центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Оказалось, что размер комплексов, содержащих Sup35, в клетках [PSI+] намного больше, чем в [psi-] (Рис. 3.1).

А Гель-фильтрация Рисунок 3.1. Фракционирование лизатов клеток [PSI+] и [psi-]:

Свободный объем колонки 669 кДа 140 кДа 67 кДа анализ размера комплексов, содержащих Sup35. Фракции 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 анализировали ДСН-ПААГЭ с [PSI+] блоттингом и иммуно-окрашиванием белка Sup35.

[psi-] (А) Гель-фильтрация на колонке Sephacryl S-300. Указаны маркеры Б молекулярной массы.

Центрифугирование (Б) Центрифугирование в градиенте цитозоль 40S 60S 80S полирибосомы плотности сахарозы. Указаны фракции растворимых белков 8 9 10 11 12 О Л 1 2 34 5 6 (цитозоль), рибосомных субъединиц [PSI+] (40S, 60S), монорибосом (80S) и [psi-] полирибосом. О – осадок;

Л - лизат Sup35NM Sup35NM Affi-Gel Affi-Gel Affi-Gel Affi-Gel Лизат Лизат Рисунок 3.2. Взаимодействие белка Sup35 из лизатов [PSI+] и [psi-] с Sup35NM. N и М домены Sup35 (Sup35NM) продуцировали в E. coli и иммобилизировали на смоле Affi-Gel 10. Смолу инкубировали с лизатами [PSI+] и [psi-] и промыли.

Sup Белок Sup35, связавшийся со смолой, анализировали ДСН ПААГЭ с иммуноблоттингом.

[PSI+] [psi-] Другая особенность прионов состоит в способности прионных агрегатов взаимодействовать с мономерами того же белка, что предшествует прионному превращению мономера или сопряжено с ним. Мы проверили это свойство для белка Sup35. Мономеры Sup35NM были продуцированы в E. coli, выделены и ковалентно зафиксированы на смоле Affi-Gel (Bio-Rad). Лизаты [PSI+] и [psi-] были инкубированы с этой смолой и затем удалены. Дрожжевой белок Sup35 задержался на смоле только в случае [PSI+] (Рис. 3.2). Это означает, что агрегаты Sup35, в отличие от мономеров, способны образовывать комплексы с мономерами Sup35, закрепленными на смоле.

3.4. Прионная форма Sup35 отличается повышенной устойчивостью к протеазам Еще одним отличием PrPSc от PrPС является его устойчивость к обработке протеиназой К. Мы обнаружили, что белок Sup35 в лизате [PSI+] примерно в 4 раза более устойчив к протеиназе К, чем в лизате [psi-] (Рис. 3.3). Sup35 [psi-] был также более чувствителен к действию собственных протеаз дрожжей. Так, он часто выявлялся в виде двойной полосы при электрофорезе (Рис. 3.3, дорожка 0), что отражает отщепление N-концевого 5 кДа фрагмента, никогда не наблюдаемое для Sup35 [PSI+]. Видимо, из-за деградации количество Sup35 в [PSI+] лизатах в несколько раз выше, чем в [psi-] (Рис. 3.3, подпись).

Рисунок 3.3. Протеазоустойчивость белка Протеиназа К: 0 8.0 4.0 2.0 1.0 0.4 0. (мкг/мл) Sup35 в лизатах [PSI+] и [psi-]. Лизаты обработали указанными количествами [psi-] Sup35 протеиназы К и анализировали ДСН-ПААГЭ с блоттингом и иммуноокрашиванием Sup35.

При электрофорезе нагрузка [PSI+] образцов была уменьшена в 8 раз относительно [psi-] [PSI+] Sup для получения равного сигнала в контрольной дорожке.

Надо отметить, что отличие прионной и неприонной форм Sup35 по устойчивости к протеазам было не было столь значительным, как в случае PrPSc. Также, в отличие от PrPSc, у прионной формы Sup35 не было обнаружено протеазоустойчивого фрагмента.

3.5. Супрессорный фенотип [PSI+] клеток является следствием уменьшения количества растворимого Sup Можно предположить, что причиной нонсенс-супрессорного фенотипа [PSI+] является инактивация функции Sup35 в терминации трансляции при его агрегации. Чтобы проверить это, мы воспользовались нашим наблюдением, что штаммы [PSI+], продуцирующие неприонизируемый белок Sup35МС или сверхпродуцирующие шаперон Hsp104 (Глава 6) не проявляют супрессии. Анализ лизатов этих клеток выявил значительное количество Sup35(Sup35МС) в растворимой фракции (Рис. 3.4). Так, в панели Б видно одновременное наличие растворимого белка Sup35МС и агрегированного полного Sup35. При сверхпродукции Hsp104 (панель В) происходил переход некоторой доли Sup35 из агрегированной в растворимую фракцию. Таким образом, причиной супрессорного фенотипа [PSI+] является недостаток растворимого функционального Sup35.

цитозоль сахароза осадок Рисунок 3.4. Состояние белка Sup35 в Дополни Супреc различных вариантах штамма 5V-H19.

[PSI ] тельно сия Клеточные лизаты фракционировали А - + [PSI+] Sup35 центрифугированием через подушку из 30% Б Sup35 сахарозы. Фракции анализировали ДСН [PSI+] Sup35MC ПААГЭ с блоттингом и иммуноокра Sup35MC шиванием Sup35. Штаммы содержали: (Б) – В Sup35 [PSI+] Hsp104 центромерную плазмиду, кодирующую Sup35МС;

(В) – многокопийную плазмиду Г Sup35 [psi-] кодирующую шаперон Hsp104.

3.6. Sup35 агрегирует посредством своего N-концевого домена Наши генетические данные (Гл. 3.1) указывали на ключевую роль N домена в поддержании [PSI+]. Это подтверждает результат, представленный на Рис. 3.4Б: белок Sup35МС, не имеющий N домена, не включается в прионные агрегаты. Таким образом, N домен необходим для агрегации Sup35. Однако достаточен ли он для этого? Чтобы проверить это, мы создали штамм 3-5V-H19, имеющий хромосомную делецию в гене SUP35, ведущую к отсутствию аминокислот 21-67 в N домене Sup35 (Sup35В). Этот штамм был трансформирован многокопийными плазмидами, кодирующими N концевые фрагменты Sup35: Sup35NМ (а.к. 1-252) и Sup35N (а.к. 1-112). Неожиданно для нас, возникновение прионных агрегатов этих фрагментов в данном штамме происходило с очень высокой частотой, порядка 50%. Фенотип [PSI+] в этом штамме не проявлялся. Поэтому процедура получения [PSI+] сводилась лишь к проверке наличия [PSI+] путем передачи его цитодукцией в тестерный штамм 10В-Н49.

Центрифугирование лизатов показало, что все N-концевые фрагменты Sup агрегируют в прионном состоянии, в то время как небольшая делеция (аминокислоты 21-67) в N домене нарушала способность Sup35 агрегировать (Рис. 3.5). Следовательно, Sup35 агрегирует посредством своего N домена. Минимальная область, способная к агрегации, составляет первые 112 аминокислот.

сахароза цитозоль сахароза цитозоль Рисунок 3.5. Агрегация белка Sup35 и его осадок осадок делеционных вариантов в клетках [PSI+]. Лизаты трансформантов штамма 3-5V-H19 (см. текст) фракционировали центрифугированием и Sup35B Sup35B анализировали ДСН-ПААГЭ и иммуноблоттингом Sup35NM с окрашиванием Sup35. Белок Sup35N агрегирован, поскольку отсутствует в цитозоле. Эти агрегаты не Sup35N попадают в осадок из-за малого размера Sup35N.

3.7. Воспроизведение прионного превращения Sup35 in vitro Принципиальным свойством прионов и амилоидов является их способность присоединять и превращать в подобие себя мономерную форму соответствующих белков. Мы попытались воспроизвести in vitro такое превращение для Sup35 (Paushkin et al., 1997b). Для этого были приготовлены лизаты [PSI+] и [psi-] клеток. При этом клетки [PSI+] или [psi-] дополнительно продуцировали белки Sup35 укороченные с С конца. Такие белки сохраняют свои прионные свойства, а их измененный размер позволяет отличать их от прионного полноразмерного Sup35 в ДСН-ПААГЭ и следить за их агрегацией. Прионное превращение проводили путем смешивания и инкубации лизатов [PSI+] и [psi-]. Затем смесь центрифугировали, чтобы определить степень агрегации белков, пришедших из [psi-] лизата.

В первом эксперименте лизат [PSI+] содержал Sup35, а [psi-] – Sup35 и Sup35N.

После смешивания лизатов растворимый белок Sup35N перешел в агрегированную фракцию через 20 минут большей частью, и через два часа почти полностью (Рис. 3.6).

Прионное превращение Sup35N было подтверждено повышением его устойчивости к протеиназе К.

Обработка Центрифугирование Рисунок 3.6. Переход белка Sup35N в протеиназой К сахароза цитозоль сахароза цитозоль агрегированную протеазоустойчивую форму в осадок осадок присутствии белка Sup35[PSI+]. Клетки [psi-] PK (мкг/мл) продуцировали белок Sup35N дополнительно к 0 4.0 2.0 1.0 0. Sup35. Эксперимент: Лизаты [PSI+] и [psi-] Sup эксперимент клеток были смешаны, инкубированы в течение 20 мин или 2 часов и подвергнуты Sup35N центрифугированию или обработке протеиназой К. Далее препараты анализировали ДСН-ПААГЭ 20 мин 2 часа и иммуноблоттингом с антителами к Sup35.

Контроль: анализ исходных [PSI+] и [psi-] [PSI+] [psi ] лизатов центрифугированием, и обработка [psi-] Sup контроль лизата протеиназой К после 2 часов инкубации.

Прямоугольниками указана возникающая Sup35N прионная форма белка Sup35N.

Принципиально важной задачей было показать, что превращенный Sup35 не является пассивным агрегатом, но и сам обладает превращающей активностью. Для этого, превращенный материал был выделен из смеси лизатов центрифугированием и часть осадка (примерно 1/7) использована в качестве затравки для новой реакции превращения. Вторая реакция также прошла успешно, и цикл был повторен еще два раза (Рис. 3.7). После четвертого цикла исходный прион составлял лишь ~1/400 долю от общего количества агрегированного Sup35. Таким образом, была показана возможность неограниченного циклического прионного превращения in vitro.

осадок осадок осадок [PSI+] Рисунок 3.7. Последовательные циклы прионного превращения Sup35. Клеточные лизаты [PSI+] и [psi-] смешивали и инкубировали в течение 2 часов, затем агрегированный Sup35 отделяли центрифуги рованием и смешивали с новой порцией [psi-] лизата для следующей реакции превращения.

psi- psi- psi- psi Прионное превращение Прионная концепция предполагает, что превращающим началом является сам белок Sup35[PSI+], а не какие-либо иные компоненты лизатов [PSI+]. Чтобы подтвердить это, мы очистили прионную форму белка Sup35S (а.к. 1-482) из клеток дрожжей.

Клетки лизировали и фракцию агрегатов осадили центрифугированием. Осадок растворили в буфере, содержащем 2,5 М ГуГХ. При этом большинство неприонных комплексов растворилось. Прионный Sup35 был собран центрифугированием и имел высокую степень чистоты (Рис. 3.8). Этот препарат был способен превращать неприонный Sup35 в прион с такой же эффективностью, как и неочищенный Sup35S в составе лизата. Таким образом, конвертирующим началом является собственно прионный белок Sup35, что подтверждает одно из базовых положений прионной модели. Данный результат, на момент его 123 публикации, являлся наиболее убедительным доказательством прионной концепции в целом.

кДа 112 Рисунок 3.8. Очистка белка Sup35S[PSI+].

Hsp 84 (А) Белок Sup35S был сверхпродуцирован в штамме 1-5V-H19 (SUP35C) и перешел в прионную форму.

63 Sup35S Лизат клеток этого штамма (дорожка 1) был 52 центрифугирован;

осадок (дорожки 2) суспендировали Sup в присутствии 2,5М ГуГХ и снова подвергли центрифугированию (осадок - дорожки 3). Препараты анализировали ДСН-ПААГЭ с покраской белков Кумасси голубым или иммуноблоттингом с покраской Hsp104, Sup35 и Sup45.

Резюме. Показано, что белок Sup35 в лизатах [PSI+] отличается от нормы ([psi-]) по свойствам, наиболее характерным для прионов: он агрегирует и имеет повышенную устойчивость к действию протеаз. Агрегация происходит за счет N-концевого домена Sup35. Прионное превращение Sup35 было воспроизведено in vitro. Показано, что превращающим началом является агрегированная форма Sup35.

4. СОЗДАНИЕ И СВОЙСТВА ХИМЕРНОГО [PSI+] Если [PSI+] полезен для клетки, а не является "болезнью", следует ожидать консервативности прионной способности Sup35. Чтобы определить консервативность прионных свойств Sup35, мы решили проверить такие свойства у N домена Sup35 из другого, эволюционно далекого, вида дрожжей – Pichia methanolica. Сходство структуры N доменов двух белков Sup35 мало (36%) и определяется в основном подобием аминокислотного состава (Kushnirov et al., 1990). Мы создали гибридный белок Sup35PS с N доменом из дрожжей P. methanolica и областью МС из S. cerevisiae, изменив в хромосоме S. cerevisiae область, кодирующую N домен Sup35. Прионное состояние Sup35PS ([PSI+PS]) было получено селекцией супрессорного фенотипа при сверхпродукции Sup35PS и подтверждено исчезновением этого фенотипа при росте клеток в присутствии 3мМ ГуГХ. При этом разные изоляты [PSI+PS] отличались по эффективности нонсенс супрессии, что указывало на присутствие различных вариантов приона, аналогичных вариантам [PSI+]. Белок Sup35PS в этих изолятах также проявил свойства характерные для приона. Центрифугирование показало, что в лизатах [PSI+PS] Sup35PS перераспределяется во фракцию осадка по сравнению с [psi-PS] лизатом, что характерно для лизатов [PSI+]. Обработка протеиназой К обнаружила, что в лизатах [PSI+PS] Sup35PS в 4 раза более устойчив к действию протеазы, чем в [psi-PS] лизатах.

Как некоторое отличие от [PSI+], отметим, что стабильность наследования [PSI+PS] во всех случаях была заметно ниже, чем у обычного [PSI+]. Низкую стабильность [PSI+PS] также можно рассматривать, как подтверждение его прионной природы.

Резюме. Показаны прионные свойства белка Sup35 из дрожжей P. methanolica, что указывает на распространенность прионного свойства Sup35 у разных видов дрожжей и его возможную биологическую значимость.

5. БЕЛКИ, ПРОТИВОДЕЙСТВУЮЩИЕ ПОДДЕРЖАНИЮ ПРИОНОВ ДРОЖЖЕЙ 5.1. Шапероны семейств Hsp70 и Hsp Практический интерес к изучению прионов и амилоидов связан в первую очередь с тем, что они вызывают неизлечимые болезни человека и животных. Это побудило нас задаться вопросом, существуют ли клеточные факторы, противодействующие поддержанию прионов? Мы попытались найти и охарактеризовать такие факторы, предполагая, что их эффект проявится при сверхпродукции. К началу нашей работы был известен один такой фактор, шаперон Hsp104 (Chernoff et al., 1995), необходимый для поддержания [PSI+] (гл. 6). Парадоксально, но сверхпродукция Hsp104 также во многих случаях приводила к исчезновению [PSI+]. Было известно о слабом влиянии на [PSI+] шаперонов семейства Hsp70, Ssa и Ssb: при избытке Hsp104 сверхпродукция Ssa1 уменьшала, а сверхпродукция Ssb1 увеличивала частоту потери [PSI+] (Chernoff et al., 1999;

Newnam et al., 1999).

Гибридный прион [PSI+PS] оказался более чувствительным, чем [PSI+], инструментом для анализа и поиска антиприонных факторов. Мы проверили действие на него сверхпродукции названных шаперонов. Также в анализ был взят шаперон Ydj в связи с данными, что Ssa1 и Ydj1 совместно помогают Hsp104 в растворении и реактивации агрегатов люциферазы, денатурированной нагреванием (Glover and Lindquist, 1998). Следует отметить, что в клетках дрожжей присутствуют четыре белка Ssa и два белка Ssb, представляющих два основных семейства шаперонов Hsp70, родственных бактериальному шаперону DnaK. Несмотря на сходство, белки Ssa и Ssb функционально различны и невзаимозаменяемы. Белок Ydj1 принадлежит семейству Hsp40, родственному DnaJ, функциональному партнеру DnaK.

Для изучения эффектов шаперонов мы трансформировали клетки с различными вариантами [PSI+PS] и "слабым" [PSI+] многокопийными плазмидами с генами шаперонов SSA1, SSB1, YDJ1, HSP104, а также SSA1 и YDJ1 одновременно. Колонии трансформантов во многих случаях отличались либо красным цветом, либо наличием красных секторов (Рис. 5.1). Красный цвет отражал потерю [PSI+PS], о чем свидетельствовало сохранение [psi-] фенотипа при потере плазмид с шаперонами.

Сверхпродукция Ssa1, Ssb1 и Ydj1 вызывала заметную, а иногда и частую, потерю [PSI+PS]. Hsp104, напротив, был активен в основном против [PSI+] (Табл.4.1).

Хотя в целом шапероны действовали более эффективно против слабых [PSI+PS], следует отметить значительную специфичность действия шаперонов относительно вариантов [PSI+PS]. Так, [PSI+PS] #3 был чувствителен ко всем шаперонам кроме Hsp104, а [PSI+PS] #4 чувствителен к Hsp104, но малочувствителен к другим шаперонам. [PSI+PS] #1 отличался от [PSI+PS] #4 повышенной чувствительностью к Ssa1 и Ydj1. Также антиприонная эффективность шаперонов не коррелировала между различными вариантами [PSI+PS] и [PSI+], за исключением пары Ssa1 - Ydj1. Это позволяет предположить существование трех относительно независимых механизмов, действующих на прионы, связанных с шаперонами Hsp104, Ssa1/Ydj1 и Ssb1.

Контроль SSA1 YDJ1 SSA1+YDJ1 SSB1 HSP [PSI+PS] # Рисунок 5.1. Исчезновение [PSI+PS] и [PSI+] при сверхпродукции # шаперонов. Клетки, содержащие [PSI+PS] варианты 1-4 и слабый [PSI+], трансформировали многоко # пийными плазмидами с указанными генами шаперонов и растили 6 дней на селективной среде с # пониженным содержанием аденина для лучшего проявления цвета.

Слабый [PSI+] Таблица 5.1 Исчезновение [PSI+PS] и [PSI+] при сверхпродукции шаперонов.

Сверхпродуцированные шапероны [PSI+PS], Эффективность Ssa1 + [PSI+] супрессии, % Ssa1 Ydj1 Ssb1 Hsp Ydj #1 40.1±5.4 ± + ++ – – #2 53.5±12.6 – – +* + – #3 6.8±0.4 ++ ++ +++ +++ ± #4 13.1±2.3 – – + ++ + слабый 7.65±1.32 – – + ++ +++ [PSI+] сильный 27.98±7.20 – – – – + [PSI+] Избыток шаперонов** 1.5 9 1.5 + 3 2 Частота потери прионов (Рис. 5.1) была интерпретирована следующим образом: –, прион стабилен;

±, потери редки;

+ заметны;

++ часты;

+++ (почти) полная потеря. +*, Большинство этих трансформантов не теряли [PSI+PS], но их рост был сильно ингибирован;

в меньшинстве колоний, более заметном из-за крупного размера, происходила секторная потеря приона.

**Указан кратный избыток шаперонов относительно нормы, определённый иммуноблоттингом. Как приблизительная оценка "силы" приона, указана эффективность супрессии (сквозное прочтение кодона UAA) в исходных штаммах.

Следует отметить, что экспрессия шаперонов подвержена жесткой саморегуляции (Stone and Craig, 1990). Например, свободный Ssa1 ингибирует собственный синтез, что позволяет повысить синтез при связывании Ssa1 денатурированными белками при стрессе, но препятствует его перепроизводству при увеличении числа копий гена SSA1.

Поэтому для корректной оценки эффектов шаперонов мы определили уровни сверхпродукции шаперонов относительно нормы (Таблица 5.1). Оказалось, что лишь уровень Hsp104 возрастал пропорционально копийности плазмиды (в 30 раз). Синтез остальных шаперонов подвергся негативной коррекции. Уровень Ydj1 возрастал в 9 раз и лишь в 3 раза в присутствии избытка Ssa1;

уровень Ssa1 возрастал лишь в 1, раза и Ssb1 в 2 раза. Таким образом, можно предполагать, что антиприонные эффекты шаперонов были бы намного сильнее при отсутствии авторегуляции их синтеза.

5.2. Систематический поиск факторов, препятствующих поддержанию [PSI+PS] Поскольку [PSI+PS] позволил обнаружить антиприонные эффекты основных шаперонных семейств, мы решили использовать его для систематического поиска антиприонных факторов у дрожжей. Для этого штамм c "сильным" [PSI+PS-1] был трансформирован многокопийной дрожжевой геномной библиотекой. Клетки штамма образуют колонии белого цвета. Если кодируемый плазмидой белок препятствовал поддержанию или проявлению [PSI+PS], колония приобретала красный цвет, что позволяло отобрать ее для анализа. Было получено около 300 тысяч трансформантов, из которых около 500 имели красный цвет и были отобраны. Хотя используемый штамм имел высокую фенотипическую стабильность, он с небольшой частотой выщеплял красные клоны. Чтобы избавиться от трансформантов, потерявших [PSI+PS] спонтанно, они были скрещены с тестерным штаммом содержащим [PSI+PS-1].

Получающиеся при этом [PSI+PS] диплоиды должны быть белыми в случае спонтанной потери и красными при наличии антиприонных факторов. Последних оказалось 50, и из них были выделены плазмиды. При трансформации клеток [PSI+PS-1] лишь 24 плазмиды привели к образованию красных, розовых или секторных колоний. Фрагменты хромосомы, содержащиеся на этих плазмидах, определили секвенированием концов вставок. Делеционный анализ вставок выявил следующие гены, влияющие на [PSI+PS]:

APJ1 SIS Контроль YDJ SIS1, YNL077w, STI1, SFL1, SSN8, RPP0 и SUP35.

Продукт гена SUP35, белок Sup35, вызывает антисупрессию, а не потерю [PSI+PS], поскольку в [PSI+ PS1] клетках [PSI+PS] Sup35 не полимеризуется, но и не RPP0 SFL1 SSN8 STI препятствует полимеризации Sup35PS.

Рисунок 5.2. Эффекты сверхпродукции антиприонных факторов. Трансформанты [PSI+PS] и Контроль SFL1 HSP [PSI+] клеток плазмидами, несущими указанные гены.

[PSI+] Контроль, трансформанты вектором YEplac195.

Таблица 5.2. Эффекты антиприонных факторов в клетках [PSI+] и [PSI+PS].

Вариант Сверхпродуцированные белки Эффект [PSI+] Sis1 Apj1 Ydj1 Sti1 Sfl1 Ssn8 Rpp0 Контроль Ослабление супрессии ++ + + + + + + [PSI+PS-1] Секторная потеря - - + - - - ++ % потери 13 9 12 12 3 0.2 25 0. Ослабление супрессии + + + - + + - [PSI+PS-2] Секторная потеря - - - - - - - % потери 10 22 5 2.2 5 2.4 0.2 Ослабление супрессии - - - - + + - [PSI+] Секторная потеря - - - - - - - сильный % потери 0.3 0.1 0.2 0 3 5 0.1 Ослабление супрессии - - - + + + - [PSI+] Секторная потеря - - - - + - - слабый % потери 0.9 0.5 0.5 1.8 15 3 0.4 0. Эффекты наблюдали у трансформантов указанных клеток сверхпродуцирующих указанные белки. Контроль, трансформанты пустым вектором YEplac195. Эффективность ослабления супрессии оценивали по цвету дрожжевых штрихов на среде не содержащей аденина.

"Секторная потеря" отражает пропорцию красных секторов в колониях (Рис. 5.2). ++, сильный эффект;

+, слабый эффект;

-, нет эффекта.

Ген YNL077w кодирует ранее не охарактеризованный белок семейства Hsp (DnaJ), который мы назвали Apj1 (антиприонный DnaJ). Другие гены кодируют шаперон Sis1 семейства Hsp40, шаперон Sti1, транскрипционные факторы Sfl1 и Ssn8, и кислый рибосомный белок Rpp0.

Эффекты сверхпродукции этих белков показаны на Рис. 5.2 и подробнее охарактеризованы для различных вариантов гибридного и обычного [PSI+] в таблице 5.2. Частота потери приона и ослабление супрессии часто не коррелировали. Для [PSI+PS-1] только избыток Sis1 вызывал значительное ослабление супрессии, в то время как избыток Rpp0 вызывал наибольшую потерю приона при низкой антисупрессии.

5.3. Механизмы антиприонных эффектов выявленных белков Центрифугирование клеточных лизатов выявило значительный уровень растворимого Sup35PS при сверхпродукции шаперона Sis1, что объясняет ослабление супрессии при избытке Sis1. Вероятной причиной эффекта является противодействие Sis1 процессу полимеризации. Например, этот белок мог бы связываться с растущими концами полимера и мешать присоединению мономеров Sup35PS.

В отличие от ранее известных антиприонных факторов, являющихся шаперонами, белки Sfl1 и Ssn8 участвуют в регуляции транскрипции. Sfl1 гомологичен Hsf1, играющему ключевую роль в регуляции ответа на тепловой шок. Ssn8 и Sfl взаимодействуют в регуляции экспрессии гена SUC2 (Song and Carlson, 1998).

Наиболее вероятным механизмом эффектов Ssn8 и Sfl1 представляется их влияние на синтез других белков, в первую очередь, шаперонов. Прямое действие Ssn8 и Sfl1 на полимеризацию Sup35PS маловероятно хотя бы потому, что эти белки присутствуют в клетке в довольно малых количествах, как и большинство транскрипционных факторов. В случае рибосомного белка Rpp0 также можно ожидать влияние этого белка на синтез шаперонов, хотя возможно и его непосредственное взаимодействие с прионными частицами. Поэтому мы решили определить влияние Ssn8, Sfl1 и Rpp0 на транскрипцию генов теплового шока. Эта транскрипция контролируется двумя основными промоторными элементами, HSE и STRE. В частности, Hsf1 связывается с HSE, активируя транскрипцию генов теплового шока, и аналогичное свойство можно предполагать у Sfl1. Для проверки транскрипционных эффектов Ssn8 и Sfl1 мы сконструировали несколько тестовых плазмид с геном lacZ E. coli (кодирует галактозидазу) под контролем синтетических промоторов, содержащих HSE и STRE, а также промоторов генов HSP104, SSA4 и SUP35. Промотор HSP104 анализировали ввиду необходимости этого гена для поддержания прионов, SSA4 представляет пример полной зависимости экспрессии от стресса, а уровень экспрессии SUP35 важен для поддержания и проявления [PSI+]. Для более полной характеристики роли генов SSN8 и SFL1 были сконструированы и включены в анализ их хромосомные делеции.

Таблица 5.3. Влияние изменения дозы генов SFL1, SSN8 и RPP0 на активность промоторов HSE, STRE, SSA4, HSP104 и SUP35.

Промотор Изменение дозы гена HSE STRE SSA4 HSP104 SUP 8.07 ± 0. 4.10 ± 0.17 7.18 ± 0.17 12.41 ± 1.31 43.1 ± 1. Многокопийный SFL 1.72 ± 0.15 5.23 ± 0.32 21.0 ± 0.2 6.17 ± 0. 13.13 ± 1. Делеция SFL 1.52 ± 0.21 18.0 ± 1.1 6.49 ± 0. 3.22 ± 0.35 2.31 ± 0. Многокопийный SSN 1.54 ± 0.11 26.6 ± 3.0 4.75 ± 0. 7.47 ± 0.24 12.72 ± 1. Делеция SSN 5.21 ± 0.44 24.5 ± 3. 3.45 ± 0.21 14.02 ± 2.53 11.58 ± 0. Многокопийный RPP 1.41 ± 0.12 4.73 ± 0.51 5.16 ± 1.14 20.5 ± 0.5 6.77 ± 0. Контроль Наиболее значительные эффекты отмечены жирным шрифтом. Контроль, трансформанты вектором YEplac 195.

Данные о влиянии генов SSN8, SFL1 и RPP0 на активность тестируемых промоторов приведены в Табл. 5.3. Видно, что Ssn8 репрессировал промоторы STRE и SSA4, но не влиял на промоторы HSE и HSP104. Отсутствие Ssn8, наоборот, имело активационный эффект. Это согласуется с литературными данными о том, что Ssn является негативным регулятором экспрессии гена SSA1 (Cooper et al., 1997). Избыток Sfl1 активировал все промоторы, но в наибольшей мере промотор HSE. Такой результат можно было предполагать ввиду подобия Sfl1 фактору Hsf1, мишенью которого является промоторный элемент HSE.

Более удивительным явилось значительное возрастание активности шаперонных промоторов HSE и SSA4 при увеличенной дозе гена RPP0. Наиболее вероятно косвенное влияние избытка рибосомного белка Rpp0 на экспрессию шаперонов:

усиление экспрессии является ответом на какое-то изменение или дисбаланс трансляционного процесса. Однако возможно и прямое влияние Rpp0 на транскрипцию. Следует отметить, что Rpp0 уникален среди рибосомных белков.

Большинство их являются основными (что помогает связываться с рибосомной РНК), а Rpp0 – кислый и менее прочно связан с рибосомой. Также важно, что избыток Rpp двукратно увеличивал продукцию Sup35, что должно затруднять устранение [PSI+PS].

Поскольку изменение дозы генов SSN8, SFL1 и RPP0 влияло на экспрессию шаперонов, оно могло также вызывать устойчивость клеток к повышенной температуре. Проверка показала, что клетки с избытком SFL1 и RPP0, но не SSN могли расти при 37°С, в отличие от нетрансформированных клеток.

5.5. Sfl1 связывается с промоторным элементом HSE Ввиду гомологии Sfl1 и Hsf1 и согласно данным Табл. 5.3 можно было предположить, что Sfl1 способен связываться c промоторным элементом HSE. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы провели эксперименты по ДНК-белковому связыванию (gel mobility shift assay). Белок Sfl1 был экспрессирован в E. coli и очищен. Были синтезированы ДНК дуплексы HSE и STRE и радиоактивно мечены Р32 с помощью ДНК полимеразы Кленова. Дуплексы ДНК инкубировали с очищенным Sfl1 или с дрожжевыми лизатами, а затем разделяли связавшиеся с белком и несвязавшиеся дуплексы посредством нативного электрофореза в полиакриламидном геле. Анализ показал, что белок Sfl1 связывался с дуплексом HSE и не связывался со STRE (Рис. 5.3). В лизатах оба дуплекса связывались с белками, однако связывание HSE коррелировало с количеством Sfl1 в лизате, а связывание STRE – нет. Это позволяет заключить, что Sfl эффективно связывается с элементом HSE и не связывается со STRE. Также можно видеть, что в лизатах в комплекс HSE STRE Sfl1-HSE входят дополнительные HSE STRE белок белок белки, что следует из его сниженной подвижности.

Рисунок 5.3. Белок Sfl Sfl1 связывается с элементом HSE, но HSE не с STRE. ДНК дуплексы HSE и STRE, меченные Р32, инкубировали с STRE очищенным Sfl1 или дрожжевыми HSE лизатами. Лизаты содержали 1хSFL 1хSFL mSFL SFL -+ mSFL -+ SFL нормальное количество Sfl (1xSFL1), его избыток (mSFL1), или чистый чистый Sfl1 отсутствовал (SFL1).

Sfl1 Sfl Лизаты Лизаты Таким образом, основными клеточными факторами, имеющими антиприонное действие являются шапероны. Помимо Hsp104, это шапероны семейств Hsp70 и Hsp40.

Кроме этого, антиприонным действием обладали транскрипционные факторы Sfl1 и Ssn8, а также рибосомный белок Rpp0. Наиболее вероятно, их действие реализуется косвенно, через изменение уровня синтеза шаперонов.

Повышение синтеза антиприонных факторов является одной из возможных стратегий лечения амилоидных болезней человека и животных. Некоторые из найденных нами факторов уже апробированы. Так, в модели полиглутаминовой болезни у Drosophila melanogaster сверхпродукция шаперонов Hsp70 подавляла нейродегенерацию (Warrick et al., 1999).

Резюме. Показано, что избыток белков Ssa1, Ssb1, Ydj1, Sis1, Apj1, Sti1, Sfl1, Ssn и Rpp0 способен противодействовать прионной полимеризации Sup35. Эти белки либо являются шаперонами, либо влияют на синтез шаперонов.

6. МОДЕЛЬ РЕПЛИКАЦИИ ДРОЖЖЕВЫХ ПРИОНОВ: РОЛЬ HSP 6.1. Две модели прионного превращения PrP Для описания процесса превращения белка PrPC в прионную форму PrPSc были предложены две модели, гетеродимерная (Prusiner, 1991) и полимеризационная (Jarrett and Lansbury, Jr., 1993). Согласно гетеродимерной модели, белок PrP может стабильно пребывать в двух структурно различных формах, нормальной PrPC и прионной PrPSc, причем обе формы являются мономерными. Спонтанный переход PrPC в PrPSc происходит крайне медленно, однако PrPSc ускоряет этот переход, катализируя преобразование молекул PrPC или их частично дестабилизированной формы (PrPInt) в PrPSc (Рис. 6.1). Этот автокаталитический процесс и определяет инфекционность PrPSc:

PrPС стабилен лишь в отсутствие PrPSc. Агрегация молекул PrPSc рассматривается при этом как вторичное явление, не существенное для конформационной перестройки.

PrPInt PrPC PrPSc PrPSc PrPSc PrPSc быстро быстро медленно Рисунок 6.1. Гетеродимерная модель прионного превращения белка PrPSc. Прионное состояние (PrPSc) характерно для мономера PrP (см. текст).

В полимеризационной модели прионное превращение сводится к процессу полимеризации прионного белка. Как обычно бывает в случае полимеризации, полимер обладает способностью катализировать переход мономера в полимерную форму.

Лимитирующей стадией процесса является возникновение полимера, который затем быстро растет, присоединяя к себе мономеры. Следует отметить, что прионные и амилоидные полимеры являются одномерными (линейными), как свидетельствуют многочисленные наблюдения их палочкообразной или нитевидной формы. В отличие от полимеров цитоскелетных белков (актин, тубулин) укладка прионных и амилоидных белков сильно изменена в полимере и обогащена бета-структурой.

6.2. Анализ моделей прионного превращения В 1994 году, когда Р. Викнер впервые провел аналогию между прионами дрожжей и животных, исследователи прионов преимущественно использовали гетеродимерную модель С. Прузинера, а полимеризационная модель использовалась в основном при изучении амилоидов. Мы тоже пытались представить репликацию прионов в гетеродимерной модели, однако обнаружили в ней существенные несоответствия. В этой модели прионное состояние присуще мономеру белка. Прионный мономер образует комплекс с неприонным, переводит его в прионную конформацию, и затем диссоциирует. Подобный цикл невозможен без энергетических затрат, например гидролиза АТФ или ГТФ, но это не предусмотрено гетеродимерной моделью. В полимеризационной модели диссоциация не требуется1, и поэтому превращение может происходить без расхода энергии. Происходит последовательное присоединение мономеров к полимеру. Вследствие этого полимер имеет нитевидную форму, характерную для амилоидов. Вторая слабость гетеродимерной модели связана с существованием штаммов, то есть структурных вариантов приона. Достаточно трудно представить для мономера белка существование многих вариантов стабильной пространственной укладки, способных к тому же к автокаталитическому структурному превращению. В амилоидных же полимерах такие варианты наблюдались. Например, фибриллы Sup35, образованные in vitro, обнаруживали существенно различающуюся морфологию (Glover et al., 1997). Поэтому мы приняли полимеризационную модель прионов как более адекватную, и это оказалось существенным для объяснения роли Hsp104. Впоследствии были опубликованы прямые свидетельства в пользу полимеризационной модели: минимальная масса инфекционного агента PrPSc была определена, как 300 кДа, что примерно соответствует 10-меру PrP (Silveira et al., 2005).

6.3. Модель репликации дрожжевых прионов: ключевая роль Hsp В поддержании дрожжевых прионов особую роль играет шаперон Hsp104, необходимый для существования всех известных природных прионов дрожжей. В то же время, сверхпродукция Hsp104 способна эффективно устранять [PSI+]. Мы попытались объяснить этот парадокс, опираясь на известные свойства Hsp104. Этот белок занимает особое место среди шаперонов. В отличие от большинства шаперонов, он не предохраняет белки от денатурации, и, видимо, не способен восстанавливать их нативную структуру. Hsp104 необходим для разборки крупных белковых агрегатов на более мелкие фрагменты, которые могут быть затем реактивированы шаперонами семейств Hsp70 и Hsp40 (Parsell et al., 1994;

Glover and Lindquist, 1998).

Чтобы объяснить роль Hsp104 в репликации прионов, мы предположили, что он действует аналогичным образом на прионные полимеры (Рис. 6.3). Эти полимеры, однако, отличаются от неупорядоченных агрегатов двумя важными свойствами:

Фрагментация полимеров, описываемая далее в этой главе, аналогична диссоциации и многократно ускоряет полимеризацию, но требует посторонней помощи (Hsp104) и расходования АТФ.

предполагаемой нитевидной формой и способностью катализировать свою дальнейшую полимеризацию. При этом присоединение мономеров происходит только на концах нитей. В результате, каждый разрыв нити, производимый Hsp104, создает новые активные концы и таким образом ускоряет полимеризацию. Кроме того, при этом происходит увеличение количества прионных частиц, что необходимо для их стабильного наследования. Следует отметить, что с точки зрения двух самых важных параметров, наследования и полимеризационной активности, размер прионного полимера не важен, если только он не опускается ниже некоторого порога. Поэтому фрагментация фактически размножает прион, при том условии, что он успел достаточно вырасти за счет полимеризации. Однако если фрагментирующая активность Hsp104 слишком высока, она способна нарушить поддержание приона, просто растворив, разобрав его до мономеров или мелких олигомеров, неспособных инициировать полимеризацию. Таким образом, данная модель полностью объясняет парадоксальные свойства Hsp104 в поддержании прионов.

Полимеризация (требует только Sup35) Фрагментация (требует Hsp104) Hsp Sup35:

Рисунок 6.3. Модель репликации прионов дрожжей на примере Sup35. Полимеры Sup растут в результате полимеризации и увеличиваются в числе вследствие фрагментации шапероном Hsp104.

Резюме. Предложена модель размножения прионов дрожжей, основанная на их фрагментации шапероном Hsp104.

7. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И АНАЛИЗА ПРИОНОВ Согласно нашей модели, прионные частицы представляют линейный полимер не ковалентно связанных молекул прионного белка, фрагментированный до некоторого размера шапероном Hsp104 (Гл. 6). Чтобы доказать эту модель, требовались методы, позволяющие уверенно отделять комплексы амилоидного (прионного) типа от ассоциированных с ними молекул и от неамилоидных комплексов. Структура прионов в клетках дрожжей оставалась неизвестной, в значительной мере вследствие отсутствия методов их очистки и анализа. Можно было предполагать, и мы это подтвердили в дальнейшем, что агрегаты Sup35 содержат множество дополнительных компонентов, например, полирибосомы. Именно эти комплексы, а не собственно прионные полимеры, выявлялись преложенным нами (Гл. 3) и широко используемым в то время ультрацентрифугированием. Другой метод, наблюдение в клетках с помощью флуоресцентного микроскопа агрегатов гибридов приона и зеленого флуоресцентного белка (Patino et al., 1996) позволял определять лишь наличие прионных частиц, но не их размеры. Наличие метода очистки прионных частиц также позволило бы выделять и идентифицировать новые прионные белки, опираясь лишь на их прионные свойства.

7.1. Подбор реагентов и условий для очистки прионных частиц Для разработки методов анализа прионов было необходимо найти условия, при которых разрушались бы все макромолекулярные комплексы, кроме прионных полимеров. Ранее мы использовали ГуГХ в высокой концентрации для очистки прионной формы белка Sup35 (Гл. 3). Однако впоследствии мы обнаружили, что ГуГХ вызывает вторичную агрегацию некоторых белков клеточного лизата, что существенно снижает степень очистки. Мы проверили ряд химических соединений (мочевина, KCl, деоксихолат натрия, несколько неионных детергентов, а также лаурил саркозил и ДСН) по их способности очищать прионные агрегаты. Эксперимент проводили следующим образом. Из лизата клеток штамма 5V-H19 [PSI+] центрифугированием осаждали фракцию, содержащую прионные агрегаты Sup35. Осадок растворяли в буферах, содержащих тестируемые вещества, и подвергали центрифугированию при 150000g в течение трех часов. Полученный осадок анализировали ДСН-ПААГЭ, и таким образом выявляли вещества, обеспечивающие максимальную степень очистки Sup35. Такими оказались сильные анионные детергенты ДСН и лаурил саркозил, намного превзошедшие остальные реагенты. В дальнейшей работе был использован ДСН, как реагент методически более распространенный. Однако саркозил также может быть использован в разработанных нами методах.

5% ДСН Рисунок 7.1. Полимеры Sup35 устойчивы к 0° 25° 37 37° 42° 50 70° старт действию ДСН при невысоких температу ° ° ° полимеры рах. Фракцию агрегатов лизата клеток [PSI+] Sup инкубировали 10 мин с 2% или 5% ДСН при указанных температурах и анализировали мономеры Sup35 ДСН-ПААГЭ. Иммуноокрашивание Sup35.

По условиям задачи, искомый агент должен сохранять прионные полимеры и растворять неприонные комплексы. Мы проверили сохранность прионных полимеров Sup35 при их обработке ДСН при различных температурах, от 10° до 100С. Образцы анализировали ДСН-ПААГЭ без их предварительного кипячения. Полимерная форма Sup35 обнаруживалась на границе гелей, а мономерная проходила в разделяющий гель.

(Рис. 7.1). В образцах, обработанных ДСН при температурах 42С и ниже, содержание мономерной формы Sup35 было мало и почти не зависело от температуры и концентрации ДСН. Это говорит об устойчивости прионных частиц Sup35 в этих условиях. Использование электрофореза в агарозном геле, описанном ниже, показало, что размер прионных частиц тоже не зависит от концентрации ДСН и температуры обработки в диапазоне 10-42°С (данные не приведены).

Также необходимо было показать, что никакие другие белки, кроме самого Sup35, не связаны с прионными полимерами в присутствии ДСН. Полимеры Sup35 выделили используя ДСН-ПААГЭ без кипячения образцов. При этом полимеры задержались в начале "разделяющего" геля, которое отделили, кипятили в присутствии ДСН и анализировали в качестве образца новым ДСН-ПААГЭ. Окрашивание геля Кумасси показало, что Sup35 является основным, если не единственным белком в задержанной полимерной фракции (Рис. 7.2). Следовательно, в присутствии ДСН полимеры Sup не содержат, или содержат достаточно малое количество посторонних белков.

Sup [PSI+] [PSI+] Рисунок 7.2. Sup35 – основной белок во фракции ДСН [psi-] устойчивых полимеров в клетках [PSI+]. Высокомолекулярную кДа фракцию лизатов клеток 5V-H19 [psi-], [PSI+] и [PSI+] со сверхэкспрессией гена SUP35 инкубировали с ДСН при 37°C и Sup анализировали ДСН-ПААГЭ. Верх разделяющего геля (3мм), содержащий ДСН-устойчивые комплексы, был отделен, подвергнут кипячению в ДСН- содержащем буфере для образцов и проанализирован другим ДСН-ПААГЭ. Окраска геля Кумасси 33 голубым. Соответствие полосы белку Sup35 подтверждено иммуноблоттингом.

7.2. Электрофорез прионных частиц в ДСН-агарозном геле – разработка метода Обработка ДСН не разрушает прионные частицы и позволяет отделить их от прочих белковых комплексов, что является принципиальной предпосылкой для корректного определения размера этих частиц. Идеальным методом для определения размера нам представлялся электрофорез, как намного более точный и менее трудоемкий, чем центрифугирование. Весьма удачным совпадением явилось то, что ДСН является стандартным и необходимым компонентом белкового электрофореза: ДСН связывается с белками и придает им отрицательный заряд, что позволяет белкам мигрировать в геле в приблизительном соответствии с их молекулярной массой.

Некоторую проблему представляло то, что полиакриламидный гель, обычно используемый для анализа белков, имеет слишком мелкие поры для прионных полимеров (Рис. 7.1), даже при минимально возможной концентрации акриламида.

Поэтому в качестве геля для разделения мы использовали агарозу, хотя она не обеспечивает столь хорошего разделения молекул, как полиакриламид. В качестве буфера был выбран Трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ), обычно используемый для разделения ДНК. В соответствии с белковой спецификой, он был дополнен 0,1% ДСН. Буфер для приготовления образцов содержал ТАЕ, 2% ДСН и -меркаптоэтанол. Попытка использовать стандартную буферную систему Лэммли дала менее качественное разделение. Также пришлось отказаться от использования вертикальных гелей, поскольку агарозный гель не крепится к стеклу и проседает в процессе электрофореза.

В качестве стандартов молекулярной массы выбрали препарат миофибрилл кролика, содержащий гигантские белки титин (примерно 4200 кДа) и небулин (740 кДа) (Wang, 1982). Перенос белков из геля на мембрану (блоттинг) также вызывал проблемы, поскольку агарозный гель в 3 раза толще акриламидного, и сплющивается при механической нагрузке. Опробовав все основные способы блоттинга, мы выбрали вакуумный, как наиболее надежный и качественный.

Для проверки метода мы сравнили белок Sup35 в штаммах 5V-H19 [PSI+] и [psi-].

Из результата, представленного на Рис. 7.3 можно заключить, что: (а) метод позволяет отчетливо различать [psi-] и [PSI+] Старт клетки, поскольку в [psi-] клетках Sup35 находится только в мономерной форме, а в [PSI+] клетках преимущественно в кДа полимерной;

(б) размер прионных полимеров составляет в данных [PSI+] клетках от 700 до 4000 кДа, что соответствует присутствию от 9 до 50 молекул Sup35.

Рисунок 7.3. Сравнение белка Sup35 в [psi-] и [PSI+] клетках.

Sup Лизаты [psi-] и [PSI+] вариантов 5V-H19 анализировали ДСН мономеры агарозным электрофорезом с иммуноокрашиванием белка Sup35. М, M [PSI+] [psi-] препарат миофибрилл кролика используемый в качестве маркера молекулярного веса (блот окрашен Понсо красным).

7.3. Другие разработанные методы Основываясь на нерастворимости прионных частиц в ДСН, мы также разработали следующие методы выделения и анализа прионных частиц (Kushnirov et al., 2006):

1.Выделение прионных частиц центрифугированием лизатов в присутствии ДСН, что может быть использовано для поиска новых прионных белков;

2.Анализ мономеров прионного белка ДСН-ПААГЭ без кипячения образцов;

3.Одновременный анализ количества мономеров и полимеров прионного белка в ДСН-ПААГЭ, с кипячением геля в середине пробега (Shkundina et al., 2006).

Резюме. Обнаружено, что прионные полимеры отличаются от прочих клеточных белковых комплексов своей нерастворимостью в присутствии сильных ионных детергентов. Основываясь на этом, разработаны новые методы выделения и анализа прионных полимеров, в частности, электрофорез полимеров в ДСН-агарозном геле.

8. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИОННЫХ ПОЛИМЕРОВ И АГРЕГАТОВ SUP 8.1. Агрегаты Sup35 состоят из его прионных полимеров и неприонных молекул Поскольку мы обнаружили, что ДСН удаляет неприонные белки, связанные с полимерами Sup35, представляло интерес сравнить размер этих полимеров и агрегатов Sup35, наблюдаемых при центрифугировании в отсутствие ДСН. Для этого мы провели центрифугирование лизата клеток [PSI+] в присутствии 2% ДСН и в его отсутствие, а также [psi-] лизата. Сравнение профилей седиментации Sup35 (Рис. 8.1) показало, что обработка ДСН весьма существенно уменьшает размер прионных комплексов. В среднем, масса прионных агрегатов Sup35 превосходила массу прионных полимеров в 35 раз. Столь значительная разница в размерах может быть обусловлена двумя причинами: ассоциацией полимеров Sup35 с другими молекулами и комплексами (такими, как рибосомы), и возможностью нахождения в одном агрегате нескольких полимеров. Относительный вклад этих двух факторов трудно оценить корректно.

Вероятно, он варьирует и между разными клетками, и между отдельными агрегатами.

Сравнение профилей седиментации Sup35 из [PSI+] и [psi-] лизатов (Рис. 8.1) указывает, что вклад ассоциированных комплексов в массу агрегата достаточно велик. Из Рис. 8. также видно, что центрифугирование различает [PSI+] и [psi-] лизаты гораздо менее четко, чем ДСН-агарозный форез (Рис. 7.3).

ДСН Рисунок 8.1. ДСН разбирает прионные агрегаты [psi-] Sup35 до малых ДСН-устойчивых частиц. Лизаты [PSI ] - клеток [PSI+] и [psi-] штамма 5V-H19 фракционировали + центрифугированием в отсутствие (-) или в [PSI+] + присутствии (+) ДСН. Фракции анализировали при 8 9 10 Оса 1 2 помощи ДСН-ПААГЭ. Иммуноокрашивание Sup35.

док Верх 8.2. Варианты [PSI+] и [PSI+PS] отличаются по размеру полимеров Sup Независимые изоляты [PSI+] и гибридного приона [PSI+PS] могут отличаться по эффективности нонсенс супрессии и по стабильности наследования. Обычно более эффективная супрессия коррелирует с повышенной стабильностью (более "сильный" вариант [PSI+]). Принято считать, что вариация свойств прионов определяется различной структурой прионных полимеров. Это может приводить к различной скорости прионной полимеризации и разной 123456 7 частоте фрагментации полимеров, а, следова Старт тельно, и к различному размеру полимеров.

Чтобы проверить это, мы сравнили размер кДа полимеров Sup35 в клетках с разными вариантами [PSI+] и [PSI+PS] (Рис. 8.2). Была Рисунок 8.2. Сравнение размера прионных 740 полимеров и уровня сквозного прочтения UAA кодона в клетках с различными вариантами [PSI+] и [PSI+PS]. Штаммы дрожжей, содержащие варианты [PSI+] и [PSI+PS] Sup Вариант анализировали ДСН-агарозным электрофорезом с мономер приона: W SSS S WSS окрашиванием белка Sup35. Варианты приона: W [PSI+] [PSI+PS] Сквозное – слабый, S – сильный;

по дорожкам: 1 - [PSI+6], прочтение – [PSI+1], 3 – [PSI+11], 4 – [PSI+37], 5 [PSI+PS-20], 6 UAA кодона, [PSI+PS-7], 7 - [PSI+PS-2], 8 - [PSI+PS-1].

% обнаружена значительная вариация, причем размер полимеров был обратно зависим от уровня сквозного прочтения UAA кодона. Единственным исключением оказался сильный вариант [PSI+PS-1] имевший большие полимеры. Обнаруженную корреляцию можно объяснить следующей логикой: меньший размер полимера означает их большее количество, большую общую скорость полимеризации, меньшее количество мономера Sup35 и более эффективную супрессию.

8.3. Присутствие ГуГХ блокирует фрагментацию прионных полимеров Гидрохлорид гуанидина обладает уникальной способностью эффективно устранять все известные дрожжевые прионы (Cox et al., 1988). Показано, что это связано со способностью ГуГХ специфически ингибировать активность Hsp104 (Ferreira et al., 2001). Согласно нашей модели, ингибирование Hsp104 должно нарушить фрагментацию полимеров, что приведет к возрастанию размера полимеров. Чтобы проверить это предположение, клетки [PSI+] растили в течение нескольких поколений в жидкой среде YPD, содержащей 3мМ ГуГХ. Через каждое клеточное поколение половину объема культуры забирали для анализа и замещали равным объемом свежей среды с ГуГХ, так что плотность культуры в течение эксперимента оставалась примерно постоянной. После трех поколений в среде с ГуГХ клетки были перенесены в среду YPD без ГуГХ и их отбирали для анализа каждый час. Анализ клеточных лизатов ДСН-агарозным электрофорезом показал, что в присутствии ГуГХ средний размер полимеров Sup35 возрастал почти в 2 раза за поколение (Рис. 8.3). Такой быстрый рост полимеров возможен лишь при одновременном соблюдении двух условий: полное блокирование их фрагментации и полное включение мономеров Sup35 в полимеры.

Последнее приблизительно верно для данных клеток в норме и в течение двух поколений в присутствии ГуГХ. При соблюдении названных условий общее количество полимеров Sup35 в культуре не Старт изменяется, а число клеток и количество Sup35 за удваивается поколение. Значит, среднее количество молекул Sup35 на полимер должно удвоиться.

кДа Соответствие результата этому предсказанию указывает, что ГуГХ полностью и сразу блокирует фрагментацию прионных полимеров.

Рис. 8.3. Влияние ГуГХ на размер полимеров Sup35.

Клетки 5V-H19 [PSI+] выращивали в течение Sup35 поколений в присутствии 3 мМ ГуГХ и затем 3 часа в мономер отсутствие ГуГХ. Лизаты анализировали ДСН Размер агарозным электрофорезом с иммуноокрашиванием 1.0 1.9 3.9 7.1 4.5 1.3 1.1 полимеров белка Sup35. Указан средний размер прионных 0123123 Sup полимеров Sup35 относительно исходного.

Поколения Часы после на ГуГХ ГуГХ 8.4. Уменьшение уровня Hsp104 увеличивает размер прионных полимеров Мишенью ГуГХ является шаперон Hsp104, необходимый для поддержания [PSI+] Ferreira et al., 2001). Поэтому далее мы проверили влияние уменьшения уровня Hsp на размер полимеров Sup35. Для этого мы заменили промотор гена HSP104 на регулируемый TET промотор (Belli et al., 1998), что позволило ингибировать синтез Hsp104 добавлением в среду 5 мкг/мл доксициклина. Однако уменьшение уровня Hsp104 не было быстрым (Рис. 8.4), поскольку Hsp104 почти не деградирует и лишь разводится в клеточных делениях. Клетки отбирали через каждое поколение роста в присутствии доксициклина. Размер полимеров Sup35 возрастал постепенно, и через поколений увеличился в 4 раза (Рис. 8.4). Более Старт медленный рост, чем в эксперименте с ГуГХ, можно связать с медленным уменьшением уровня Hsp104.

Полученные данные подтверждают ключевую роль кДа Hsp104 во фрагментации прионных полимеров.

Рисунок 8.4. Уменьшение уровня шаперона Hsp приводит к увеличению размера полимеров Sup35. В штамме 5V-H19 [PSI+] хромосомный ген HSP104 был поставлен под контроль ТЕТ промотора. Продукцию Hsp104 репрессировали добавлением в среду Sup мономер доксициклина в течение указанного числа поколений.

Лизаты анализировали ДСН-агарозным электрофорезом 210 100 55 30 17 11 8 % Hsp с окрашиванием блота по Sup35. Указан уровень белка 01234 Поколения Hsp104 относительно нормы.

8.5. Увеличение уровня Hsp104 уменьшает размер прионных агрегатов при увеличении или сохранении размера прионных полимеров Согласно нашим представлениям о функции Hsp104, увеличение уровня Hsp должно вызывать уменьшение размера агрегатов и полимеров Sup35, и увеличение количества его мономера. Мы подтвердили, что сверхпродукция Hsp104 в клетках с сильным [PSI+] уменьшает размер прионных агрегатов Sup35 и увеличивает уровень его мономера (Рис. 8.5).

моно оса Рисунок 8.5. Сверхпродукция Hsp104 уменьшает размер меры док прионных агрегатов Sup35. Лизаты клеток 5V-H19 [PSI+] без 1x (1х) или с многокопийной плазмидой (30х), кодирующей Sup35 Hsp104 Hsp104, фракционировали центрифугированием в градиенте 30x сахарозы. Фракции анализировали ДСН-ПААГЭ с иммуноокрашиванием Sup35.

Однако анализ полимеров показал, что избыток Hsp104 значительно увеличивает размер полимеров Sup35 в [PSI+] клетках и не влияет на размер полимеров гибридного Sup35PS [PSI+PS] (Рис. 8.6). Этот результат кажется парадоксальным в рамках нашей модели. Нам представляется наиболее вероятным следующее объяснение. Полимеры Sup35 могут различаться по степени доступности для Hsp104. Некоторые из них, находясь в комплексе с другими макромолекулами, лучше защищены от действия Hsp104. При избытке Hsp104 наименее защищенные полимеры будут растворены, в результате чего Старт образуется значительное количество мономерного Sup35, наблюдаемое экспериментально. В этих условиях "защищенные" полимеры будут ускоренно кДа расти, поскольку обычно рост полимеров сдерживается недостатком мономера Sup35.

740 Рисунок 8.6. Сверхпродукция Hsp104 увеличивает размер полимеров Sup35 и не влияет на размер 205 полимеров Sup35PS. Клетки с указанными "сильными" Sup вариантами приона имели ген HSP104 либо только в мономер 1 M 1 M 1 M Hsp104 хромосоме (1), либо еще и на многокопийной плазмиде (М).

] ] + PS-1 I+ PS-2] Лизаты анализировали ДСН-агарозным электрофорезом с I+ [ PS I [ PS [ PS иммуноокрашиванием Sup35.

Данные наблюдения показывают, что прионные полимеры и агрегаты представляют собой две относительно независимые категории: их размер, а значит и количество, коррелируют не всегда. При этом количество полимеров определяет эффективность полимеризации, а число агрегатов – стабильность наследования приона.

Резюме. Установлено, что прионные агрегаты Sup35 состоят из малых полимеров Sup35 и ассоциированных неприонных молекул. Показано, что Hsp104 фрагментирует полимеры Sup35 и фрагментация блокируется в присутствии ГуГХ. Полимеры Sup35 в различных вариантах [PSI+] различаются по размеру, что связано с разной эффективностью их фрагментации и определяет отличия в уровне мономерного Sup35 и эффективности нонсенс супрессии.

9. НЕПРИОННЫЕ АМИЛОИДЫ БЕЛКА SUP 9.1. Полимеры Sup35, возникающие при его сверхпродукции Целью данной части работы был поиск нестандартных вариантов [PSI+] и изучение их свойств. Вариация свойств [PSI+], видимо, определяется существованием различных полимерных укладок Sup35. Мы предполагали, что не всякая допустимая in vitro полимерная укладка Sup35 может наследоваться in vivo подобно [PSI+], и набор наследуемых укладок зависит от уровня экспрессии Sup35. Так, сверхпродукция Sup в [PSI+] клетках приводит к сильному ингибированию их роста, вероятно, вследствие нарушения терминации трансляции. Уменьшение уровня Sup35 может приводить к утрате [PSI+] [наши неопубликованные данные и теоретический расчет (Tanaka et al., 2006)]. Поэтому мы предположили, что [PSI+]-подобные детерминанты, могущие существовать при сверхпродукции Sup35, будут отличаться от известных вариантов [PSI+], и решили изучить их свойства, в том числе и их поведение при нормализации уровня Sup35.

Кроме того, мы хотели понять причину нонсенс-супрессорного фенотипа, возникающего при сверхпродукции Sup35 (Chernoff et al., 1992). Этот эффект парадоксален, поскольку обычно супрессия связана с уменьшением функциональной активности белка Sup35, вследствие мутаций, недостаточного уровня синтеза или перехода в прионное состояние. Супрессия при сверхпродукции Sup35, так же, как и [PSI+], требуют присутствия приона [PIN+], соответствующего возникновение прионной форме белка Rnq1. Этот белок похож по аминокислотному составу на N домен Sup35, и было предположено, что полимеры Rnq1 способны с малой частотой инициировать прионную полимеризацию Sup35 (Derkatch et al., 2001). В отличие от [PSI+], нонсенс супрессия при сверхпродукции Sup35 возникает у гораздо большей доли клеток и отличается от [PSI+] по условиям, требуемым для ее поддержания (Табл.

9.1). Все это позволило предположить, что супрессия при сверхпродукции Sup связана с возникновением необычных вариантов [PSI+].

Таблица 9.1. Сравнение условий возникновения и поддержания [PSI+] и супрессорного фенотипа при сверхпродукции () Sup35.

Супрессорный фенотип при [PSI+] сверхпродукции Sup Необходимы [PIN+]*, Sup35 Необходимы [PIN+], Sup Возникновение Необходимы [PIN+]*, Sup Поддержание Несовместимо со Sup Частота возникновения Очень высокая Очень низкая *Определено в данной работе.

Чтобы изучить свойства амилоидных полимеров Sup35, возникающих при его сверхпродукции, в клетки [psi-][PIN+] ввели многокопийные плазмиды, несущие либо ген SUP35, либо SUP35NM-GFP (кодирует район NM белка Sup35, сшитый с зеленым флуоресцирующим белком) либо контрольный вектор без SUP35. Сверхпродукция Sup35 и Sup35NM-GFP не влияла на терминацию трансляции: цвет колоний на среде с аденином был таким же красным, как и у контрольных трансформантов (Рис. 9.1).

Однако на среде, не содержащей аденина, росли лишь клетки [PIN+], сверхпродуцирующие Sup35 или Sup35NM-GFP, что указывает на супрессию нонсенс мутации ade1-14 (UGA).

[PIN] Сверх Рисунок 9.1. Супрессия мутации ade1-14 при продукция сверхпродукции Sup35 в клетках [psi-][PIN+].

+ контроль Клетки содержали многокопийные плазмиды, кодирующие указанные белки. Супрессорный Sup фенотип требует [PIN+], сверхпродукции Sup35 или Sup + Sup35NМ-GFP и селекции на супрессию (отсутствия аденина). Клетки растили на указанных средах в Sup35NM + течение 3 дней при 30°С.

eGFP -Leu+Ade -Leu-Ade Несмотря на отсутствие супрессорного фенотипа на среде с аденином, анализ лизатов клеток, сверхпродуцирующих Sup35, ДСН-агарозным электрофорезом обнаружил в них полимеры Sup35 устойчивые к ДСН (Рис. 9.2). Можно предполагать амилоидную природу этих полимеров, поскольку нерастворимость в ДСН при комнатной температуре является характерным свойством прионных частиц Sup35 из дрожжевых лизатов (Гл. 7) и амилоидных фибрилл Sup35, полученных in vitro (Serio et al., 2000).

Старт Рисунок 9.2. Белок Sup35, сверхпродуцированный в клетках кДа [psi-][PIN+] образует ДСН-нерастворимые полимеры. Лизаты следующих клеток анализировали ДСН-агарозным форезом с последующим иммуноокрашиванием блота по Sup35.

(1) [PSI+];

(2) [psi-] [PIN+];

(3)-(5), клетки, содержащие мультикопийную плазмиду YEplac181-SUP35. Генотипы клеток:

(3) [psi-] [PIN+];

(4) [psi-] [pin-];

(5) [psi-] rnq1 (делеция гена RNQ в клетках, соответствующих дорожке 3).

Sup мономер 123 Обнаруженные полимеры Sup35 по размеру намного превосходили прионные полимеры Sup35 из клеток [PSI+]. Это указывает на плохую фрагментацию этих полимеров и, вследствие малого количества полимеров, должно приводить к сниженной стабильности их наследования и уменьшенной эффективности полимеризации Sup35. Наличие агрегатов Sup35 было также подтверждено анализом седиментации Sup35 при центрифугировании и флуоресценцией гибридного белка Sup35NM-GFP (Рис.9.3). Амилоидная природа агрегатов была подтверждена и их способностью инициировать полимеризацию Sup35 in vitro.

Чтобы оценить эффективность полимеризации Sup35, мы определили количество общего и растворимого Sup35 в штамме [psi-][PIN+] при сверхпродукции Sup35 и в норме. Растворимый Sup35 определяли ДСН-ПААГЭ без кипячения образцов.

Оказалось, что количества растворимого и общего Sup35 при его сверхпродукции превышали такие количества в норме в 3 раза и 20 раз соответственно. Таким образом, 15% (3/20) белка Sup35 в клетках таких трансформантов находилось в растворимой форме, а 85% - в полимерной. Выявленное количество мономера Sup35 достаточно для эффективной терминации трансляции, что объясняет отсутствие супрессорного фенотипа у клеток и что было подтверждено прямым измерением эффективности прочтения нонсенс-кодонов.

Возникновение прионных полимеров Sup35 зависит от присутствия приона [PIN+] (Derkatch et al., 1997). Мы проверили, зависят ли полимеры сверхпродуцированного Sup35 от [PIN+]. Для этого в штаммах [psi-][PIN+] и [psi-][pin-] сверхпродуцировали Sup35 или Sup35NM-GFP. Оказалось, что только [PIN+] клетки содержали ДСН устойчивые полимеры Sup35 (Рис. 9.2) и агрегаты Sup35NM-GFP (наблюдаемые в виде зеленых светящихся точек или пятен, Рис. 9.3). Следовательно, возникновение полимерного состояния Sup35 зависит от [PIN+]. Кроме того, поддержание этих полимеров, в отличие от [PSI+] полимеров Sup35 также зависело от [PIN+]. Они исчезали при устранении [PIN+] делетированием гена RNQ1, что было показано ДСН агарозным форезом (Рис. 9.2) и флуоресцентной микроскопией (Рис. 9.3).

А Б В Рисунок 9.3. Сверхпродуцированный белок Sup35NM-GFP образует агрегаты в [PIN+] клетках. Приведены фотографии клеток, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа. (A, Б) [PIN+] [pin-] rnq1 Клетки [psi-] с указанным [PIN] статусом ([PIN+], [pin-]) были трансформированы многокопийной плазмидой YEplac181-Sup35NM-GFP. Агрегация белка (появление светящихся точек), видна только в клетках [PIN+]. (В) В клетках представленных в панели (А) была сделана делеция гена RNQ1, что вызвало потерю [PIN+]. При этом агрегация Sup35NM-GFP исчезала, о чем свидетельствует диффузное свечение.

Зависимость поддержания полимеров сверхпродуцированного Sup35 от [PIN+] допускает единственное объяснение: эти полимеры существуют за счет их постоянного и высокоэффективного возникновения de novo на матрице прионных полимеров Rnq1.

Размножение этих полимеров путем фрагментации шапероном Hsp104 либо не происходит, либо происходит недостаточно эффективно для их наследования в клеточных поколениях. Такая неспособность к наследованию дает основание относить эти амилоидные полимеры к неприонному типу.

Таким образом, мы впервые показали, что один и тот же белок (в данном случае Sup35) способен образовывать амилоидные полимеры как прионного, так и неприонного типа. При этом неприонные полимеры образуются с гораздо более высокой частотой.

9.2. Полимеры Sup35 содержат белок Rnq Зависимость полимеризации сверхпродуцированного Sup35 от [PIN+] указывает на инициацию полимеризации Sup35 полимерами Rnq1. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы предприняли поиск белка Rnq1 в составе полимеров Sup35, образующихся in vivo.

Для этого нам потребовалось разработать метод аффинного выделения амилоидных полимеров Sup35 из лизатов клеток дрожжей.

Мы предположили, что гетерополимеры Rnq1 и Sup35 так же устойчивы к ДСН, как и гомополимеры этих белков, что впоследствии подтвердилось. Очистку полимеров проводили в два этапа: сначала выделяли ДСН-нерастворимую фракцию, используя центрифугирование (Kushnirov et al., 2006), затем из этой фракции выделяли полимеры Sup35, используя аффинную метку (тэг). Второй этап особенно критичен, поскольку разделение полимеров требует присутствия ДСН, который препятствует большинству аффинных белковых взаимодействий. Мы использовали гексагистидиновый тэг, который, по утверждению производителя (Clontech), совместим с низкими (1%) концентрациями ДСН.

В штамме [PIN+], содержащем хромосомный аллель SUP35-C, кодирующий только С-домен Sup35, неспособный к полимеризации, были сверхпродуцированы и образовали полимеры белки Sup35NM-His6 с гексагистидиновой меткой на С-конце и Sup35NM-GFP. Sup35NM-GFP был необходим для визуального контроля выделения полимеров Sup35. В контрольных клетках продуцировали только Sup35NM-GFP.

Совокупная фракция амилоидных полимеров, содержащая и полимеры Sup35, была выделена из дрожжевых лизатов путем ультрацентрифугирования в присутствии 2% ДСН. Из этого препарата выделили полимеры Sup35 путем аффинной хроматографии на хелатной смоле "Talon" в присутствии 0,1% ДСН.

Рисунок 9.4. Присутствие Rnq1 в полимерах Sup35.

1 2 34 5 67 Полимеры Sup35 выделили, как описано в тексте и Sup35NM- анализировали ДСН-ПААГЭ. Белки Rnq1 и гибриды -eGFP Sup35 были выявлены иммуноблоттингом с соответ ствующими антителами. Образцы: 1, 2: кополимеры Sup35NM Sup35NM-His6 и Sup35NM-GFP (2: нагрузка 1/5);

3,4:

-His контроль: выделение полимеров Sup35NM-GFP в Rnq1 отсутствие Sup35NM-His6;

5-7: исходные клеточные лизаты, последовательное 5-кратное разведение.

Чтобы определить содержание белка Rnq1, полимеры Sup35 анализировали с помощью ДСН-ПААГЭ. Иммуноблоттинг и сопутствующий расчет показали, что полимеры Sup35 содержали примерно 1/5 от общего количества Rnq1 в клетке (Рис.

9.4). Высокое содержание Rnq1 в составе полимеров Sup35 подтверждает гипотезу прямой инициации полимеризации Sup35 прионными полимерами Rnq1 и эффективность этого процесса.

9.3. Амилоидная полимеризация Sup35 является причиной нонсенс супрессии В клетках [PIN+], сверхпродуцирующих Sup35, нонсенс кодоны прочитываются, но лишь на среде без аденина, селективной для этого. Чтобы понять причину этого явления и его возможную связь с полимерами Sup35, мы проанализировали состояние Sup35 в таких клетках при их росте в присутствии и в отсутствие аденина. Размер полимеров Sup35 значительно уменьшался в отсутствие аденина, и возвращался почти к исходной величине при дальнейшем добавлении аденина в среду (Рис. 9.5А).

Уменьшение размера полимеров должно приводить к росту эффективности полимеризации, уменьшению количества растворимого Sup35 и нонсенс супрессии.

Действительно, количество растворимого Sup35 существенно уменьшалось при росте клеток без аденина (Рис. 9.5Б).



Pages:   || 2 |
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.