авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Структурно-функциональный анализ полисахарид-связывающего домена пероксидазы пшеницы

На правах рукописи

КУЗЬМИНА ОЛЬГА ИЛЬИНИЧНА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИСАХАРИД-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА ПЕРОКСИДАЗЫ ПШЕНИЦЫ Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА 2010

Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений Учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН доктор биологических наук, старший научный

Научный консультант:

сотрудник Максимов Игорь Владимирович доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Бабаков Алексей Владимирович кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Маркушева Татьяна Вячеславовна Учреждение Российской академии наук

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН им. В.А.Энгельгардта

Защита состоится «_» декабря 2010 г. в «_» ч на заседании диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября,

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: http://ibg.anrb.ru /dissov.html;

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Неблагоприятные факторы внешней среды абиотической и биотической природы отрицательно влияют на рост и развитие растений, что проявляется в изменении экспрессионной активности ряда генов, кодирующих белки, ответственные за восстановление гомеостатического физиологического состояния организма. Среди них пероксидаза (ПО) как защитный белок, привлекает значительный интерес [Carpin, 2001;

Behle, 2002;

Delannoy, 2003;

Dunand, 2003;

Claude, 2004;

Passardi, 2004;

Газарян и др., 2006;

Bacalovic, 2006;

Максимов, Черепанова, 2007;

Almagro, 2009;

Cosio, Dunand, 2009]. Этот интерес обусловлен как разнообразием практического использования фермента, так и множеством выполняемых им в растениях функций, в числе которых важное место занимают участие в лигнификации и суберинизации клеточных стенок, перекрестное сшивание структурных белков клеточных стенок, катаболизм ауксина, защита при окислительном стрессе, регуляция клеточного растяжения, генерация активных форм кислорода (АФК), формирование устойчивости к разным стрессовым факторам, в том числе биотическим [Liu, 2005;

Cosio, 2009]. Экспрессирующиеся при патогенезе изопероксидазы (изоПО) отнесены к 9-му классу PR-белков (pathogen related) [Van Loon et al., 2006;

Ferreira et al., 2007].

Разнообразие функций ПО предполагает и различия в структурной организации ее молекулы в зависимости от изоформы. Так, при определении физиологической роли патоген-индуцируемых изоПО обнаружилось свойство некоторых из них ионообменно связываться с клеточной стенкой патогенных грибов [Черепанова, 2005]. Однако структурные особенности таких изоПО пока остаются слабо изученными. До сих пор нет детального анализа связи синтезируемых в растениях изоПО с кодирующими их генами. Остаются открытыми вопросы, связанные с доказательством способности молекулы ПО связываться с полисахаридами клеточных стенок патогеннов (хитином).

Цель исследований провести структурно-функциональный анализ фрагмента гена пероксидазы, кодирующего связывающийся с полисахаридами (хитином) домен у разных видов пшениц.

Задачи исследований:

1. Выделение, секвенирование и межвидовое сравнение фрагмента гена пероксидазы, кодирующего связывающийся с полисахаридами домен у разных видов пшеницы;

2. Анализ нуклеотидной последовательности искомого фрагмента гена пероксидазы и определение генетического сходства связывающихся с полисахаридами пероксидаз разных видов растений;

3. Создание генно-инженерной конструкции на основе векторов с фрагментом гена пероксидазы, экспрессирующихся в бактериальных системах в смысловой ориентации и в растениях – в антисмысловой ориентации;

4. Получение химерного белка GUS, содержащего полисахарид связывающий домен пероксидазы пшеницы в штаммах Escherichia coli;

5. Трансформация растений и клеточных культур пшеницы генно инженерной конструкцией с фрагментом гена пероксидазы, кодирующего связывающийся с полисахаридами домен в антисмысловой ориентации.

Научная новизна. Впервые выделен фрагмент гена, кодирующий связывающийся с полисахаридами домен пероксидаз у различных видов пшеницы.

Проведен сравнительный анализ нуклеотидной последовательности и предсказанной аминокислотной последовательности данного фрагмента гена ПО мягкой пшеницы (Triticum aestivum TC151917) с таковыми других видов пшеницы и Aegilops taushii.

Определено генетическое сродство связывающихся с полисахаридами ПО разных видов растений. Получены генно-инженерные конструкции со смысловой и антисмысловой ориентациями этого фрагмента гена пероксидазы мягкой пшеницы, способные экспрессироваться, соответственно, в штаммах бактерий E. coli и растениях пшеницы. Доказана способность синтезированного в E. coli химерного белка GUS, содержащего взаимодействующий с полисахаридами домен ПО, связываться с хитином. На основе конструкции, содержащей антисмысловую последовательность этого домена пероксидазы, впервые получены растения пшеницы со сниженной активностью целевого изофермента. Обнаружено, что падение активности анионной пероксидазы приводит к подавлению устойчивости растений пшеницы к возбудителю септориоза.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных вносит вклад в познание структуры как генов, так и белков пероксидаз растений. Генно инженерные сенс-конструкции к гену хитин-специфичной ПО позволяют использовать связывающийся с полисахаридами домен для создания химерных белков с целевыми фрагментами. Эти же конструкции можно использовать для анализа локализации целевых полисахаридов в растениях. Генно-инженерные конструкции с антисмысловой ориентацией искомого домена можно использовать для изучения физиологической роли ПО в защите растений от патогенов.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на XV Межд. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008), 12-й Пущинской межд. школе-конф. молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2008), II Всерос. конгрессе студентов и аспирантов-биологов (Пермь, 2009), Межд. 13-м симп. «SymBioSe» (Казань, 2009), Всероссийской конф. «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем» (Уфа, 2009), Десятой Межд. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010), XVII Congress of the Federation of European of Plant Biology (FESPB) (Valencia, 2010), Межд. симп. «Oxidative enzymes as sustainable industrial biocatalysts» (Santiago de Compostela, 2010).

Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантом РФФИ ККРНТ 08-04-90259узб_а (2008), проектом № 10234 «Участник молодежного научно инновационного конкурса» (2009), госконтрактами Министерства образования и науки РФ № 02.512.11.2051 (2007), №2.1.1./5676 (2009) и № П339 (2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 1 статья в журнале из Перечня ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы, содержащего 254 источника. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 35 рисунками.

Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН к.б.н. О.Б. Сурину, к.б.н. Е.А.Черепанову, к.б.н.

А.Ш. Валеева, а также лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. А.В. Князева, к.б.н. Б.Р. Кулуева, к.б.н. Б.Н. Постригань за помощь при выполнении и обсуждении работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследования были семена, проростки и каллусные культуры различных видов пшеницы и эгилопса из коллекции ВНИИ растениеводства им. Н.И.

Вавилова РАСХН (Triticum aestivum, T. boeoticum, T. compactum, T. durum, T.

fungicidum, T. macha, T. monococcum, T. petropavlovskyi, T. spelta, T. timopheevii, T.

turgidum, T. urartu, Aegilops taushii), а также бактериальные культуры E. coli (штамм XL1 - Blue) и Agrobacterium tumefaciens (штамм AGLO), предоставленные сотрудниками лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН. Развитие гриба Septoria nodorum на листьях пшеницы оценивали согласно рекомендациям Г.В. Пыжиковой и Е.В. Карасевой [1985].

ДНК растений выделяли набором Trizol Reagent (Invitrogen Corporation, США), плазмидную ДНК – по методу Бирнбойма [1983]. При анализе рекомбинантных клонов для определения размера вставки применяли метод щелочного лизиса бактериальных колоний [Sambrook et al., 1989]. Расщепление ДНК проводили в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками. Количество и качество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1%-м агарозном геле. Концентрацию ДНК измеряли при А260/A280 на спектрофотометре Smart SpecTM Plus (BioRad, США). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе ТП4-ПЦР-01-“Терцик” (ДНК-Технология, Россия) c использованием Taq и Pfu-полимераз. После амплификации фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза с использованием прибора miniProtean 3 Cell (BioRad, США), согласно описанию Т. Маниатис и др. [1984], в 2% агарозном геле или 7% полиакриламидном геле. Для определения размеров синтезированных ампликонов использовали маркерные ДНК GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Латвия).

Секвенирование ДНК производили на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM Genetic Analyzer» (Applied Biosystems Inc., США).

Для клонирования продуктов амплификации фрагментов генов ПО использовали фагмидные векторы pGEM-T и pALTA. Экспрессионные конструкции на основе промотора вируса мозаики цветной капусты и целевой ДНК в сенс- и антисенс-ориентации встраивались в бинарные векторы pCAMBIA 1305.1 и pCAMBIA 2301 и трансформировались в компетентные клетки E. coli и A. tumefaciens, соответственно, по методу Коэн [Cohen et al., 1972]. Белки из бактерий выделяли ультразвуковым методом и их содержание определяли по методу Бредфорд [1976].

Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) проводили на приборе фирмы «Хийу-Каллур» (Эстония). Активность -глюкуронидазы (GUS) определяли с помощью специфического гистохимического окрашивания под действием субстрата X-Gluc.

Биобаллистическая трансформация проводилась с использованием “генной пушки” PDS-1000/Нетм (Biolistic Particle Delivery system, США). В качестве микроносителя использовали золотые микрочастицы, средний размер которых составляет 0.6-1.6 мкм. Преципитация проводилась по методике кальций спермидинового способа [Finer et al, 1992]. Для повышения выживаемости трансформируемой ткани экспланты культивировали на среде MS с гидролизатом казеина, маннитолом и сорбитолом [Фадеев, 2006].

Агробактериальную трансформацию проростков пшеницы проводили по методике, предложенной Даниловой [2009]. Проросшие семена пшеницы (24 ч.) выдерживали в условиях вакуума в течение 2 часов в агробактериальной суспензии, содержащей экстракт табака в соотношении 1:3 к суспензии бактерий, и ацетосирингон – в концентрации 10 мг/мл. Потом, на протяжении 3-х сут, проростки, обработанные A. tumefaciens, культивировали на среде МС с половинной концентрацией минеральных солей, без гормонов с добавлением 500 мг/л клафорана [Roussel Uclaf, Франция] для ингибирования последующего роста агробактерий и мг/л канамицина («Ферейн», Россия) как селективного агента [Майсурян, 2006;

Bajaj, 2006] при комнатной температуре 20-22о С на светоплощадке с 16-ти часовым светопериодом, освещенностью 12-16 тыс. лк (лампы ЛД-40, ЛБ-40).

Определение экспрессии гена GUS в растительных тканях проводили методом гистохимического окрашивания растительных эксплантатов по Jefferson [1987].

Активность ПО определяли по методу Ермакова [1985]. Компьютерный анализ нуклеотидных (н.п.) и предсказанных аминокислотных последовательностей (а.п.) проводили с помощью пакета компьютерных программ Vector NTI 10.3.0 (Invitrogen Corporation, США), а также DNASIS (Hitachi Software Engineering Co, Япония) и Lasergene (DNASTAR, Inc., США).

В работе анализировали биоматериал каждого из трех повторов одного варианта опыта. Статистическая обработка проводилась компьютерными программами фирмы Stat Soft (Statistica 6.0).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ I. Сравнительный анализ связывающих полисахариды аминокислотных последовательностей пероксидаз разных видов растений Ранее была показана способность анионных ПО ряда растений к взаимодействию с хитином клеточных стенок грибных патогенов [Максимов и др., 1995;

2003;

2005]. Такие изоПО, обозначенные как хитин-специфичные, активируются в растениях при инфицировании возбудителями ряда болезней, а также при воздействии элиситоров и сигнальных молекул [Бурханова и др., 2007]. Анализ изоферментного состава связавшихся с хитином ПО выявил, что у всех испытанных видов растений на хитин сорбировались анионные изоПО, в ряде случаев имеющие схожие антигенные детерминанты среди как однодольных, так и двудольных видов [Максимов и др., 2010]. Это позволяет предположить наличие в растениях отдельного, пока не охарактеризованного подкласса изоПО, связывающихся с полисахаридами [Carpin, 1999;

Dunand, 2002].

Критерием для поиска связывающегося с полисахаридами домена служило наличие аргинина (R) или лизина (K) в этом фрагменте а.п. в определенной комбинации, которые и определяли сродство проанализированных ПО, например, арабидопсиса и цуккини, к пектинам [Carpin et al., 2001]. Поиск среди генов изоПО различных видов растений, в том числе арабидопсиса и пшеницы, позволил выделить фрагмент гена ПО пшеницы, предположительно способный взаимодействовать с полисахаридами. В качестве исходного для сравнения а.п. был отобран участок гена пшеницы ТС151917, кодирующий полисахарид-специфичный фрагмент ПО в зоне от 243-го до 269-й остаток аминокислоты, взятый из базы данных «PeroxiBase» [http://peroxibase.toulouse.inra.fr]. Он был близок по структуре к участкам ПО арабидопсиса ATg08770 (от 217-го до 247-й аминокислотный остаток) и NM_ (от 241-го по 261-й аминокислотный остаток) (табл.1) [Dunand et al., 2002].

Проведенное сравнение а.п. ПО разных видов растений выявило разную степень сходства этого мотива (табл. 1). Например, у белка NM_101321 полисахарид специфичный домен гомологичен а.п. ПО капусты 75974310, хрена D90115, цуккини DQ518906, кукурузы ZM004710 и риса OS378734.

Таблица 1.

Сравнение связывающегося с полисахаридами домена у пероксидаз разных видов растений Вид растения Локус Анализированный фрагмент 243 fdKqyyhnllnKKglltsdq TC Triticum aestivum 238 fdnayytnlmsqKgllhsdq X 249 fdnsyynnllsqKgllhsdq Avena sativa AF 243 fdnayysnllsnKgllhsdq X Oryza sativum 249 fdnryyqnllnqKgllssdq D 255 fdlgyfKnvaKRRglfhsdg OS 175 fdndyyKnllteRgllssdq AF Zea mays 265 fdnKyyvgltnnlglfKsdv AY 256 fdnKyyfdliaKqglfKsdq ZM 240 fdnKyyvdllnRqtlftsdq Allium cepa TC 253 fdnKyyvnlKenKgliqsdq Armoracia rusticana D 258 fdnsyfKnlmaqRgllhsdq Raphanus sativus X 260 fdnKyyvnlKehKgliqtdq Brassica oleraceae 217 fdnKyyvnlKenKgliqsd ATg Arabidopsis thaliana 241 fdnnyyRnlmqKKgllesdq NM_ 271 fdKvyydnlnnnqgimfsdq Solanum tuberosum M Nicotiana tabacum L02124 221 fdndyftnlqsnqgllqtdq 22 fdnmyfKnlqRgRglftsdq Petunia hybrida CV 183 fdnnyfKnlvqRKglletdq Cucumis sativus DQ 239 fdKnyytnlqanRglltsdq Cucurbita pepo DQ 252 ldnnyyRnildnKglllvdh Arachis hypogaea 16 fdvgyfKqvvKRRglfesda Pisum sativum AF Жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки лизина (К) и аргинина (R), предположительно ответственные за связывание ПО с полисахаридами.

Из 135 аминокислотных последовательностей пероксидаз пшеницы из международной базы данных «PeroxiBase» только у одной анионной ПО TС обнаружен подобный мотив [http://peroxibase.toulouse. inra.fr]. Среди других известных а.п. ПО пшеницы, включая патоген-индуцируемые, и риса, данного мотива нами не обнаружено. На основе имеющихся а.п. построено древо их сходства (рис. 1).

Гомология полисахарид-связывающего фрагмента анионной ПО пшеницы с таковым у овса AF078872 и риса D84400, X66125 оказалась, соответственно, равна 70 и 68.4 – 75%. Обнаружено, что у гена анионной ПО цуккини APRX (DQ518906) она составляла 65%, у гена огурца CsaPrx05 (DQ124871) – 55%. В то же время среди генов, кодирующих ПО, предположительно связывающиеся с полисахаридами, нами были обнаружены изогены, слабо гомологичные к гену анионной ПО пшеницы.

Рис. 1. Древо сходства видов растений, построенное на основе сравнения аминокислотных последовательностей фрагментов пероксидаз, ответственных за связывание с полисахаридами.

Так, фрагмент гена табака L02124, предположительно кодирующий анионную полисахарид-специфичную ПО, был гомологичен с фрагментом гена анионной ПО пшеницы ТС151917 только на 43%.

Таким образом, наиболее близкими по расположению на древе сходства аминокислотных последовательностей оказались виды злаковых и бобовых, точно так же как и в случае сравнения их иммуноспецифичности [Максимов и др., 2010].

II. Амплификация фрагмента гена, кодирующего полисахарид связывающий домен анионной пероксидазы различных видов пшеницы и поиск гомологичных последовательностей ПЦР-анализ фрагмента гена пероксидазы, ответственного за связывание с полисахаридами Для выяснения вариабельности участка гена ПО, содержащего полисахарид специфичный домен, был проведен анализ размера этого фрагмента у разных видов растений. Представленные на рис. 2 электрофореграммы амплифицированных фрагментов после ПЦР с использованием праймеров 3Forward и 3Reverse показывают, что размер ампликона у всех видов полиплоидного ряда пшеницы и эгилопса был близок (200-220 п.н.) и соответствовал теоретически рассчитанному.

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации гена пероксидазы растений с использованием пары праймеров 3Forward и 3Reverse: 1- T. spelta, 2- T.

polonicum, 3- T. boeoticum, 4- T. petropavlovskyi, 5- Ae. taushii, 6- Ae. bicornis, 7- Ae.

sharonensis, 8- Ae. speltoides, 9- T. aestivum, 10- T. durum, 11- A. thaliana, 12-Nicotiana tabacum, M-маркер.

Интересно, что у A. thaliana, в тех же условиях ПЦР, получен ампликон размером всего около 150 п.н.. Анализ генов, кодирующих ПО, по известным из международного генбанка NCBI нуклеотидным последовательностям арабидопсиса показал, что из более чем 70-ти генов, кодирующих этот фермент, только у одного (NM-101321) имелся подобный фрагмент размером 175 пар нуклеотидов. При использовании ДНК табака, который был слабо гомологичен к фрагменту гена ПО пшеницы, а также ряда злаковых (кукуруза, рис, ячмень, рожь), кроме эгилопсов, и ДНК двудольных видов, формирования искомого ампликона не происходило, что может быть связано с неспецифичностью подобранных нами праймеров к данному фрагменту ДНК этих видов растений или, возможно, условиями проведения ПЦР.

Анализ нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов пероксидаз, кодирующих полисахарид-специфичный домен у разных видов пшеницы Известно, что гомология между генами, кодирующими ПО, в ряду растений может составлять от 10 до 99% и, в основном, связана с сайтами субстратной специфичности и ферментативной активности [Passardi, 2004;

Cosio, Dunand, 2009].

Эта гомология может быть высокой у изоПО из эволюционно отдаленных видов растений, отсутствовать у родственных видов и/или обладать вариабельностью внутри одного вида [Куприянова и др., 2006].

Анализ предсказанных а.п. секвенированных фрагментов ПО разных видов пшеницы и эгилопса с последовательностью из генетического банка данных NCBI не выявил заметных отличий, что говорит об их консервативности для рода Triticum.

Процент сходства а.п. исследованных фрагментов ПО с таковой у мягкой пшеницы составлял от 98% до 100%. Сравнительный анализ фрагмента гена ПО мягкой пшеницы с последовательностью риса OsPrx126, также отобранной из базы данных NCBI, показал сходство, которое составляет 64%. Наибольшее количество замен нуклеотидов в ДНК было у T. timopheevii, а наименьшее - у T. compactum. Древо, построенное на основе сравнения секвенированных фрагментов гена ПО (рис. 3) показало, что уровень гомологии хитин-специфичных доменов совпадает с уровнем сходства геномов из литературных данных [Allaby, 2001;

Гончаров, 2008].

Рис. 3. Древо, построенное на основании анализа секвенированных нуклеотидных последова тельностей, содержащих полисахарид-специфичный сайт.

Полученные в этом разделе данные позволяют оценить степень эволюционных связей между видами пшеницы и эгилопса. Важно при этом отметить, что среди генов пшеницы нами, так же как и среди генов арабидопсиса, были обнаружены и гомологичные гены пероксидаз, что предполагает необходимость более конкретного анализа генетической структуры ПО внутри одного генома, а также анализа филогенетической эволюции исследованных генов наземных растений.

Создание генно-инженерных конструкций фрагмента гена пероксидазы пшеницы в смысловой и антисмысловой ориентациях Для доказательства способности полисахарид-специфичного домена ПО пшеницы связываться с хитином нами была получена генно-инженерная конструкция на основе вектора pCambia 1305.1, содержащая фрагмент гена ПО пшеницы, кодирующий искомый домен в смысловой ориентации (рис. 4).

Рис. 4. Схема генно-инженерной конструкции на основе вектора pCambia 1305.1 со встроенным фрагментом гена анионной пероксидазы в “смысловой” ориентации (AnPerox sense);

обозначены сайты рестрикции по которым происходило лигирование фрагмента (NcoI, SpeI);

CaMV35S промотор – промотор вируса мозаики цветной капусты;

GUS – ген -глюкуронидазы, R - гены устойчивости к гигромицину и канамицину.

При помощи ПЦР с использованием праймеров (3Fanperox и 3Ranperox), комплементарных 5’- и 3’-концам фрагмента гена анионной ПО пшеницы и содержащих сайты рестрикции NcoI и SpeI, нами был получен ПЦР-продукт длиной 201 п.н. Целевой фрагмент ДНК был встроен внутрь рамки считывания гена глюкуронидазы (GUS) в исходном векторе вместо каталазного интрона, по границам которого находятся сайты рестрикции NcoI и SpeI (рис. 5).

Рис. 5. Схема участка генно-инженерной конструкции, содержащей фрагмент гена анионной пероксидазы (AnPerox sense, обозначен подчеркиванием);

стрелками показано положение праймеров (3Fanperox и 3Ranperox), использованных для клонирования фрагмента гена;

рамками обозначены нуклеотидные последовательности этих праймеров;

сайты рестрикции, по которым происходило лигирование фрагмента (NcoI, SpeI), показаны серым цветом.

В исходном векторе ген GUS не может экспрессироваться в прокариотической системе из-за наличия интрона и нарушения структуры гена. В полученной нами генно инженерной конструкции фрагмент гена ПО заменял каталазный интрон, причем праймеры были подобраны так, что рамка считывания гена -глюкуронидазы и фрагмента гена ПО совпали. В этом случае при трансляции с ATG-кодона мРНК, полученной транскрипцией с СаМV35S промотора в клетках, должен синтезироваться химерный белок, содержащий полисахарид-специфичный домен ПО и обладающий активностью -глюкуронидазы. Поскольку промотор вируса мозаики цветной капусты способен работать как в бактериях, так и в растениях, мы внедрили полученную генно инженерную конструкцию в клетки E. coli XL1 - Blue и культивировали их в жидкой среде LB, содержащей 50 мг/мл канамицина. Выросшие на селективной среде бактериальные колонии проверяли на наличие целевой вставки путем ПЦР анализа и искомые штаммы отбирали для выделения плазмидной ДНК, секвенирования с праймером к СаМV35S промотору, ПЦР и анализа способности химерного GUS-белка связываться с хитином. Концентрацию тотального белка, выделенного из «дикого» и трансформированного штаммов E. coli, выравнивали и подвергали взаимодействию с хитином в том же буфере. Не сорбировавшиеся на хитине белки были отмыты путем многократного его промывания в буфере. Сорбировавшиеся белки элюировали с сорбента раствором 1М NaCl. Все фракции белка, в том числе и элюат, анализировали на наличие активности -глюкуронидазы (табл. 2).

Таблица 2.

Выход и удельная активность химерного GUS белка на различных этапах очистки Стадия очистки Варианты Содержание Удельная GUS белка, активность, мкг/мл ед./мг белка 1. Белковый экстракт «дикий» 800 25. трансформант 800 60. 2. Фракция, не «дикий» 600 25. взаимодействующая с трансформант 500 10. хитином 3. Элюция с хитина «дикий» 200 1. 1 М раствором NaCl трансформант 300 50. Рис. 6. Сравнительный анализ способности химерного белка, содержащего хитин связывающий фрагмент гена анионной пероксидазы пшеницы взаимодействовать с хитином. Хитин после нанесения тотального белка из трансформированных вектором pCambia 1305.1, содержащем ген химерного белка, клеток E. coli (Б) и из клеток «дикого» типа (А). Сорбент после промывки лизис-буфером был окрашен субстратом для -глюкуронидазы (Х-Gluc).

А Б Часть хитина до элюирования отбирали для доказательства способности химерного GUS белка связываться с хитином. Как видно из рис. 6, хитин, подвергшийся взаимодействию с белками из трансформированных бактериальных клеток, активно окрашивается в темно-синий цвет. Таким образом, химерный белок глюкуронидазы, содержащий полисахарид-связывающий домен ПО экспрессируется в клетках E.coli и обладает способностью взаимодействовать с хитином.

В случае штамма кишечной палочки «дикого» типа, белки, обладающие GUS активностью, с хитином не связывались. А в случае использования лизата из бактерий, трансформированных генно-инженерной конструкцией, содержащей химерный белок, после нанесения на хитин и последующей промывки лизис буфером, значительная часть белков, обладающих GUS активностью, связалась с хитином и их удельная активность составила 50.20 ед/мг.

Проведенные эксперименты по определению молекулярной массы (м.м.) и изоэлектрической точки (pI) химерного белка с помощью ИЭФ и SDS-фореза показали, что трансформированные клетки E. сoli синтезируют целевой химерный белок, сочетающий в себе свойства взаимодействия с хитином и GUS активностью. Поскольку при создании этой конструкции мы объединили ген, ответственный за синтез GUS белка, и фрагмент гена ПО пшеницы путем вставки целевого ампликона вместо каталазного интрона в начале открытой рамки считывания гена GUS белка (рис. 4), то следовало ожидать синтеза химерного белка с иной pI и м.м. (5.2 и 80 кДа, соответственно), в сравнении с GUS белком «дикого» типа (pI ~ 4.8, м.м. ~ 68 kDa) [Baragona, 1992;

Ruebelt, 2006].

Действительно, SDS-фракционирование в ПААГ обнаружило наличие в трансформированных бактериях E. сoli белка размером 80 - 90 кДа, что совпало с рассчитанным нами (рис. 7).

Рис. 7. Электрофореграмма препаратов белков лизата клеток E. coli: 1 - тотальный белок клеток E.coli XL1 - Blue (контроль), 2 тотальный белок клеток, трансформированных плазмидой, несущей химерный белок, М-маркер. Стрелкой на треке 2 показана дополнительная полоса, предположительно соответствующая химерному белку GUS (м.м. ~ 80 - 90 кДа), отсутствующая среди белков «дикого» штамма.

При изоэлектрофокусировании (ИЭФ) была обнаружена дополнительная полоса, соответствующая белку с pI ~ 5.8, что также близко к теоретически рассчитанному для химерного белка (рис. 8). Таким образом, в этой части работы нам удалось получить в бактериях E. coli химерный белок, обладающий способностью взаимодействовать с хитином.

Рис. 8. Изоэлектрофокусирование белков, выделенных из E. coli: 1 - белки штамма E.

coli XL1 - Blue (контроль), 2 - белки из трансформированных клеток E.coli. М маркерный белок, pI – изоэлектрические точки маркерных белков. Стрелкой показана дополнительная полоса (pI ~ 5.8), предположительно соответствующая химерному белку GUS.

Экспрессионные активности генно-инженерной конструкции фрагмента гена пероксидазы пшеницы в антисмысловой ориентации Основываясь на имеющихся данных о возможности изучения роли того или иного гена в морфолого-физиологических проявлениях растения с помощью антисмысловых РНК нами была создана генно-инженерная конструкция в антисенс ориентации участка, содержащего полисахарид-специфичный сайт. Фрагмент гена ПО был получен с помощью ПЦР с кДНК пшеницы. Этот участок размером 200 п.н., кодирующий полисахарид-связывающий домен, был амплифицирован и клонирован в Т-векторе pKRX. Затем он был секвенирован, полученная п. н. была проверена при помощи пакета программ Vector NTI (Invitrogen, США). Выделенная копия фрагмента гена ПО, полностью совпавшая по н.п. с исследуемым участком кДНК пшеницы, вырезана из вектора pKRX по сайту BsePI, а модифицированный ранее вектор pCambia 2301 разрезан по сайту рестрикции XbaI. Затем «липкие» концы плазмиды и фрагмента гена ПО были обработаны Т4-ДНК-полимеразой, лигированы и использованы для конструирования целевой генно-инженерной конструкции. Для проверки правильной сборки полученной конструкции использовали рестрикционный анализ, ПЦР-ПДРФ и секвенирование.

Она была встроена в геном клеток каллусов, а также проростков пшеницы путем баллистической и агробактериальной трансформации, соответственно (рис. 9).

Баллистическая трансформация использовалась для доказательства эффективности функционирования созданной генно-инженерной конструкции. Достоинством этого метода является то, что он позволяет быстро переносить гетерологичные гены в геном растений и за короткое время оценить способность генно-инженерной конструкции работать в эукариотическом организме [Rasco, Gaunt, 2000;

Mackintosh, 2005;

Johrde, 2008]. Однако внедрение микрочастиц металла в клетку путем пробивания клеточной стенки нарушает структуру клетки и, соответственно, ее нормальное состояние.

Рис. 9. Клонирование фрагмента гена анионной пероксидазы пшеницы в “антисмысловой” ориентации в векторе pCambia 2301. Km – ген устойчивости к канамицину;

35S промотор – промотор вируса мозаики цветной капусты;

промотор ВМГ – промотор вируса мозаики георгина;

GUS – ген -глюкуронидазы;

SmaI, BamHI, XbaI – сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, polyA – сайт полиаденилирования.

Таким образом, поиск оптимальных условий, сочетающих максимальную степень доставки векторных конструкций в клетки и при этом наносящих незначительные повреждения живой ткани, является главной задачей оптимизации параметров трансформации. Для оптимизации условий эксперимента для трансформации клеток пшеницы была проведена сравнительная оценка влияния расстояния от источника частиц до ткани мишени – 3, 6, 9, 12 см. C помощью специфического гистохимического окрашивания субстратом X-gluc на третьи сутки были выявлены крупные участки, окрашенные в голубой цвет (рис. 10). Высокий уровень транзиентной экспрессии маркерного гена обнаружен при использовании расстояния 6 см до ткани мишени – для T. monococcum, эти данные совпадают и с литературными данными [Patnaik, 2003], в остальных случаях транзиентная экспрессия не наблюдалась, причем при расстоянии 3 см жизнеспособность каллуса была очень низкой, что, видимо, связано с сильным механическим повреждением клеток при выстреле на таком близком расстоянии.

Рис. 10. Транзиентная экспресс сия GUS-белка в эмбриогенном каллусе T. monococcum после баллистической трансформации (А - контроль, Б - после трансформации).

Трансформированные расти тельные ткани с высоким уров нем экспрессии GUS на рисунке выделяются потемнением.

Оценка экспрессии GUS-гена в проростках пшеницы при агробактериальной трансформации Агробактериальный метод трансформации имеет ряд достоинств: с его помощью можно вводить в реципиентные клетки сравнительно крупные генетические конструкции с минимальными нарушениями в кодирующей последовательности переносимого гена, он обеспечивает включение в геном реципиента ограниченного числа копий чужеродного гена и не требует применения специального оборудования, кроме прибора для вакуумной инфильтрации [Cheng, 1997;

Майсурян, 2006].

Среди 600 проростков пшеницы при культивировании на питательной среде Кнопа с канамицином обнаружено 12 полностью зеленых, в то время как большая их часть обесцвечивалась из-за усиленной потери ими хлорофилла. Например, из литературы известно, что проростки ячменя становятся полностью бесхлорофилльными после 3-х суток культивирования на среде с канамицином [Майсурян, 2006], а по другим данным - на 10-е сутки [Степанова, 2006].

Рис. 11.

Экспрессия -глюкуронидазы (GUS) в трансформированных (Б) проростках пшеницы, содержащих антисмысловую последовательность фрагмента гена пероксидазы пшеницы.

А – контроль;

Б – опыт.

А Б Если в контроле наличие GUS белка в проростках практически не обнаруживалось специфическим субстратом к этому ферменту, то в опытных растениях трансформированные клетки окрашивались в темно-синий цвет (рис. 11).

Из этих растений были выделены белки и проведен анализ изоферментного состава ПО. Как видно из рис. 12, трансформация приводит к активации ряда изоПО с pI ~ 7.2 - 7.6 в опытных проростках, что, вероятно, связано с влиянием агробактерий или антибиотика, содержащегося в питательной среде, на защитные системы растений.

Ранее в лаборатории, где выполнялась работа, было показано, что инфицирование патогенами приводит к активации у растений ряда изоПО с pI ~ 3.5 4.5, ~ 6.0 - 7.5 и ~9.4 – 10.0 [Максимов, 2005], которые можно обозначить как чувствительные к инфицированию. Важно, что активность анионных изоПО (pI ~ 3. – 4.0) при грибном патогенезе [Бурханова и др., 2007] и инфицировании растений бактериями [Мубинов, 2007;

Максимов и др., 2010] повышалась. Интересно, что в опытных проростках, являющихся химерными, то есть содержащими как «нормальные», так и трансформированные клетки, происходило снижение активности ПО. Однако полного отключения ПО активности в таких растениях мы не наблюдали. Подобная мозаичная экспрессия генов ранее прослежена в трансформированных растениях березы [Данилкович, 2008].

На следующем этапе исследований нами был проведен анализ устойчивости листьев химерных растений пшеницы к возбудителю септориоза. Обнаружено, что внедрение генно-инженерной конструкции с антисмысловым фрагментом приводит к значительному падению устойчивости растений.

Рис. 12. Изменение активности изоферментов пероксидазы в трансформированных колеоптилях химерных проростков пшеницы, содержащих антисмысловую последовательность фрагмента гена пероксидазы пшеницы.

1 - контроль, 2 – проростки, зараженные агробактериями, содержащими целевую генно инженерную конструкцию;

3 - проростки, зараженные агробактериями, не содержащими целевой генно-инженерной конструкции.

Стрелкой указаны изоформы пероксидазы со сниженной (отмечены звездочкой *) или повышенной активностью.

* * Таким образом, данные по агробактериальной трансформации пшеницы по принципу РНК-сайленсинга, то есть подавления синтеза продуктов экспрессии гена эндогенной ПО, позволяют в определенной степени изменить изоферментный спектр ПО растения. Следовательно, можно заключить, что использование антисмысловых РНК способствует получению новых форм растений с пониженной активностью анионной ПО, которые, впоследствии, можно использовать для анализа физиологической роли этого изофермента.

Заключение Пероксидаза является одним из растительных ферментов, характеризующихся широкой функциональной активностью. Важное ее свойство - активное включение в защитные механизмы против патогенов. В данной работе впервые показано, что за полисахарид-специфичность некоторых изоПО пшеницы, которая способствует их взаимодействию с клетками патогенных грибов, несет ответственность домен, расположенный между 243 и 269 остатками аминокислот. Анализ этого домена обнаружил формирование на древе сходства предполагаемых а.п. отдельной ветви изоПО. Проверка генетической близости просеквенированных ампликонов после ПЦР ДНК разных видов пшеницы обнаружила, что анализируемый нами домен характеризуется сходной организацией внутри рода пшениц. При этом полученные * после секвенирования ДНК данные по нуклеотидным заменам в искомой последовательности показали четкое разделение испытанных нами видов пшениц на отдельных кластера. Результаты этой работы подтверждают известные из литературных источников данные о делении рода Triticum на 2 подрода пшеницы Boeoticum и Urartu.

В целях определения функциональной активности полисахарид-связывающего домена нами получены генно-инженерные конструкции в сенс– и антисенс ориентациях. Показано, что выделенный фрагмент полисахарид-специфичной изоПО является необходимым при взаимодействии белка с важным компонентом клеточных стенок патогенных грибов – хитином. В перспективе предполагается возможность использования отмеченной конструкции для детектирования ацетилированных олигосахаридов в растениях пшеницы. Кроме того, химерные сенс-конструкции на основе выделенного нами полисахарид-связывающего домена представляют значительный интерес в биотехнологической промышленности, так как с их помощью из множества белков, синтезируемых в рекомбинантных организмах, можно фракционировать целевые с меньшим количеством этапов. Причем для этого процесса можно использовать распространенный и дешевый биополимер – хитин. В этих условиях использование ионообменно взаимодействующих с биологической матрицей пептидов, например, таких как у хитин-специфичных пероксидаз, является перспективным наряду с аффинной хроматографией. [Kurek, 2009].

При использовании антисмысловых конструкций может происходить полная блокада экспрессии отдельного гена ПО по механизму РНК-интерференции. Можно предположить, что эта блокада может быть полной при трансформации диплоидных форм пшениц и частичной – у аллополиплоидных. Соответственно, данная технология в перспективе позволяет определить роль отдельных геномов аллоплоидной мягкой пшеницы в реализации синтеза белков, ответственных за развитие защитных реакций. Причем, важным обстоятельством является и то, что целевая изоПО, на отключение синтеза которой направлена генно-инженерная конструкция, характеризуется свойством активироваться под влиянием инфицирования. Полученные нами в этой работе данные показали, что анионная пероксидаза пшеницы является важным компонентом защитной системы растений, и отключение накопления этой изоформы приводит к снижению их устойчивости к патогенам, например, к возбудителю септориоза.

Таким образом, полученные данные позволяют подойти к оценке степени эволюционного родства разных видов растений и роли полисахарид-связывающего домена изоПО пшеницы в физиологических механизмах ее роста и развития на молекулярном уровне.

ВЫВОДЫ 1. Из большого семейства генов растительных пероксидаз III класса выделены в отдельную группу гены, кодирующие изоферменты, связывающиеся с полисахаридами.

2. Впервые охарактеризована молекулярная структура домена изопероксидазы, взаимодействующего с полисахаридами растительного и грибного происхождения.

3. Выявлено, что степень гомологии хитин-связывающего домена пероксидазы у разных видов двудольных и однодольных растений варьирует от 30% (Allium cepa) до 75% (Oryza sativum).

4. Обнаружена высокая степень гомологии фрагментов генов пероксидазы, кодирующих связывающийся с полисахаридами домен из видов пшеницы, что говорит о сходной организации этого участка гена пероксидазы.

5. Доказана способность химерного белка GUS, содержащего полисахарид связывающий домен пероксидазы пшеницы в смысловой ориентации, взаимодействовать с хитином.

6. Получены трансгенные формы пшеницы, содержащие генетическую конструкцию, кодирующую хитин-связывающий домен анионной пероксидазы в антисмысловой ориентации и показано снижение активности этого фермента в таких растениях по механизму РНК-сайленсинга.

7. Активное развитие возбудителя септориоза S. nodorum на трансформированных растениях пшеницы с подавленным синтезом полисахарид специфичной пероксидазы в сравнении с контрольными доказывает ее важную роль в защите растений от патогенов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Кузьмина О.И, Яруллина Л.Г., Ахунов А.А.

Молекулярные особенности пероксидаз растений, связывающихся с хитином // Биоорганическая химия. 2010. №2, том 36. С. 1-8.

2. Кузьмина О.И. Анализ хитин-связывающего сайта гена растительных изопероксидаз // Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». М.: Издательство МГУ;

СП МЫСЛЬ.

2008. С. 151-152.

3. Кузьмина О.И., Благова Д. К., Бурханова Г. Ф., Максимов И. В. Анализ хитин связывающего сайта в гене полисахарид-специфичной пероксидазы // IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008. С.

154.

4. Кузьмина О.И., Черепанова Е.А., Максимов И.В. Иммунохимическое и генетическое сходство хитин-специфичных пероксидаз разных видов растений // Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений:

тез.докл. Междунар. науч. конф., Екатеринбург, 6-10 окт. 2008. Екатеринбург: Изд во Урал. ун-та, 2008. С. 235-237.

5. Кузьмина О.И., Благова Д.К., Бурханова Г.Ф. Анализ хитин-связывающего сайта гена растительных пероксидаз // Материалы 12-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 10- ноября 2008 года). С.38-39.

6. Кузьмина О.И., Бурханова Г.Ф., Максимов И.В. Полиморфизм хитин связывающего сайта гена анионной пероксидазы у разных видов растений // Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты: материалы Междунар. науч. конф., 3-6 дек. 2008 г., Минск. Минск: Изд. Центр БГУ, 2008. – С.

7. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Кузьмина О.И. Хитин-специфичные пероксидазы растений: молекулярная организация и иммунохимическая специфичность// Материалы международной конференции «Геном растений», Одесса, 2008, с. 88-90.

8. Кузьмина О.И., Благова Д.К. Полиморфизм хитин-специфичного сайта гена анионной пероксидазы у разных видов растений // Материалы Молодежной школы конференции «Современные методы и подходы в биологии и экологии», посвященной 100-летию со дня рождения В.К. Гирфанова. Москва. Издательство «ФОЛИУМ», 2009. С.122-123.

9. Кузьмина О.И., Благова Д.К., Максимов И.В. Молекулярно-генетическая организация хитин-специфичных пероксидаз растений // Симбиоз Россия 2009:

Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов (25-29 мая 2009 г., Пермь). С. 219-221.

10. Кузьмина О.И., Черепанова Е.А., Максимов И.В. Участие изопероксидаз, связывающихся с хитином (ацетилированными полисахаридами), в устойчивости растений к стрессовым факторам // Материалы Всероссийской научной конференции, Иркутск, 24-28 августа, 2009. С. 264-267.

11. Максимов И.В., Кузьмина О.И., Благова Д.К., Кулуев Б.Р., Чемерис А.В.

Использование хитин-связывающего домена изопероксидаз для анализа физиологической роли фермента // V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня 2009 г. С. 24.

12. E. A. Cherepanova, O. I. Kuzmina and I.V. Maksimov. Chitin-specific peroxidases and the plant defence //

Abstract

of FESPB-2008. Physiologia Plantarum 2008. V.133. S12 07.

13. Kuzmina O.I., Blagova D.K., Maksimov I.V. Molecular and genetic organization of «chitin-specific» peroxidases of plants // Abstracts of the 13th annual Symposium for Biology Students of Europe “SymBioSE-Kazan 2009” / Edited by Tatiana V. Baltina.

Kazan: printed Kazan State University. P. 58.

14. Кузьмина О.И., Постригань Б.Н., Кулуев Б.Р., Максимов И.В. Создание генно инженерной конструкции с фрагментом гена анионной пероксидазы пшеницы для анализа биологической роли фермента // Материалы Всероссийской конференции «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем», посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. Акмуллы, Уфа, 2009. C.143-148.

15. Кузьмина О.И. Структурно-функциональное разнообразие хитин связывающих доменов растительных пероксидаз и их практическое применение // Материалы доклада XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - М.: МАКС Пресс, 2010. – С. 203-204.

16. Кузьмина О.И., Постригань Б.Н., Максимов И.В. Получение химерного белка GUS, содержащего хитин-связывающий домен анионной пероксидазы пшеницы // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Н. Новгород: ННГУ, 2010. – С. 271-274.

17. Kuzmina O., Maksimov I. Studying of the «chitin-specific» domain of plant peroxidases // Abstracts of XVII Congress of the Federation of European of Plant Biology (FESPB). – Valencia, Spain, 2010. – P. 145.

18. Kuzmina O., Maksimov I., Cherepanova E. Molecular peculiarities of the chitin binding peroxidases of plants // Proceedings of the «Oxidative enzymes as sustainable industrial biocatalysts». – Santiago de Compostela, Spain, 2010. – P.109-114.

Список сокращений:

a.п. – аминокислотная последовательность;

н.п. – нуклеотидная последовательность;

АФК – активные формы кислорода;

изоПО – изопероксидаза;

ИЭФ – изоэлектрофокусирование;

ПО – пероксидаза;

м.м. - молекулярная масса;

pI – изоэлектрическая точка.

Подписано в печать 19.11.10 г. Формат 60х84 1/16.

Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 443.

Гарнитура «TimesNewRoman». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО.

Объем 1,1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.