авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Выявление и филогенетический анализ генов, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы формы i, у бактерий различных таксономических групп

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

на правах рукописи

СПИРИДОНОВА ЕЛИЗАВЕТА МИХАЙЛОВНА Выявление и филогенетический анализ генов, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы формы I, у бактерий различных таксономических групп 03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2006 г.

Работа выполнена на базе ЦКП Центра «Биоинженерия» РАН Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Ивановский Р.Н.

Научный консультант кандидат биологических наук Турова Т.П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Бонч-Осмоловская Е. А.

доктор биологических наук Кочиева Е. З.

Научно-исследовательский институт Ведущая организация физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Защита состоится 24 октября 2006 года в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан _ сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Первичная продукция органического углерода в биосфере основана на ассимиляции СО2 автотрофными организмами. В процессе эволюции у разных групп автотрофов выработались различные механизмы фиксации СО2, наиболее распространненым из которых является восстановительный рибулозобисфосфатный цикл (цикл Кальвина).

Ключевым ферментом автотрофной фиксации СО2 в цикле Кальвина является рибулозо-1,5 бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РБФК, КФ 4.1.1.39), по структурным и функциональным свойствам разделяемая на четыре формы. Наиболее распространенной является форма I, которая состоит из больших и малых субъединиц, кодируемых, соответственно, генами cbbL и cbbS. В свою очередь, РБФК формы I подразделяют на два типа: так называемые «зеленый» (варианты IA и IB) и «красный» (варианты IC и ID). РБФК формы II, кодируемая геном cbbM, встречается гораздо реже и состоит только из больших субъединиц. Форма III недавно обнаружена у архей, к форме IV относят РБФК-подобные белки. В то время, как структурные и биохимические свойства РБФК обстоятельно исследованы классическими методами, данные о происхождении и эволюции этого фермента чрезвычайно ограничены.

Наиболее эффективные способы исследования происхождения и эволюции РБФК основаны на молекулярно-биологических методах, позволяющих проводить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих этот белок, у различных групп прокариот, принадлежащим к удаленным друг от друга эволюционным ветвям.

Филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей генов, кодирующих РБФК, широко применяется в таксономии растений и водорослей (Clegg, 1993;

Freshwater et al., 1994). Сравнение филогенетических схем (деревьев), построенных на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих РБФК, традиционного анализа генов, кодирующих 16S рРНК, а также, в некоторых случаях, анализа и других структурных генов, позволяет выявить особенности эволюции и функционирования генов, кодирующих РБФК, у различных прокариот.

Несмотря на большую экологическую и практическую значимость процесса фиксации СО2, до настоящего времени остаются малоизученными вопросы, связанные с оценкой биоразнообразия автотрофных бактерий в природных сообществах.

В этой связи разработка методов выявления и филогенетической характеристики генов, кодирующих РБФК у различных прокариот, представляется весьма актуальной.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в разработке универсальной системы олигонуклеотидных праймеров, позволяющей амплифицировать фрагменты генов, кодирующих большую субъединицу РБФК формы I бактерий, и ее применении для анализа разнообразия исследуемых генов у фото- и хемотрофных бактерий, различающихся по экологическим, физиологическим особенностям и таксономическому положению.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Конструирование универсальной системы олигонуклеотидных праймеров, позволяющей амплифицировать фрагменты генов, кодирующих большую субъединицу РБФК формы I, у максимально широкого спектра бактерий.

2. Проверка выбранной системы праймеров на препаратах ДНК, выделенных из бактерий, для которых ранее была продемонстрирована способность к фиксации СО2 через цикл Кальвина и известна первичная структура генов, кодирующих РБФК.

3. Подбор и оптимизация условий ПЦР для амплификации выбранных фрагментов генов, кодирующих РБФК, и применение разработанных системы праймеров и протокола проведения реакции для исследования модельной группы бактерий, использующих восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов. Проведение филогенетического анализа полученных последовательностей.

4. Сопоставление филогенетических деревьев, построенных на основе анализа последовательностей генов, кодирующих РБФК и 16S рРНК.

5. Проверка применимости разработанной системы праймеров для исследования микробных сообществ.

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработана универсальная система праймеров, позволяющая амплифицировать фрагменты генов cbbL у максимально широкого спектра бактерий.

Впервые выявлены и секвенированы гены cbbL фототрофных зеленых несерных бактерий рода Oscillochloris, а также ряда хемотрофных серуокисляющих бактерий, принадлежащих к родам Thiobacillus, Thioalkalivibrio, Thioalkalispira, Thioalkalimicrobium, Thiomicrospira и Thioclava, и проведен их филогенетический анализ.

Предложена схема эволюции генов, кодирующих РБФК, у представителей родов Thioalkalimicrobium и Thiomicrospira.

Предположено существование нового варианта «красного» типа РБФК формы I у бактерий Oscillochloris trichoides и Sulfobacillus acidophilus.

Проведен комплексный анализ разнообразия симбиотического бактериального сообщества, обитающего в жабрах глубоководных двустворчатых моллюсков Bathymodiolus azoricus. Показано, что разработанная система праймеров может использоваться при проведении исследований биоразнообразия автотрофных микроорганизмов в различных природных сообществах. Показано, что результаты анализа функциональных генов позволяют существенно дополнять выводы, получаемые при проведении анализа генов, кодирующих 16S рРНК, и получать более полную информацию о составе прокариотных природных сообществ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 1st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (Badajoz, 2005), XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Всероссийской Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), Всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2005), 11th International Symposium on Microbial Ecology (Vienna, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей, 5 тезисов в сборниках работ российских и зарубежных конференций, 2 статьи приняты в печать.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста и включают 31 рисунок и 5 таблиц. Диссертация состоит из разделов:

«Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы», который содержит 11 отечественных и 189 иностранных наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования являлись 28 штаммов бактерий, использующих восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов, из коллекций кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова и Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Образцы жаберной ткани двустворчатых моллюсков Bathymodiolus azoricus были предоставлены Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Выбор праймеров. Построение консенсусных последовательностей по результатам выравнивания нуклеотидных последовательностей генов cbbL и поиск в них консервативных участков осуществляли с помощью программы Consens (Марусина, неопубликованные данные).

Выделение ДНК. Для выделения ДНК применяли модифицированную методику щелочной экстракции (Birnboim & Doly, 1979) и Wizard-технологии фирмы Promega (США).

ПЦР. Разработанные ранее системы праймеров и протоколы проведения реакции были использованы для амплификации фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК (Lane, 1991) и мембранную метанмонооксигеназу (Holmes et al., 1995).

Амплификацию фрагментов генов cbbL «зеленого» типа проводили с использованием сконструированных праймеров: RubIgF 5`-GAYTTCACCAARGAYGAYGA-3`;

RubIgR 5`-TCRAACTTGATYTCYTTCCA-3`.

Объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав: буфер ДНК полимеразы (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 4 мМ MgCl2);

по 6.25 нмоль каждого из dNTP, 25 нг ДНК-матрицы;

по 7.8 пмоль каждого праймера и 1.5 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия). Температурно-временной профиль ПЦР: первый цикл - 94оС х 3 мин, 58оС х 1 мин, 72оС х 1 мин;

последующие 7 циклов - 94оС х 30 с, 58оС х 20 с, 72оС х с;

последние 28 циклов - 94оС х 30 с, 45оС х 30 с, 72оС х 30 с;

завершающий цикл - 72оС х 7 мин.

Амплификацию фрагментов генов cbbL «красного» типа проводили с использованием сконструированных праймеров: RubIrF 5`-GCVACCTGGACSGTSGTVTGG-3`;

RubIrR 5`-TCGCCYTCSAGCTTGCCSAC-3`;

RubIr892R 5`-TCTTCTGSCGSGTRTAGGTSSMRTGRCC-3`.

Для пары праймеров RubIrF-RubIrR объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав: буфер ДНК полимеразы (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 4 мМ MgCl2);

по 6.25 нмоль каждого из dNTP, 17.5 нг ДНК-матрицы;

по 3.9 пмоль каждого праймера и 1.5 ед. ДНК полимеразы BioTaq. Температурно-временной профиль ПЦР: первый цикл - 94оС х 3 мин, 66оС х 1 мин, 72оС х 1 мин;

последующие 7 циклов - 94оС х 30 с, 66оС х 20 с, 72оС х 45 с;

последние 28 циклов - 94оС х 30 с, 55оС х 30 с, 72оС х 30 с;

завершающий цикл - 72оС х 7 мин. Для пары праймеров RubIrF-RubIr892R объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав: буфер ДНК полимеразы (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 2 мМ MgCl2);

по 6.25 нмоль каждого из dNTP, 17.5 нг ДНК-матрицы;

по 3.9 пмоль каждого праймера и 1 ед. ДНК полимеразы BioTaq.

Температурно-временной профиль ПЦР: первый цикл - 94оС х 3 мин, 60оС х 30 с, 72оС х 30 с;

последующие 35 циклов - 94оС х 30 с, 60оС х 30 с, 72оС х 30 с;

завершающий цикл - 72оС х 7 мин.

Очистка и клонирование ПЦР-фрагментов. Продукты ПЦР очищали с применением набора реактивов «Wizard PCRPreps» (Promega, США). Клонирование выделенных ПЦР фрагментов проводили с использованием набора реактивов «pGEM-T Easy Vector System» (Promega, США) в компетентных клетках Escherichia coli DH5. Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили при помощи набора реактивов Wizard MiniPrep (Promega, США).

Секвенирование ДНК. Секвенирование проводили с использованием набора реактивов «Silver Sequence™ DNA Sequencing System» (Promega, США) согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Клонированные фрагменты исследуемых генов секвенировали с универсальных плазмидных праймеров M13F, M13R26, SP6 и T7 (Sambrook et al., 1989). Секвенирование ПЦР-фрагментов исследуемых генов проводили с использованием соответствующих амплифицирующих и секвенирующих праймеров.

Филогенетический анализ. Первичный сравнительный анализ секвенированных последовательностей проводили с помощью программы NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).

Выравнивание последовательностей осуществляли с помощью программы CLUSTAL W v 1.75 (Thompson et al., 1994). Построение филогенетических деревьев проводили с использованием различных алгоритмов, реализованных в пакетах программ TREECON W (Van de Peer & De Wachter, 1994) и PHYLIP (Felsenstein, 1989). Расчет относительных частот использования кодонов (RSCU) и проведение анализа соответствия осуществляли с помощью пакета программ Codon W (http://www.molbiol.ox.ac.uk/cu). Уровни синонимичных (dS) и несинонимичных (dN) замен рассчитывали при помощи пакета программ PAML (Yang, 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Конструирование системы олигонуклеотидных праймеров. Был проведен компьютерный анализ всех имевшихся в электронных базах данных последовательностей генов cbbL. По результатам анализа степени консервативности различных районов консенсусных последовательностей для генов cbbL «зеленого» и «красного» типов были выбраны несколько участков, на основе которых была сконструирована система праймеров для амплификации фрагментов исследуемых генов длиной приблизительно 800 пар нуклеотидов. В процессе работы разрабатываемая праймерная система подвергалась совершенствованию по мере появления новых последовательностей генов cbbL.

Последовательности разработанных праймеров указаны в разделе «Объекты и методы исследования».

Проверка разработанной системы праймеров проводилась на препаратах ДНК бактерий Acidithiobacillus ferrooxidans TFY и Rhodobacter sphaeroides 2R. У исследуемых штаммов были выявлены фрагменты ожидаемой длины, последовательности которых были в значительной степени гомологичны (90.1-98.9%) генам cbbL штаммов соответствующих видов, ранее депонированным в базу данных GenBank, что свидетельствовало об эффективности разработанной системы праймеров.

С целью уменьшения количества неспецифических продуктов ПЦР и получения нужного фрагмента в повышенной концентрации были подобраны и оптимизированы условия проведения ПЦР для амплификации участков генов cbbL и «зеленого» и «красного» типов по методу Тагучи (Cobb, 1997). Конечные протоколы проведения реакций приведены в разделе «Объекты и методы исследования».

2. Филогенетический анализ генов cbbL у представителей различных таксонов прокариот. Эффективность разработанной нами системы праймеров была проверена на модельной группе бактерий, способных использовать восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов. К ней относятся фото- и хемотрофные, авто- и гетеротрофные микроорганизмы, принадлежащие к различным, не родственным в систематическом отношении, подгруппам. Большинство автотрофных представителей этой группы ассимилируют СО2 через цикл Кальвина. Однако, данные о первичных последовательностях генов, кодирующих РБФК этой группы прокариот, ограничены.

2.1. Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов cbbL у фотолитоавтотрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae. Бактерии семейства Oscillochloridaceae являются единственными представителями филогенетической линии аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий (АНФБ) (Рис. 1а), для которых ранее было показано наличие активности РБФК (Ivanovsky et al., 1999). У трех представителей рода Oscillochloris нами впервые были выявлены и секвенированы фрагменты генов сbbL «красного» типа. Также был проведен анализ последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК.

Несмотря на то, что исследуемые штаммы рода Oscillochloris были выделены из географически отдаленных пресноводных источников, филогенетически они оказались а) б) Рис. 1. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

а) нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления 100 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 95%).

Подчеркнуты последовательности исследованных бактерий.

б) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 аминокислот. Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев на основании bootstrap-анализа.

Последовательности генов cbbL, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

идентичными, согласно результатам анализа последовательностей генов, кодирующих как 16S рРНК, так и РБФК. Это не противоречит ранее полученным данным фенотипического анализа, включая детальное исследование углеродного метаболизма, которые также не выявили заметных различий между этими штаммами (Keppen et al., 2000;

Берг и др., 2005).

Таким образом, на основании всего комплекса данных можно заключить, что все исследованные штаммы являются представителями одного вида Osc. trichoides.

Анализ генов cbbL свидетельствовал об особом положении представителей рода Oscillochloris, которые с высоким уровнем bootstrap-поддержки (97%) образовывали на филогенетическом дереве отдельную ветвь, значительно удаленную от вариантов IC и ID генов cbbL «красного» типа (уровни гомологии аминокислотных последовательностей 73.1 85.3% и 74.0-79.5%, соответственно). В то же время, по данным анализа генов cbbL, единственной близкой к исследуемым АНФБ оказалась грамположительная факультативно хемоавтотрофная бактерия Sulfobacillus acidophilus (уровень гомологии аминокислотных последовательностей 89.2%), которая образовывала с исследуемыми штаммами монофилетический кластер с высоким уровнем bootstrap-поддержки (98%) (Рис. 1б).

Обособленное положение кластера последовательностей сbbL Osc. trichoides/S. acidophilus, возможно, свидетельствует о существовании нового варианта «красного» типа РБФК формы I. Вопрос о том, является ли обнаруженное сходство последовательностей генов сbbL между видами Osc. trichoides и S. acidophilus результатом вертикальной эволюции или же результатом латерального переноса генов, пока остается открытым.

2.2. Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов cbbL у хемолитоавтотрофных бактерий.

2.2.1. р. Thiobacillus. Недавно из низкотемпературных сероводородных источников Хойто-Гол (Восточные Саяны) были выделены штаммы алкалитолерантных облигатно автотрофных серуокисляющих бактерий (СОБ). Согласно результатам анализа генов, кодирующих 16S рРНК, эти изоляты были отнесены к -протеобактериям рода Thiobacillus, в монофилетическом кластере которого они составляли отдельную ветвь (Рис. 2а).

На основании фенотипических и генотипических различий было предложено выделить изолированные штаммы в новый вид Thiobacillus sajanensis (Дульцева и др., 2006).

К этому моменту к роду Thiobacillus относили только три вида: T. thioparus, T. aquaesulis и T. denitrificans.

Все исследованные представители рода Thiobacillus ассимилируют СО2 через цикл Кальвина. Была известна первичная структура генов, кодирующих РБФК, только для одного представителя рода Thiobacillus – T. denitrificans. С помощью разработанной системы праймеров нами были выявлены гены cbbL «зеленого» типа у T. thioparus DSM 505Т, а также у штаммов 4HGT и 1HG ‘T. sajanensis’, при этом оказалось, что последовательности генов cbbL исследованных штаммов ‘T. sajanensis’ были идентичными.

В отличие от дерева, основанного на анализе генов, кодирующих 16S рРНК, последовательности РБФК близкородственных представителей рода Thiobacillus не образуют а) б) Рис. 2. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

а) нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Последовательности исследованных бактерий подчеркнуты;

б) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 аминокислот. Последовательности генов cbbL, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 90%).

монофилетического кластера. Более того, их ближайшими соседями на филогенетическом дереве, основанном на анализе транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL, оказались различные представители - и -протеобактерий: T. denitrificans образует единый кластер с видом -протеобактерий Acidithiobacillus ferrooxidans с высоким уровнем сходства последовательностей (95.5-95.9% гомологии) и bootstrap-поддержки (92%), T. thioparus составляет отдельную ветвь с неустойчивым положением на дереве (уровень bootstrap-поддержки 31%), а ‘T. sajanensis’ образует монофилетический кластер с представителем другого рода -протеобактерий – Thiomonas intermedia – также с высоким уровнем сходства последовательностей (96.2% гомологии) и bootstrap-поддержки (98%) (Рис. 2б).

Таким образом, проведенный нами филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей генов cbbL, в таксономическом плане подтверждал необходимость выделения новых изолятов в отдельный вид ‘T. sajanensis’, а в эволюционном плане свидетельствовал о возможном участии в эволюции генов, кодирующих РБФК у тиобацилл, процессов латерального переноса.

2.2.2. рр. Thioalkalivibrio и Thioalkalispira. В результате интенсивных микробиологических исследований содовых озер была обнаружена и охарактеризована новая группа галоалкалифильных облигатно автотрофных СОБ, основным отличием которых является способность к оптимальному росту в соленых щелочных растворах с рН 9–10.6. Эта группа к настоящему времени включает три рода, относящиеся к -протеобактериям:

Thioalkalimicrobium, Thioalkalivibrio и Thioalkalispira.

Согласно результатам анализа последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК, род Thioalkalivibrio составляет единый филогенетический кластер, разделенный на подгруппы (Sorokin et al., 2001;

2002;

2003;

2004;

Banciu et al., 2004);

Thioalkalispira microaerophila ALEN 1Т не является близким ни к одному из известных таксонов протеобактерий и образует в этом подклассе новую глубокую ветвь (Sorokin et al., 2002) (Рис. 3а).

Хотя для представителей родов Thioalkalivibrio и Thioalkalispira было показано наличие активности РБФК (Sorokin et al., 2000;

2002), до сих пор оставались неизвестными как форма и структура фермента, так и последовательности детерминирующих его генов.

С использованием разработанной нами системы праймеров у типовых штаммов видов родов Thioalkalivibrio и Thioalkalispira были выявлены гены cbbL «зеленого» типа.

В результате анализа генов cbbL не было обнаружено близкого филогенетического родства между единственным видом рода Thioalkalispira и каким-либо видом, принадлежащим к роду Thioalkalivibrio, что подтверждает разделение этих двух типов галоалкалифильных СОБ на два различных рода, проведенное ранее на основании комплекса фенотипических и генотипических данных.

На деревьях, построенных по результатам анализа последовательностей генов cbbL, род Thioalkalivibrio не является монофилетичным, хотя его разделение на независимые кластеры отчасти коррелирует с внутренней филогенетической дивергенцией, выявляемой по результатам анализа генов, кодирующих 16S рРНК (Рис. 3б,в) Из сравнения результатов анализа генов, кодирующих 16S рРНК и РБФК формы I, следует, что наиболее обширная группа видов Tv. versutus, Tv. jannaschii, Tv. nitratis и Tv. thiocyanoxidans (кластер 1) объединяет безусловно родственные организмы, имеющие единое происхождение. Представители этой группы, несмотря на физиолого-биохимические различия, позволяющие разделить их на самостоятельные виды, имеют типичную для данного рода вибрионоподобную форму клеток c полярным жгутиком;

большинство из них способны к росту в гиперсоленых условиях. Слабогалофильные виды Tv. denitrificans и Tv. thiocyanodenitrificans (кластер 3) с палочковидной формой клеток и способностью к денитрификации, относятся к отдельной филогенетической подгруппе, которая согласно результатам анализа последовательностей 16S рРНК, расположена на дереве ближе всего к точке ответвления всего кластера рода Thioalkalivibrio (Рис. 3а). Наибольшая степень генетической дивергенции этих видов относительно других представителей исследуемого рода также подтверждается и низким уровнем ДНК-ДНК гибридизации, не превышающей 20% (Sorokin et al., 2001;

2004). Согласно филогенетическому анализу генов cbbL, эта группа видов также значительно дивергировала от основной группы облигатно аэробных видов, причем межвидовое родство внутри кластера 3 прослеживается только при сравнении на уровне нуклеотидных последовательностей, а на дереве, основанном на анализе аминокислотных последовательностей, этот кластер распался на две независимые ветви.

Филогенетические взаимоотношения видов, входящих в кластер 2 (Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus), особенно интересны. Согласно результатам анализа генов, кодирующих 16S рРНК, они составляют единую филогенетическую группу внутри исследуемого рода.

Общность происхождения и филогенетическая обособленность этой группы видов подтверждаются также их высоким уровнем ДНК-ДНК гибридизации в сравнении с очень низким уровнем гибридизации с ДНК бактерий двух других групп, а также весьма необычной для рода Thiоalkalivibrio морфологией клеток (оба вида имеют крупные, неподвижные, кокковидные клетки с крупными включениями серы) (Sorokin et al., 2002).

Согласно результатам проведенного нами анализа как нуклеотидных, так и аминокислотных последовательностей, гены cbbL этой группы видов также имеют общее происхождение и значительно дивергировали по сравнению с остальными видами исследуемого рода и, кроме того, эти два вида достоверно кластеризуются с пурпурной серной бактерией Allochromatium vinosum, являющейся представителем другого семейства -подкласса протеобактерий - Chromatiaceae. С высокой вероятностью, это свидетельствует об общности происхождения генов cbbL у этих различающихся по филогенетическому положению и физиолого-биохимическим особенностям микроорганизмов. Одним из возможных эволюционных механизмов в данном случае мог быть горизонтальный перенос генов, вклад которого в эволюцию семейства генов, кодирующих РБФК, предполагается весьма значительным (Delwiche & Palmer, 1996). Этот процесс, возможно, осуществлялся на уровне общего предка обоих видов Thiоalkalivibrio и предшественника семейства Chromatiaceae, как а) б) в) Рис. 3. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

а) нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Последовательности исследованных бактерий подчеркнуты;

б) нуклеотидных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 нуклеотидов;

в) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 аминокислот. Последовательности генов cbbL, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

Цифрами показана достоверность ветвления 100 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 70%).

это следует из относительно невысокого сходства последовательностей генов cbbL у этих организмов и Alc. vinosum.

Следует отметить, что оба данных вида Thiоalkalivibrio морфологически очень напоминают Allochromatium и настолько сильно отличаются от других представителей рода Thiоalkalivibrio, что один из них был назван «paradoxus». Данный случай – яркий пример из многих, накопившихся к настоящему времени, когда таксономическое положение бактерии, определяемое только на основе последовательностей 16S рРНК, не совпадает с комплексом других признаков. И хотя обычно преимущество отдается результатам анализа рибосомных генов, такой подход, по всей видимости, не совсем оправдан. В случае с парой Tv. paradoxus/Tv. nitratireducens наиболее естественным решением стало бы их выделение за пределы рода Thiоalkalivibrio в самостоятельный род. В то же время, учитывая удивительное морфологическое сходство двух таких различных типов серозависимых автотрофов, как фототрофные Allochromatium и хемотрофные Thioalkalivibrio, можно предположить, что в процесс переноса генов между этими филогенетически отдаленными бактериями могли вовлекаться не только отдельные гены, такие как кодирующие РБФК, но и целые генетические блоки.

Признание возможности горизонтального переноса в процессе эволюции обширных блоков генетической информации может сильно осложнить создание естественной системы бактерий, из чего вытекает необходимость выработки новых подходов в таксономии.

Использование дополнительных филогенетических данных, особенно касающихся генов, имеющих первостепенное значение для изучаемой группы, может в какой-то мере помочь прояснить сомнительные в эволюционном и таксономическом аспекте случаи.

2.2.3. рр. Thioalkalimicrobium и Thiomicrospira. Род Thiomicrospira включает облигатно хемолитоавтотрофных СОБ, выделенных из соленых, преимущественно морских, мест обитания и принадлежащих к -протеобактериям. Основными особенностями, отличающими род Thiomicrospira от остальных СОБ, являются толерантность к соли и высокие скорости роста (Brinkhoff et al., 2005).

Согласно результатам анализа генов, кодирующих 16S рРНК, род Thiomicrospira является гетерогенным и включает в свой состав по крайней мере две различные группы, кластеризующиеся либо с Tms. pelophila, либо с Tms. crunogena (Brinkhoff et al., 1999;

Takai et al., 2004). Кроме того, род Thiomicrospira является частью более крупной группы близкородственных бактерий, названной нами группа «Thiomicrospira». Эта группа включает в себя галоалкалифильных СОБ рода Thioalkalimicrobium (Sorokin et al., 2001;

2002) и водородокисляющую бактерию рода Hydrogenovibrio (Nishihara et al., 1991), являющихся членами кластеров «Tms. pelophila» и «Tms. crunogena», соответственно (Рис. 4а).

Недавно было показано, что Hydrogenovibrio marinus обладает тремя наборами генов, кодирующих РБФК (два гена cbbL «зеленого» типа и один ген cbbM) (Yoshizawa et al., 2004).

Проведенные нами исследования показали, что Tms. kuenenii и Tms. crunogena также имеют по три набора генов, кодирующих РБФК, тогда как Tms. pelophila, филогенетически обособленная от этой группы видов, имеет два набора генов, соответствующих генам cbbL- а) б) в) Рис. 4. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

а) нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Последовательности исследованных бактерий подчеркнуты;

б) нуклеотидных последовательностей генов cbbL;

в) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 нуклеотидов/аминокислот. Последовательности генов cbbL, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (в скобках указаны значения для алгоритма maximum-parsimony).

и cbbM H. marinus. Представители рода Thioalkalimicrobium обладают только одним геном cbbL, соответствующим гену cbbL-2 H. marinus (Рис. 4б,в;

5).

Как на нуклеотидном, так и на аминокислотном деревьях, последовательности cbbL- Tms. crunogena и Tms. kuenenii, а также последовательности cbbL Tms. pelophila и трех видов рода Thioalkalimicrobium формировали единый кластер с высоким уровнем bootstrap поддержки (100% и 97% для нуклеотидов и аминокислот, соответственно) с последовательностью cbbL-2 H. marinus. Последовательности cbbL-1 Tms. crunogena и Tms. kuenenii также формировали единый кластер с высоким уровнем bootstrap-поддержки (100% и для нуклеотидов, и для аминокислот) с последовательностью cbbL-1 H. marinus.

Однако для группы «Thiomicrospira» в целом видно, что филогенетические деревья, построенные на основании сравнения нуклеотидных и аминокислотных последовательностей РБФК, отличаются по топологии и длине ветвей (Рис. 4б,в). На нуклеотидном дереве последовательности cbbL-1 и cbbL-2 группы «Thiomicrospira» формировали единую группу (с уровнем bootstrap-поддержки 87%), кластеризуясь с геном rbcL цианобактерии Prochlorococcus marinus (с уровнем bootstrap-поддержки 84%), с большой длиной ветви. Ближайшим соседом этого кластера является основной кластер генов rbcL цианобактерий Prochlorothrix hollandica, Synechococcus sp. PCC 6301, Synechococcus sp.

PCC 7002 и Anabaena sp. PCC 7120 (уровень bootstrap-поддержки 92%). На аминокислотном дереве последовательности cbbL-1 и cbbL-2 группы «Thiomicrospira» формировали два отдельных кластера с неопределенным положением точек ответвления, в то время как P. marinus кластеризовался с Synechococcus sp. WH7803 (с высоким уровнем bootstrap поддержки 99%) с почти равными длинами ветвей. Сходства группы «Thiomicrospira» и основного кластера цианобактерий на аминокислотном дереве не наблюдалось.

Результаты филогенетического анализа последовательностей генов cbbL для группы «Thiomicrospira» коррелируют с кластеризацией группы, получаемой в результате проведения анализа последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК (Рис. 4а-в). На дереве генов 16S рРНК Tms. pelophila образует кластер с видами рода Thioalkalimicrobium (кластер «Tms. pelophila»), в то время как Tms. crunogena и Tms. kuenenii образуют другой кластер с H. marinus (кластер «Tms. crunogena»). Однако, близкое родство генов cbbL этой группы генам rbcL цианобактерий противоречит филогенетическим взаимоотношениям, вытекающим из анализа генов, кодирующих 16S рРНК, согласно которому группа «Thiomicrospira» относится к -протеобактериям.

На нуклеотидном дереве гены cbbM видов рода Thiomicrospira и H. marinus образуют единый кластер (уровень bootstrap-поддержки 100%). Этот кластер попадает в точку ветвления, разделяющую тиоавтотрофных - и -протеобактерий, принадлежащих к родам Thiobacillus, Acidithiobacillus, Halothiobacillus и Thiomonas. На аминокислотном дереве только Tms. pelophila и Tms. crunogena остаются в тиоавтотрофном cbbM кластере, в то время как Tms. kuenenii и H. marinus с практически идентичными (98.1%) аминокислотными последовательностями формируют отдельную ветвь с неопределенной позицией точки ветвления (Рис. 5а,б) (Tourova et al., 2006).

Рис. 5. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

a) нуклеотидных последовательностей генов cbbM;

б) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbM.

Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые нуклеотидов/аминокислот. Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (в скобках указаны значения для алгоритма maximum parsimony). Последовательности исследованных бактерий подчеркнуты.

По результатам проведенного нами анализа частот использования кодонов генов cbbL, наиболее близким к группе «Thiomicrospira» оказался штамм Anabaena sp. PCC 7120.

Филогенетический анализ группы «Thiomicrospira» выявил неплохую корреляцию между данными, полученными на основании анализа последовательностей генов, кодирующих как 16S рРНК, так и РБФК. Прежде всего, анализ генов, кодирующих РБФК, свидетельствует о монофилетичности группы (включая ранее исследованный род Hydrogenovibrio), что следует из высокого уровня кластеризации этих генов на нуклеотидном дереве. Выделение в отдельную ветвь генов cbbL-1 кластера «Tms. crunogena» и генов cbbM пары Tms. kuenenii-H. marinus на аминокислотном дереве может быть объяснено повышенной частотой несинонимичных замен в генах, кодирующих РБФК этих организмов.

Разделение группы «Thiomicrospira» на два кластера, основанное на результатах анализа генов, кодирующих 16S рРНК, коррелирует с результатами анализа генов cbbL. В частности, гены cbbL-1 были обнаружены только в кластере «Tms. crunogena», а топологии деревьев, построенных на основании сравнения последовательностей cbbL-2 и 16S рРНК, весьма сходны между собой.

Но, в то же время, внутреннее разделение группы на основании анализа генов cbbM недостаточно ясно, что может являться результатом специфичного пути эволюции этой формы РБФК и иного давления естественного отбора на форму II фермента для различных видов группы, в зависимости от занимаемых ими экологических ниш. Можно предположить, что сравнение последовательностей генов cbbM позволяет проследить только отдаленно родственные связи внутри всей группы «Thiomicrospira», но не более современную дивергенцию группы на два филогенетических кластера.

На основании ранее проведенного исследования трех оперонов генов, кодирующих две формы РБФК у H. marinus, его авторами (Yoshizawa et al., 2004) был предложен следующий сценарий их возникновения: предковая форма H. marinus, обладающая кластером генов cbbM, получила гены cbbL-2 путем латерального переноса. Затем произошла дупликация генов cbbL-2. Последующая реорганизация их с генами кластера cbbM привела к образованию кластера генов cbbL-1.

Результаты проведенного нами исследования позволяют расширить эту гипотезу, предложив схему эволюции генов, кодирующих РБФК, для группы «Thiomicrospira» в целом. Сходство последовательностей генов cbbL-2 и cbbL-1 и их практически идентичные ГЦ-состав и частоты использования кодонов у всех исследованных представителей группы «Thiomicrospira» подтверждают предположение о дупликации, произошедшей в геноме предковой формы кластера «Tms. crunogena», от которой и произошли Tms. crunogena, Tms. kuenenii и H. marinus. Кроме того, принимая во внимание эволюционные расстояния и частоты использования кодонов, можно предположить, что наиболее вероятными донорами набора генов cbbL-2 для предковой формы группы «Thiomicrospira» являлись цианобактерии (Рис.6).

Рис. 6. Гипотетическая схема эволюции группы «Thiomicrospira».

Также, на основании полученных данных можно предположить два пути дальнейшей эволюции кластера «Tms. pelophila». Либо в геноме предковой формы этого кластера не произошла дупликация гена cbbL-2, либо дупликация все же произошла, но ген cbbL-1 был утерян в процессе последующей эволюции группы. У представителей рода Thioalkalimicrobium также произошла потеря генов cbbM (Рис. 6).

Полученные в нашей работе результаты расширяют круг микроорганизмов, обладающих множественным набором генов cbbL. Причинами возникновения мультикопийности считаются латеральный перенос генов или дупликация генов (с возможной избирательной потерей одной из копий в процессе эволюции). Такого рода потеря могла быть результатом эволюционного отбора оптимальной формы РБФК.

Поскольку РБФК формы I может избирательно ассимилировать СО2, несмотря на присутствие кислорода, и является, таким образом, наиболее приспособленной к современным атмосферным условиям, присутствие дополнительных генов cbbM или cbbL не является обязательным. Поэтому вполне вероятна их инактивация и последующая потеря в зависимости от условий существования организмов.

Возможно, что потеря генов cbbL-1 и cbbM у представителей рода Thioalkalimicrobium (облигатных алкалифилов, выделенных из содовых озер) и cbbL-1 Tms. pelophila (алкалитолерантной бактерии) произошла как раз в связи с адаптацией к занимаемой экологической нише, а именно к низкой концентрации CO2 при рН выше 8.

Однако, в некоторых эконишах наличие нескольких форм фермента с отличающимися каталитическими свойствами обеспечивает бактериям определенные экологические преимущества и гибкость. Подтверждением этому может служить тот факт, что Tms. crunogena, которая обладает тремя наборами генов, кодирующими РБФК, является наиболее быстрорастущим мезофильным хемолитоавтотрофом (Jannasch et al., 1985).

Результаты как анализа генов, кодирующих 16S рРНК, так и проведенного нами анализа генов, кодирующих РБФК, свидетельствуют в пользу необходимости таксономической ревизии этой группы;

более конкретно – разделения ее на четыре рода внутри нового монофилетического семейства Роды «Thiomicrospiraceae».

Thioalkalimicrobium и Hydrogenovibrio достаточно отделены от рода Thiomicrospira физиологически и генетически, чтобы сохранить за ними исходный родовой статус. Род Thiomicrospira предлагается разделить на два рода, основанных на кластерах «Tms. crunogena» и «Tms. pelophila».

2.2.4. р. Thioclava. Облигатно аэробная факультативно автотрофная СОБ Thioclava pacifica TL2Т была выделена из прибрежных морских гидротерм. Согласно результатам анализа генов, кодирующих 16S рРНК, Tc. pacifica формирует на филогенетическом дереве отдельную ветвь, расположенную между пурпурными несерными бактериями родов Rhodobacter и Rhodovulum (Рис. 7а) с неустойчивым положением точки ответвления (уровень bootstrap-поддержки менее 24%). Уровни сходства гена, кодирующего 16S рРНК у Tc. pacifica, с аналогичными генами различных видов родов Rhodobacter и Rhodovulum были почти одинаковыми (92.4 – 95% гомологии) (Sorokin et al., 2005).

Поскольку для Tc. pacifica было показано наличие активности РБФК (Sorokin et al., 2005), для уточнения филогенетического положения нового организма в кластере Rhodobacter- Rhodovulum нами был проведен дополнительный филогенетический анализ генов, кодирующих РБФК. Ввиду отсутствия в базе данных GenBank последовательностей а) б) Рис. 7. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

а) нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Последовательности исследованных бактерий подчеркнуты;

б) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 аминокислот. Последовательности генов cbbL, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 80%).

РБФК каких-либо видов рода Rhodovulum, необходимых для проведения корректного сравнения, объектами исследования также стали типовые штаммы видов Rdv. adriaticum, Rdv. euryhalinum и Rdv. sulfidophilum. У всех исследованных штаммов были выявлены гены cbbL «зеленого» типа Из результатов филогенетического анализа транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL следует, что Tc. pacifica входит в кластер, также включающий -протеобактерии родов Rhodobacter и Rhodovulum и -протеобактерию Hydrogenophilus thermoluteolus (уровень bootstrap-поддержки 100%), но, тем не менее, образует на филогенетическом дереве обособленную ветвь (уровень bootstrap-поддержки 98%), только отдаленно родственную подкластеру Rhodobacter-Rhodovulum-Hydrogenophilus (Рис. 7б).

Таким образом, проведенный нами дополнительный филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей генов cbbL, подтвердил обособленное положение Tc. pacifica среди фототрофных бактерий кластера Rhodobacter-Rhodovulum и правомочность выделения исследуемого организма в новый род.

3. Исследование разнообразия эндосимбиотического сообщества моллюска Bathymodiolus azoricus. Для проверки эффективности разработанной нами системы праймеров при выявлении генов cbbL в молекулярно-экологических исследованиях, в качестве модельной экосистемы было выбрано симбиотическое бактериальное сообщество, обитающее в жабрах глубоководных двустворчатых моллюсков Bathymodiolus azoricus. Это сообщество было ранее исследовано цитологическими и физиолого-биохимическими методами, и было показано, что оно состоит всего из двух компонентов: тиоавтотрофного и метанотрофного (Пименов и др., 2002).

Нами были проведены амплификация, клонирование и секвенирование фрагментов генов cbbL «зеленого» типа из суммарной ДНК, выделенной из жаберной ткани B. azoricus.

Были выявлены два сиквенс-типа генов cbbL, которые, по результатам анализа сходства последовательностей, входили в кластер некультивируемых симбиотических и свободноживущих бактерий из морских гидротерм, которому принадлежал также и ранее изученный эндосимбионт Bathymodiolus sp. (номер доступа в GenBank AB038634) (Рис. 8).

Таким образом, выявление генов cbbL в сложной смеси, содержащей эукариотическую и прокариотические ДНК, свидетельствует об эффективности разработанной нами системы праймеров и показывает, что предлагаемая методика может служить основой для проведения исследования биоразнообразия автотрофных микроорганизмов в различных природных сообществах.

Применение системы праймеров, специфичной для генов, кодирующих 16S рРНК, выявило наличие в исследуемом сообществе только одного сиквенс-типа (Рис. 9а). Этот сиквенс-тип принадлежал кластеру -протеобактерий, содержащему всех ранее изученных тиоавтотрофных симбионтов Bathymodiolus.

Рис.8. Положение эндосимбионтов B. azoricus на филогенетическом дереве, построенном с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее заменам на каждые 100 аминокислот. Цифрами показана достоверность ветвления альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 80%). Последовательности генов cbbL, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

Поскольку с помощью анализа 16S рДНК сообщества метанотрофный компонент обнаружен не был, его выявление проводили с применением системы праймеров, специфичной для генов, детерминирующих метанотрофию. В результате было показано наличие гена pmoA, кодирующего мембранную метанмонооксигеназу. Анализ сходства последовательностей генов pmoA указывает на принадлежность метанотрофного эндосимбионта B. azoricus к метанотрофам типа I (Рис. 9б).

Таким образом, результаты проведенного нами комплексного анализа генов подтверждают данные, полученные цитологическими и физиолого-биохимическими методами, о наличии тиоавтотрофного и метанотрофного компонентов в составе симбиотического бактериального сообщества B. azoricus и показывают, что результаты анализа функциональных генов существенно дополняют выводы, получаемые при проведении стандартного анализа генов, кодирующих 16S рРНК.

а) б) Рис. 9. Положение эндосимбионтов B. azoricus на филогенетическом дереве, построенном с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

а) нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК.

б) транслированных аминокислотных последовательностей генов pmoA.

Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов/аминокислот.

Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 95%).

Последовательности генов, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

ВЫВОДЫ 1. Разработана универсальная система олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагментов генов, кодирующих большую субъединицу РБФК формы I, у бактерий различных таксономических групп;

подобраны и оптимизированы условия полимеразной цепной реакции.

2. С помощью предложенной методики определена первичная структура и проведен филогенетический анализ фрагментов 32 генов, кодирующих РБФК формы I, у широкого круга серозависимых автотрофных бактерий.

3. Использование генов, кодирующих РБФК формы I, в качестве молекулярных маркеров позволило:

а) выявить особенности эволюции различных групп автотрофов, как это было показано на примере рр. Oscillochloris, Thiobacillus, Thioalkalivibrio;

б) предложить схему эволюции генов, кодирующих РБФК, и подтвердить необходимость таксономической реорганизации группы «Thiomicrospira»;

в) способствовать описанию новых таксонов автотрофов (рр. Thiobacillus, Thioclava, Thioalkalispira);

г) предположить существование нового варианта «красного» типа РБФК формы I у бактерий Oscillochloris trichoides и Sulfobacillus acidophilus.

4. На примере симбиотического бактериального сообщества, обитающего в жабрах глубоководных двустворчатых моллюсков рода Bathymodiolus:

а) показана эффективность разработанной системы праймеров при выявлении генов, кодирующих РБФК формы I, в молекулярно-экологических исследованиях;

б) показано, что результаты анализа функциональных генов могут существенно дополнить выводы, получаемые при проведении стандартного анализа генов, кодирующих 16S рРНК, и дать более полное представление о составе микробных сообществ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Спиридонова Е.М., Берг И.А., Колганова Т.В., Ивановский Р.Н., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П.

Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов рибулозо-1,5 бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у бактерий различных таксономических групп.

Микробиология, 2004, т.73, №3, с.377- 2. Турова Т.П., Спиридонова Е.М., Берг И.А., Кузнецов Б.Б., Сорокин Д.Ю. Филогения генов рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у облигатно автотрофных галоалкалофильных сероокисляющих бактерий рода Thioalkalivibrio. Микробиология, 2005, т.74, №3, с.378- 3. Sorokin, D.Yu., Tourova, T.P., Spiridonova, Е.M., Rainey, F.A., Muyzer, G. Thioclava pacifica gen. nov., sp. nov., a novel facultatively autotrophic, marine, sulfur-oxidizing bacterium from a near shore sulfidic hydrothermal area. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, v. 55, № 3, p. 1069- 4. Турова Т.П., Спиридонова Е.М., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кеппен О.И., Кузнецов Б.Б., Ивановский Р.Н. Филогения аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae на основании сравнительного анализа генов rrs, cbbL и nifH. Микробиология, 2006, т.75, №2, с.235– 5. Tourova T.P., Spiridonova E.M., Berg I.A., Kuznetsov B.B., Sorokin D.Yu. Occurrence, phylogeny and evolution of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase genes in obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria of the genera Thiomicrospira and Thioalkalimicrobium.

Microbiology, 2006, v. 152, №7, p. 2159- 6. Дульцева Н.М., Турова Т.П., Спиридонова Е.М., Колганова Т.В., Осипов Г.А., Горленко В.М. Thiobacillus sajanensis sp.nov.–новая облигатно автотрофная сероокисляющая бактерия, выделенная из сероводородных источников Хойто-Гол, Бурятия. Микробиология, 2006, т.75, №5, с.670-681.

7. Спиридонова Е.М., Кузнецов Б.Б., Пименов Н.В., Турова Т.П. Определение филогенетического разнообразия эндосимбионтов моллюска на Bathymodiolus azoricus основании анализа генов 16S рРНК, cbbL и pmoA. Микробиология, 2006. В печати.

8. Sorokin D. Yu., Tourova T.P., Kolganova T. V., Spiridonova E. M., Berg I. A., Muyzer G.

Thiomicrospira halophila sp. nov., a novel, moderately halophilic, obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacterium from hypersaline lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006. In press.

9. Spiridonova E.M., Kuznetsov B.B., Tourova T.P. Phylogenetic characterization of endosymbionts in hydrothermal vent mussel Bathymodiolus azoricus. 1st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz, Spain, March 15-18th 2005.

Book of Abstracts, p.182.

10. Спиридонова Е.М. Усовершенствование системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов РуБисКО у бактерий различных таксономических групп. XII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», Москва, Россия, 12-15 апреля 2005 г. Тезисы докладов, с.203.

11. Спиридонова Е.М., Берг И.А., Турова Т.П. Сравнительный анализ генов, кодирующих РуБисКО, у представителей рода Всероссийская Молодежная школа Thiomicrospira.

конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, Россия, 1-3 ноября 2005 г. Тезисы докладов, с. 12. Спиридонова Е.М., Турова Т.П., Кеппен О.И., Ивановский Р.Н. Филогенетический анализ бактерий рода Oscillochloris на основе сравнения последовательностей генов, кодирующих РуБисКО. Всероссийский симпозиум «Автотрофные микроорганизмы», Москва, Россия, 21 – декабря 2005 г. Материалы симпозиума, с. 69.

13. Spiridonova E. M., Berg I. A., Tourova T. P., Kuznetsov B. B., Sorokin D. Yu. Extended phylogenetic analysis of a first truly halophilic representative of the genus Thiomicrospira. 11th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-11), Vienna, Austria, August 20-25 2006. Book of Abstracts, p. 30.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.