авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Роль водной компоненты и полисахаридов клеточной поверхности в процессах коммуникации живых систем: анализ молекулярных моделей

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

РОГАЧЕВА СВЕТЛАНА МИХАЙЛОВНА РОЛЬ ВОДНОЙ КОМПОНЕНТЫ И ПОЛИСАХАРИДОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В ПРОЦЕССАХ КОММУНИКАЦИИ ЖИВЫХ СИСТЕМ:

АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МОДЕЛЕЙ 03.00.02 – биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Воронеж – 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет» и ГОУ ВПО «Саратовский военный институт биологической и химической безопасности»

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Кузнецов Павел Евгеньевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ковалева Тамара Андреевна доктор биологических наук Антонюк Людмила Петровна доктор химических наук, профессор Панкратов Алексей Николаевич

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт биофизики клетки РАН

Защита состоится "24" октября 2008 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» по адресу: 394006, Россия, г. Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет» Автореферат разослан "———" —————————— 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Грабович М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Коммуникация живых систем происходит с участием разнообразных химических соединений и различного рода излучений.

Во всех этих взаимодействиях восприятие физико-химического сигнала осуществляется на клеточном уровне, и основополагающую роль в них играют клеточные поверхности.

Особый интерес вызывают эффекты и механизмы действия биологически активных веществ (БАВ) в «сверхмалых дозах» (СМД). В малых и сверхмалых концентрациях (10-20-10-13 моль/л) проявляют свою активность многие природные хемомедиаторы - токсины и противоядия, вещества, предупреждающие об опасности, феромоны, криопротекторы, фитогормоны и другие (Чибисова, 1998). Описан парадоксальный характер действия низких концентраций токсичных веществ и лекарственных препаратов, который заключается, в частности, в бимодальной или полимодальной зависимости «доза эффект» (Бурлакова и др. (обзор), 2004). Отмечается (Бурлакова, 2002), что последствия от воздействия СМД ксенобиотиков могут быть не менее серьезными, чем последствия от высоких разовых доз: под их влиянием могут меняться существующие связи, давать сбой некоторые системы адаптации, поскольку организм способен приспосабливаться лишь к эффектам, лежащим в обычном диапазоне проявлений воздействия. Установлена также высокая чувствительность биологических объектов к нетепловому электромагнитному излучению (ЭМИ) крайне высоких частот (КВЧ), предполагается, что оно выполняет информационную функцию в живых системах (Бецкий и др., 2004).

Исследования в области слабых воздействий находятся на стадии накопления экспериментальных данных. Гипотезы, объясняющие их механизмы, немногочисленны и противоречивы. Решение данной проблемы позволит уточнить пределы токсичности ксенобиотиков, приведет к пересмотру доз лекарственных веществ и открытию новых направлений их использования, к переосмыслению многих принципов в биологии, экологии и медицине.

Известно, что основные закономерности эффектов СМД не связаны со структурой вещества или уровнем биологической организации мишени (Бурлакова и др., 2003, 2004). Ряд исследователей полагают, что в основе механизма их парадоксального действия лежит изменение структурных свойств воды. Следует отметить, что водная компонента биосистем признана первичной мишенью действия ЭМИ КВЧ малой интенсивности (Синицын и др., 1998).

Поскольку свойства воды значительно различаются в объёме жидкости и вблизи поверхности раздела фаз, мы предположили, что химические вещества и ЭМИ изменяют структуру сетки водородных связей воды у клеточной поверхности, этот процесс является первой стадией в последовательности биохимических превращений в клетке и организме в целом.

Актуальной задачей при изучении роли водной компоненты биосистем в формировании отклика на низкоинтенсивное воздействие является разработка адекватных моделей клеточной поверхности. Они могут найти практическое применение: для прогноза биологического действия химических соединений и физических факторов, при поиске веществ и средств, повышающих адаптационные возможности организма, при разработке тест-систем для определения низких концентраций физиологически активных и токсичных веществ.

Важным и новым аспектом использования экспериментального и компьютерного моделирования клеточной поверхности является изучение или уточнение механизмов межклеточных контактов, в частности малоизученных полисахарид-полисахаридных взаимодействий, которые могут иметь место в симбиотических процессах, например, при агрегации бактерий и адсорбции на поверхности корней растений.

Цель диссертационной работы: развитие методологии моделирования клеточных поверхностей для исследования молекулярных механизмов физико химической коммуникации живых систем.

Для достижения указанной цели нами были поставлены и решены следующие задачи:

1. Разработать модельные системы, имитирующие поверхностные свойства мембран и белков и позволяющие фиксировать изменение структуры и динамики приповерхностной воды.

2. Изучить концентрационные эффекты воздействия биологически активных веществ (индолил-3-уксусной кислоты, никотина, метронидазола) на биологические и модельные системы.

3. Исследовать влияние биологически активных веществ на состояние объемной и приповерхностной воды. Провести молекулярное моделирование динамики сетки водородных связей воды в их присутствии.

4. На основе биоподобных моделей сконструировать тест-системы для определения низких концентраций биологически активных веществ.

5. Исследовать изолированные и комбинированные эффекты воздействия электромагнитного излучения крайне высоких частот низкой интенсивности и биологически активных веществ на модельные биообъекты.

6. Создать модели клеточной поверхности бактерий Azospirillum brasilense Sp245 на основе липосом и изучить роль липополисахарида наружной бактериальной мембраны в процессах образования микробных ассоциатов и адсорбции клеток на корнях пшеницы.

7. Осуществить компьютерное моделирование пространственной структуры О-специфического полисахарида внешней мембраны Azospirillum brasilense Sp245 и полисахарид-полисахаридного взаимодействия.

8. Разработать биоподобные наносистемы для целевой доставки химических соединений к корням растений.

Научная новизна работы:

В результате проведенных исследований получило развитие перспективное научное направление моделирования клеточной поверхности для исследования механизмов физико-химической коммуникации живых систем. Впервые разработана методология выбора и создания моделей для исследования участия воды у поверхности мембран и белков при воздействии на биосистемы БАВ в низких концентрациях и ЭМИ нетепловой интенсивности. В основу данной методологии положены следующие принципы: отсутствие сродства модельной системы к БАВ;

высокая чувствительность к изменению структуры и подвижности воды;

возможность регистрации отклика системы на указанное изменение;

комплексное применение моделей, соответствующих различным уровням организации биосистем. Исследовано дозо-зависимое воздействие фитогормона гетероауксина, алкалоида никотина и антимикробного препарата метронидазола на биологические и модельные системы, обнаружены немонотонный характер действия и эффекты низких концентраций ИУК (10-17 10-9 моль/л), никотина (10-12 - 10-9 моль/л) и цитопротекторное действие метронидазола (10-10 - 10-2 моль/л). Благодаря сочетанию экспериментального и компьютерного моделирования определено, что в основе указанных эффектов лежит неодинаковое воздействие БАВ на структуру воды у поверхности биологических объектов. В качестве наиболее вероятного молекулярного механизма действия низких концентраций БАВ предложен фазовый -переход типа порядок-беспорядок, связанный с перестройкой сетки водородных связей воды, который индуцируется молекулами вещества в водном микроокружении.

Установлено, что эффекты комбинированного воздействия ЭМИ КВЧ на резонансных частотах и БАВ в низких концентрациях зависят от характера воздействия вещества на структуру водной компоненты. Разработаны модели бактериальной поверхности, представляющие собой липосомы, инкрустированные липополисахаридами (ЛПС) внешней мембраны клеток А.

brasilense Sp245. Они впервые использованы для изучения полисахарид полисахаридных взаимодействий в межклеточных контактах в системах бактерии-бактерии, бактерии-злаки. Методами молекулярной динамики установлены термодинамически равновесные конформации О-специфического полисахарида (О-ПС) ЛПС А. brasilense Sp245 в водной фазе и доказано, что две цепи полисахаридов только при антипараллельной ориентации взаимодействуют друг с другом с образованием структуры типа двойной спирали за счет межмолекулярных водородных связей. Сочетание экспериментального и компьютерного моделирования позволило доказать участие О-ПС ЛПС бактериальной поверхности в симбиотических взаимодействиях бактерий и предположить молекулярный механизм этих взаимодействий.

Научно-практическая значимость работы:

Разработаны методические подходы к конструированию биоподобных систем, чувствительных к изменению динамики приповерхностной воды.

Впервые показана возможность создания сенсорных систем на этой основе для определения низких концентраций БАВ в водных средах. Оформлено 2 заявки на изобретение по способам определения ИУК (№ 2007140953, приоритет от 02.11.2007;

№ 2007142881, приоритет от 19.11.2007). Обнаружено цитопротекторное действие метронидазола в отношении ЭМИ и детергента.

Предложено использовать разработанные модельные системы для поиска клеточных протекторов нового поколения. Осуществлен прогноз характера воздействия химических веществ на структурные характеристики воды с помощью методов молекулярного моделирования;

в качестве структурных характеристик использованы парные корреляционные функции радиального распределения, среднее время жизни и среднее количество водородных связей, распределение молекул воды по кластерам различного размера. Отмечена корреляция результатов экспериментального и компьютерного моделирования.

Обнаружены новые биологически эффективные частоты в КВЧ диапазоне ЭМИ, показано, что данное излучение способно компенсировать негативное влияние токсичных веществ на живые системы. Впервые показана возможность применения биоподобных наносистем для проведения фундаментальных исследований симбиотических процессов взаимодействия бактерий и растений и для направленного транспорта химических веществ к корням растений. В модельных экспериментах показана высокая эффективность доставки химического соединения к корням пшеницы с помощью наночастиц диоксида кремния, обогащенных растительными полисахаридами, и липосом, инкрустированных ЛПС внешней бактериальной мембраны А. brasilense Sp245.

Оформлена заявка на изобретение систем транспорта химических веществ к корням пшеницы (заявка № 2007145119, приоритет от 06.12.2007), применение которых позволит уменьшить антропогенную нагрузку на сельскохозяйственные угодья и окружающую среду.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Развитие методологии моделирования клеточной поверхности способствует установлению и уточнению молекулярных механизмов физико химической коммуникации живых систем.

2. Предложенные модели для изучения роли приповерхностной воды во взаимодействиях живых систем с биологически активными веществами в низких концентрациях и ЭМИ КВЧ нетепловой интенсивности соответствуют различным уровням организации биосистем, не обладают сродством к БАВ и проявляют высокую чувствительность к структурным изменениям водной компоненты.

3. БАВ в низких концентрациях оказывают различное воздействие на структуру воды у поверхности биологических объектов: структурирующее, деструктурирующее, разнонаправленное в зависимости от концентрации.

4. Прогноз характера воздействия БАВ на структуру приповерхностной воды проводится по совокупности определенных с помощью методов молекулярного моделирования структурных характеристик воды (парных корреляционных функций радиального распределения, среднему времени жизни и среднему количеству водородных связей, распределению молекул воды по кластерам различного размера) в присутствии молекулы вещества.

5. Биоподобные структуры, чувствительные к изменению диффузионной подвижности приповерхностной воды, используются в сенсорных системах для определения БАВ в низких концентрациях.

6. Модельные системы применяются для выявления биологически эффективных частот в КВЧ-диапазоне ЭМИ низкой интенсивности и исследования комбинированных эффектов воздействия ЭМИ и БАВ на биосистемы.

7. Молекулярное моделирование бактериальной поверхности позволяет изучать полисахарид-полисахаридные взаимодействия в симбиотических процессах агрегации бактерий и адсорбции на поверхности корней растений.

8. Разработанные наносистемы с углеводными детерминантами являются эффективными средствами для направленного транспорта химических веществ к корням растений.

Апробация работы:

Основные результаты исследований докладывались на российских и международных конференциях: III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002);

I и II Российских школах конференциях «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» (Саратов, 2002, 2004 гг.);

1, 2, 3 Всероссийских конференциях «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2003, 2005, 2007 гг.);

Saratov Fall Meeting - Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine, (Саратов, 2003-2006 гг.);

Международном симпозиуме “Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants” (Саратов, 2003 г.), HUPO 2nd Annual & IUBMB XIX World Congress (Montreal, Canada, 2003);

41-st Congress of the European Societies of Toxicology “Eurotox-2003” (Florence, Italy, 2003);

10th International Congress of Toxicology (Tampere, Finland, 2004);

Всероссийский симпозиум "Тест-методы химического анализа" (Саратов, 2004 г.);

Gordon Research Conference “Macromolecular Organization & Cell Function” (Oxford, Great Britain, 2004);

42nd Congress of the European Societies of Toxicology “Eurotox-2005” (Cracow, Poland, 2005);

10 и Пущинских конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2006, 2007 гг.);

Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2006 г.);

III Научно-практическая конференции «Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия» (Москва, 2006 г.);

VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва 2006 г.);

EUROTOX 2006/6 CTDC Congress, (Dubrovnik, Croatia, 2006);

IV Международной научно-практической конференции «Экология речных бассейнов» (Владимир, 2007 г.);

VII Международной крымской конференции «Космос и биосфера» (Судак, Крым, Украина, 2007 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 57 работ.

Декларация личного участия автора. Автор лично выбрал и теоретически обосновал тематику исследований, участвовал в экспериментальных исследованиях. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад автора составил 60-80 %.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 287 страницах машинописного текста, включает 90 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и приложения;

список используемых источников включает 422 работы отечественных и зарубежных авторов.

Настоящая работа представляет собой часть плановых научно исследовательских работ Саратовского государственного технического университета, Саратовского военного института биологической и химической безопасности. Исследования проводились также в сотрудничестве с Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (НИР № гос. регистрации 01.200.116077) и лабораторией электромагнитных полей НИИ Естественных наук Саратовского государственного университета. Работа поддержана программой Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» (раздел 3.3, проект № 45436).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность исследования, его практическая и теоретическая значимость;

сформулированы цель и основные задачи работы;

намечены пути их реализации.

Глава 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ КОММУНИКАЦИИ ЖИВЫХ СИСТЕМ – ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА МОДЕЛЕЙ (обзор литературы) Анализ литературных данных показал, что во взаимодействиях биосистем участвуют разнообразные химические соединения. Во-первых, это хемомедиаторы, выделяемые организмами в окружающую среду для хемокоммуникации или формирования благоприятных для жизнедеятельности условий и образующиеся в организме для повышения его устойчивости к природным и антропогенным факторам. Во-вторых, это компоненты клеточной поверхности, участвующие в межклеточных контактах. В-третьих, это вещества антропогенного происхождения, определяющие взаимоотношения человеческого общества и биосферы.

Большой интерес представляют биоэффекты сверхмалых доз природных и синтетических химических соединений, а также слабых электромагнитных полей.

Основные закономерности этих эффектов не связаны ни со структурой вещества или разновидностью ЭМИ, ни с уровнем биологической организации мишени, и многие исследователи объясняют их парадоксальное действие участием водной компоненты биообъектов.

Поскольку вода является структурированной жидкостью, участвующей в построении и функционировании биомакромолекул, а ее свойства значительно различаются в объёме жидкости и вблизи поверхности раздела фаз, влияние молекул БАВ на структуру сетки водородных связей воды у поверхности биомишени может реализовываться в изменении конформации последней и, как следствие, функциональной активности.

Для исследования роли водной компоненты во взаимодействиях биосистем с БАВ нами предложено использовать различные модели клеточной поверхности. В основу их выбора и создания новых моделей положены следующие методологические принципы:

- отсутствие сродства модельной системы к химическому соединению;

- высокая чувствительность к изменению структуры и подвижности воды;

- возможность регистрации отклика системы на указанное изменение;

- последовательное применение моделей: от сложного к более простому уровню организации.

На основе указанных принципов осуществлен выбор в качестве модельных систем:

• популяционного, организменного, клеточного уровней организации – одноклеточных водорослей Scenedesmus quadricauda и инфузорий Paramecium caudatum – гидробионтов, традиционно используемых в биотестировании водных сред и системе первичных биологических испытаний химических соединений;

• клеточного и субклеточного уровня – эритроцитов – безъядерных клеток, имеющих типичную клеточную мембрану эукариотов;

• субклеточного уровня – липосом – традиционных моделей клеточной мембраны;

• субклеточного и молекулярного уровня - гидрозолей ультрадисперсных алмазов и наночастиц диоксида кремния. Нами установлена аналогия в структуре, размерах, наличии гидратной оболочки агрегатов УДА и белков (Бульенков, 1991;

Апаркин и др., 2003);

на примере опиатов показано, что водное окружение УДА является чувствительным к воздействию БАВ в низких концентрациях (Кузнецов и др., 2003).

• молекулярного уровня - ферментов АТФ-азы, ацетилхолинэстеразы, лизоцима и биоподобного полимера поли-N-винилкапролактама.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В диссертационных исследованиях использовались: культура простейших Paramecium caudatum и альгологически чистая культура протококковых зеленых водорослей Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. из коллекции ГосНИИОРХ, г. Саратов;

бактериальная культура Аzospirillum brasilense Sp из коллекции ИБФРМ РАН, г. Саратов;

растительная культура мягкой яровой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29;

эритроциты, выделенные из крови белых беспородных крыс-самцов;

ферменты лизоцим куриного яйца (КФ 3.2.1.17) и ацетилхолинэстераза (КФ 3.1.1.7.);

ультрадисперсные алмазы (УДА), размер 4 нм, предоставленные Красноярским НЦ СО РАН;

наночастицы оксида кремния (размер 7 нм) фирмы Sigma;

поли-N-винилкапролактам (ПВКЛ) со средней молекулярной массой 1,3103 г/моль, синтезированный по методике (Кирш, Калниньш, 1999) на кафедре неорганической химии СарГУ;

сверхчистая вода, полученная пропусканием дистиллированной воды через систему высокой очистки «Водолей» (фирма «Аквилон», Россия).

Выращивание культур и выделение эритроцитов проводили по известным методикам.

Использовались биологически активные вещества: индолил-3-уксусная кислота (ИУК) и никотин, фирмы Aldrich;

метронидазол (1-(2'-гидроксиэтил)-2 метил-5-нитроимидазол), который экстрагировали из таблетированной лекарственной формы «Трихопол» фирмы PolPharmа SA (Польша), чистота, определенная методом ТСХ, составляла 94 %. Липополисахарид (ЛПС) внешней мембраны бактерий Аz. brasilense Sp245 выделен сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН (г. Саратов) (Федоненко, 2001).

В работе применялись реактивы: додецилсульфат натрия (ДСН) (Merk, Германия);

мочевина (Fluka, Германия);

яичный фосфатидилхолин («Биолек», Украина);

флуоресцеин-натрий (ФН) и метиленовый синий (МС) (Вектон, Россия), 4-диметиламинохалкон (ДМХ), синтезированный на кафедре органической химии СарГУ по методике (Яновская и др., 1971);

Sephadex G- (Pharmacia, Швеция). Все остальные реактивы были градации ХЧ и ХЧДА фирмы Экрос, Россия.

Источником ЭМИ в диапазоне частот 53-78 ГГц служил генератор Г4-142.

Биологические объекты облучались с помощью пирамидальной рупорной антенны длиной 12 см и апертурой 42 х 50 см2. Плотность потока энергии (ППЭ) в месте расположения биообъекта составляла 120 мкВт/см2.

Источником ЭМИ в диапазоне частот 120 – 170 ГГц являлась лампа обратной волны ЛОВ-87 «А» (НПО «Исток», Россия). В качестве передающей и приемной антенн использовались параболические антенны с апертурой 15Х см. Расстояние между ними было задано 80 см. Коэффициент усиления антенны - 50 дБ, ППЭ 8-10 мкВт/см2.

Для оценки концентрационного влияния ИУК, никотина, метронидазола, а также низкоинтенсивного ЭМИ использовали характеристические показатели модельных систем, применимые для каждого отдельного случая:

- Численность клеток культуры S. quadricauda измеряли по стандартной методике (Владимирова, Семененко, 1962). Фотосинтетическую активность и дыхание микроводорослей определяли по изменению концентрации кислорода в среде (метод Винклера) на свету и в темноте, соответственно.

- Подвижность P. сaudatum анализировали на специализированном импульсном фотометре «Биотестер-2» (Россия) (Еропкин, 1999).

- Гемолитическую устойчивость эритроцитов к детергенту ДСН проводили по изменению оптической плотности проб, на фотоэлектроколориметре КФК- (Россия) при = 670 нм, l = 1 см, при 20С (Черницкий, Сенькович, 1999).

- Активность мембраносвязанного фермента эритроцитов АТФ-азы определяли по известной методике (Якушева, Орлова, 1970), основанной на колориметрическом определении фосфора, образовавшегося при каталитическом гидролизе АТФ. Измерения проводили на спектрофотометре «Specord M40» при = 735 нм, l = 1 см.

- Активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) определяли колориметрически методом Эллмана. Пробы фотометрировали на спектрофлуориметре «Флюорат 02-Панорама» при = 412 нм.

- За фолдингом лизоцима следили по изменению интенсивности флуоресценции растворов белка во времени. В качестве денатурирующего агента использовали 6 М раствор мочевины. Измерения проводили на спектрофлуориметре при возб.= 280 нм, эмис. = 340 нм.

- Липосомы получали методом инжекции 10 %-го этанольного раствора яичного фосфатидилхолина (до концентрации 5 г/л) в Na-фосфатный буфер, рН 7.4, при температуре 50С и непрерывном перемешивании на магнитной мешалке до полного испарения растворителя. Полученную суспензию озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе «UD-11-automatic» (Германия) раза по 30 с на максимальной мощности (Дворкин, 1985;

Марголис, 1986) с последующей фильтрацией недиспергированных липидов через фильтры Millex-GS 0.22µm (Ирландия) с диаметром пор 0.2 мкм. Определяли устойчивость липосом (D450 = 1.0 при l = 1 см) к воздействию 160 мкМ раствора ДСН по изменению оптической плотности. Исследовали диффузионную подвижность приповерхностной воды в суспензии липосом с помощью флуоресцентного зонда ДМХ (Владимиров, Добрецов, 1980). Интенсивность флуоресценции суспензий измеряли при возб. = 419 нм, эмис. = 525 нм.

- Липосомы, загруженные красителем ФН, готовили описанным выше способом, вводя спиртовой раствор яичного фосфатидилхолина в 0.01 % водный раствор ФН. Оптическая плотность суспензии липосом при = 450 нм была 1.0. Краситель удаляли из окружающей липосомы водной среды диализом против воды в течение 2-х суток. Определяли стабильность липосом к воздействию 160 мкМ раствора ДСН. Интенсивность флуоресценции суспензий на каждом этапе измеряли при возб. = 491 нм, эмис. = 512 нм.

- Гидрозоли УДА и диоксида кремния с концентрацией 0.1 г/л получали внесением наночастиц в очищенную дистиллированную воду при интенсивном перемешивании с последующим ультразвуковым дезинтегрированием три раза по 30 с при максимальной мощности прибора (Чиганова, 1997).

Флуоресцентное зондирование гидрозолей наночастиц проводили с помощью 10-5 М раствора ДМХ. Гидрозоли наночастиц выдерживали в герметичных бюксах в суховоздушном термостате при температуре 30С в течение 1 ч.

Интенсивность флуоресценции определяли при возб. = 422 нм, спектральный диапазон сканирования эмиссии 518-522 нм. Определение размеров агрегатов наночастиц УДА проводили по спектру мутности суспензий (Безрукова, Розенберг, 1981), измеряя значения их оптической плотности в интервале длин волн 250-600 нм.

Для изучения влияния ИУК на свойства воды определяли упругое (релеевское) светорассеяние (Вукс, Шурупова, 1976) и поверхностное натяжение (Балакирева, 2003) ее водных растворов. В первом случае проводились две независимые серии экспериментов с использованием двух спектрофлуориметров «Флюорат-02-Панорама» и «Shimadzu» модель RF- (Япония). Измерения осуществляли во флуориметрическом режиме работы приборов при длине волны возбуждения 560 нм, с регистрацией рассеянного света под углом 90. Растворы ИУК перед анализом выдерживали в герметичных бюксах в суховоздушном термостате ТС-80 (Россия) 24 ч при температуре 30С. Поверхностное натяжение растворов ИУК измеряли методом отрыва кольца через 6 ч, 1 сутки, 2 суток при температуре 25С с помощью торсионных весов ВТ-500. Для изучения поверхностных свойств ИУК использовался метод определения изотерм адсорбции (Кротов, Малеев, 1979).

При создании сенсорных систем на низкие концентрации ИУК использовались две модели: ПВКЛ и водно-ацетоновый раствор ДМХ. В первом случае регистрировали изменение окраски растворов визуально при их нагревании и охлаждении с шагом 0.1С. Во втором случае определяли оптическую плотность суспензий в максимуме поглощения спектрального диапазона сканирования 410-440 нм.

Молекулярное моделирование влияния химических веществ на водное микроокружение проводили с помощью программы HyperChem Professional 7. (демо версия). Во всех экспериментах число молекул воды было около 200, чтобы плотность раствора была приблизительно равной 1 г/см3. Вода окружала единственную молекулу исследуемого вещества. Граничные условия периодические, силовое поле - ММ2+, заряды рассчитывались методом CNDO/2 в неограниченном базисе Хартри-Фока. Молекулярно-динамический расчет проводился до выхода на динамическое равновесие, при котором полная энергия системы не менялась с точностью до флуктуаций. Температура 40С, шаг по времени 0.5 пс. На конечном отрезке расчетов выбирали несколько позиций с временным интервалом 0.06 пс, запоминали их в файлах с расширением *.hin, которые затем использовали для расчета функций радиального распределения g(r), средней величины водородной связи, среднего времени водородной связи и распределения молекул воды по кластерам. Расчет указанных параметров реализован на языке Turbo Basic в программе MD_AN.

Моделирование бактериальной поверхности проводили с помощью липосом, инкрустированных ЛПС, которые получали введением 10 %-ного этанольного раствора яичного фосфатидилхолина до концентрации 1.4 г/л в водные растворы ЛПС с концентрацией 23 или 150 мг/л, при температуре 50С и постоянном перемешивании. Полученную суспензию озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе 3 раза по 30 с на максимальной мощности.

Недиспергированные фосфолипиды удаляли центрифугированием (центрифуга К-24, Германия) взвеси в течение 10 мин при 8000 об/мин. Размеры липосом определяли по спектру мутности суспензий, они составили 100-180 нм.

Размеры агрегатов липосом определяли методом динамического рассеяния света в режиме «записи аналогового сигнала» (Khlebtsov et al., 2003).

Для определения положения О-ПС ЛПС относительно билипидного слоя использовали метод лежачей капли. Каплю 1-бромбутана, содержащего 10-3 % фосфатидилхолина, помещали на дно стеклянной кюветы с дистиллированной водой, вносили в воду растворы ЛПС, увеличивая его концентрацию. С помощью цифровой камеры FinePix A405, Япония (4 Mpixels) фиксировали изменение во времени контура капли. Определяли поверхностное натяжение капли в зависимости от концентрации ЛПС в водной фазе, используя формулы и таблицы Кошевника (1953).

Моделирование взаимодействия между полисахаридными фрагментами О-ПС бактериального липополисахарида, а также определение геометрического пространственного строения О-ПС и его расположения относительно плоскости липосомы проводилось в коммерческой программе HyperChem Professional 7. (демо версия) методом молекулярной динамики с молекулярно-механическим силовым полем Amber S.

Для изучения адсорбции модельных систем на корнях пшеницы Triticum aestivum L. проводилось инкубирование (45 мин и 24 ч) корней проростков в следующих растворах и суспензиях: 1) раствор МС, 1,0 мг/л;

2) раствор ЛПС (150 мг/л) + раствор МС (0,9 мг/л);

3) липосомы, загруженные МС (0,7 мг/л);

4) липосомы с низким содержанием ЛПС (23 мг/л) и загруженные МС (0, мг/л);

5) липосомы с высоким содержанием ЛПС (150 мг/л) и загруженные МС (0,7 мг/л). После инкубации в суспензиях и растворах корни промывали дистиллированной водой, растирали в ступке и экстрагировали 96 %-ным этанолом в течение 1 ч. В спиртовом экстракте корней содержание красителя определяли спектрофотометрически при = 632 нм.

Для оценки влияния N-ацетилглюкозамина на адсорбцию модельных систем корни пшеницы предварительно выдерживались в 15 и 30 мМ растворах аминосахарида в течение 1 ч. Отрезанные корешки инкубировали в течение мин и 24 ч в суспензиях липосом, содержащих МС и ЛПС (110 мг/л). Срезы корней фиксировали над поверхностью суспензии. Количество адсорбированного маркера определялось спектрофотометрически.

В экспериментах по изучению возможности доставки химических веществ к корням растений использовались наночастицы диоксида кремния, обогащенные растительными полисахаридами, и липосомы, инкрустированные ЛПС и загруженные ИУК.

Гидрозоль наночастиц получали трехкратным ультразвуковым дезинтегрированием водной суспензии диоксида кремния 3 раза по 30 с на максимальной мощности. Гидрозоль наночастиц с ФН, получали разбавлением исходного гидрозоля 10-5 М раствором красителя до концентрации частиц 10-2, 10-3, 10-4 г/л при перемешивании в течение 1 ч. Для приготовления наночастиц, инкрустированных полисахаридами, к суспензии частиц приливали растворы высокомолекулярных или низкомолекулярных фракций полисахаридов до концентрации 10-1, 10-2, 10-3 г/л при перемешивании в течение 1 ч.

Полисахариды выделяли из биомассы корней пшеницы методом концентрирования этанольного экстракта с последующей гель-фильтрацией (Коннова и др., 2005).

Для регистрации адсорбции наночастиц на корнях пшеницы от проростков пшеницы отделяли целые корни, помещали их в бюксы с 10-5 М раствором ФН или суспензией наночастиц с красителем. По окончании инкубации корни экстрагировали водой в течение 1 ч, ценрифугировали 10 мин при об/мин, отбирали 1 мл супернатанта, смешивали с 5 мл фосфатного буфера рН 8.25 (1:5). Измеряли интенсивность флуоресценции при возб. = 491 нм, эмис. = 512 нм. Концентрацию ФН определяли по калибровочной кривой. Растворами сравнения для экстрактов служил водный экстракт корней пшеницы с содержанием фосфатного буфера рН 8.25 в соотношении 1:5.

Липосомы с ИУК готовили инжекцией 10 %-ного спиртового раствора фосфатидилхолина в цитрат-фосфатный буфер (рН=6.0), содержащий ЛПС в концентрации 150 мг/л и ИУК в концентрациях 0.1;

1 и 10 мг/л. Концентрацию ИУК определяли по реакции Сальковского. Оптическую плотность измеряли при 490 нм, l = 1 см. Суспензию липосом вносили в пробирки с гидропонной комплексной средой в соотношении 1:10, на поверхность гидропонного раствора помещали наклюнувшиеся семена пшеницы Triticum aestivum L. и выращивали в климатокамере KTLK 1250 (Германия) в течение 2-х недель с режимом: 16-часовой световой период, 25С. Измеряли длину проростков.

Оценивали также эффективность доставки ИУК липосомами с ЛПС к колеоптилям пшеницы, контроль проводили по приросту их длины.

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы Excel 2003. Рассчитывали среднее арифметическое, доверительный интервал, стандартное отклонение.

Достоверность результатов оценивалась при уровне значимости 0,05. При построении линейных графиков использовалась многочленная аппроксимация, полученная по методу наименьших квадратов.

Глава 3. МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БИОСИСТЕМ С БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ В НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ Для изучения механизмов неспецифического взаимодействия биосистем с гетероауксином (индолил-3-уксусной кислотой), алкалоидом никотином и антимикробным препаратом метронидазолом использовались различные модели клеточной поверхности.

Известно, что ИУК является участником разнообразных взаимодействий экологического характера: межвидовых, внутривидовых и обусловленных хозяйственной деятельностью человека. Однако при этом не изучена биологическая активность ИУК в низких концентрациях, окончательно не определен молекулярный механизм фитогормонального действия ИУК, нет объяснения двухфазности воздействия гетероауксина на растения. В связи с этим нами исследованы дозо-зависимые эффекты ИУК на биосистемы различных уровней организации (популяционного, организменного, клеточного, субклеточного, молекулярного).

Для моделирования действия ИУК на популяцию использовалась культура зелёных протококковых водорослей S. quadricauda, водоросли этого рода продуцируют ИУК и накапливают её в культуральной среде (Mazur, 2001). В качестве показателя воздействия химического вещества на популяцию использовалось изменение ее численности. Подсчет клеток микроводорослей в водных средах с ИУК проводился на свету и в темноте, контролем служила среда без ИУК. Оказалось, что на свету ИУК в низких концентрациях (10-17 10-11 моль/л) сдерживает рост численности популяции микроводорослей. В темноте вещество в концентрации 5,710-7 моль/л стимулирует рост популяции, аналогичное действие наблюдается для высших растений.

Применение оптической микроскопии позволило установить, что гетероауксин в концентрации порядка 10-5 моль/л вызывает изменение формы клеток и их содержимого (рис.1), что свидетельствует о токсичности ИУК в данных концентрациях для одноклеточных водорослей.

а б Рис. 1. Фотографии клеток S. quadricauda, инкубированных в водных средах: (а) – без ИУК;

(б) – с 5,710-5 М ИУК. Фотографии получены при помощи цифровой камеры-окуляра для микроскопа SCOPETEK, модель DCM Как известно, уровень химического воздействия, в том числе ИУК, на клетки S. quadricauda можно проследить по изменению интенсивности их фотосинтеза и дыхания (рис. 2).

изменение интенсивности 100 изменение интенсивности фотосинтеза, % дыхания,% - - - - -5 -10 -15 - -5 -10 -15 - lg (C, моль/л) lg (C,моль/л) б а Рис. 2. Изменение интенсивности фотосинтеза (а) и дыхания (б) микроводорослей S. quadricauda в зависимости от концентрации ИУК (С, моль/л). Значению 0 соответствует отсутствие ИУК Нами установлен немонотонный дозо-зависимый характер воздействия ИУК на указанные показатели гидробионтов, положительные и отрицательные значения на графиках свидетельствуют о стимулирующем и ингибирующем эффектах ИУК, соответственно (рис.2). Показано, что в определенных низких концентрациях ИУК оказывает прямо противоположное действие на фотосинтез и дыхание микроводорослей. Например, в концентрации 5,710- моль/л гетероауксин стимулирует фотосинтез и ингибирует дыхание;

в концентрациях 5,710-7 и 5,710-17 моль/л действует противоположным образом.

В качестве модели организменного и клеточного уровней использовались инфузории P.caudatum. Показано, что в зависимости от концентрации в водной среде ИУК уменьшает или увеличивает их подвижность. Обнаружен эффект малых доз ИУК (5.710-17 моль/л) (рис.3).

подвижность,% 0 20 40 60 время, мин контроль 1 2 3 4 5 Концентрация ИУК, моль/л: 1 - 5.710-6;

2 – 5.710-10;

3 - 5.710-12;

4 - 5.710-15;

5 - 5.710-17;

6 - 5.710-19.

Рис. 3. Изменение подвижности P.caudatum во времени в зависимости от концентрации ИУК По аналогии с растительной клеткой (Шишова, 1999) можно предположить, что ИУК изменяет активность мембраносвязанных белков парамеций, ответственных за транспорт ионов Ca2+ в клетку, тем самым воздействует на их подвижность. Поскольку активность ферментов и функционирование ионных каналов зависит от конформационного состояния белковых молекул, на которое большое влияние оказывает диффузионная подвижность воды, далее нами изучалось влияние вещества на биомакромолекулы, не обладающие к нему сродством.

В экспериментах использовали ацетилхолинэстеразу (АХЭ). Определяли ее активность в присутствии ИУК в различных концентрациях. Установлено, что при концентрациях порядка 10-6-10-13, 10-15, 10-18 моль/л происходит значительное снижение её активности по сравнению с контролем (p0,05) (рис.

4). Характер зависимости указывает на то, что ИУК не является для АХЭ субстратом или ингибитором. Поэтому можно предположить, что изменение активности АХЭ под действием гетероауксина обусловлено изменением его конформации в результате воздействия ИУК на структуру и динамику связанной на поверхности белка воды.

Далее изучался процесс сворачивания полипептидной цепи лизоцима, связанный с перестройкой сетки водородных связей воды, в присутствии ИУК.

За ходом процесса следили по изменению интенсивности флуоресценции растворов белка во времени. Полученные значения интенсивности флуоресценции в относительных единицах использовали для расчета параметра насыщения (Н) – показателя окончания фолдинга белка:

(1) I I H = I I где I - текущее значение интенсивности;

I0 - значение интенсивности, принятое за 100% (начальная точка измерений);

I - значение интенсивности в точке, где интенсивность принята за 0 %.

Для описания влияния ИУК на фолдинг лизоцима, использовали величину – характерное время сворачивания полипептидной цепи белка:

= -(t – t0)/ln(H/100), (2) где t - t0 – время от начала эксперимента.

1 Время сворачивания, с активность АХЭ, отн. ед.

0,8 0, 0, 0, -6 -8 -10 -12 -14 -16 -18 - -5 -10 -15 - lg (C,моль/л) lg (C, моль/л) Рис. 4. Зависимость относительной Рис. 5. Зависимость времени сворачивания активности АХЭ от концентрации ИУК лизоцима от концентрации ИУК. Жирная (результаты кинетического опыта). линия соответствует времени фолдинга белка Единице соответствует активность АХЭ в в отсутствии ИУК отсутствии ИУК Оказалось, что зависимость времени фолдинга от концентрации ИУК имеет немонотонный характер (рис.5). Причем некоторые концентрации этого соединения, даже очень низкие, способны значительно увеличивать скорость процесса. Это может быть обусловлено воздействием ИУК на состояние сетки водородных связей воды, окружающей белок.

Для оценки изменения диффузионной подвижности приповерхностной воды использовался метод флуоресцентного зондирования. Изучалось влияние ИУК на состояние воды вблизи твердых поверхностей. В качестве флуоресцентного зонда был выбран 4-диметиламинохалкон (ДМХ), интенсивность флуоресценции которого снижается при увеличении подвижности молекул воды. Для моделирования гидрофобной и гидрофильной поверхности макромолекул использовались наночастицы ультрадисперсных алмазов и диоксида кремния, соответственно.

Установлено, что ИУК в низких концентрациях значимо снижает интенсивность флуоресценции ДМХ в гидрозолях диоксида кремния, и увеличивает ее в гидрозолях УДА (рис. 6). Полученные результаты свидетельствуют о способности ИУК изменять подвижность приповерхностной воды в зависимости от полярности поверхности.

Таким образом, с помощью предложенных нами различных модельных систем получены результаты, свидетельствующие о том, что двухфазный характер биологического действия ИУК в какой-то мере обусловлен влиянием вещества на структуру сетки водородных связей воды вблизи клеточных мембран. Этот эффект затем может распространяться на структуру билипидного слоя мембраны и на состояние интегрального рецептора.

I отн, % I отн, % -5 -10 -15 - -5 -10 -15 - lg (C, моль/л) lg (C, моль/л) а б Рис. 6. Изменение относительной интенсивности флуоресценции ДМХ в зависимости от концентрации ИУК в гидрозоле наночастиц УДА (а), диоксида кремния (б) с концентрацией твердой фазы 0.1 г/л. Интенсивность флуоресценции ДМХ в отсутствии ИУК – 100 % Далее в исследованиях использовали никотин - алкалоид табака. Его выбор обусловлен катастрофическим распространением табакокурения, с которым связан рост различных заболеваний (Радбиль, 1982;

Лисицин и др., 1986;

Радбиль, Комаров, 1988). Известно, что привыкание к табаку определяет никотин, признанный в последние годы наркотиком (Сахарова, Чучалин, 2001).

Представляло интерес изучить неспецифическое воздействие низких концентраций никотина на клеточные мембраны, поскольку именно они участвуют в реализации биологического эффекта данного вещества.

С помощью методов быстрого и медленного гемолиза эритроцитов ДСН (рис.7) установлено дестабилизирующее действие никотина в микромолярных (физиологически значимых) и низких (10-12, 10-9 моль/л) концентрациях на мембраны.

относительный процент 1, акивность АТФазы, ед 1, 1, гемолиза 1, 1, 1 0,9 3 5 7 9 11 13 15 3 5 7 9 11 13 -lg (C, моль/л) - lg (C, моль/л) Рис. 7. Зависимость относительного Рис. 8. Зависимость активности АТФ-азы от процента медленного гемолиза эритроцитов концентрации никотина ДСН (40 мкМ) от концентрации никотина в суспензиях эритроцитов. Контроль – суспензия клеток без никотина Отмечено увеличение активности мембраносвязанной АТФ-азы эритроцитов (рис.8) от концентрации никотина в среде инкубирования.

Эффекторное действие вещества может быть обусловлено его неспецифическим связыванием с мембранами, с определенными участками белка, а также с изменением подвижности и структуры приповерхностной воды, влияющей на конформацию белка. Последнее предположение более вероятно, о чем свидетельствует эффект низких концентраций никотина.

Чтобы выяснить характер воздействия алкалоида на мембраны использовались их простейшие модели - липосомы, загруженные флуоресцентным красителем ФН (рис.9). Определялась относительная интенсивность флуоресценции Iотн, обратно пропорциональная I отн, % стабильности липосом. Расчеты проводили по формуле:

Iотн = (I – I0) / (I1 – I0) x 100, (3) где I0 – интенсивность флуорес ценции суспензии липосом, инкубированных в течение суток без никотина (контроль);

-3 -5 -7 -9 -11 -13 -15 - I1 - интенсивность флуорес lg (C, моль/л) ценции суспензии липосом после разрушения раствором ДСН;

Рис. 9. Относительная интенсивность флуоресценции липосом, загруженных ФН, в I – интенсивность флуорес зависимости от концентрации никотина в смеси ценции суспензии липосом после инкубации инкубирования в течение суток с никотином.

Коэффициент распределения никотина в системе октанол-вода lg Р = 1, свидетельствует о том, что никотин в 52,5 раза лучше растворим в жирах, чем в воде. Поэтому никотин может встраиваться в бислой липосомы, нарушая его структуру. Результаты опытов и расчетов показали, что полное разрушение липосом происходит в присутствии никотина в концентрации 1 ммоль/л, когда на одну молекулу никотина приходится 3 молекулы фосфолипида, при таком соотношении никотин встраивается в билипидный слой, нарушая его целостность. При содержании никотина в суспензии 10-5 и 10-9 моль/л липосомы имеют одинаковую стабильность, которая заметно отличается от контроля;

в данных случаях соотношение молекул никотина и фосфолипида составляет 1:300 и 1:3000000. Это свидетельствует о том, что уменьшение стабильности липосом в присутствии никотина в низких концентрациях не связано с воздействием вещества на билипидный слой, а, возможно, обусловлено изменением подвижности и структуры воды у его поверхности.

Проведено флуоресцентное зондирование суспензии липосом (рис.10) и гидрозолей УДА с помощью ДМХ, а также определена агрегационная устойчивость гидрозолей УДА и наночастиц диоксида кремния (рис.11) в присутствии никотина в различных концентрациях.

Размер, нм I отн, % 60 40 0 0,5 1 1,5 2 2, Время, сутки -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 - контроль никотин lg (С, моль/л) Рис. 10. Зависимость относительной Рис. 11. Динамика изменения размеров интенсивности флуоресценции ДМХ в агрегатов наночастиц диоксида кремния в эмульсии липосом от концентрации средах с никотином в концентрации 10-12 моль/л и без него никотина Поскольку интенсивность флуоресценции ДМХ снижается, а размеры агрегатов уменьшаются с увеличением подвижности воды, экспериментальные данные свидетельствуют о способности никотина в низких концентрациях увеличивать подвижность приповерхностной воды.

Результаты исследований позволяют заключить, что в основе механизма неспецифического действие никотина в низких концентрациях на клеточные мембраны лежит дестабилизация структуры сетки водородных связей приповерхностной воды.

Следующим БАВ в исследованиях являлся метронидазол – противомикробный и противопаразитарный препарат (Чекман, Пелещук, 1986;

Лоуренс, Бенетт, 1991). Известно, что метронидазол проявляет протекторные свойства по отношению к мембранам эукариотических клеток. Механизм его протекторного эффекта не исследован.

Чтобы оценить влияние метронидазола на структурно-функциональное состояние плазматической мембраны, нами изучалась гемолитическая устойчивость эритроцитов к действию ДСН в присутствии соединения в различных концентрациях. Показано, что скорость гемолиза хорошо описывается кинетическими кривыми первого порядка с независящей от времени константой скорости, о чем свидетельствует линейность зависимостей, приведенных на рис. 12. Тогда для зависимости оптической плотности D от времени t справедливы соотношения:

dD (t ) kt = kD(t ) D (t ) = D (0)e k = ln( D (t ) / D (0)) dt lg( D(t ) / D(0)), (4) kотн = lg( Dконтр (t ) / Dконтр (0)) где kотн- относительная константа скорости гемолиза;

Dконтр – оптическая плотность суспензии эритроцитов в отсутствии метронидазола.

Из рис.13 видно, что значимые отличия константы гемолиза в присутствии метронидазола от контроля наблюдаются в диапазоне концентраций вещества от 310-10 до 310-2 моль/л, следовательно, в этих концентрациях метронидазол проявляет выраженное протекторное действие по отношению к эритроцитам.

1, lg(D,%) 2, k отн 1, 1,8 0, 1, 1, 0 -2 -4 -6 -8 -10 - 0 5000 10000 lg (C,моль/л) t,c – контроль (отсутствие метронидазола);

Рис. 13. Зависимость относительной - моль/л, –310-8 моль/л, константы скорости гемолиза эритроцитов – - ДСН (kотн) от концентрации метронидазола.

–310 моль/л метронидазола За единицу принята константа скорости в Рис. 12. Зависимости оптической плотности отсутствии вещества суспензии эритроцитов от времени в условиях гемолиза ДСН. За 100 % принята оптическая плотность суспензии эритроцитов в начальный момент времени Установлено также увеличение устойчивости липосом к детергенту ДСН в присутствии метронидазола в концентрационном интервале 310-2 - 310- моль/л (рис.14), что свидетельствует о неспецифическом характере его действия на клеточные мембраны. С помощью флуоресцентного зонда ДМХ определена способность вещества снижать коэффициент диффузии воды вблизи липосом (рис.15). Предположено, что метронидазол способствует увеличению гидратной оболочки у клеточной поверхности.

I отн,% D,% -2 -4 -6 -8 -10 - 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 - lg (C,моль/л) lg (C,моль/л) Рис 14. Зависимость относительной Рис. 15. Зависимость интенсивности оптической плотности суспензии липосом от флуоресценции ДМХ в суспензии липосом концентрации метронидазола. За 100 % принята от концентрации метронидазола. За 100 % оптическая плотность в отсутствии вещества принята интенсивность флуоресценции в отсутствие метронидазола Чтобы проверить данное предположение, определялась удельная вязкость [] гидрозолей УДА с концентрацией дисперсной фазы 0.1 г/л, проинкубированных в течение часа в водных растворах метронидазола различных концентраций. Из рис.16 видно, что значимое увеличение удельной вязкости гидрозоля УДА наблюдается в концентрационном интервале метронидазола 310-5 - 310-9 моль/л, в котором зафиксирован стабилизирующий эффект вещества на клеточные и модельные мембраны.

0,14 удельная вязкость изменение толщины, нм 0, 0,10 0, 0, 0,04 -1 -3 -5 -7 -9 -11 -1 -3 -5 -7 -9 - lg(C, моль/л) lg (C,моль/л) Рис. 16. Зависимость удельной вязкости Рис. 17. Зависимость изменения толщины УДА от концентрации метронидазола в гидратной оболочки наночастиц УДА (нм) гидрозоле. Пунктирная линия - удельная от концентрации в гидрозолях вязкость УДА в отсутствии вещества метронидазола. Пунктирная линия соответствует толщине гидратной оболочки УДА в отсутствие вещества.

Звездочками помечены точки, значимо отличающиеся от контроля (p0,05) Известно, что удельная вязкость гидрозолей зависит от гидродинамического радиуса частиц r, в котором учитывается слой связанной на поверхности частицы воды (Чанг, 1980):

[ ] = 10nr 3 / 3, (5) где n – количество частиц в единице объема.

n= 3, (6) 4r где - объемная доля частиц, ro - радиус частицы УДА (84 нм).

Подставив выражение 6 в формулу 5, получаем:

[ ] = 2,5 (r / r0 )3, (7) Поскольку удельная вязкость гидрозоля зависит от концентрации метронидазола (С), получаем зависимость:

[ (C )] r (C ) = ro 3 (8) 2, Тогда изменение толщины гидратной оболочки r, обусловленное наличием метронидазола, есть:

( ) r0 3 [ (C )] 3 [ (0)] r = r (C ) r ( 0 ) =. (9) 3 2, По формуле (9), используя экспериментальные данные вязкости гидрозолей, нами рассчитано изменение толщины гидратной оболочки частиц в зависимости от концентрации метронидазола (рис. 17), значимые величины наблюдаются в интервале концентраций вещества 310-5-310-9 моль/л, в котором находятся и его фармакологически активные концентрации.

Результаты данного эксперимента подтверждают наше предположение о способности метронидазола стабилизировать структуру сетки водородных связей приповерхностной воды. Вероятно, аналогичное явление имеет место вблизи клеточных мембран, чем и объясняется протекторное действие препарата на клетки.

Таким образом, показано, что эффекты малых доз различных БАВ реализуются посредством неодинакового воздействия веществ на структуру воды у поверхности биологических объектов: клеток, мембран, белков.

Целесообразно в связи с полученными результатами исследовать влияние указанных БАВ на свойства жидкой воды.

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ВОДЫ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ С КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ Известно, что вода - это сложная динамическая система, в которой постоянно образуются и распадаются разнообразные по количеству молекул и геометрии ассоциаты – кластеры, составляющие ее структуру, время жизни кластеров 10-9 с (Аксенов, 1990;

Калниньш, Павлова, 2005). Любые вещества, независимо от их химического строения и растворимости, влияют на мгновенную структуру воды. По характеру этого воздействия их делят на вещества, структурирующие и деструктурирующие воду. Аналогично, но более интенсивно, вещества могут влиять на приповерхностную воду.

Экспериментальные модели биосистем позволяют нам регистрировать эти эффекты.

Определена возможность прогнозирования характера воздействия веществ на воду методами молекулярного моделирования. Проведены молекулярно динамические расчеты для следующих систем: 1 - чистая вода;

2 - частица алмаза, содержащая атомы углерода двух элементарных ячеек в воде;

3 - -D глюкоза в воде;

4 - дофамин в воде;

5 - ацетилхолин в воде;

6 - ИУК в воде;

7 никотин в воде;

8 - метронидазол в воде. В качестве структурных характеристик водных систем использованы: парные корреляционные функции радиального распределения gOO(r), gOH(r), gHH(r), среднее время жизни водородных связей (), среднее количество водородных связей (n) (табл.1), распределение молекул воды по кластерам различного размера (рис.18).

Таблица Расчетные данные функций радиального распределения Значение Номер системы параметров 1 2 3 4 5 6 7 r1 2.75 2.75 2.75 2.66 2.66 2.75 2.75 2. gОО 2.92 3.02 2.88 2.59 2.50 2.79 2.92 2. r2 4.88 4.95 4.80 4.67 4.47 4.75 4.75 4. gОО 1.53 1.52 1.43 1.36 1.43 1.52 1.45 1. r1 1.85 1.95 1.85 1.86 1.86 1.85 1.85 1. gOH 1.38 1.41 1.39 1.30 1.10 1.45 1.36 1. r2 3.38 3.45 3.45 3.67 3.37 3.35 3.45 3. gOH 1.35 1.30 1.29 1.30 1.28 1.33 1.38 1. r1 2.65 2.65 2.65 2.56 2.66 2.55 2.55 2. gHH 1.42 1.48 1.38 1.38 1.31 1.43 1.41 1. r2 4.92 5.05 4.95 4.67 4.68 4.75 4.95 4. gHH 1.12 1.11 1.08 1.08 1.07 1.09 1.07 0. n 2.89 2.87 2.82 2.62 2.58 2.80 2.81 2., пс 0.19 0.19 0.20 0.20 0.16 0.18 0.17 0. При оценке ошибок Содержание молекул воды, % рассчитываемых вели 3, чин получены следую щие средние значения 2, стандартных отклоне ний. Для величины 1, функции радиального распределения Sg = 0.01.

0, Для положения экстре мумов этой функции Sинт 1 2 3 4 5 6 7 Размер кластера, количество молекул воды = 0.01. Эта же величина с учётом вода наночастица ИУК никотин метронидазол ошибки шкалы Рис.18. Расчетные данные по распределению молекул воды (функции радиального по кластерам для водных систем, содержащих молекулу распределения строи химического вещества лись как гистограммы с интервалом 0.1) составляет Sинт = 0.06. Ошибка определения величины молекул в кластере Sc= 0.17. Ошибка среднего времени жизни составила S= 0.01 пс, эта же величина с учётом ошибки шкалы (шаг по времени составил 0. пс) равна 0.03 пс. Полученные величины погрешностей свидетельствуют о достоверности возмущений, вносимых в структуру сетки водородных связей воды различными соединениями.

По совокупности указанных параметров установлено, что метронидазол может оказывать структурирующее действие на воду (стабилизирующее сетку водородных связей), а никотин – деструктурирующее (дестабилизирующее сетку водородных связей). Это согласуется с результатами экспериментального моделирования. Для ИУК однозначных выводов не сделано, что может являться подтверждением двойственности действия гетероауксина на приповерхностную воду.

Для выяснения причины разнонаправленного действия ИУК на водную фазу, нами проведены исследования разбавленных водных растворов ИУК методами упругого рассеяния света и поверхностного натяжения. Характер концентрационных зависимостей интенсивности упругого рассеяния света (рис.19) свидетельствует о существовании флуктуаций плотности растворителя в присутствии ИУК в определенных низких концентрациях. Это указывает на способность ИУК вызывать фазовый -переход в структуре сетки водородных связей воды, что может обуславливать эффекты малых доз и двухфазность биологического действия вещества.

I отн, % I отн, % 100 0 -7 -9 -11 -13 -15 -17 -7 -9 -11 -13 -15 - lg (C,моль/л) lg (C, моль/л) а б Рис. 19. Относительная интенсивность рассеяния света (%) растворами гетероауксина в зависимости от концентрации вещества и условий проведения анализа:

(а) - спектрофлуориметр «Shimadzu» модель RF-540 (Япония);

(б) – спектрофлуориметр «Флюорат-02-Панорама» (Россия). За 100 % принята интенсивность рассеяния света чистой водой Адсорбционную способность веществ оценивали по величине удельной адсорбции (Г) (Кротов, Малеев, 1979):

c d Г =, (10) RT dc где с – концентрация вещества, моль/л;

T – абсолютная температура,oK;

R – универсальная газовая постоянная, Дж/(мольК).

– коэффициент поверхностного натяжения исследуемой жидкости, Н/м.

Для нахождения d/dс использовали уравнение Шишковского (Евграфова, Каган, 1970):

= о- = Вln (1+Ac), (11) где о, – межфазное натяжение при c = 0 и при с 0, соответственно, Н/м;

А, В – эмпирические константы (л/моль и Н/м, соответственно).

После подстановки (11) в (10), уравнение изотермы адсорбции имеет следующий вид:

B Ac Г= (12) RT 1 + Ac Для определения значений эмпирических параметров А, В применимы численные методы. В этом случае используется набор экспериментальных значений концентраций сi и Гi и метод максимального правдоподобия. При этом минимизируется сумма квадратов отклонений расчетных значений Г от Гi.

B Ac i Гi 1 + Ac i RT min (13), Si i где Si – оценка стандартного отклонения.

Полученные данные по адсорбции ИУК на границе раздела фаз вода-воздух (рис.20) указывают на то, что теоретически ИУК должна вытесняться из припо верхностной воды, о чем свидетельствует кривая, соответствующая аппрок симации Шишковского. Но характер экспериментально полученной зависимости позволяет заключить, что в отдельных концентрационных Рис. 20. Удельная адсорбция ИУК на границе интервалах имеются области раздела фаз вода-воздух в зависимости от концентрации. Жирная линия соответствуют достоверного накопления аппроксимации Шишковского вещества. Причем, они хорошо совпадают с областями наиболее интенсивного светорассеяния (рис.19). Т.е. ИУК в концентрациях порядка 10-9, 10-15 моль/л лучше растворяется в приповерхностной воде, упорядочивает ее структуру, что может способствовать более эффективному взаимодействию с мембраной или рецептором.

Основываясь на известных термодинамических и кинетических характеристиках лиганд-рецепторного взаимодействия, а также на результатах проведенного нами молекулярного моделирования процесса взаимодействия ауксина с рецептором ABP1, можно заключить, что слой структурированной воды способствует значительному снижению активационного барьера при образовании комплекса лиганд-рецептор.

Обнаруженная нами способность ИУК в определенных концентрациях изменять структуру воды далее реализована при создании сенсорных систем. В первой системе в качестве детектора использован полимер ПВКЛ, температура фазового перехода «растворение-осаждение» которого чувствительна к состоянию воды. Установлено, что с его помощью можно визуально определять ИУК в водной среде в концентрации не более 10-10 г/л (рис.21). Во второй системе использован индикаторный раствор, изменение седиментационных свойств которого зависит от состояния воды и может быть зарегистрировано фотометрически. Показано, что с помощью данного детектора можно количественно определять ИУК в водных средах в диапазоне концентраций 10-3-10-10 г/л (рис.22).

35,4 1, t, C D 35, 0, 0, 34,8 0, 0, 34, 0, 34, 0, -16 -14 -12 -10 -8 -6 - -4 -6 -8 - lg (C, г/л) lg (C, г/л) Рис. 21. Зависимость температуры фазового Рис. 22. График зависимости оптической перехода ПВКЛ от концентрации ИУК в плотности индикаторных растворов от растворе концентрации ИУК Таким образом, результаты наших исследований могут найти практическое применение при разработке сенсорных систем.

Глава 5. МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭФФЕКТОВ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ КРАЙНЕ ВЫСОКИХ ЧАСТОТ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА БИОСИСТЕМЫ Анализ литературных данных свидетельствует о том, что ЭМИ КВЧ низкой интенсивности оказывает значительное влияние на биосистемы различных уровней организации (Бецкий и др., 2004). Как считают авторы, первичными мишенями действия этого излучения являются водная компонента биосистем и клеточные мембраны, ответственные за регуляцию биохимических превращений в клетке. Несмотря на высокую способность воды поглощать КВЧ-излучение, волны на определенных «резонансных» частотах глубоко проникают в водные среды, вызывая ответную реакцию биологических структур. Такое свойство воды связывают с ее кластерной структурой.

Малоизученным остается терагерцовый диапазон этого спектра, в котором исследователи ожидают обнаружить новые биологически эффективные частоты. Кроме того, в литературе имеются единичные сведения о комбинированных эффектах КВЧ-излучения и химических веществ.

Первоначально для изучения изолированного и сочетанного действия КВЧ излучения и БАВ на биосистемы использовалась культура P.caudatum. С ее помощью установлен резонансный характер взаимодействия низкоинтенсивного излучения терагерцового диапазона 120-170 ГГц с клеточными мембранами и выявлены наиболее значимые резонансные частоты:

156.6, 161.3 ГГц, обусловленные увеличением подвижности инфузорий;

151.8, 155.7, 167.1 ГГц, связанные с уменьшением тест-отклика.

В исследовании комбинированных эффектов ЭМИ КВЧ и БАВ использовались никотин и метронидазол, которые как отмечалось выше, в низких концентрациях оказывают различное влияние на структуру приповерхностной воды - дестабилизирующее и стабилизирующее, соответственно.

Изучение концентрационных эффектов никотина (10-4 – 10-15 моль/л) на тест-культуру показало, что в концентрациях 10-4 и 10-9 моль/л вещество изменяет тест-реакцию инфузорий, вызывая значительное увеличение их подвижности. При сочетании действия никотина в малой концентрации (10- моль/л) с ЭМИ на резонансных частотах 156.6 и 161.3 ГГц обнаружено усиление, а на частоте 167.1 ГГц - снижение эффекта воздействия никотина (рис.23).

относительная подвижность, % 1 2 - никотин (10-9 моль/л);

- ЭМИ + никотин (10-9 моль/л);

- ЭМИ;

- никотин (10-10 моль/л);

- ЭМИ + никотин (10-10 моль/л) Рис. 23. Относительная подвижность инфузорий в зависимости от изолированного и комбинированного с никотином воздействия на культуру ЭМИ на частотах:

1 -156.6 ГГц;

2 - 161.3 ГГц;

3 - 167.1 ГГц. За 100% принята подвижность клеток без предварительного воздействия Комбинированное действие метронидазола в концентрации 10-9 моль/л и ЭМИ 167.1 ГГц приводит к обратному результату: усилению тест-отклика по сравнению с изолированным эффектом вещества. Противоположное влияние ЭМИ данной частоты на эффекты изучаемых веществ в низких концентрациях, мы связываем с различным характером воздействия БАВ на структуру сетки водородных связей примембранной воды.

На эритроцитах нами изучено влияние ЭМИ 55-73 ГГц нетепловой интенсивности (ППЭ 120 мкВт/см2) на мембраны и установлено его гемолитическое действие (табл.2).

Таблица Количество негемолизированных эритроцитов в исследуемых образцах Проба Число негемолизированных эритроцитов, % контроль 98,51±10, эритроциты + метронидазол 84,81±5, ЭМИ (65 ГГц) 36,93±4, ЭМИ + метронидазол 67,31±5, Показано, что стабилизация структуры сетки водородных связей воды, индуцированная лекарственным препаратом метронидазолом (порядка 10- моль/л), способствует уменьшению гемолитического воздействия на мембраны эритроцитов КВЧ-излучения на резонансных частотах (55, 65 ГГц) Это доказывает, что резонансные частоты воздействуют на биообъекты, разрушая структуру их гидратной оболочки.

При исследовании комбинированного действия ЭМИ 65 ГГц (ППЭ мкВт/см2) и никотина в концентрациях 10-12, 10-9, 10-6, 10-5 моль/л на мембраны эритроцитов с использованием модели медленного гемолиза клеток ДСН установлен аддитивный эффект ЭМИ и вещества в концентрации 10-5 моль/л.

Для остальных исследованных концентраций никотина наблюдается антагонизм действия вещества и ЭМИ на мембрану. По-видимому, на фоне структурных нарушений в мембранах, вызванных ЭМИ, Размер, нм небольшое дестабилизирую щее воздействие никотина в низких концентрациях на гидратное окружение мембран не регистрируется.

С помощью модельной системы на основе УДА (рис.24) показано дестаби лизирующее влияние ЭМИ на частоте 65 ГГц на структуру 0 0,5 1 1,5 2 2, сетки водородных связей воды Время, сутки вблизи поверхности, что контроль никотин ЭМИ ЭМИ+никотин согласуется с результатами Рис. 24. Изменение размеров агрегатов УДА исследований на эритроцитах. под действием ЭМИ КВЧ и никотина Не обнаружено отрицательного воздействия ЭМИ резонансных частот в диапазоне 150-170 ГГц (ППЭ 10 мкВт/см2) на мембраны эритроцитов (табл.3).

Показано, что излучение на частотах 151.8;

156.6;

161.3 ГГц потенцирует дестабилизирующее действие никотина (10-5, 10-6 моль/л) на мембраны, а излучение на частотах 155.7 и 167.1 ГГц снижает эффект никотина, что свидетельствует о протекторных свойствах волн указанных частот. Отмечена корреляция эффектов воздействия ЭМИ частот 155.7 и 167.1 ГГц на клетки инфузорий и мембраны эритроцитов.

Таблица Относительный процент гемолиза эритроцитов, после изолированного и комбинированного воздействия никотина и ЭМИ № Относительный процент гемолиза никотин 10-5 моль/л никотин 10-6 моль/л серии ЭМИ без опы- (ГГц) комбинир. комбинир. с никотина изолир. изолир.

тов с ЭМИ ЭМИ 1 151.8 1.33 ± 0.19 1.21 ± 0.19 1.75 ± 0.16 0.92 ± 0.14 2.00 ± 0. 2 155.7 0.57 ± 0.08 1.03 ± 0.09 0.65 ± 0.16 0.86 ± 0.12 0.86 ± 0. 3 156.6 1.11 ± 0.17 0.97 ± 0.21 1.38 ± 0.24 0.95 ± 0.20 1.35 ± 0. 4 161.3 0.94 ± 0.13 1.00 ± 0.08 1.56 ± 0.32 1.03 ± 0.13 1.33 ± 0. 5 167.1 0.92 ±0.20 1.22 ± 0.2 1.16 ± 0.24 0.92 ± 0.07 1.00 ± 0. Таким образом, применение двух модельных систем, позволяющих регистрировать структурно-функциональные изменения в клеточных мембранах в результате изменения структуры и подвижности примембранной воды, помогло нам обнаружить в малоизученном терагерцовом диапазоне новые резонансные частоты. Предполагается, что они являются биологически эффективными и могут содействовать адаптации живого организма к неблагоприятному воздействию токсичных веществ.

Глава 6. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МОДЕЛИ В ИЗУЧЕНИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В СИСТЕМАХ БАКТЕРИИ-БАКТЕРИИ, БАКТЕРИИ-ЗЛАКИ Анализ литературных данных показал, что способность бактерий к агрегации и сорбции на корнях растений зависит от структуры компонентов бактериальных и растительных клеточных поверхностей (Burdman et al, 1998, 1999;

Никитина и др., 2001;

Федоненко и др., 2001, 2004). Макромолекулы, определяющие специфичность этих процессов, а также механизмы взаимодействий окончательно не установлены.

Как правило, в системе азоспириллы-злаки большее внимание уделяется белок-углеводным взаимодействиям, поскольку этот механизм лежит в основе реакции антиген-антитело. В последние годы открыт новый тип молекулярного распознавания - углевод-углеводное взаимодействие, которое, по утверждению S. Hakomori (2001), происходит за счет образования межмолекулярных водородных связей. Мы предположили, что в процессах образования микробных агрегатов и микробно-растительных ассоциаций могут иметь место полисахарид-полисахаридные взаимодействия. Для исследования таких сложных многокомпонентных процессов нами использовались приемы и методы моделирования. Исходными данными послужили известные для бактерий А. brasilense Sp 245 состав ЛПС (липид А, погруженный в билипидный слой мембраны, олигосахаридный «кор» и О-ПС, который обращен в окружающую среду) и структура повторяющегося звена О-ПС, состоящего из пяти остатков D-рамнозы (Fedonenko et al, 2002).

Нами предложены модели бактериальной поверхности, представляющие собой липосомы, инкрустированные ЛПС внешней мембраны клеток А.

brasilense Sp 245.

В рамках модифицированной континуальной модели Хопфингера-Шераги проведено молекулярное моделирование пространственного расположения молекулы О-ПС, состоящего из пяти звеньев D-рамнана, относительно границы раздела фаз вода-липофильная среда (рис.25). Определено межфазное натяжение на границе вода-липид в зависимости от концентрации в водной среде ЛПС (рис.26). В результате доказано, что ЛПС встраиваются в липосому липидной частью, их О-ПС направлены в окружающую среду и расположены по нормали к поверхности липосом.

Рис. 26. Зависимость межфазного натяжения () от молярной концентрации (Сi) ЛПС. Кривая аппроксимация по формуле Шишковского Из полученных экспериментальных данных по формуле Гиббса рассчитана площадь, которую занимает одна молекула ЛПС в монослое - 92± Рис. 25. Ориентация ЛПС на границе раздела фаз “вода липофильная среда” Методом динамического рассеяния света изучен процесс агрегации липосом, имитирующий агрегацию бактерий. Установлено, что размеры агрегатов липосом, инкрустированных ЛПС, значительно увеличиваются по сравнению с размерами агрегатов пустых липосом (рис.27).

Методами молекуляр Автокорреляционная функция ной динамики установлены g() термодинамически равно- 1. g()~exp(-a) весные конформации О-ПС a=0. А. brasilense Sp245 в водной size=430 nm фазе. Показано, что при взаимодействии двух цепей 1 полисахаридов с анти- 2 параллельной ориентацией наиболее энергетически a=1. выгодной является струк- size= 210 nm тура типа двойной спирали, образованная за счет 0. 0.2 0.4 0.6 0.8 1. межмолекулярных водород- t, мс ных связей. Полисахариды, Рис. 27. График зависимости нормированной ориентированные парал- автокорреляционной функции флуктуаций фототока лельно друг другу не рассеянного света при температуре 298 К от времени t образуют устойчивого для липосом (1) и липосом со встроенным ЛПС (2).

Размер липосом определялся по параметру a комплекса (рис.28,29).

автокорреляционной функции, рассчитанному из приведенных на графике данных по методу наименьших квадратов с применением аппроксимации g()~exp(-a ) - выделены фиктивные атомы с молекулярной Рис. 28. Расположение двух массой 1000 Да;

цепей, состоящих из одного звена - показано направление, которое принимают О-ПС бактериального ЛПС, относительно друг друга полисахаридные цепи через направленных параллельно друг 1000 pc моделирования другу и по нормали к поверхности Рис. 29. Комплекс, полученный в результате сферы, имитирующей липосому молекулярно-динамического моделирования взаимодействия двух цепей, состоящих из пяти звеньев О-ПС при исходной параллельной ориентации Следовательно, липосомы, содержащие на своей поверхности О-ПС азоспирилл, образуют агрегаты посредством полисахарид-полисахаридного взаимодействия.

Для изучения роли ЛПС в процессе адсорбции бакте млн. доли риальных клеток на корнях пшеницы нами созданы модельные системы, пред ставляющие собой липосомы, инкрустированные ЛПС и загруженные красителем метиленовым синим. Иссле довался процесс их сорбции на а б в г д корнях пшеницы сорта 45 мин 24 ч Саратовская 29 (рис.30).

а - контроль, б - липосомы без ЛПС, Установлено, что модель в - липосомы с низким содержанием ЛПС, ные системы, подобно живым г - липосомы с высоким содержанием ЛПС, бактериальным клеткам, д - раствор ЛПС сорбируются на корневой Рис. 30. Количество красителя (млн. доли от веса поверхности пшеницы.

сухого корня), адсорбированного корнями Показано, что степень сорбции пшеницы из растворов и суспензий после полного погружения корней в среды и инкубации в течение зависит от присутствия и 45 мин;

после фиксации среза корней над содержания в мембранах ЛПС, поверхностью сред и инкубации в течение 24 ч что доказывает участие ЛПС во взаимодействиях в системе «азоспириллы-злаки».

Таким образом, установлено, что экспериментальные и компьютерные модели можно успешно использовать при исследовании молекулярных механизмов межклеточных контактов.

Кроме того, нами изучалась возможность применения модельных систем для целевой доставки химических соединений к корням пшеницы.

Первоначально в экспериментах использовали липосомы, загруженные флуоресцентным зондом ФН, изучалась их способность к адсорбции на корнях пшеницы. Интенсивность флуоресценции зонда, сорбированного корнями из эмульсии липосом, оказалась выше по сравнению с контролем в 547.5 раз.

Высокое сродство липосом к корневой поверхности объясняется встраиванием молекул ФН в их мембрану определенным образом. Подобный результат можно ожидать и в случае применения в качестве активного химиката в системах доставки соединения со структурным подобием ФН.

Далее использовались липосомы, обогащенные ЛПС и загруженные ИУК.

Исследовалось их влияние на рост колеоптилей пшеницы в фазе растяжения и на рост пшеницы в гидропонном растворе (табл.4). В обоих экспериментах доказана эффективность транспорта этих систем к корням растений.

Таблица Длина проростков пшеницы, выращиваемой в гидропонной среде различного состава Раствор /Суспензия Длина растения, мм Гидропонный раствор (контроль) 1456± Раствор ИУК, 10 мг/л 1620± Липосомы с ЛПС (150 мг/л) и ИУК, 10 мг/л 1697± Наночастицы диоксида кремния использовались в качестве другой вероятной системы целевой доставки химических веществ к корням пшеницы.

Их выбор обусловлен возможностью инкрустации частиц полисахаридами растений, которые являются более привлекательными по сравнению с бактериальными ЛПС. В качестве углеводной детерминанты использовали полисахариды высокой молекулярной массы (ВПС) и низкой молекулярной массы (НПС), выделенные из корней пшеницы, в качестве зонда - 10-5 М раствор ФН. Из рис. 31 видно, что наибольшая степень сорбции наблюдается для наночастиц, инкрустированных ВПС и НПС в концентрации 10-1 г/л, при их содержании в гидрозоле 10-4 г/л. По сравнению с частицами без полисахаридного покрытия она возрастает в 22.2 раза для ВПС (рис. 31а) и в 11.3 для НПС (рис. 31б).

I отн, % I отн, % 0 -6 -5 -4 -3 -2 -1 -6 -5 -4 -3 -2 - lg C lg C —— – 10-1 г/л ВПС;

—— - 10-2 г/л ВПС;

—— – 10-1 г/л НПС;

—— - 10-2 г/л НПС;

—— –.10-3 г/л НПС;

—— без НПС —— – без ВПС, а б Рис. 31. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции экстракта корней после их инкубации в гидрозолях наночастиц, инкрустированных ВПС (а), НПС (б), от концентрации частиц (lg C) и полисахаридов Таким образом, установлено, что липосомы и наночастицы, несущие на поверхности углеводные детерминанты, как бактериальной, так и растительной природы, являются эффективными системами для направленного транспорта химических веществ к корням растений.

Результаты исследований позволяют заключить, что разработанные нами модельные системы могут найти применение не только для исследования фундаментальных основ неспецифических и специфических взаимодействий, но и практического применения в биотехнологиях.

ВЫВОДЫ 1. Получила развитие методология моделирования клеточных поверхностей для исследования молекулярных механизмов физико-химической коммуникации живых систем.

2. Методами экспериментального и молекулярного моделирования установлено, что эффекты малых доз биологически активных веществ реализуются посредством их неодинакового воздействия на структуру воды у поверхности биологических объектов.

3. Разработаны модели клеточной поверхности для изучения роли водной компоненты во взаимодействиях живых систем с биологически активными веществами в низких концентрациях. С их помощью исследованы концентрационно-зависимые эффекты воздействия индолил-3-уксусной кислоты, никотина и метронидазола на биосистемы различных уровней организации.

4. Обнаружены дозо-зависимый разнонаправленный характер действия индолил-3-уксусной кислоты на биосистемы популяционного, организменного, клеточного, молекулярного уровней организации и эффект низких концентраций (10-17 моль/л). Определено разнонаправленное действие ИУК на подвижность и структуру приповерхностной воды в зависимости от свойств поверхности.

5. Показано, что никотин в низких (10-12-10-9 моль/л) концентрациях оказывает дестабилизирующее действие на клеточные мембраны, что обусловлено увеличением подвижности приповерхностной воды.

6. Установлено, что метронидазол в концентрационном интервале 310-2 310-10 моль/л оказывает протекторное действие на клеточные мембраны, что связано с его способностью стабилизировать структуру сетки водородных связей примембранной воды.

7. Установлена способность ИУК в определенных концентрациях накапливаться на границе раздела фаз и вызывать фазовый -переход в структуре сетки водородных связей воды, что может обуславливать эффект малых доз и разнонаправленность биологического действия вещества.

8. Разработаны сенсорные системы для определения ИУК (до 10-10 г/л) в водной среде на основе способности вещества в определенных концентрациях изменять структуру приповерхностной воды.

9. Изучено изолированное и сочетанное действие КВЧ-излучения и БАВ на модельные биосистемы. Установлено литическое действие ЭМИ 55-73 ГГц нетепловой интенсивности на мембраны. В диапазоне 150-170 ГГц обнаружены новые резонансные частоты, вызывающие биологический отклик. Показано, что эффект комбинированного действия ЭМИ КВЧ на резонансных частотах и БАВ в низких концентрациях зависит от характера воздействия вещества на структуру водной компоненты.

10. Разработаны молекулярные модели для исследования механизмов межклеточных контактов в процессах агрегации бактериальных клеток и их адсорбции на корневой поверхности пшеницы. Доказано участие О-специ фического полисахарида липополисахарида внешней мембраны бактерий А.

brasilense Sp245 и показана возможность полисахарид-полисахаридных взаимодействий в этих симбиотических процессах.

11. Установлено, что липосомы и наночастицы, несущие на поверхности углеводные детерминанты бактериальной или растительной природы, являются эффективными наносистемами для направленного транспорта химических веществ к корням растений, что может найти применение в биотехнологиях.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Экспериментальное и теоретическое изучение водных растворов некоторых лекарственных соединений / П.Е. Кузнецов … С.М. Рогачева [и др.] // Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине: тез. докл. I Рос. школы-конф., Саратов, 18–20 сентяб., 2002 г. – Саратов, 2002. – С.28.



Pages:   || 2 |
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.