авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Молекулярная динамика пептидных структур и функционирование ионного канала глицинового рецептора

На правах рукописи

Терёшкина Ксения Борисовна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА ПЕПТИДНЫХ СТРУКТУР И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ИОННОГО КАНАЛА ГЛИЦИНОВОГО РЕЦЕПТОРА Специальность 03.00.02. - "Биофизика"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Москва – 2006

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Москов ского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Немухин Александр Владимирович (химический факультет МГУ) кандидат физико-математических наук Балабаев Николай Кириллович (ИМПБ РАН)

Ведущая организация: Институт химической физики им. Н. Н. Семёнова РАН, г. Москва

Защита состоится " " 2006 г. в часов на за седании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государствен ном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, Ленин ские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория "Новая".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан: " " апреля 2006 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Т. Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы при решении фундаментальных и прикладных задач молекулярной биоинженерии и биофизики активно исполь зуются методы молекулярного моделирования и молекулярного дизайна. При этом внимание уделяется всё более сложным и большим молекулярным систе мам, таким как белки-ферменты, мембранные белки, биомембраны и ионные каналы и др. Совершенно очевидно, что применение методов обычной равно весной молекулярной динамики к столь большим объектам встречает опреде ленные затруднения, связанные с невозможностью за сколь либо реальное вре мя изучить все возможные конформационные изменения в системе и получить таким образом статистически корректные результаты. Поэтому возрастает важ ность методов неравновесной молекулярной динамики, или управляемой моле кулярной динамики (SMD), суть которых заключается в следующем. Над сис темой проводится серия численных экспериментов, в которых создаются спе циальные неравновесные условия (состояния) и изучается релаксация этих со стояний. Рассматриваются серии релаксационных процессов с характерными временами до 10 нс. В результате становится возможным определение кинети ческих и релаксационных параметров системы, которые несут информацию о функциональном акте и связанных с ним конформационных перестройках. Это направление является перспективным, в частности, для исследования связи структуры и функционирования крупных молекулярных объектов таких, как мембранные белки, ионные каналы и др. Что весьма актуально с биологической точки зрения, т.к. ионные каналы играют ключевую роль в поддержании гомео стаза, передаче сигнала в возбудимых клетках, создания и поддержания мем бранного потенциала в прокариотических и эукариотических клетках. Меха низм их функционирования, в части ионной проводимости, во многом опреде ляется строением мембранной части рецепторов. Эти же методы могут быть применены также и к другим сложным случаям. Следует отметить, что, не смотря на полезность метода управляемой молекулярной динамики, он сущест венно менее развит по сравнению с методом равновесной молекулярной дина мики. Поэтому актуальным также является и развитие основ этого метода в применении к различным классам объектов, и установление качественных про токолов моделирования.

Целью работы является изучение механизмов миграции ионов сквозь канал мембранных рецепторов на основе разработки новых методических под ходов и протоколов управляемой молекулярной динамики, построение струк туры канальной части глицинового рецептора в закрытом и открытом состоя ниях, исследование процессов переноса ионов при функционировании ионного канала глицинового рецептора, изучение влияния действия внешних сил, элек тростатических свойств канала и сольватированных комплексов ионов на ди намику миграции ионов, а также разработка методов и программного обеспече ния для анализа результатов вычислительных экспериментов.

Постановка задачи.

Для достижения этих целей необходимо было поставить и решить сле дующие основные задачи:

1. Отработать методические вопросы метода управляемой молекулярной дина мики в части:

• изучения влияния термостатов Берендсена, Нозе-Гувера, столновительной и ланжевеновской динамики на поведение рассчитываемых систем, на энерге тические и вероятностные характеристики системы;

• сравнения параметров динамического поведения пептидных структур в сре дах с различной гидрофобностью;

• вычисления методами квантовой химии высот потенциальных барьеров за торможенного вращения и парциальных атомных зарядов для уточнения па раметров силового поля;

• изучения влияния внешних сил и искусственных стерических препятствий на динамику макромолекул.

2. Реконструировать по гомологии структуру канальной части глицинового ре цептора в закрытом состоянии.

3. Провести изучение динамики различных ионов и молекул воды внутри кана ла методом управляемой молекулярной динамики и установить возможное нахождение ворот канала, определяющих селективность и скорость проник новения ионов.

4. Определить путём направленных конформационных изменений вероятную структуру открытого канала глицинового рецептора и параметры взаимодей ствия интерьера открытого канала с гидратированными ионами.

5. Провести сравнительное исследование миграции через канал глицинового рецептора ионов и заряженных комплексов для установления соответствия расчётных и экспериментальных данных по подвижности.

Научная новизна:

Впервые - получена модель канальной части, имеющей следующую первичную после довательность: MET-ASP-ALA-ALA-PRO-ALA-ARG-VAL-GLY-LEU-GLY ILE-THR-THR-VAL-LEU-THR-MET-THR-THR-GLN-SER-SER-GLY-SER ARG-ALA, закрытого канала глицинового рецептора.

- предложен метод изучения канальной части мембранных рецепторов с ис пользованием стабилизирующего углеводородного кольца.

- построена полноатомная модель открытого канала глицинового рецептора.

Впервые проведено сравнительное исследование миграции гидратированных ионов сквозь канал глицинового рецептора.

- проведено сравнительное изучение миграции ионов при различных напря женностях силового поля.

- разработан протокол управляемой молекулярной динамики для изучения миграции ионов сквозь пору мембранных каналов.

Для достижения этих результатов был впервые проведён следующий комплекс методических разработок:

- проведено сравнительное изучение динамики систем при использовании практически всех используемых термостатов: Берендсена, Нозе-Гувера, ланжевеновской и столкновительной динамики. Определено влияние термо статов на характер изменения распределений плотностей вероятностей и энергетических характеристик системы.

- проведен вычислительный эксперимент по сравнительному изучению влия ния гидрофобности среды на динамические свойства всех 20 природных аминокислотных остатков.

- проведено сравнительное изучение динамики ноотропного агента СЕМАКС и его аналогов.

- проведено сравнение параметров цис-транс переходов в молекуле ретиналя в различных электронных состояниях методом управляемой молекулярной динамики.

Практическое значение работы. Разработанные методы, протоколы управляемой молекулярной динамики для изучения сложных систем и полу ченные данные по влиянию гидрофобности среды, аминокислотного состава, зарядов и других параметров на конформационную подвижность имеет практи ческое значение для развития методов молекулярного дизайна биологических функционально активных структур. Это может быть использовано при разра ботке новых лекарственных препаратов, проведении фундаментальных и при кладных исследований для определения связи структуры и функциональной ак тивности биомолекул. По результатам работы было разработано и внедрено в процесс обучения молекулярной динамике студентов биологического факуль тета МГУ методическое пособие "Молекулярная динамика белков и пептидов", М.: Ойкос, 2004. – 103с. (К. В. Шайтан, К. Б. Терёшкина).

Достоверность результатов диссертации обеспечивается использовани ем универсальных законов и уравнений классической и квантовой механики и проведением тестовых расчётов систем, сравниваемых с экспериментальными данными.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 4-ой Школе-конференции В.А.Фока по квантовой и компьютерной химии (Москва, 2001 г.), 5-ой Школе-конференции В.А.Фока по квантовой и компьютерной хи мии (Великий Новгород, 2002 г.), Международной конференции "Ломоносов 2002" (Москва, 2002 г.), Первой национальной конференции “Информационно вычислительные технологии в решениии фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины” (Москва, 2002 г.), 5-ом Международном конгрессе по математическому моделированию (Дубна, 2002 г.), 6-ой Школе-конференции В.А.Фока по квантовой и компью терной химии (Великий Новгород, 2003 г.), 4-ом Европейском биофизическом конгрессе (Испания: Аликанте, 2003 г.), на семинаре лаборатории биологиче ской физики Института биофизики Федерального университета Рио-де Жанейро (Бразилия: Рио-де-Жанейро, 2003 г.), Международной конференции "Ломоносов-2004" (Москва, 2004 г.), 29-ом Конгрессе Европейского биохими ческого общества (Польша: Варшава, 2004 г.), Форуме молодых учёных при 29-ом Конгрессе Европейского биохимического общества (Польша: Варшава, 2004 г.), 9-ом Международном конгрессе по математическому моделированию (Нижний Новгород, 2004 г.), 3-ей Всероссийской Школе-Симпозиуме "Дина мика и структура в химии и биологии" (Москва, 2005 г.), Международной кон ференции по классическому и квантово-динамическому моделированию в хи мии и биологической физике (Германия: Дрезден, 2005 г.), 30-ом Объединён ном конгрессе Европейского биохимического общества и Международного союза биохимиков и молекулярных биологов (Венгрия: Будапешт, 2005 г.), Фо руме молодых учёных при 30-ом Объединённом конгрессе Европейского био химического общества и Международного союза биохимиков и молекулярных биологов (Венгрия: Вышеград, 2005 г.), 3-ем Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, 2005 г.), Конференции молодых ученых "Системная биология и биоинженерия" (Звенигород, 2005 г.), Московской меж дународной конференции "Биотехнология и медицина" (Москва, 2006 г.). Рабо та также докладывалась на семинарах кафедр биофизики и биоинженерии био логического факультета МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа (150 страниц) состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (203 ссылки), иллюст рирована 62 рисунками и содержит 20 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлен литературный обзор по методам молекуляр ной динамики и применению метода к изучению динамики биологических объ ектов. Дан обзор по современным методам квантовой химии, используемым для дополнения силового поля AMBER-99. Приведены данные по сравнитель ному изучению термостатов и протокол молекулярной динамики, используе мый в процессе исследования и дополняемый параметрами для управляемой молекулярной динамики. Литературный обзор по изучаемым объектам не вы несен в отдельную главу, а приводится далее по главам.

Во второй главе приведены результаты методических разработок по те ме диссертации. Исследована динамика пептидов в средах с различной гидро фобностью. Проведены МД расчёты двадцати природных аминокислотных ос татков и пяти форм модифицированного тирозина с различными положениями гидроксильных групп. Все аминокислотные остатки во избежание концевых эффектов были связаны с N-метиламином с C-конца и с ацетилом c N-конца.

Изучались модели молекул в полноатомном приближении.

Вычислялись одномерные, двумерные (1) и трёхмерные распределения плотностей вероятностей по торсионным углам,, и 1 и сечения Пуанкаре для всех сочетаний этих углов. Для оценки индивидуального динамического поведения торсионных углов вычислялись автокорреляционные функции спе циального вида (2).

P( k1, k 2 ) =... P(1,..., N ) d i (1) i k 1, k Fxx = eik ( t ) e ik ( t + ) (2) Здесь k(t) - значение торсионного угла в момент времени t.

Для сравнительного анализа динамического поведения аминокислотных остатков проводился дисперсионный анализ. Использовалась Евклидова метри ка для определения различий между картами уровней свободной энергии, для выявления однотипных объектов и классификации конформационных степеней свободы. Метрики для нахождения различий между двумерными картами (3) и автокорреляционными функциями (4) выбирались следующим образом:

( p (, ) ps,i (, )) d sr = a 2 (3) r,i i ( f r (t ) f s (t ) ) dt d sr = (4) max ( f i (t ) ) dt Здесь индексы r, s соответствуют двум разным аминокислотным остат кам, а – параметр разбиения, р – плотность вероятности, f – значение действи тельной части автокорреляционной функции, индексом i обозначена автокорре ляционная функция, интеграл под которой имеет максимальное значение на рассматриваемом участке. Для построения кластерного дерева был применён алгоритм выбора минимальных расстояний.

Было установлено, что с точки зрения динамического поведения в под пространстве торсионных углов, и 1, все монопептиды природных амино кислотных остатков проявляют сходные свойства. Основные отличия выявля ются для монопептидов пролина и глицина, связанные со спецификой структу ры их боковых радикалов. Для всех монопептидов наиболее заселены области, соответствующие -конформациям и правой -спирали.

Присутствие растворителя сглаживает рельеф потенциальной поверхно сти и увеличивает набор вероятных конформаций при данных условиях. При переходе от неполярной (столкновительной) к полярной (метанол, вода) среде наблюдается увеличение доступного конфигурационного объёма (табл. 1). Для остатков с заряженными боковыми радикалами этот эффект наиболее выражен.

Различия в динамическом поведении монопептидов максимальны в столкновительной среде, при переходе к метанолу и водной среде они соответ ственно уменьшаются. Изменения при вариации растворителя в наименьшей степени испытывают монопептиды с небольшими боковыми радикалами. Цик лизация монопептида при образовании водородной связи между атомами ки слорода ацильного остатка и водорода N-метильного остатка наиболее выраже на в столкновительной среде.

Таблица 1 Эффективный объём в процентах от всего объёма подпространства торсионных углов, 1 и. M – изменение объёма при переходе метанол столкновительная среда, W – изменение объёма при переходе вода столкновительная среда, WM – изменение объёма при переходе вода метанол.

Столкнови Монопептид тельная Метанол Вода M W WM среда ala 66,85 74,70 81,30 7,85 14,45 6, arg 42,54 51,97 57,93 9,43 15,39 5, asn 44,37 59,16 60,12 14,79 15,75 0, asp 21,27 31,99 49,54 10,72 28,27 17, cys 47,41 57,15 65,20 9,74 17,79 8, gln 54,69 59,73 62,42 5,04 7,73 2, glu 25,87 39,15 50,27 13,28 24,40 11, his 35,18 49,66 61,72 14,48 26,54 12, ile 35,99 41,12 45,68 5,13 9,69 4, leu 49,54 53,70 53,27 4,16 3,73 -0, lys 48,08 55,53 63,51 7,45 15,43 7, met 53,06 58,75 63,04 5,69 9,98 4, phe 48,76 60,20 62,93 11,44 14,17 2, pro 6,49 7,01 2,89 0,52 -3,60 -4, ser 65,73 64,00 69,92 -1,73 4,19 5, thr 39,57 42,62 50,38 3,05 10,81 7, trp 47,87 59,28 64,27 11,41 16,40 4, ty2 52,10 57,08 61,33 4,98 9,23 4, ty3 55,94 58,23 57,05 2,29 1,11 -1, tyc 57,08 56,08 59,22 -1,00 2,14 3, tyo 49,44 53,90 54,56 4,46 5,12 0, tyr 52,65 57,56 60,31 4,91 7,66 2, tys 52,55 56,36 63,16 3,81 10,61 6, val 37,47 44,93 46,26 7,46 8,79 1, В ряду модифицированных тирозинов дополнительная гидроксильная группа замедляет конформационные переходы по углу 1, а присутствие до полнительной шарнирной группы СН2, напротив, делает движение более сво бодным. Эти явления наиболее заметны в столкновительной среде. В метаноле и водном окружении наиболее замедлена динамика конформационных перехо дов по углу для тирозина без шарнирной метильной группы в боковом ради кале.

В третьей главе представлены результаты применения метода управляе мой молекулярной динамики к процессу изомеризации ретиналя. Методами Хартри-Фока с базисом 6-31ГФ и конфигурационного взаимодействия прово дится изучение барьеров вращения торсионных углов полиеновой цепи ретина ля в основном и возбуждённых состояниях. Методом конфигурационного взаи модействия получены барьеры вращения по связям, участвующим в изомериза ции в родопсине и бактериородопсине. Предварительно были проведены расчё ты этилена и бутадиена с целью определения метода расчёта и базиса для раз ложения молекулярных орбиталей, оптимального по соотношению соответст вия результатов с экспериментами и возможности их использования при суще ствующих компьютерных мощностях.

Полученные данные были использованы при параметризации силового поля для ретиналь-содержащих систем. При сравнении конформаций ретиналя, соответствующей минимуму потенциальной энергии, с конформацией внутри белкового окружения было показано наличие напряжения в цепи ретиналя внутри белка. Методом управляемой молекулярной динамики было проведено изучение динамики ретиналя. Для имитации напряжения полиеновой цепи ре тиналя в белковом окружении концы ретиналя фиксировались на расстояниях от 5 до 14. Было установлено, что напряжения полиеновой цепи и распреде ление барьеров внутреннего вращения способствуют появлению коллективной степени свободы, вовлекающий в процесс изомеризации сразу две двойные свя зи. Таким образом, результативное взаимодействие ретиналя и белкового окру жения делает эффективность процесса очень высокой (квантовый выход более 67).

Четвёртая глава посвящена изучению динамики функционирования ионного канала глицинового рецептора. С помощью приложений Swiss-Model, 3D-JIGSAW и др. было проведено моделирование структуры канальной части глицинового рецептора по гомологии. Наряду с этим проводилось построение модели канала на основании данных о трёхмерной структуре ТМ2-спирали 1-субъединицы. С помощью специальной программы ТМ2-спираль была по вёрнуты на 0о, 72о, 144о, 216ои 288о вокруг оси поры, затем были сделаны ради альные смещения. Предварительно спирали были сориентированы вдоль оси Z.

Особое внимание уделялось расположению аминокислотных остатком, играю щих ключевую роль в процессе прохождения ионов. Для проверки правильно сти полученной модели каждая спираль ТМ2-спираль поворачивалась на 5-20о относительно своей оси и проверялось расположение ключевых аминокислот ных остатков и взаимная ориентация спиралей. Среди различных структур, по лученных по гомологии, были выбраны модели, основанные на данных для ни котинового ацетилхолинового рецептора из нервно-мышечного синапса (PDB: 1OED). Эти модели были использованы для получения структуры канала глицинового рецептора. Предположительно была получена структура закрыто го канала. Для устранения краевых эффектов N-конец каждой -спирали был связан с ацетилом, C-конец – с н-метиламином.

Были проведены исследования прохождения ионов и комплексов сквозь канал при различных условиях. Во всёх расчётах использовался метод управ ляемой молекулярной динамики, включающий в себя стандартный протокол молекулярной динамики, дополненный введением сил, действующих на ионы и комплексы (табл. 2).

Таблица 2 Протокол молекулярной динамики.

Параметр Значение Потенциальное поле AMBER- “Длина траектории” до 20 нс Термостат столкновительный Масса виртуальных частиц m=18 а.е.м.

=55 пс- Частота столкновений виртуальных частиц с атома ми рассчитываемой молекулы Температура термостата 300К Температура релаксации в начальный период расчё- 500К та Режим фиксации атомов включён Диэлектрическая проницаемость среды варьировалась Радиус обрезания для электростатических взаимо- R el =2 нм действий Интервал обрезания для взаимодействий Ван-дер- R VdW =1,5 - 1,6 нм Ваальса Алгоритм численного интегрирования Верле Метод определения начальных скоростей атомов генератор случайных чисел по распределению Максвелла Шаг интегрирования 1 фс Шаг записи в траекторный файл 0,1 пс Шаг создания файла контрольной точки 0,1 пс Сила, действующая на атом или комплекс варьировалась Силы, прикладываемые к атому или комплексу, были направлены вдоль нормали мембраны с внеклеточной стороны во внутриклеточную. Параметры для иона Cl- соответствовали параметрам атома IM в справочнике AMBER99.

Все расчёты были проведены с помощью программного комплекса PUMA. Си ловые константы для валентных связей, валентных углов, торсионных углов гидратированных комплексов ионов находились с помощью программы GAMESS. Проводилась оптимизация геометрии системы методом Хартри-Фока с разложением молекулярных орбиталей по базису 6-31ГФ**. Парциальные за ряды на атомах находились методом электростатического потенциала. В неко торых случаях для сравнения были использованы заряды, найденные методом Малликена.

Для контрольных расчётов ионной проводимости созданных моделей ка нала значение диэлектрической проницаемости среды бралось равным двум, значение силы составляло 6 ккал/(моль). Это связано с тем, что при таком значении силы возможно прохождение ионов сквозь закрытый канал без потери его селективности. Изучалась миграция ионов Cl - и Na +, гидратированных шестью молекулами воды. Ниже приведены графики миграции ионов сквозь пору рецепторов, полученных по гомологии (рис. 1). В первой модели (рис. 1а) радиус канала в самом узком месте составляет 2,2, во второй модели (рис. 1б) – 2,5;

модели отличаются поворотом спиралей. На обоих рисунках заметно, что время прохождения иона Cl - в 34 раза больше времени прохождения иона Na + (на втором рисунке обозначен как Na 1 ). Для того чтобы исключить воз + можные артефакты, связанные с парциальными зарядами на атомах, во второй модели был также проведён расчёт миграции иона натрия с увеличенным в 1, раза по абсолютной величине зарядом (обозначен как Na + ). Однако сущест венного уменьшения скорости иона в канале добиться не удалось.

Cl Z, Z, Na+ + Na 80 + Na 90 70 Cl 0 50 100 150 200 250 300 0 20 40 60 80 100 а б t, пс t, пс Рис. 1 Миграция ионов Cl - и Na + сквозь пору канала глицинового рецептора в моделях канала, полученных по гомологии с ацетилхолиновым рецептором. См. объяснения в тексте.

Таким образом, было установлено, что модели, полученные по гомоло гии, нуждаются в серьёзной корректировке. Одним из факторов изменения се лективности может служить то обстоятельство, что в полученных моделях бо ковые радикалы остатков аргинина, играющие предположительно ключевую роль в процессах миграции ионов, не обращены внутрь канала. Указанные не достатки модели были устранены после изменения геометрии -спиралей на основе данных о трёхмерной структуре -спиралей вторых трансмембранных доменов глицинового рецептора (PDB: 1MOT). Радиус канала в узкой части был взят 2,1. На рис. 2а показаны графики движения ионов Cl - и Na + в моде ли закрытого канала. Замедление иона Na + происходит на уровне первого ар гининового кольца;

затем ион полностью останавливается в области канала с обращёнными внутрь боковыми радикалами остатков метионина. Ион хлора почти не чувствителен к присутствию первого аргининового кольца при боль ших силах. Заметным потенциальным барьером служит второе аргининовое кольцо. Для сравнения показана динамика прохождения иона Cl - при =1. Ион останавливается в области остатков метионина и треонина. Тот же эффект был обнаружен для ионов I -, Br -, F-, модельного иона Cl 2-, K +, Li +, Cs +, Mg 2+, Rb +. Следует заметить, что молекулы воды могут проходить через канал при действии на порядок меньших сил, что может говорить об электростатической природе ворот канала.

Arg1 + Na = Met* Cl = Z, - Arg Cl = - 0 200 400 600 800 1000 1200 а t, пс MDAAPAR2VGLGITTVLTM*TTQSSGSR1A б MDAA-ER2VGLGITTVLTM*TVQSSGSR1A Рис. 2 Миграция ионов Cl - и Na + сквозь пору канала глицинового рецептора в модели открытого канала: показан общий вид рецептора, обозначены остатки Arg (первое вверху и второе – внизу аргининовые кольца) и Met (а);

выравнивание последователь ностей ТМ2-домена глицинового рецептора дикого типа (верхняя последовательность) и рецептора с мутацией STM (б). Индексами 1, 2 и * обозначены первое, второе аргини новые и метиониновое кольцо соответственно.

По гомологии с моделью закрытого канала была построена модель канала глицинового рецептора с мутацией STM (рис. 2б).

При моделировании открытого канала были проведены повороты -спиралей относительно их оси на 20о. Затем были проведены повороты спи ралей друг относительно друга с образованием суперспирали. Радиальные смещения после поворота спиралей были сделаны таким образом, чтобы диа метр канала стал равным 5,2. Измерения радиуса канала проводились в про грамме HOLE. Структура TM2-спиралей были скорректирована на основании данных PDB: 1VRY. Эта запись содержит данные о структуре второго и третье го трансмембранных доменов 1-субъединицы глицинового рецептора челове ка. При построении модели рецептора были использованы только второй и тре тий трансмембранные домены, перед проведением расчётов третий трансмем бранный домен был удалён. Из имеющихся в файле PDB:1VRY 20 моделей бы ли выбраны первая и шестая модели, наиболее сильно отличающиеся ориента цией верхних и нижних частей спиралей. В качестве конечной была выбрана структура, основанная на первой модели из файла PDB:1VRY. Изучалось влия ние различных факторов на динамику ионов.

На рис. 3 представлен график зависимости миграции иона Cl - вдоль оси канала при различных значениях диэлектрической проницаемости среды () под действием силы F = -5z. Кривая, соответствующая расчёту с =1 не показа на, так как на приведённом интервале времён она совпадает с кривой, соответ ствующей =2. Видно заметное увеличение времени прохождения иона при пе реходе от =2 к =3, связанное с ослаблением электростатических взаимодейст вий между аргининовыми кольцами (z8 и 20 ) и ионом. Дальнейшее увели чение диэлектрической проницаемости среды приводит к сильному ослаблению (=4;

5) и полному исчезновению (=6) вклада электростатических взаимодей ствий в динамику иона. При =6 и выше скорость иона не изменяется при вы ходе из канала и движении в столкновительной среде. Похожую картину можно наблюдать при изменении силы, действующей на ион (рис. 3б-г), здесь =2.

На рис. 3в показан общий вид графика. Видно, что при силах, больших 5 ккал/(моль) (ток хлора направлен из внеклеточной области внутрь клетки) и меньших -6 ккал/(моль) (обратный ток) зависимость скорости иона от при ложенной силы описывается прямой линией. В случае большой по модулю си лы происходит быстрый отрыв гидратной оболочки иона. При силах около 5 ккал/(моль) по модулю ион становится нечувствительным к заряженным атомам внутри канала. Кривая зависимости скорости иона от силы не симмет рична относительно нуля. При силах, двигающих ион внутрь канала, наблюда ется более резкое повышение скорости иона Cl -. Этот эффект связан с процес сом отрыва гидратной оболочки иона. При уменьшении радиуса канала с 2, (рис. 3г, сплошная линия) до 2,3 (пунктирная линия) скорость Cl - уменьша ется. В случае периодической силы (рис. 3б) время прохождения иона опреде ляется начальным значением силы, частотой и амплитудой.

= 0 Z, Z, 3,5+1,5sin(2t/10) -10 -10 5+0,1sin(2t/50) 64 5+0,1sin(2t/10) -20 3 - - 0 50 100 150 0 200 400 600 800 1000 а б t, пс t, пс 3 0. 0. 0. v, /пс v, /пс 0 r = 2, 2, - -0. - -3 -0. -10 -5 0 5 10 -6 -4 -2 0 2 4 в г F, ккал/(моль) F, ккал/(моль) Рис. 3 Зависимость миграции иона Cl - от времени: а) при различных значениях ди электрической проницаемости среды;

б) при постоянной и периодической силах. Зави симость скорости движения иона Cl - от приложенной силы в каналах диаметра и 2,3:

в) для канала радиуса 2,6 показаны прямолинейные участки, г) подробная картина при малых силах: пунктирная линия – для канала 2,6, сплошная линия – для канала 2,3.

На рис. 4 представлены данные по коэффициентам диффузии ионов, рассчи танным при разных действующих на ион силах, диэлектрическая проницае мость среды для приведённых расчётов была взята равной двум. Коэффициент диффузии рассчитывался согласно уравнению Эйнштейна:

kT D= F = Здесь – коэффициент трения:, v где v – средняя скорость комплекса, F – действующая сила.

- x D, м2/с 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0. 1/F, (моль/ккал) Рис. 4 Зависимость коэффициентов диффузии ионов от величины, обратной действую щим силам. Приведённые данные соответствуют расчётам гидратированных ионов с двумя вариантами зарядов атомов в молекулах воды гидратной оболочки (M – расчёта по Малликену, E – c помощью метода электростатического потенциала) в каналах ра - - - диусов 2,3 (r) и 2,6 (R): – BF4 (M,r);

– Br (M,r);

– Br (E,r);

– Br (E,R);

– Cl - (M,r);

- - - – Cl (E,R, обратный ток);

– Cl (E,r);

– Cl (E,R);

– Cl(H 2 O) 2 (E,r);

- – Cl (E,r, начальная точка – на уровне первого кольца Arg);

– Cl (M,r, заряд q= 0.852);

– Cl (M,r, параметры потенциала Леннард-Джонса соответствуют CCl4);

– F- (M,r);

- - - - + – HCO 2 (M,r);

– I (M,r);

– I (M,R);

– I (E,r);

– Na (M,r);

– Na + (M,R);

+ - – Na (E,R);

– SCN (M,r);

– SCN (M,R). Сплошными линиями по казано изменение коэффициентов диффузии для иона хлора.

Коэффициент диффузии ионов сквозь пору канала зависит как от эффек тивного заряда иона, так и от абсолютного значения эффективных зарядов на атомах воды гидратной оболочки. Наблюдается также зависимость от радиуса канала. В среднем, коэффициент диффузии ионов в более узком канале ниже.

Диффузия иона Cl - происходит быстрее по направлению внутрь клетки. В слу чае остановки иона в области первого аргининового кольца дальнейшее про движение иона замедляется в среднем в 2,2 раза. При силе F=5 ккал/(моль) коэффициент диффузии Cl -, определяемый по формуле Эйнштейна, наиболее близок к экспериментальному и составляет 0.8110-9м2/с. Увеличение силы вы ше некоторого предела увеличивает эффективный коэффициент диффузии, по видимому, за счет образования неравновесного поля деформаций в канале (сре де).

На основании выражения для оценки проводимости канала:

c gmax (c) = e F r0 D kT, где e – заряд электрона, F – постоянная Фарадея, k – постоянная Больцмана, T – температура, D – коэффициент диффузии, ro – эффективный радиус канала, был получен следующий ряд проводимостей для открытого канала глицинового ре цептора: Cl- Br- I- SCN-, который согласуется с экспериментальными дан ными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, разработанные методы и протоколы управляемой моле кулярной динамики позволяют получить новую информацию о динамике и функционировании сложных молекулярных систем. Конструирование мем бранной части глицинового рецептора по гомологии с ацетилхолиновым рецеп тором и изучение прохождения ионов Na+ и Cl- показало, что при воссоздании структуры канала глицинового рецептора (сформированного пятью -спиралями) необходимо так поворачивать -спирали друг относительно дру га, чтобы внутрь канала были экспонированы положительно заряженные остат ки. Это согласуется с имеющимися экспериментальными данными по проводи мости глициновых рецепторов, мутантных по данным аминокислотным остат кам. В закрытом состоянии канала -спирали расположены параллельно друг другу. Переход канала из закрытой в открытую конформацию происходит при повороте каждой -спирали на угол порядка 20о с образованием суперспирали.

В закрытом состоянии канала торможение ионов происходит за счёт двух составляющих: электростатического взаимодействия иона с заряженными бо ковыми группами и стерических препятствий. Миграции ионов препятствуют два кольца, составленных из боковых радикалов аминокислотных остатков, экспонированных внутрь канала. Это положительное кольцо из остатков арги нина (диаметр поры в этом сечении 4) и нейтральное кольцо из остатков ме тионина (диаметр поры в данном сечении 3). В открытом состоянии канала внутрь также экспонированы два положительно заряженных кольца из остатков аргинина. Однако диаметр канала на уровне колец составляет 5,1 5,2, что согласуется с данными по проводимости канала для различных анионов.

Отрицательные ионы теряют гидратную оболочку при взаимодействии с положительно заряженными остатками первого кольца. Показано также, что миграция положительных ионов не происходит дальше уровня первого кольца за счёт сильного электростатического отталкивания. Модельными вычисли тельными экспериментами установлено, что динамика прохождения ионов че рез канал чувствительна к достаточно тонкому балансу электростатических взаимодействий. Характерное время прохождения отрицательных ионов сквозь пору канала зависит как от эффективного заряда иона, так и от абсолютного значения эффективных зарядов на атомах воды гидратной оболочки. При про хождении ионов через открытый канал средняя скорость прохождения иона возрастает с увеличением параметра диэлектрической проницаемости. Начиная с =4 транспорт иона Cl- становится нечувствителен к заряженным атомам внутри канала.

Наиболее хорошее совпадение расчётной проводимости канала с имею щимися экспериментальными данными наблюдается в силовом поле AMBER при использовании столкновительного термостата, F=3 5 ккал/(моль), =2.

При амплитуде внешнего силового поля F=5 ккал/(моль) и =2 коэффициент диффузии наиболее близок к экспериментальному и составляет 0.8110-9м2/с.

Полученный ряд проводимости для различных ионов при этих параметрах МД протокола имеет вид Cl- Br- I- SCN-, который полностью совпадает с экс периментальными данными.

На основании вышеизложенных результатов можно сделать следующие выводы.

ВЫВОДЫ 1. В закрытом состоянии канала глицинового рецептора -спирали расположе ны параллельно друг другу, внутрь канала экспонированы положительно за ряженные остатки аргинина. Переход канала из закрытой в открытую кон формацию происходит при повороте каждой -спирали на угол порядка 20о с образованием суперспирали.

2. Торможение ионов в закрытом состоянии канала происходит за счёт двух со ставляющих: электростатического взаимодействия иона с заряженными бо ковыми группами (остатки аргинина) и стерических препятствий (остатки метионина).

3. В открытом состоянии диаметр канала на уровне аргининовых колец состав ляет 5,1 5,2, что согласуется с данными по диаметру различных анионов, проходящих через канал. При взаимодействии с положительно заряженными остатками первого кольца отрицательные ионы теряют гидратную оболочку и проходят сквозь канал, положительных ионы – не могут преодолеть этот барьер.

4. Динамика прохождения ионов через канал чувствительна к балансу электро статических взаимодействий. При прохождении ионов через открытый канал средняя скорость прохождения иона возрастает с увеличением параметра ди электрической проницаемости среды. Начиная с =4 движение иона Cl- ста новится нечувствительным к небольшим вариациям атомных зарядов внутри канала.

5. При установленных параметрах МД протокола: силовое поле AMBER99, столкновительный термостат, F=5 ккал/(моль), =2 коэффициент диффузии наиболее близок к экспериментальному и составляет 0.8110-9м2/с, а получен ный ряд проводимости для различных ионов при этих параметрах имеет вид Cl- Br- I- SCN-, который полностью совпадает с экспериментальными данными.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Шайтан К. В., Терёшкина К. Б. – Молекулярная динамика белков и пептидов: Учебно-методическое пособие. М.: Ойкос – 2004 – 103с.

2. Шайтан К. В., Беляков А. А., Леонтьев К. М., Сарайкин С. С., Михай люк М. Г., Егорова К. Б., Орлов М. В., Геометрия энергетической поверхно сти и конформационная динамика: от углеводородов - к белкам и пептидам, // Хим.физ., 2003. – Т. 22. – №2. – С. 57-68.

3. Egorova K. B., Shaitan K. V., Ermilov A. Y. – Molecular Dynamics of Strained Retinal in Various Electronic States // International Journal of Quantum Chemistry. – 2004. – V. 94 – P. 219-225.

4. Shaitan K. V., Tereshkina K. B. – Molecular Dynamics of Small Peptides Using Ergodic Trajectories. In: Bioinformatics of Genome Regulation and Structure II (N. Kolchanov and R. Hofestaedt, eds. ), Springer Science+Business Media. – 2005. – P. 271-284.

5. Терёшкина К. Б., Шайтан К. В., Левцова О. В., Голик Д. Н. – Молекулярная динамика олигопептидов 6. Сравнительное изучение сечений Пуанкаре монопептидных структур в средах с различной гидрофобностью. // Биофизика. – 2005. –Т. 50. – № 6. – С. 974-985.

6. Шайтан К. В., Турлей Е. В., Голик Д. Н., Терешкина К. Б., Левцова О. В., Федик И. В., Шайтан А. К., Кирпичников М. П. – Молекулярная динамика и дизайн био- и наноструктур // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии. – 2005. – Т. 1. – Вып. 1. – С. 66-78.

7. Шайтан К. В., Турлей Е. В., Голик Д. Н., Терешкина К. Б., Левцова О. В., Федик И. В., Шайтан А. К., Ли А., Кирпичников М. П. – Динамический мо лекулярный дизайн био- и наноструктур // Российский химический журнал.

– 2006. – T. 50. Вып. 2. С. 53-65.

8. Шайтан К. В., Турлей Е. В., Голик Д. Н., Терешкина К. Б., Левцова О. В., Федик И. В., Шайтан А. К., Кирпичников М. П. – Неравновесная молекуляр ная динамика био- и наноструктур // Химическая физика. – 2006. Т. 25. № 7.

9. Egorova K. B., Shaitan K. V. – Ab initio Simulation of Internal Rotation in Proto nated Retinal. // Abstracts of the 4-th Electronic Session of the V.A. Fock School on Quantum and Computational Chemistry. Novgorod-the-Great, 2001. – http://194.226.222.41/fock/proceedings/4/470/retinal.htm.

10. Egorova K. B., Shaitan K. V., Ermilov A. Yu.. – The Effect of Protonation on Internal Rotation in Retinal. // Abstracts of the 5-th session of the V.A. Fock School on Quantum and Computation Chemistry. Novgorod-the-Great. – 2002. – P. 87.

11. Егорова К. Б., Шайтан К. В. – О физических основах функционирования молекулярных машин на примере ретиналя. // Первая Национальная Конференция “Информационно-вычислительные технологии в решениии фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины”. Сборник тезисов. Москва. – 2002. – С. 62-63.

12. Egorova K. B., Shaitan K. V. – Molecular Dynamics of the Quasi-Carnot Cycle for Retinal Isomerization Molecular Machine. // Proceedimngs of the V International Congress on Mathematical Modeling. Book of Abstracts. Moscow. – 2002. – V. 2. – P. 231.

13. Egorova K. B., Ermilov A. Yu., Shaitan K. V. – Isomerization of unsaturated molecules in various electronic sates by the example of butadiene and retinal. // Proceedimngs of the 6-th Session of the V.A. Fock School on Quantum and Computational Chemistry. Velikiy Novgorod. – 2003. – P. 115.

14. Egorova K. B., Shaitan K. V. – Retinal Isomerization in Terms of Quantum Chemistry and Molecular Dynamics // European Biophysics Journal. V. 32.(3). – 2003. – P. 214.

15. Егорова К. Б., Левцова О. В.– Сравнительное изучение динамического поведения аминокислотных остатков в воде, метаноле и столкновительной среде // Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2004". М.: МГУ. – 2004. – Т. 1. – С. 14.

16. Егорова К. Б.– Молекулярная динамика трансмембранных доменов ТМ альфа субъединицы глицинового рецептора и бета 2 субъединицы ацетилхолинового рецептора // Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2004".

М.: МГУ. – 2004. – Т. 1. – С. 15.

17. Левцова О. В., Егорова К. Б.– Кинематика конформационных переходов природных аминокислотных остатков // Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоно сов-2004". М.: МГУ. – 2004. – Т. 1. – С. 19-20.

18. Egorova K. B., Shaitan K. V. – Dynamic Properties of Natural Aminoacids Residues (a comparative study) // FEBS J., 2004. – V. 271. – Supp. 1. – P.63.

19. Egorova K. B., Shaitan K. V. – Dynamic Properties of Natural Aminoacids Residues (a comparative study) // FEBS Forum for Young Scientists, Abstract book, Warsaw, 2004. – P.15.

20. Egorova K. B., Levtsova O. V., Shaitan K. V. – Aminoacid Residues in Water, Simulated Water and Methanol Environment (a Comparative Molecular Dynamic Study) // Proceedimngs of the VI International Congress on Mathematical Model ing, Nizhny Novgorod, 2004. – P.495.

21. Tereshkina K. B., Shaitan K. V. – Ionic migration through glycine channel // FEBS Journal, 2005. –V. 272 (s1). – C1-066P.

22. Tereshkina K. B., Shaitan K. V. – Ionic migration through glycine channel // FEBS Forum for Young Scientists: Abstracts, Visegrad, 2005. – P.122.

23. Tereshkina K. B., Shaitan K. V. – Molecular dynamics of migration of ions and complexes through the glycine receptor TM2 domain // European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 2005. – V. 34(6). – P. 656.

24. Шайтан К. В., Терешкина К. Б., Турлей Е. В., Левцова О. В., Ли А., Го лик Д. Н. – Методы управляемой динамики для молекулярного дизайна сложных мембранных структур // Материалы третьего съезда Общества Биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова, Макс Пресс, Москва, 2005. – C.26.

25. Ли А.-Б., Терешкина К. Б., Шайтан К. В.– Механизм открытия канала аце тилхолинового рецептора // Сборник тезисов международной школы конференции молодых ученых "Системная биология и биоинженерия", 2005.

– C.108.

26. Терёшкина К. Б., Шайтан К. В.– Сравнительное изучение динамического пове дения СЕМАКСА и его аналогов // Материалы Московской международной конференции "Биотехнология и медицина", 2005. – C.50.

27. Щука Т. В., Терешкина К. Б.– Сравнительное изучение молекулярной динами ки антимикробных пептидов буфорина и магаинина // Сборник тезисов Меж дународной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2006". М.: МГУ. – 2006. – С. 259.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.