авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 ||

Геномно-протеомная характеристика вариабельности helicobacter pylori

-- [ Страница 2 ] --

Интересно, что соответствие между неметилированным C в GCGC и Т в GCGТ составило 3.3%. Уровень достоверности полученных различий р 0.01 (t-критерий). Полученные результаты, а именно значительную долю соответствий между C и T в составе ACGT-ATGT (28.3%) по сравнению с GCGC–GTGC (6.6%), можно объяснить различной функциональной активностью 5mC-метилтрансфераз в двух штаммах H. pylori. Только одна метилтрансфераза, обладающая 5mC-активностью, HP1121 (GmCGC), обнаружена в H. pylori 26695. В штамме J99 обнаружены две активные 5mC-метилтрансферазы: JHP1050 (GmCGC) и JHP435 (AmCGT).

Возможно, что присутствие активных метилаз одного типа в обоих штаммах H. pylori делает равновероятным процесс мутирования нуклеотидов в одних и тех же выровненных сайтах метилирования, где эти мутации не являются летальными. Вследствие этого профили мутаций в обоих штаммах H. pylori будут достаточно близки. Следует отметить, что если замена CT произошла в одной и той же позиции гена обоих штаммов, данная замена не будет распознана предложенным методом, поскольку нет исходной информации о нуклеотидной последовательности генов предка современного H. pylori и, следовательно, нельзя достоверно выявить историю появления того или иного нуклеотидного мотива, например, AТGT. Таким образом, степень отличий нуклеотидных замен в случае присутствии метилаз одного типа в обоих штаммах H. pylori будет невелика. Поэтому наблюдаемые нуклеотидные соответствия между GCGC-GTGC (6.6%), когда соответствующая метилаза активна в двух штаммах H. pylori, меньше, чем в случае, если активная метилаза присутствует только в одном штамме ACGT-ATGT (28.3%), но достоверно выше, чем соответствия между неметилированным C в нуклеотидном мотиве GCGC и Т в GCGТ (3.3%). Влияние (следы) метилирования на частоту транзиций СТ наиболее значительно проявляется только в том случае, когда один из сравниваемых штаммов обладает активной метилтрансферазой, а другой нет. Таким образом, если считать, что соответствие нуклеотидных мотивов по положению между двумя гомологичными геномными последовательностями организмов в пределах одного вида отражает нуклеотидные замены, произошедшие в популяции в процессе эволюции, то можно заключить, что в H. pylori, вероятно, протекают преимущественно мутации СТ, обусловленные механизмом метилирования-дезаминирования цитозина.

Разработка метода оценки частоты транзиций СТ с помощью реакции минисеквенирования с последующей масс-спектрометрией. Для проверки высказанного выше предположения, нами был разработан высокопроизводительный метод оценки частоты нуклеотидных транзиций СТ в сайтах метилирования генома H. pylori J99 на основе реакции минисеквенирования с последующей MALDI-TOF масс-спектрометрией.

Преимуществом предложенного метода является возможность масштабного мониторинга СТ транзиций во всем геноме бактерии. Учитывая, что скорость дезаминирования цитозина возрастает в 2–4 раза при его предварительном метилировании в 5-ом положении, мы разработали систему минисеквенирования ACGT фрагментов, сайта метилирования активной метилтрансферазой M.Hpy99XI в штамме H. pylori J99.

Предварительно при анализе открытых рамок считывания H. pylori J99 было найдено всего 465 тетрануклеотидных мотивов ACGT, из них в 396 мотивах цитозин является третьим нуклеотидом в кодоне, соответственно замены цитозина на тимин в этом положении являются нейтральными и не подвергаются отбору. Для детекции замен цитозина в ACGT тетрануклеотиде с помощью реакции минисеквенирования были подобраны 396 праймеров (СНП-праймеры), комплементарные 20-25 п.н. участку ДНК, находящемуся непосредственно перед ACGT тетрануклеотидом (http://www.ripcm.org.ru/2/2_1/2/2_5/head.php). В зависимости от нуклеотидной последовательности тетерануклеотида, СНП-праймеры достраиваются на два или три нуклеотида (рис. 10). Для амплификации фрагментов ОРС H. pylori использовали набор олигонуклеотидных праймеров Eurogentec (Бельгия). 792 праймера были подобраны для амплификации 328 ОРС H. pylori, включая старт и стоп кодоны. Штаммы H. pylori и J99 культивировали как описано ранее. Реакцию минисеквенирования с последующей MALDI-TOF масс-спектрометрией проводили по ранее разработанной методике. Учет результатов генотипирования производили на основании ожидаемых масс продуктов минисеквенирования – масса праймера плюс масса двух/трех нуклеотидов в зависимости от того произошла транзиция СТ или нет. Результаты минисеквенирования, полученные с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF, подтверждали прямым секвенированием ДНК с помощью ABI Prism Genetic Analyzer 3100 (“Applied Biosystems”, США), согласно протоколам производителя.

Рис. 10. А – Ожидаемые массы продуктов реакции минисеквенирования в зависимости от по полиморфизма второго нуклеотида в ACGT тетрануклеотиде. Б – MALDI TOF-масс-спектры продуктов реакции минисеквенирования ACGT мотива (слева) и ATGT (справа) Проверку разработанной системы проводили на двух штаммах H. pylori: 26695 и J99.

Для тестирования были выбраны 23 гомологичных гена с идентичностью 97–98%, причем, если в штамме J99 эти гены имеют только ACGT мотивы, то в штамме 26695 таких мотивов только 12, остальные 11 – ATGT. Эксперимент повторяли три раза. В результате были обнаружены все указанные мотивы, в том числе и ATGT мотивы в 12 генах штамма 26695.

Таким образом, аккуратность и воспроизводимость разработанного метода составила 100%.

Учитывая, что анализ 291 возможных транзиций СТ в специфических сайтах ACGT в геноме H. pylori J99 занимает 1.5 дня от амплификации фрагментов до получения результатов, разработанный подход будет использован в дальнейших экспериментах, связанных с влиянием модуляции активности метилтрансферазы на частоту транзиций СТ в геноме H. pylori.

Вклад процессов метилирования в вирулентность H. pylori. Для того, чтобы выяснить, действительно ли метилирование ДНК in vivo является причиной структурной и/или функциональной гетерогенности, необходимо было инактивировать активные метилтрансферазы в H. pylori. Учитывая, что лабораторные штаммы H. pylori 26695 и J потеряли способность к трансформации, был проведен скрининг среди клинических штаммов H. pylori с целью выявления естественно компетентных штаммов. В результате скрининга 44 клинических штаммов H. pylori был найден один естественно компетентный штамм H. pylori А45. Далее, для идентификации активных метилтрансфераз клинического штамма H. pylori А45 были использованы два подхода: установление паттернов чувствительности/устойчивости геномной ДНК к обработке различными эндонуклеазами рестрикции и детекция метилированных нуклеотидов путем анализа хроматограмм, полученных с помощью автоматического секвенатора ABI PRISM 3100.

Рис. 11. Электрофореграмма геномной ДНК штамма А45 H. pylori, обработанной различными эндонуклеазами рестрикции Результаты обработки геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции после электрофореза в агарозном геле представлены на рис. 11. ДНК штамма А45 H. pylori оказалась устойчива к гидролизу рестриктазами MboI, Hin6I, HinfI и чувствительна к обработке DpnI, что свидетельствует о присутствии метилированных нуклеотидов в последовательностях GATC, GCGC и GANTC. Метилирование аденина и цитозина в этих последовательностях является результатом присутствия в клетке метилтрансфераз M.HpyAIII, метилирующей аденин в последовательности GATC, M.HpyAVIII, метилирующей внутренний цитозин в последовательности GCGC, и M.HpyAIV, метилирующей аденин в последовательности GANTC. В штамме 26695 H. pylori эти метилтрансферазы кодируются генами HP0092, HP1121 и HP1352 соответственно.

Присутствие метилтрансферазы M.HpyAVIII является ожидаемым, поскольку она присутствует у всех ранее проанализированных штаммов H. pylori. Вполне вероятно, что высококонсервативные метилтрансферазы M.HpyАI и M.HpyAVIII могут быть вовлечены в регуляцию каких-то важных клеточных процессов. Ранее было показано, что экспрессия M.HpyАI повышается при контакте бактериальной клетки с клетками эпителия желудка, хотя роль, которую этот белок может играть в ходе адгезии клеток H. pylori остаётся неясной.

Метилтрансфераза M.HpyAIII также является весьма распространённой и по данным разных авторов встречается у 95%, 98% и 100% проанализированных штаммов.

Получение производных штамма А45 H. pylori, дефектных по генам метилтрансфераз. Для получения производных штамма А45 H. pylori, дефектных по генам метилтрансфераз M.HpyАI, M.HpyAIII, M.HpyAIV, M.HpyAVIII была проведена их направленная инактивация методом генного нокаута с использованием встройки в геном кассеты, содержащей в качестве селективного маркера ген aphA-3, обусловливающего устойчивость к канамицину.

1 2 3 4 Рис. 12. Результаты электрофореза в агарозном геле геномной ДНК, обработанной эндонуклеазой рестрикции MboI, исходного штамма А45-3 и полученного штамма, содержащего нокаут генов, кодирующих метилтрансферазу и рестриказу системы HpyAIII M.HpyAIII.

1 – маркер. 2 – геномная ДНК штамма А45-3, обработанная рестриктазой MboI. 3 – геномная ДНК штамма, содержащего нокаут генов, кодирующих метилтрансферазу и рестриказу системы HpyAIII- M.HpyAIII, обработанная рестриктазой MboI. 4 – геномная ДНК штамма А45-3. 5 – геномная ДНК штамма, содержащего нокаут генов, кодирующих метилтрансферазу и рестриказу системы HpyAIII- M.HpyAIII Проверку правильности встройки кассеты в геном H. pylori проводили с помощью ПЦР-анализа и секвенирования. Инактивация мишеней – генов, кодирующих метилтрансферазы, была подтверждена рестрикционным анализом геномной ДНК полученных штаммов с помощью метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции: MboI (GATC), Hin1II (CATG), Hin6I (GCGC), HinfI (GANTC). Изменение паттерна рестрикции геномной ДНК с устойчивого на чувствительный трактовалось как исчезновение метилирования в сайтах узнавания этих рестриктаз, связанное с инактивацией соответствующих метилтрансфераз. В качестве примера на рис. 12 приведены результаты электрофореза в агарозном геле обработанной эндонуклеазой рестрикции MboI геномной ДНК исходного штамма А45-3 и полученного штамма, содержащего нокаут генов, кодирующих метилтрансферазу и рестриказу системы HpyAIII- M.HpyAIII.

Оценка скорости роста полученных штаммов H. pylori. Большое число факторов определяет патогенность H. pylori и степень его вирулентности: подвижность клетки, механизмы адгезии, синтез уреазы, количество белков, узнающих рецепторы эпителиальных клеток и др. Так же H. pylori экспрессирует ряд токсинов, которые повреждают эпителиальные клетки как напрямую, так и опосредовано.

В ходе нашей работы была проанализирована скорость роста штаммов H. pylori, дефектных по M.HpyАI, метилирующей аденин в последовательности CATG;

дефектных по M.HpyAIII, метилирующей аденин в последовательности GATC и дефектных по M.HpyAVIII, метилирующей внутренний цитозин в последовательности GCGC (рис. 13). Как видно из представленных данных, все штаммы, дефектные по метилтрансферазам характеризовались сниженной скоростью роста по отношению к исходному штамму H. pylori А45. Наименьшая скорость роста была зарегистрирована для штамма H. pylori, дефектного по M.HpyAIII, метилирующей аденин в последовательности GATC.

0, 0, ОД 0, 0, 0 20 40 60 80 время (часы) Рис. 13. Кривые роста штамма H. pylori А45 ();

H. pylori дефектного по M.HpyАI ();

H. pylori дефектного по M.HpyAVIII () и H. pylori дефектного по M.HpyAIII ().

Таким образом, вероятно, что замедление скорости роста штаммов H. pylori дефектных по метилитрансферазам связано с эпигенетическими событиями, т.е. метилирование ДНК H. pylori in vivo действительно является одной из причин функциональной гетерогенности бактерии.

3. Микрофлюидные технологии для оценки функциональной гетерогенности клеточных популяций Обоснование модели. Изучение процессов, протекающих в живых системах, как правило, часто проводят на большом числе клеток, при этом измеряемый параметр является усреднённым значением и отражает суммарный ответ многих клеток. В ряде случаев подобный подход может приводить к неправильной интерпретации результатов, поскольку клеточная популяция является неоднородной и различные её субпопуляции имеют разные характеристики за счёт генетической гетерогенности, нахождения в разных стадиях клеточного цикла, вероятностной природы биохимических реакций в живых объектах и т.д.

Например, рассмотрим работы, посвященные поиску и анализу генов H. pylori, участвующих в адаптации бактерии к изменению рН среды. В работе Wen и коллег (2003) было идентифицировано 120 генов, экспрессия которых повышалась более чем в два раза при адаптации микроорганизма к среде рН 4.0. В то же время, Ang и коллеги (2001) нашли только 79 кислото-индуцируемых генов. Allan (2001) обнаружил только 7 генов, экспрессия которых изменялась более чем в два раза при понижении кислотности среды. Кроме того, данные Wen и Ang совпали только по 10 генам. Дискордантность данных, полученных при изучении адаптационных возможностей H. pylori к кислой среде, на наш взгляд, не может быть только связана с различным происхождением H. pylori штаммов. Подобная гетерогенность может быть обусловлена различными стадиями роста бактерий, фазами деления, дифференциации и т.д. Кроме того, показано как для бактерий, так и для эукариот, что даже в генетически идентичных и синхронизированных клетках паттерны экспрессии зависят от случайных флуктуаций, поэтому, чтобы исключить фактор гетерогенности популяции, измерение интересующего параметра необходимо проводить индивидуально для каждой клетки, что особенно информативно при использовании репортерных систем на основе флуоресцирующих белков.

Развитие технологии манипулирования индивидуальными бактериальными клетками является актуальной проблемой современной биологии, поскольку размер клетки, составляющий несколько микрометров, значительно ограничивает выбор средств для анализа отдельных живых микроорганизмов в режиме реального времени. Качественно новым подходом в изучении отдельных клеток является употребление микрофлюидных технологий, использующих миниатюризированные системы для контроля и управления потоками жидкостей или газов и реакциями, проходящими в них. Проведение химических и биологических процессов в микро- и нано-масштабе даёт ряд преимуществ, недостижимых в случае использования макросистем: оперирование с количествами жидкостей в границах от нано- до миллилитра, ускорение прохождения реакций, ограниченных диффузией веществ, снижение стоимости работ и количества отходов, повышение безопасности при работе с вредными веществами и патогенными микроорганизмами и т.д. В случае индивидуальных живых систем использование микрофлюидных платформ позволяет не только анализировать многие параметры индивидуальных клеток в реальном времени, но и с высокой точностью регулировать условия окружающей среды.

Описанные ранее микрофлюидные технологии для манипуляций с единичными клетками включают в себя (1) гидродинамические транспортировку и фиксацию;

(2) диэлекторофоретические методы;

(3) прямую транспортировку и фиксацию клеток с помощью микроклапанов и микронасосов, интегрированных в чип;

(4) оптические и оптоэлектронные методы;

(5) механическое удерживание клеток и др. Для прямых наблюдений за процессами, происходящими в единичных клетках, хорошо подходят системы на основе Green Fluorescent Protein (GFP) или его аналогов, флуоресценция которого может регистрироваться в живых клетках. Флуоресценция GFP может быть зарегистрирована и количественно оценена в отдельных клетках, в отличие от ряда других репортерных систем, сигнал от которых может быть измерен только при суммарном ответе большого числа клеток.

Для производства микрофлюидных чипов с целью анализа живых клеток, экспрессирующих GFP, хорошо подходят такие материалы как полиметилметакрилат (PMMA) и полидиметилсилоксан (PDMS), поскольку они являются биосовмесимыми материалами с хорошей оптической проницаемостью. В качестве основных требований к ним выдвигаются создание условий для длительного нахождения в них живых клеток, возможность точной регулировки параметров окружающей среды и наблюдений за клетками в режиме реального времени. Таким образом, создание микрофлюидной платформы, адаптированной для задач, поставленных в эксперименте, вероятно будет являться одной из ключевых задач любого исследования, связанного с анализом отдельных клеток.

Конструирование микрофлюидного чипа. Нами был спроектирован и сконструирован микрофлюидный чип, выполненный из оптически проницаемого полиметилметакрилата, состоящий из сети микрофлюидных каналов с ячейками, ввод пробы в которые осуществлялся с помощью перистальтического насоса. Выбранная топология и способ ввода проб позволяют культивировать клетки H. pylori и осуществлять их иммобилизацию химическим способом с помощью лектинов. Иммобилизованные клетки могут культивироваться внутри микрофлюидных каналов в течение нескольких часов без потери жизнеспособности, о чем свидетельствуют зарегистрированные случаи деления клеток (рис. 14).

Микрофлюидный чип состоит из пяти независимых дорожек, каждая из которых имеет четыре канала, содержащих по 20 ячеек (рис. 14А). Чип сделан из полиметилметакрилата (PMMA) методом фотолитографии с последующим термическим связыванием поверхностей (Epigem, Великобритания). Микрофлюидный чип с помощью пластиковых коннекторов крепится на платформе (Epigem, Великобритания), позволяющей осуществлять ввод пробы с помощью перистальтического насоса 2232 Microperpex S (LKB Bromma, Швеция).

Маркерные штаммы, содержащие кодирующую последовательность GFP, находящегося под промоторами генов sodB, flgB, rocF, ansB. Для оценки работоспособности микрофлюидного чипа использовали рекомбинатные плазмиды, содержащие промоторные области генов sodB, кодирующего супероксиддисмутазу, flgB, кодирующего минорную субъединицу проксимального стержня жгутика, rocF, кодирующего аргиназу, ansB, предположительно кодирующего аспарагин синтазу. Использование промоторных областей генов, имеющих разные механизмы регуляции, позволяет оценить возможности применения предложенной модельной системы с участием GFP для H. pylori. Во всех штаммах H. pylori, содержащих генно-инженерные конструкции, была зарегистрирована флуоресценция GFP. В качестве отрицательных контролей использовались штамм А45 H. pylori дикого типа и штамм А45 H. pylori, содержащий плазмиду pHel2-MCS-promotorlessGFP, для которого было показано отсутствие флуоресценции.

В зависимости от используемой в рекомбинантной плазмиде промоторной области в маркерных штаммах наблюдался различный уровень флуоресценции GFP. Наибольший уровень флуоресценции наблюдался в клетках, содержащих кодирующую последовательность gfp под промотором гена sodB, присутствие которого требуется для роста бактерии в микроаэрофильных условиях и выживания в условиях окислительного стресса. В клетках, содержащих кодирующую последовательность GFP под промоторами генов flgB и ansB, был зарегистрирован промежуточный уровень флуоресценции;

в клетках, содержащих кодирующую последовательность GFP под промотором гена rocF, был зарегистрирован наименьший уровень флуоресценции.

Иммобилизация клеток. Для иммобилизации клеток нами был предложен метод химической иммобилизации бактерий с помощью лектинов – белков, способных специфически связывать определённые углеводные части соединений, интегрированных в клеточную стенку: Concanavalin A связывается с остатками маннозы, Lectin tetragonolobus с остатками фукозы, Lectin T.vulgaris связывается с глюкозой в составе (GlcNAc)2. В дополнение к этим лектинам в качестве компонента внеклеточного матрикса был использован фибронектин. Смесь этих компонентов наносилась на поверхности микрофлюидной сети, после чего осуществлялся ввод пробы, содержащей клетки H. pylori, инкубация, смыв неприкреплённых клеток и регистрация иммобилизованных бактерий.

Эффективность иммобилизации в разных экспериментах составляла от 10-5 до 10-7, что в ряде случаев является достаточным для проведения достоверного анализа (рис. 14Б).

Показано, что иммобилизованные клетки могут культивироваться внутри микрофлюидных каналов в течение нескольких часов без потери жизнеспособности, о чем свидетельствуют зарегистрированные случаи деления клеток (рис. 14В).

Как уже отмечалось выше, характеристики индивидуальных клеток достаточно часто отличаются от усреднённых параметров, получаемых при анализе клеточных популяций.

Разница в паттернах экспрессии отдельных клеток может быть выражена с помощью коэффициента вариабельности (h), являющегося отношением стандартного отклонения параметра в популяции (s) к среднему значению параметра в популяции (m). На рис. приведены результаты оценки интенсивности флуоресценции отдельных иммобилизованных в каналах микрофлюидного чипа клеток H. pylori, содержащих кодирующую последовательность gfp под промотором гена flgB.

Рис. 14. А – схема микрофлюидного чипа;

Б – клетки H. pylori, иммобилизованные в ячейке микрофлюидного чипа;

В – делящиеся в ячейке микрофлюидного чипа клетки H. pylori Для несинхронизированной популяции клеток, содержащих транскрипционное слияние промоторной области гена flgB и кодирующей части гена gfp, коэффициент вариабельности интенсивности флуоресценции равен 0.23, что согласуется с расчетными данным о вариабельности в количестве белка между клетками, находящимися в разных стадиях клеточного цикла – h = 0.22.

Продемонстрированная нами возможность регистрации флуоресценции в клетках H. pylori, иммобилизованных в микрофлюидных каналах чипа, позволяет анализировать гетерогеность бактериальной популяции и характеризовать ее отдельные клетки. Кроме того, разработанный микрофлюидный чип может быть использован для создания клеточного эррея (array), элементом которой является единичные клетки несущие рекомбинатные плазмиды с репортерной системой на основе GFP-белка и промоторными областями генов в качестве сенсоров.

Рис. 15. Распределение интенсивности флуоресценции отдельных клеток H. pylori, содержащих плазмиду pHel-flg-GFP ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе выполнения данной работы нами были описаны границы структурной и функциональной вариабельности H. pylori. Показано, что микро- и макровариабельность H. pylori является следствием адаптации бактерии к окружающему стрессу. Основную часть вариабельных белков H. pylori при раннем раке желудка составляют белки-антиоксиданты, белки цикла трикарбоновых кислот и белки теплового стресса. При этом различие в экспрессии белков генетически идентичных H. pylori изолятов, выделенных из разных отделов желудка спустя несколько пассажей на искусственных питательных средах сохраняются. При адаптации бактерии к антибиотику, в качестве стрессового фактора, происходит накопление «случайных» мутаций не связанных и/или не обеспечивающих антибиотикоустойчивость.

При поиске причин, обусловливающих генетическую вариабельность бактерии, мы бы хотели обратить внимание на следующие факты. Если считать, что соответствие нуклеотидных мотивов по положению между двумя гомологичными геномными последовательностями организмов в пределах одного вида отражает нуклеотидные замены, произошедшие в популяции в процессе эволюции, то можно заключить, что в H. pylori, вероятно, протекают преимущественно мутации СТ, обусловленные механизмом метилирования-дезаминирования цитозина. С другой стороны, следует принимать во внимание, что некоторые штаммы H. pylori содержат свыше 20 систем рестрикции модификации (Р-М), подавляющее большинство которых относится ко II типу. Функция систем рестрикции-модификации у Н. pylori не ограничивается созданием барьера, препятствующего поступлению в клетки чужеродной генетической информации. Основным аргументом в пользу этого можно считать большое число генов систем Р-М, занимающих более 4% всего генома!

Согласно эгоистической (selfish) природе существования систем рестрикции модификации у прокариот, эти системы, содержащие активный ген М (метилтрансферазы) и неактивный ген Р (рестриктазы), могут перемещаться из одного штамма H. pylori в другой, где ген Р может снова реактивироваться или замещаться на новый активный ген Р. С этой точки зрения, Н. pylori может рассматриваться как резервуар для систем Р-М – в процессе эволюции бактерия может случайным образом приобретать и терять системы Р-М. Учитывая повышение скорости превращения цитозина в тимин под влиянием метилирования, 5mC метилтрансферазы можно рассматривать как потенциальные внутриклеточные мутагены.

Поскольку мутации являются относительно редким событием, то их число зависит от продолжительности времени присутствия мутагена. Таким образом, время существования различных систем рестрикции–модификации в клетках бактерии может оказывать влияние на количество мутаций в соответствующих сайтах рестрикции-модификации. Другим фактором, ограничивающим частоту метилирования, является естественный отбор. Сайты системы Р-М могут быть расположены в структуре гена таким образом, что мутации в них понижают приспособляемость микроорганизма, и, как следствие, не наследуются. Этим же объясняются повышенные частоты замен в третьем положении кодона: поскольку транзиции в этом положении оказываются синонимичными, и они с большей вероятностью передаются потомству клетки.

Учитывая эти данные и полученные результаты, мы предполагаем следующую модель формирования микрогетерогенности геномов H. pylori. В настоящее время предполагается, что гетерогенность геномов хеликобактера в природе обусловлена спонтанными точечными мутациями или высокой частотой межштаммовых и внутригеномных рекомбинационных событий. По нашему мнению, «спонтанное» образование однобуквенных транзиций, которое может эффективно модулироваться системами рестрикции-модификации, являющихся, в свою очередь, также вариабельной частью генома, делает два вышеуказанных предположения о механизмах формирования гетерогенности элементами одной системы. Мы предполагаем, что возможно рассматривать процессы дезаминирования цитозина как химическую реакцию, определяющую формирование микрогетерогенности, с последующим включением рекомбинационных процессов, формирующих множество гетерогенных локусов ДНК у H. pylori, выщепление фрагментов генома и их горизонтальный перенос, варьирование количества и активности систем рестрикции-модификации.

Необходимо добавить, что в отсутствие окружающего стресса популяция H. pylori вероятно содержит изначально некое количество клеток с гипермутабельным фенотипом или же они появляются в популяции спустя некоторое количество генераций. Данное предположение основывается на анализе геномов рифампицинрезистентных штаммов, в которых были обнаружены мутации, не связанные с процессом адаптации H. pylori к рифампицину, так как ни одна из этих мутаций не появляется при адаптации H. pylori к антибиотику. Однако, учитывая, что пять мутаций T389863С, Ins597760T, G748722T, T189153G, Del1487684GA, оказались общими для двух мутантных штаммов Р1 и Р2, причем, частично они были найдены в дополнительно проанализированных рифампицинустойчивых штаммах H. pylori можно предположить, что эти мутации, могли уже предсуществовать в популяции до селекции, т.е. генерировались случайным образом гипермутаторными клетками в популяции. Тогда обнаруженные мутации в рифампицинустойчивых H. pylori штаммах являются лишь отражением того, что отбору подвергаются только гипермутабельные клетки. Другими словами, рифампицин выступает в качестве агента, фиксирующего мутации в гипермутабельных клетках до селекции. Следует отметить, что гипермутабельные клетки не могут быть зафиксированы в бактериальной популяции, поскольку вероятность появления вредных (deleterious) мутаций достаточно велика, и они имеют более пониженный фитнес, чем клетки с устойчивыми геномами в неселективных условиях окружающей среды. Однако в стрессовых условиях, каковыми является новая ниша или антибиотик только эти гипермутабельные клетки имеют шанс пройти через селективный отбор за счет высокой скорости мутационных процессов.

ВЫВОДЫ 1. Выявлена популяционная принадлежность штаммов H. pylori выделенных на территории России. Показано, что выделенные штаммы преимущественно принадлежат к европейской (hpEurope) популяции. Однако, среди штаммов H. pylori выделенных от народов, проживающих компактно в Сибири обнаружена новая H. pylori субпопуляция – hspSiberia и штаммы hspAmerind субпопуляции. Полученные данные позволили предположить пути миграции человека в Северную Америку через Аляску.

2. Описаны границы структурной и функциональной вариабельности клинических изолятов H. pylori. Показано, что 1271 генов (81% всех генов) в геноме составляют функциональное ядро генома H. рylori, а 19% являются вариабельными. Изучение транскрипционных профилей клинических штаммов H. pylori показало, что коэффициент корреляции между суммарными транскрипционными профилями составляет 0.70–0.83. На протеомном уровне зафиксировано изменение экспрессии мажорных белков, в том числе, белков домашнего хозяйства клетки, ферментов инактивации свободных радикалов и пероксида водорода, компонент липопротеина клеточной стенки.

3. Показано, что микро- и макровариабельность H. pylori является следствием адаптации бактерии к окружающему стрессу. Основную часть вариабельных белков H. pylori при раннем раке желудка составляют белки-антиоксиданты, белки цикла трикарбоновых кислот и белки теплового стресса. Кроме того, показано, что при адаптации бактерии к рифампицину, как стрессового фактора, происходит накопление мутаций, не связанных и/или не обеспечивающих антибиотикоустойчивость.

4. Для оценки функциональной вариабельности H. pylori популяции разработан микрофлюидный чип, выполненный из оптически проницаемого полиметилметакрилата, состоящий из сети микрофлюидных каналов с ячейками.

Отработаны условия для длительного нахождения в них живых клеток, возможность точной регулировки параметров окружающей среды и наблюдений за клетками в режиме реального времени.

5. В качестве одной из возможных причин возникновения генетической вариабельности геноме H. pylori исследовано метилирование ДНК. Показано, что в геноме H. pylori преобладают нуклеотидные замены по типу транзиций над трансверсиями.

Преобладание транзиций обусловлено высокой скоростью перехода цитозина в тимин в кодирующей цепи ДНК и некодирующей. Показано, что штаммы H. pylori с инактивированными метилтрансферазами характеризуется замедленной скоростью роста, чем штамм исходного, дикого типа, что свидетельствует об эпигенетической компоненте регуляции жизнедеятельности бактерии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Маев И.В., Момыналиев К.Т., Селезнева О.В. Эффективность эрадикации Helicobacter pylori в зависимости от полиморфизма IL-1-511. Материалы 10-го юбилейного международного Славяно-Балтийского форума "Санкт-Петербург – Гастро-2008" // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2008.- № 2-3.-С.61.

2. Маев И.В., Момыналиев К.Т., Оганесян Т.С., Казюлин А.Н., Кучерявый Ю.А., Селезнева О.В. Полиморфизм гена интерлейкина-1 в оценке эффективности эрадикационной терапии язвенной болезни, ассоциированной с Н. pylori. // Клинико эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения. Материалы VIII Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции. // Под ред. проф. Цуканова В. – Красноярск, – 2008.– С.127-134.

3. Маев И.В., Оганесян Т.С., Момыналиев К.Т., Кучерявый Ю.А., Белый П.А. Полиморфизм гена цитохрома Р-450 2С19 и лечение инфекции Helicobacter pylori. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2008.- №3. – С.78-85.

4. Momynaliev K.T., Kashin S.V., Chelysheva V.V., Selezneva O.., Demina I.A., Serebryakova M.V., Ivanisenko V.A., Aman E., Akopian T., Govorun V. M. Functional divergence of H. pylori related to early gastric cancer. // Helicobacter. - 2008.- V.13.- №.5 – P.477.

5. Momynaliev K. T., Chelysheva V. V., Selezneva O. V., Akopian T. A., Govorun V. M.

Comparative genome sequencing of H. pylori rifampicin-resistant strains. // Helicobacter. 2008.- V.13. - №.5 - P.465.

6. Маев И.В., Кучерявый Ю.А., Момыналиев К.Т., Говорун В.М., Т.С. Оганесян.

Полиморфизм гена CYP2C19 и эффективность антихеликобактерной терапии у больных язвенной болезнью. // Фарматека. -2008.-№13. – С.98-102.

7. Момыналиев К.Т., Лазарев В.Н., Кострюкова Е.С, Челышева В.В., Селезнева О.В., Кравченко Е.В., Говорун В.М. Микрофлюидные технологии для детекции внутриклеточных процессов в бактериальной клетке // Российские нанотехнологии. 2007. - Т.2 - №5-6. - С.126- 8. Оганесян Т.С., Маев И.В., Момыналиев К.Т., Говорун В.М., Казюлин А.Н., Моржакова А.А. Влияние полиморфизма IL-1b-511 на эффективность эрадикации H. pylori у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки// Росс. журнал гастроэнтер., гепатол., колопрокт. – 2007. – №5. – Т.17. – C.164.

9. Маев И.В., Момыналиев К.Т., Оганесян Т.С., Казюлин А.Н. Моржакова А.А, Кучерявый Ю.А Эффективность эрадикации Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в зависимости от полиморфизма гена CYP2С19.

// Росс. журнал гастроэнтер., гепатол., колопрокт. - 2007 – 5.- Т.17.- С.137.

10. Rogov S.I., Momynaliev K.T., Govorun V.M. Coexpressionfinder: a new algorithm for finding groups of coexpressed genes // J. Bioinform. Comput. Biol.- 2006. - V.4. - P.853-864.

11. Momynaliev K. T., Govorun V. M. System level analysis of antibiotic resistance of Helicobacter pylori. // Abst. 3rd International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine. - Novosibirsk. – 2006. – P. 12. Prokhorenko I.A., Malakhov A.D., Kozlova A.A., Momynaliev K., Govorun V.M., Korshun V.A. Phenylethynylpyrene-labeled oligonucleotide probes for excimer fluorescence SNP analysis of 23S rRNA gene in clarithromycin-resistant Helicobacter pylori strains // Mutat.

Res.- 2006. - V.599. - P.144-151.

13. Момыналиев К.Т., Рогов С.И., Говорун В.М.. Соответствие нуклеотидов между белок кодирующими последовательностями штаммов Helicobacter pylori 26695 и J99 // Молекул. биол.- 2005. - Т.39. - №6. -C.945-951.

14. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Комплексная характеристика клинических штаммов Helicobacter pylori // Молекул. мед.- 2005. - Т.4. - С.30-34.

15. Момыналиев К.Т., Рогов С.И., Селезнева О.В., Челышева В.В., Акопиан Т.А., Говорун В.М.. Сравнительный анализ транскрипционных профилей штаммов Helicobacter pylori // Биохимия.- 2005. - Т.70. - С.467-475.

16. Момыналиев К.Т., Cелезнева О.В., Козлова А.А., Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Говорун В.М.. А2144G – основная мутация в гене 23S rRNA Helicobacter pylori, ассоциированная с устойчивостью к кларитромицину // Генетика.- 2005. - Т.41. -№10. С.1338-1344.

17. Момыналиев К.Т., Cелезнева О.В., Челышева В.В., Акопиан Т.А., Линц Б., Ахтман М., Говорун В.М. Популяционная идентификация российских штаммов H. pylori // Генетика.- 2005. - Т.41. - С.1434-1437.

18. Говорун В.М., Лохов П.Г., Мошковский С.А., Момыналиев К.Т., Селезнева О.В., Кудрявцева Л.В., Серебрякова М.В., Тихонова О.В., Гоуфман Е.И., Арчаков А.И..

Сравнительный анализ различных методов типирования клинических штаммов Helicobacter pylori // Биохимия. - 2004. - Т.69. - С. 536-541.

19. Momynaliev K., Smirnova O., Kudryavtseva L., Govorun V. Helicobacter pylori genotypes in Russia // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. - 2003. - V.22. - P.573-574.

20. Момыналиев К.Т.,Смирнова О.В., Челышева В.В., Кудрявцева Л.В., Воробъев А.А.

Говорун В.М. Генотипирование клинических штаммов H. pylori в России // Вестник РАМН. - 2003. – Т.6. - С. 33-38.

21. Говорун В.М., Момыналиев К.Т., Мошковский С.А., Тихонова О.В., Згода В.Г., Гоуфман Е.И., Серебрякова М.В., Лохов П.Г., Торопыгин И.Ю., Кудрявцева Л.В., Селезнева О.В., Арчаков А.И. Сравнительная характеристика протеомных карт клинических штаммов Helicobacter pylori // Биохимия. - 2003. - Т.68. - С. 42-49.

22. Момыналиев К.Т., Смирнова О.В., Кудрявцева Л.В., Говорун В.М. Cравнительный геномный анализ штаммов Нelicobacter pylori // Молекул. биол. - 2003. - Т.37. -С.625 633.

23. Momynaliev K.T., Govorun V.M., Gnedenko O., Ivanov Y.D., Archakov A.I. The use of the resonant mirror biosensor to detect point mutations, as demonstrated with synthetic oligonucleotides // J. Mol. Recognit. - 2003. - V.16. - P.1-8.

24. Momynaliev K.T., Smirnova O., Kudryavtseva L., Govorun V. Global gene expression analysis of Helicobacter pylori clinical isolates. // Helicobacter. - 2003.- V.8. - P.491.

25. Govorun V. M., Momynaliev K. T., Kudriavtseva L. V. et al. Molecular typing of the Helicobacter pylori clinical isolates in Russia by genome and proteome analysis. // Abst.

International Conference “Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine” St.

Petrsburg – Moscow - 24-30 June 2002- PP2-2.

26. Говорун В.М., Момыналиев К.Т., Кудрявцева Л.В. и др. Географическое распределение cagA, vacA, iceA и babA Helicobacter pylori типов и субтипов в российской Федерации // Экспер. Клинич. Гастроэнтер. - 2002. - Т.1. - С.124-125.

27. Говорун В.М., Момыналиев К.Т., Смирнова О.В. и др. Современные подходы к молекулярной диагностике и типированию клинических штаммов Helicobacter pylori в России // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2002. - Т.3. - С.57-65.

28. Govorun V., Momynaliev K., and Lokhov P. Molecular typing of the H. pylori clinical isolates in Russia by genome and proteome analysis. // Molecular & Cellular Proteomics. – 2002. – V.1.- №9 – P.657.

29. Momynaliev K. T., Govorun V. M., Isakov V. A., Megraud F.. Detection of point mutations associated with Helicobacter pylori resistance to clarithromycin by real-time fluorescence based analysis. // Gut. - 2001. - Suppl. 11 - V.47. - A10.

30. Момыналиев К.Т., Говорун В.М., Иванов Ю.Д., Арчаков А.И. Мегро Ф.

Использование резонансного зеркала для обнаружения точечных мутаций, ассоциированных с устойчивостью Helicobacter pylori к кларитромицинe. // В тезисах 4-го Международного семинара «Российские технологии для индустрии». Санкт Петербург. - 2000. - С.206.

31. Momynaliev K. T., Govorun V. M., Isakov V. A., Megraud F., Archakov A.I.. Detection of point mutation associated with resistance of Helicobacter pylori to clarithromycin by optical biosensors. // Gut. - 2000.- Suppl. 1. - V.47. - A20.

Использованные сокращения:

КИРИЛЛИЦА АФК, активные формы кислорода кДНК, комплементарная ДНК мРНК, матричная РНК ПЦР, полимеразная цепная реакция ОРС, открытая рамка считывания, РИФ, рифампицин, РИФр, рифампицин-устойчивые изоляты HpРР, H. pylori изоляты, выделенные от пациента с ранним раком желудка HpХГ, H. pylori изоляты, выделенные от пациента с хроническим гастритом МИК, минимальная ингибирующая концентрация ИСГ, интенсивность сигналов гибридизации ГПГ, горизонтально перенесенные гены ЛАТИНСКИЙ РЕГИСТР 2DE, англ. two dimensional electrophoresis, двумерный электрофорез PAI, англ. pathogenecity island;

островок патогенности PMMA, англ. Poly(methyl methacrylate), полиметиметакрилат

Pages:     | 1 ||
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.