Совершенствование лабораторной диагностики инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами, с использованием компьютерных технологий

На правах рукописи

ЧЕМУРЗИЕВА Наталья Вадимовна СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С УСЛОВНО ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЬЮТЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь – 2008 2

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования Пермская Государственная медицинская академия им. академика Е.А.Вагнера Росздрава. Пермь Научный руководитель доктор биологических наук, Карпунина Тамара Исаковна профессор Официальные оппоненты Октябрьский Олег Николаевич доктор биологических наук Зубарева Надежда Анатольевна доктор медицинских наук

Ведущая организация: Омская Государственная медицинская академия.

Омск

Защита состоится «»_2008 года в_ часов на заседании диссертационного совета ДМ004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.

Факс: (3422) 44 67 11.

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН: http://www.iegm.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан «»_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна Введение Актуальность проблемы. Этиологическая структура возбудителей инфекционных процессов в последнее десятилетие существенно изменилась, что связано с постоянной эволюцией бактерий и вовлечением в патологические процессы условно патогенных микроорганизмов (Galinski et.al, 1994, Csonka, 1996, Priestley, 1997, Анкирская, 2000, Кисина, 2002, Ленгелер с соавт., 2005). В связи с двойственной природой последних – условно патогенные микроорганизмы (УПМ) в качестве комменсалов присутствуют в составе нормальной микрофлоры здоровых людей, а также регистрируются как этиопатогены при различных местных и генерализованных процессах – у клиницистов нередко возникают сложности при оценке результатов обследования, определении целесообразности назначаемого лечения и выборе лекарственных препаратов (Петрович, 2001, Коломойцева, 2004, Володин, Коршунов 2008, Падейская, 2008). В диагностике неспецифических инфекций до последнего времени решающее значение при определении этиологической значимости придавалось численности обнаруженных микроорганизмов в пораженном органе, а в случае микстинфекции – установлению количественных соотношений между ассоциантами (Кира, 2001, Падруль и соавт., 2004, Борисов, 2005). Однако многими исследователями (Кудрявцева с соавт., 2001, Reid, 2004 и др.) в подобных ситуациях зачастую более существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности. Ценность этого критерия повышается при выявлении не одного, а нескольких факторов вирулентности, и особенно в патогенетически значимой дозе и/или уровне активности. Теперь стало очевидно, что такие диагностические тесты, как ИФА и ПЦР, высоко информативные при заболеваниях, вызванных абсолютными патогенами, не обеспечивают адекватную диагностику при инфекциях, обусловленных условно патогенными микроорганизмами (Domingue et.al, 2003, Michailova et.al, 2005, Елисеева с соавт., 2006). В то же время метрические параметры, в частности степень обсемененности исследуемого материала, размеры микробных клеток и колоний, уровень чувствительности к антибиотикам, регистрируются посредством визуальной оценки результатов культурального исследования. Такой способ обработки информации в значительной степени субъективен. Тем не менее, подобные характеристики могут отражать функциональное состояние микроорганизмов, что особенно актуально при оценке вовлеченности условно патогенных представителей в патологический процесс.

Решение вопроса об этиологической роли УПМ в очаге поражения облегчается при выяснении ответной реакции макроорганизма в зоне первичной колонизации, поскольку степень реактивности и динамические изменения показателей локальных факторов неспецифической защиты в существенной мере отражают «поведение» условного патогена как комменсала или возбудителя инфекционного процесса. В подобных случаях использование неинвазивных методов исследования наиболее предпочтительно, поскольку любое повреждение слизистых и кожных покровов повышает риск микробной контаминации внутренней среды организма. Весьма перспективным для определения бактерицидных и бактериостатических свойств биологических жидкостей, на наш взгляд, является использование рекомбинантных штаммов бактерий, несущих плазмиды с lux-оперонами природных люминесцирующих микроорганизмов и методы клинической кристаллографии биологических жидкостей (БЖ) (Пшеничнов, 2002, Дерябин, 2004, Шабалин, 2005). Они высокоспецифичны, экспрессны и мало затратны. Однако общепринятая оценка полученных результатов, основанная лишь на описательных характеристиках, значительно снижает их диагностическую значимость и практически исключает возможность стандартизации (Ruderman et al, 1998, Kern, 2002, Theodoridis et al, 2003). Именно поэтому, использование методов компьютерной морфометрии, позволяющих объективизировать данные лабораторной диагностики, становится все более востребованным в клинической медицине и достаточно широко применяется в цитологических, гистологических и патоморфологических исследованиях (Фот с соавт., 2002, Свешников, 2006, Тугой с соавт., 2006). Однако в микробиологической диагностике данные методы анализа используется крайне ограниченно.

Комплексный подход, учитывающий как биологические особенности УПМ, так и специфику локальной ответной реакции макроорганизма, выбор наиболее информативных и доступных для практики критериев, позволяющих определить роль изолируемых штаммов в патологическом процессе, представляется актуальной и насущной проблемой клинической микробиологии. Применение компьютерных технологий, адаптирование существующих аналитических программ к задачам микробиологического исследования позволят подойти к решению этого вопроса с позиций доказательной медицины.

Цель настоящей работы: повышение информативности и объективизация результатов микробиологических исследований при оценке этиологической значимости условно патогенных микроорганизмов с помощью методов компьютерной морфометрии.

Основные задачи исследования:

- оценить возможности традиционных методов микробиологического анализа в диагностике инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами.

- на основе компьютерных технологий отобрать и усовершенствовать методические приемы, способствующие определению роли УПМ, изолируемых из материала обследованных пациентов.

- разработать новые подходы к оценке локальных ответных реакций в зоне инфицирования УПМ.

- разработать алгоритм комплексной оценки этиологической значимости УПМ при различных инфекционных процессах.

Научная новизна. Впервые на основе комплексного подхода определена этиологическая значимость УПМ, изолируемых при микробиологическом исследовании различного патологического материала. Показано, что на этапе скрининга для идентификации выделенного штамма в качестве возбудителя инфекции, наряду с определением степени обсемененности анализируемого образца, целесообразно изучение морфометрических характеристик выделенных микроорганизмов, которые различны у соименных видов, вызывающих заболевание и входящих в норме в состав представителей транзиторной или облигатной микрофлоры организма-хозяина. Впервые обоснована информативность морфометрии с применением компьютерного анализа цифровых изображений клеток и колоний исследуемых культур в определении роли УПМ в патологическом процессе.

Впервые с помощью компьютерных технологий выявлена возможность получения ошибочных результатов при оценке степени антибиотикочувствительности микробных культур диско-диффузионным методом, и предложен оригинальный подход к решению этой задачи. Показано, что основанное на автоматической регистрации оптической плотности измерение диаметра зоны задержки роста вокруг диска, нагруженного соответствующим антибиотиком, повышает эффективность этого метода преимущественно при исследовании штаммов с промежуточной резистентностью.

Впервые предложен новый подход к дифференциации природы (асептическая или инфекционная) воспалительных процессов. Для его реализации при открытой травме глаза рассчитан оригинальный дифференцирующий коэффициент (Кd) на основе количественной оценки структурообразующих компонентов кристаллограмм слезной жидкости. Доказано, что при Кd 3, воспаление связано с инфекционным процессом (Заявка № 2008108059.

Приоритетная справка от 29.02.2008).

Впервые для определения бактерицидной активности раневого отделяемого (БАРО) показана возможность регистрации гашения люминесценции биотестов с использованием компьютерных технологий. Уровень БАРО учитывается посредством оригинального коэффициента бактерицидности (Кб). Установлено, что предложенная модификация повышает информативность исследования по сравнению с существующими технологиями (Патент на изобретение № «Способ оценки интенсивности воспалительной реакции в операционной ране»).

Теоретическая и практическая значимость. Выработан новый алгоритм оценки этиологической значимости УПМ при их обнаружении в исследуемом материале, учитывающий как биологические особенности изолятов, так и ответную реакцию макроорганизма в зоне первичной колонизации. Предложены коэффициенты, позволяющие оценивать изучаемые процессы в количественном выражении. Применение предложенных методов при определении чувствительности микробных культур к антибиотикам повышает качество проводимого исследования.

Использование количественных показателей при кристаллографическом исследовании биологических жидкостей позволяет выработать стандартные критерии для диагностики патологических состояний. Внесены изменения в режимы микрофотосъемки кристаллограмм, значительно улучшающие качество получаемых изображений и обеспечивающие возможность их автоматической обработки. В серии специальных экспериментов определено оптимальное количество исследуемого материала и обоснована целесообразность использования его минимальных объемов без потери качества.

Показано, что компьютерные технологии при оценке этиологической значимости УПМ придают применяемым методикам экспрессность и повышают их объективность. Использование методов компьютерной морфометрии позволяет не только производить измерения в автоматическом режиме, но и систематизировать, подвергать статистической обработке, архивировать аналитические данные, что в значительной степени облегчает микробиологический мониторинг инфекций, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологические особенности условно патогенных микроорганизмов, вызывающих локальные инфекционные процессы, обусловливают необходимость комплексного подхода к оценке этиологической значимости изолируемых штаммов с учетом их количества, степени патогенности и ответной реакции организма в очаге поражения.

2. Использование адаптированных компьютерных программ для обработки данных микробиологического анализа существенно объективизирует интерпретацию полученных результатов и облегчает их учет при диагностике инфекций, ассоциированных с условно патогенной микрофлорой.

3. Применение компьютерных технологий при оценке состояния биологических жидкостей как одного из показателей изменения ответной реакции в динамике инфекционного процесса расширяет аналитические возможности и повышает информативность применяемых диагностических тестов.

Личный вклад автора в проведенное исследование: автором самостоятельно проведены микроскопические и бактериологические исследования, разработаны новые и модифицированы существующие способы обработки их результатов, адаптированы возможности морфометрических программ (Image Pro+, Морфология-Мастер) для решения микробиологических задач, а также проведена систематизация и анализ полученных результатов.

Апробация работы и публикации: основные положения работы доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004), Юбилейной научно-практической конференции ФМБА России «Высокие технологии в промышленной медицине» (Пермь, 2008), Научной сессии ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава (Пермь, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получены Патент Российской Федерации №2321858 от 10.04.2008, приоритетная справка на Заявку на изобретение №2008108059 от 29.02.2008, приоритетная справка на Заявку на изобретение № 2008113940 от 09.04.2008.

Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в практику Городского центра репродукции и планирования семьи при МСЧ №9, г. Перми, отделения травмы глаза Краевой клинической больницы, отделения общей хирургии ГКБ №2 г. Перми. Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии и вирусологии, офтальмологии, факультетской хирургии с курсом урологии ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава (номер государственной регистрации темы 0120. 0502713).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 218 источников, из них 175 отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 27 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Работа выполнена в ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава на кафедре микробиологии и вирусологии (заведующий кафедрой – доктор медицинских наук, профессор Э.С. Горовиц), в Отделе учебно-методического и научного обеспечения.

Лабораторному и экспериментальному изучению были подвергнуты следующие материалы: 286 образцов вагинального секрета женщин репродуктивного возраста с различными инфекционными заболеваниями влагалища;

59 и 24 образца патологического материала от больных торакального отделения и отделения реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) соответственно;

60 образцов смывов с аппаратуры ИВЛ из ОРИТ;

64 образца слезной жидкости от больных с травмой глаз и 15 (контроль) – от здоровых людей, а также 20 образцов раневого отделяемого от пациентов Центра колопроктологии «Евромедсервис» и 15 культур микроорганизмов клинических изолятов, любезно предоставленных бактериологической лабораторией Городской клинической больницы №7, для сравнительной оценки степени их антибиотикочувствительности.

Для определения роли УПМ в инфекционном процессе изучали морфофункциональные особенности выделенных микроорганизмов традиционными микробиологическими методами. При цитологическом исследовании вагинального секрета учитывали количество лейкоцитов, эпителиальных клеток в поле зрения, определяли их суммарное количество (СК) и цитологический коэффициент (ЦК) (Трухина, 2005, Машуров, 2008), при микроскопическом – наличие мицелия и бластоспор Candida (Кубанов с соавт., 2001), численность и морфотипы сопутствующей микрофлоры, а также присутствие «ключевых» клеток. Морфометрическому анализу подвергали клетки и колонии C. albicans. Бактериологические исследования вагинального секрета проводили согласно методике Р.В. Федорова, Е.Р. Федоровой, Н.Ю. Матюхиной (1995), содержимого эмпиемной полости больных торакального отделения, смывов с внутренних поверхностей дыхательной аппаратуры ИВЛ в отделении РИТ проводили в соответствии с приказом МЗ РФ №535 от 22.07.85. «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико диагностических лабораториях», а также с практическими рекомендациями Российской ассоциации специалистов по хирургическим инфекциям (2004). При идентификации бактерий рода Pseudomonas, дополнительно учитывали образование пигмента и их способность расти при 42°С.Биохимическое исследование фосфолипазной активности (ФЛА) Candida albicans и Pseudomonas auruginosa выполняли на основе методики Г.Н. Нестеровой с соавт. (1987).

Морфометрическое определение ФЛА проводили на основе методики Е.А.Трухиной (2005) с вычислением коэффициента вирулентности (Кв), рассчитанного по соотношению площадей сформировавшейся колонии и зоны опалесценции, образовавшейся вокруг неё. Для изучения атибиотикочувствительности использовали диско-диффузионный метод. При оценке полученных результатов для определения диаметра зоны задержки роста применяли метод компьютерной морфометрии. Уровень местной ответной реакции при открытой травме глаза оценивали по результатам, полученным методом клиновидной дегидратации слезной жидкости, с последующим вычислением предложенного нами дифференцирующего коэффициента (Кd). Для определения бактерицидной активности раневого отделяемого при хирургических вмешательствах применяли метод автоматической регистрации гашения биолюминесценции с использованием био-теста «Эколюм-5» (Данилов, Зарубина, 2001). Контроль осуществляли стандартным бактериологическим методом (Дерябин, Поляков, 2005). При компьютерной обработке материала была использована программа Image-Pro+. Для оценки полученных результатов применяли методы описательной статистики. Обработку статистических данных проводили с использованием стандартных пакетов программ MS «Excel, 2000» и Statistica 6.0.

Результаты исследования и их обсуждение Для реализации комплексного подхода к оценке этиологической значимости УПМ, предполагающего изучение как свойств изолируемых штаммов, так и показателей реактивности макроорганизма в зоне первичной колонизации, работа проводилась в двух направлениях, характеризующих особенности микроорганизма и ответную реакцию макроорганизма. Было выполнено углубленное «слепое» микробиологическое исследование 88 образцов вагинального секрета, отобранных при микроскопии мазков 286 женщин, проходивших обследование в городском Центре планирования семьи и репродукции. Основным критерием отбора служило выявление бластоспор и /или псевдомицелия дрожжеподобных грибов.

Результаты традиционных (цитологического, бактериоскопического, бактериологического) методов исследования позволили выделить III основные группы. К I группе отнесли образцы (n=35), морфологические и количественные характеристики которых соответствовали состоянию нормоценоза и кандидоносительства. Для II группы (n=20) были свойственны признаки острой монокандидозной инфекции, в частности, количество грибов Candida составило в среднем 7,49±0,31 lg КОЕ/мл, наблюдались мицелиарные формы гриба.

Численность лактобактерий составила 6,05±0,05 lg КОЕ/мл на фоне общего снижения как общего количества, так и видового разнообразия сопутствующей микрофлоры. III группа была представлена 33 образцами (37,5 % от общего количества) с нечетко выраженными признаками инфекции. Данные микологического исследования образцов этой группы отличались значительным разбросом показателей lg КОЕ/мл = 5,3±1,2 (M±), т.е. грибы выявляли как в диагностически значимых (5,7±0,65), так и незначимых (4,8±0,12) количествах, обнаруживали «ключевые» клетки, типичных представителей родов Bacteroides, Gardnerella, Mobiluncus, лактоморфотипы отсутствовали или определялись как единичные не во всех полях зрения. Культуральная диагностика выявила снижение титра лактобактерий до 3,01±0,05, характерным было и присутствие строгих анаэробов в высоких титрах. Таким образом, более трети проб исследованного материала с диагностической точки зрения оказались проблемными (табл 1).

В подобных ситуациях роль условных патогенов, в том числе C.аlbicans, в воспалительном процессе традиционно определяется по количественному признаку (КОЕ/мл), учитываемому при культуральном исследовании. В то же время, по мнению ряда авторов (Богомолова, 1987, Хмельницкий, 2000), количественные характеристики не являются исчерпывающими и не всегда отражают истинное участие выделенного микроорганизма в инфекционном процессе. Активная колонизация при развитии инфекционного заболевания Таблица 1.

Состав микрофлоры влагалища пациенток обследованных групп I группа (n=35) II группа (n=20) III группа (n=33) Показатели P 0, lg Количество lg КОЕ/мл Количество lg КОЕ/мл Количество КОЕ/мл случаев. случаев. случаев.

**;

*** Lactobacillus spp. 35(100%) 18(90%) 28 (84,8%) 6,1±0,07 6,05±0,05 3,0 ± 0, 17 (85%) *;

**;

*** E.coli 9(25,7%) 8 (24,2%) 3,7±0,39 1,32 ± 0,32 1,4 ± 0, * Enterobacteriaceaе(прочие) 7(20%) 10 (50%) 5 (15,1%) 3,15±0,29 2,63 ± 0,34 2,7 ± 0, 5 (25%) * S.aureus 8(22,8%) 3 (9%) 3,25±0,11 2,48 ± 0,31 3,6 ± 0, 13 (65%) * S.epidermidis 11(31,4%) 7 (21,2%) 3,1±0,09 1,5 ±0,24 1,2 ± 0, Staphylococcus sp.(haem+) 12 (60%) 18 (54,5%) 2,35±0,54 3,3 ± 0, **;

*** Streptococcus sp.(haem +) 6(17,1%) 9 (45%) 10 (30,3 %) 1,79±0,38 1,1±0,28 3,3 ± 0, **;

*** Streptococcus sp.(haem -) 5(14,2%) 7(35%) 12 (36,4%) 2,86±0,92 1,15±0,18 5,3 ± 0, * Corynebacterium spp. 10(28,5%) 9 (30%) 13 (39,4%) 3,6±0,08 1,2 ± 0,11 3,6 ± 0, **;

*** Bacteroides spp. 7(20%) 4(20%) 14 (42,4%) 2,48±1,01 2,25±0,65 8,45 ± 0, **;

*** Mobiluncus spp. 3(8,5%) 1(5%) 30(90,9%) 1,87±0,63 1,45±0,0 10,0 ± 0, **;

*** Gardnerella spp. 8(22,8%) 4(20%) 17(51,5%) 2,95±0,88 2,3±0,77 9,85 ± 0, Peptococcus spp. 11 (33,3%) 3,75 ± 0, Peptostreptococcus spp. 13 (39,4%) 3,6 ± 0, 5,3±1,2 33 (100%) *;

**;

*** Candida spp. 35(100%) 20(100%) 2,3±0,08 7,49 ± 0, *- I – II группа ** - II – III группа *** - I - III группа диктует необходимость перераспределения внутриклеточной энергии с приоритетом процессов интенсивного деления, что должно отражаться на размерах микроорганизма. Основываясь на данных литературы (Перт, 1978, Сергеев, 2001, Ленгелер, 2005), мы предприняли попытку оценить возможность использования метрических характеристик для определения роли C.albicans в воспалительном процессе. С этой целью морфометрическому анализу подвергали цифровые фотографии колоний, выросших на плотной среде Сабуро, а также приготовленные из них мазки-препараты, окрашенные по Граму. Количество колоний регистрировали в автоматическом режиме. Их метрические данные в заранее откалиброванных единицах измерения (см – для колоний, мкм – для клеток) заносились в электронные таблицы и статистически обрабатывались.

Полученные при этом результаты позволили выделить две подгруппы – IIIа и IIIб.

В подгруппе IIIа выделенные штаммы не требовательны к температуре культивирования, колонии Candida чаще всего сформировывались к концу первых суток, как в условиях термостата, так и при комнатной температуре, диаметр колоний равнялся 1,32 ± 0,267 см, а при анализе изображений мазков препаратов выявлены клетки крупных размеров (2,9±,87 мкм в длину и 2,2±0,65мкм в поперечнике), с типичной для бластоспор C. аlbicans морфологией, иногда почкующиеся. При этом все выделенные штаммы по изученным морфологическим свойствам можно отнести к “авирулентным” (Богомолова, 1987, 1991), когда грибы оцениваются как представители транзиторной нормофлоры. В подгруппе IIIб размеры колоний были достоверно (р=0,02) меньше, образование колоний в условиях термостата происходило к концу вторых суток, а при комнатной температуре культуры прорастали через 72 часа и более, либо вообще не давали роста. Клетки гриба были более мелкие (2,4±0,83 мкм в длину, 2,1±0, мкм в поперечнике), выявлялись мицелиальные формы, что косвенно указывало на вовлеченность C. аlbicans в патологический процесс. Таким образом, полученные метрические данные позволяли предположить, что в подгруппе IIIа C. аlbicans присутствовали лишь в качестве комменсалов, а в подгруппе IIIб – как возбудители инфекционного процесса. Исходя из имеющихся в литературе данных о том, что фосфолипазная активность (ФЛА) C. аlbicans может отражать степень их вирулентности (Ghannoum, 2000, Трухина, 2005), мы использовали этот показатель для подтверждения наших предположений.

В серии специальных экспериментов нами проведен сравнительный анализ двух методов определения фосфолипазной активности – традиционного и морфометрического. При этом была установлена сильная прямая связь (r=0,91) между показателями ФЛА, полученными традиционным способом и рассчитанными на основе компьютерной морфометрии. Поскольку биохимическое определение ФЛА достаточно трудоемко и продолжительно во времени, использование с этой целью посева на среду Сабуро с желтком представляется наиболее предпочтительным, а применение компьютерного анализа при учете результатов повышает информативность такого исследования (рис.1).

Рис. 1. Проявление фосфолипазной активности C. аlbicans на среде Сабуро с добавлением желтка При этом для группы IIIа коэффициент вирулентности равнялся 0,35±0,087, а для группы IIIб – 0,77±0,136, что в соответствии с данными Е.В. Трухиной (2005) подтвердило наши предположения о роли C. аlbicans как комменсалов в группе IIIа и как возбудителей в группе IIIб. Сведенные воедино данные морфометрического анализа (табл.2), отражающие особенности представителей каждой подгруппы, свидетельствуют о целесообразности такого подхода при определении роли Candida в патологическом процессе.

С целью подтверждения универсальности компьютерного морфометрического анализа мы использовали в качестве дополнительного маркера для дифференцировки госпитальных штаммов определение фосфолипазной активности культур P. aeruginosa – одного из наиболее часто встречающихся возбудителей внутрибольничных инфекций, изолированных от больных торакального отделения, ОРИТ и из смывов с аппаратов ИВЛ отделения РИТ. При этом выявили следующую закономерность: штаммы, выделенные из образцов смывов, и изоляты из транстрахеального аспирата больных ОРИТ, как правило, отличались более высоким (р = 0,02) уровнем ФЛА (Кв = 1,2 ± 0,15 и Кв = 1,1 ± 0,21 соответственно), чем культуры от больных торакального отделения (0,49 ± 0,137). Как считают многие исследователи, именно этому ферменту принадлежит ведущая роль в патогенезе пневмоний, поскольку благодаря ФЛА Таблица Метрические характеристики культур C. аlbicans Группа III а Группа III б Характеристики Форма клеток Продолговатые единичные Почкующиеся клетки гриба, клетки и шаровидные, округлой формы, нити почкующиеся формы, чаще псевдомицелия, чаще мелкие крупные Размер клеток М() 2,85± 0, длина (мкм) 2,66± 0, 2,23 ± 0, поперечник (мкм) 2,12±0, Коэффициент 1,44 1, сферичности Диаметр колоний (см) 1,32±0,267 0,33±0, Степень ФЛА (Кв) 0,35± 0,087 0,77±0, lg КОЕ/мл 4,8±0,12 5,7±0, микроорганизмам удается разрушать поверхностный слой альвеолярных мембран (сурфактант), содержащих значительное количество фосфолипидов. Важно подчеркнуть, что характерной особенностью госпитальных штаммов является способность формировать биопленки на поверхности синтетических полимеров – материалов, из которых изготовлены детали дыхательного оборудования. Как считают исследователи, именно в таком состоянии бактерии способны «консервировать» биохимические свойства, отвечающие за биодеградацию защитных покровов и факторов неспецифической резистентности макроорганизма.

При попадании в органы дыхания они успешно реализуют накопленный потенциал (Ершов с соавт., 2000, Chastre et. аl, 2002, Faberga et al, 2002). Использование показателя уровня ФЛА в качестве дополнительного маркера госпитальных штаммов, в первую очередь в ОРИТ, представляется нам целесообразным.

Важной характеристикой внутрибольничных штаммов микроорганизмов является и показатель их антибиотикочувствительности (Меньшиков, 2002, Сидоренко, 2002, Руднов, 2006). Общепринятый метод серийных разведений отличается трудоемкостью, а интерпретация результатов, полученных диско диффузионным методом, в ряде спорных случаев вызывает серьезные затруднения.

Нами была изучена чувствительность к антибиотикам 15 микробных культур, выделенных из клинического материала, и предложен модифицированный способ учета результатов, в основу которого положена автоматическая регистрация диаметра зоны задержки роста (ЗЗР).

Принцип регистрации основан на разнице оптических плотностей питательной среды и «микробного газона». В качестве примера приводим результаты определения антибиотикочувствительности Streptococcus pneumoniae к некоторым препаратам (рис.2). В случаях с амикацином по результатам «ручного» измерения культуру S. pneumoniae, в соответствии с рекомендациями CLSI (Clinical and Laboratory Standarts Institution, 2005) следует отнести к резистентным, в то же время данные автоматического определения свидетельствуют о её промежуточной резистентности.

Препарат I II S ((мм 2) S (мм (2) D (мм) D ((мм) Амикацин 14 153,9 16,1 298, Эритромицин 16 200,9 14,1 140, а б Рис.2. Иллюстрация автоматической обработки (а) регистрации диаметров (D) и площадей (S) зон задержки роста (б), выполненных в «ручном» (I) и автоматическом (II) режимах.

В случае с эритромицином при «ручном» измерении показатели соответствуют таковым у культур с промежуточной резистентностью, в то время как по результатам автоматической обработки штамм следует отнести к резистентным.

Подобные расхождения в расчетах объясняются, во-первых, тем, что при автоматической обработке учитываются показатели не двух, как принято, а интегрированная величина 180 диаметров, измеренных с интервалом в 2 градуса.

Во-вторых, что является особенно важным, колонии, сформированные резистентными формами в зоне задержки роста, нередко невидимые невооруженным глазом, отличаются от неё по оптической плотности и, соответственно, не регистрируются при автоматической обработке. Таким образом, значения их диаметров не включаются в расчеты, снижая интегрированный, показатель диаметра ЗЗР. Следовательно, уменьшение диаметра, выявленное при компьютерной регистрации, может указывать на появление колоний в зоне задержки роста и служить косвенным свидетельством инициации селекции штамма. Более того, принцип, положенный в основу подобной регистрации ЗЗР при определении антибиотикочувствительности, позволяет объективно контролировать равномерность распределения питательной среды и формирования «микробного газона». Следует также иметь в виду, что зона задержки роста не всегда соответствует форме идеального круга. При компьютерной обработке изображений в основу определения площади выделенного объекта положена не традиционная формула,а интегрированная сумма площадей формирующих её единиц (пикселей). Очевидно, логично предположить, что величина площади ЗЗР, измеренная подобным способом, является более объективным показателем антибиотикочувствительности микробной культуры и в спорных случаях может способствовать конкретизации (уточнению) полученных результатов, однако в связи с отсутствием стандартизованных величин данного показателя в своей работе мы руководствовались общепринятыми (диаметр ЗЗР) параметрами.

Вторым направлением нашей работы было изучение показателей реактивности макроорганизма в зоне первичной микробной колонизации. Нами проанализированы фации (высушенная на стекле капля) слезной жидкости больных с травмой глаза, полученные методом клиновидной дегидратации, с целью выявления особенностей кристаллообразования при асептических воспалительных процессах, а также процессах, обусловленных УПМ. По мнению ряда авторов, при различных офтальмологических заболеваниях биохимические показатели слезной жидкости достаточно информативны для характеристики локальных процессов (Бржеский, 1990). Инфекционное воспаление сопровождается изменением содержания общего белка и баланса белковых фракций, повышением концентрации IgA, G и M в слезе (Мошетова, Волков, 2004), что неизбежно отражается на формировании кристаллограмм (Шабалин, 2003, Алешаев, 2003, Суслеева с соавт., 2004, Девяткин с соавт., 2004, Чухман с соав., 2004, Акопян, 2005). Нами предложен способ количественной оценки, основанный на автоматическом выделении зон, формирующих фацию, и определении их площадей, по соотношению которых вычисляли дифференцирующий коэффициент (рис.3).

а б в Рис. 3. Фрагменты фаций слезной жидкости представителей трех обследованных групп: а – контрольная группа, б – II - группа, в – III - группа Для группы контроля дифференцирующий коэффициент (Кd) был равен 7,5±0,89, при воспалительных процессах неинфекционной природы Кd = 5,6±0,81;

инфекционной природы – Кd = 3,1±0,60 (табл. 3). Несмотря на то, что во II группе бактериологическое исследование не дало результата и дифференцирующий коэффициент в среднем составлял Кd = 5,6±0,81, т.е.

соответствовал асептическому воспалению, в 14,3% случаев в этой группе значение Кd = 3,2±0,45 приближалось к уровню Кd = 3,1 «септической» группы. Подобный факт может свидетельствовать о наличии существующей, но не выявленной, «скрытой» инфекции и/или указывать на высокий риск ее развития.

Кроме того, он может быть связан с сопутствующей офтальмопатологией.

Величина Кd в подобных ситуациях указывает на необходимость (или ее отсутствие) проведения повторного клинико-микробиологического обследования.

Таблица Значения дифференцирующего коэффициента при различной степени тяжести воспалительного процесса Контрольная группа II группа (Кd) III группа (Кd) (Кd) М ± SD М ± SD М ± SD среднее min max среднее min max среднее min max 7,5±0,89 5,7 9,1 5,6±0,81 4,3 6,7 3,1±0,60 2,0 3, *р =0,006 для 1-2 группы, р =0,009 для 2-3группы Важно отметить, что одним из достоинств морфометрического метода является его универсальность: можно исследовать образцы любых жидких сред организма, поскольку анализируются лишь фотоизображения их фаций, принципы формирования которых одинаковы. Своеобразие рисунка (текстуры) кристаллограммы, обусловленное в первую очередь биохимическим составом, и, как следствие, физико-химическим состоянием анализируемой пробы, придает специфичность получаемому результату.

Оценивая ответную реакцию организма, следует учитывать, что воспаление служит патогенетической основой большинства инфекционных процессов. Оно инициируется микробной инвазией и эволюционирует вместе с ней. При хирургических вмешательствах повреждающее действие операционной травмы становится фоном, на котором либо возникает и прогрессирует инфекционное осложнение, либо флогогенные факторы устраняются и происходит репарация поврежденных тканей (Маянский, 2006). Помешать микробной колонизации раневой поверхности – самый простой способ заблокировать инфекционный процесс. Соответственно, раневое отделяемое должно обладать выраженной антиколонизационной активностью, т.к. содержит антиадгезивные, биостатические, биоцидные факторы, активность которых возрастает в ответ на микробную инвазию. Таким образом, уровень бактерицидной активности биологических жидкостей в зоне повреждения может стать свидетельством участия УПМ в воспалении (Воеводина, с соавт.1990, Савченко с соавт.1996, Дерябин с соавт.2005).

Нами проанализирована бактерицидная активность 20 образцов раневого отделяемого, которую мы тестировали по подавлению биолюминесценции микроорганизмов. В частности, анализ влияния проб раневого отделяемого на свечение рекомбинантного штамма E.coli выявил прогрессирующее падение уровня биолюминесценции по мере увеличения времени контакта с ним (рис.4).

а б Рис. 4. Результаты автоматической регистрации светящихся объектов в контроле (а) и в опыте (б) после 30-минутной экспозиции.

Ингибирующее действие проявлялось уже к 10-й минуте инкубации, достигая максимума к 30-й, и в дальнейшем достоверно не изменялось. При параллельном исследовании проб были прослежены однотипные тенденции в подавлении свечения (количества светящихся клеток) и снижении доли бактерий, выживших после 10, 20, 30, 40 мин контакта с образцами раневого отделяемого. Вместе с тем число клеток, сохранивших жизнеспособность после 30–40 мин экспозиции и определенных при посеве на плотную питательную среду, оказалось практически вдвое больше, чем количество «светящихся» объектов. Поскольку гашение бактериальной люминесценции отражает воздействие на клеточную стенку комплекса бактерицидных факторов (комплемента, лизоцима, -лизина и т.д.), то снижение числа объектов, соответствующих заданным компьютерной программой порогам яркости и регистрируемым в автоматическом режиме, может быть связано с проявлением не только бактерицидного, но и бактериостатического воздействия раневого отделяемого. Такой эффект не выявляется посредством культурального метода, хотя и отражает ответную реакцию в очаге инфекции. На основании проведенных исследований был предложен коэффициент бактерицидности (Кб), рассчитанный по формуле:

Кб = (Ак – Ао)/Ак 100, где Ак и Ао – средние значение количества светящихся объектов, определенные при автоматизированном подсчете 10 полей зрения в контроле и опыте соответственно. При значении Кб 60% интенсивность воспалительной реакции оценивали как высокую, соответствующую развитию инфекционно-воспалительного осложнения в зоне хирургического вмешательства.

Динамические наблюдения за БАРО показали, что её максимальные значения проявлялись спустя сутки после операции. Поскольку во всех случаях наблюдали положительную динамику послеоперационного процесса, изменения БАРО носили однотипный характер, и к 6-м суткам ее уровень снижался на 27 – 34%.

На основании проведенных исследований разработан алгоритм (рис.4) определения этиологической значимости УПМ, учитывающий как особенности микроорганизмов, так и степень реактивности макроорганизма. На первом этапе используются традиционные микробиологические тесты, а также применяются кристаллографический и биолюминесцентный методы исследования соответствующих биологических жидкостей. Дальнейшую обработку результатов проводят в автоматическом режиме, используя возможности компьютерных программ анализа изображений. Наибольшая сложность заключается в выборе характеристик, подлежащих автоматическому учету, и критериев для маркировки анализируемых объектов, а также программного ресурса, способного решить поставленные задачи. Предлагаемый подход представляется нам оптимальным, поскольку, суммируя полученные результаты, как правило, удается определить этиологическую значимость изолируемого микроорганизма.

Выводы.

1. Установлено, что в диагностике инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами, результаты традиционных методов микробиологического анализа более чем в трети (37,5%) проанализированных случаев не позволяют однозначно определить этиологическую значимость последних.

2. Выявлено, что бактериоскопические и бактериологические тесты, в том числе оценка антибиотикочувствительности, отражают патогенетический потенциал изолируемых условно патогенных микроорганизмов.

Особенности микроорганизма Реакция макроорганизма Исследование Микробиологические биологических жидкостей методы 1. Микроскопический Люминесцентная Кристаллографические микроскопия 2.(световая микроскопия) методы Бактериологический Анализ фаций БЖ, Регистрация (выделение, идентифи- полученных методом гашения кация, определение клиновидной дегидратации биолюминесценции антибиотикочувствит.) определение) Компьютерная обработка полученных результатов 3.

Выбор критерия для автоматической маркировки объектов 4.

Показатели цветности Показатели оптической плотности Показатели интенсивности 5.

Определение 6.Определение Определение ферментативной метрических бактерицидной активности 7.характеристик активности БЖ микробных 8.клеток в окрашенных 9.препаратах Определение КОЕ и метрических характеристик колоний Оценка антибиотикочувствительности Анализ кристаллограмм Определение этиологической значимости микроорганизма Рис 4. Алгоритм определения этиологической значимости условно патогенных микроорганизмов Использование компьютерных технологий при определении метрических характеристик клеток и колоний, зон задержки роста микробного “газона” для оценки антибиотикочувствительности при диско-диффузионном методе, уровня ферментативной активности изолированных микроорганизмов с расчетом коэффициента вирулентности, повышают значимость этих тестов, обеспечивая их статистическую достоверность.

3. Показано, что предложенный способ оценки чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, основанный на компьютерной обработке диаметров зон задержки роста вокруг стандартного диска, способствует конкретизации результатов исследования штаммов с промежуточной резистентностью и позволяет контролировать равномерность распределения питательной среды и формирования микробного "газона".

4. Для дифференциальной диагностики воспалительных процессов инфекционной и неинфекционной природы разработан способ количественной оценки кристаллограмм биологических жидкостей и на примере слезной жидкости рассчитан дифференцирующий коэффициент (Кd), который способствует оценке "вовлеченности" изолируемых условно патогенных микроорганизмов в патологический процесс.

5. Для оценки бактерицидной активности раневого отделяемого в зоне первичной колонизации модифицирован способ регистрации, учитывающий эффект гашения биолюминесценции биотеста с применением компьютерного анализа, и выведен коэффициент бактерицидности (Кб), позволяющий при динамических наблюдениях определять участие микробного фактора в развитии воспалительного процесса.

6. Установлено, что использование возможностей компьютерного программного обеспечения (Image-Pro+, «Морфология-Мастер») в соответствии с разработанным алгоритмом, регламентирующим выбор функций на каждом этапе проводимого исследования, позволяет повысить качество микробиологической диагностики.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Карпунина Т.И. Морфометрические показатели в оценке действия «Микосиста» на грибы рода Candida /Т.И. Карпунина, Е.В. Трухина, Н.В. Чемурзиева //Материалы Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств». - Пермь, 2004. - С. 48-49.

2. Карпунина Т.И. Изменение микробного пейзажа содержимого пародонтальных карманов у больных хроническим генерализованным пародонтитом/ Т.И. Карпунина, Л.Е. Леонова, Е.Н. Таболина, Н.В. Чемурзиева // Естествознание и гуманизм. – Томск, 2006. - Т. 3. №4 - С. 84-85.

3. Карпунина Т.И. Фосфолипазы оппортунистических грибов: их возможная роль в патогенезе и диагностике микозов/Т.И Карпунина, А.А. Олина, М.Г Машуров, Н.В. Чемурзиева, В.А. Драбкова// Проблемы медицинской микологии. - 2006. - Т. 8.- №4 - С. 41-47.

4. Косарева П.В. Морфологическая характеристика пиелонефрита, протекающего на фоне инфекционного энтероколита, вызванного условно-патогенной микрофлорой, у детей грудного возраста/ П.В. Косарева, Ф.А. Шилова, Н.И. Аверьянова, Е.С. Патлусова, Н.В. Чемурзиева// Материалы ХIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2006. - С. 176.

5. Лисичкин А.Л. Оценка интенсивности воспалительных реакций при исследовании раневого отделяемого с использованием компьютерных технологий/ А.Л. Лисичкин, Н.В. Чемурзиева, Т.И. Карпунина// Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006 - № 3 - 1(14). - С. 136-138.

6. Чемурзиева Н.В. Возможности использования методов компьютерной морфометрии в клинической диагностике/ Н.В. Чемурзиева, Е.А. Трухина// Материалы юбилейной научной сессии ПГМА. - Пермь, 2006. - С. 306-307.

7. Чемурзиева Н.В. Новые подходы к обработке результатов кристаллографии слезной жидкости/ Н.В. Чемурзиева, В.Н. Бусырева, Т.И. Карпунина// Материалы Юбилейной научно-практической конференции ФМБА России «Высокие технологии в промышленном здравоохранении. - Пермь, 2007. - С. 219 8. Чемурзиева Н.В. Возможности использования методов компьютерной морфометрии в микробиологической диагностике / Н.В. Чемурзиева, Т.И. Карпунина, Н.П. Новоселова// Материалы 1Хсъезда всероссийского научно практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва: Санэпидмедиа, 2007. - Т. 3. - С. 9. Чемурзиева Н.В. К вопросу об оценке чувствительности бактериальных культур к антибиотикам/Н.В. Чемурзиева, Т.И. Карпунина, Н.П. Новоселова, Е.В. Афанасьевская//Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2007. 1 (17). - С. 286-287.

10. Карпунина Т.И. Особенности диагностики вагинального кандидоза, ассоциированного с возбудителями неспецифических вагинитов/ Т.И. Карпунина, А.А. Олина, М.Г. Машуров, Н.В. Чемурзиева, В.А. Драбкова// Пермский медицинский журнал. - 2007. - Т. 24. - № 1 – 2. - С. 62-65.

11. Карпунина Т.И. Новые подходы к оценке кристаллографии биологических жидкостей при патологических процессах различной природы/Т.И. Карпунина, Н.В. Чемурзиева, Э.С. Горовиц // Материалы научной сессии ПГМА. - Пермь, 2008. - С. 351 - 12. Карпунина Т.И. Способ оценки интенсивности воспалительной реакции в операционной ране/ Патент на изобретение №2321858 10 апреля 2008 // Т.И. Карпунина, А.Л. Лисичкин, Н.В. Чемурзиева, Ю.Б. Бусырев.

13. Карпунина Т.И. Способ дифференциальной диагностики инфекционно воспалительных осложнений при травме глаза/ Заявка №2008108059, приоритетная справка от 29.02.2008 // Т.И. Карпунина, Э.С. Горовиц, Н.В. Чемурзиева, В.Н. Бусырева.

14. Карпунина Т.И. Способ дифференциальной диагностики бактериального вагиноза и неспецифического вагинита/ Заявка №2008113940, приоритетная справка от 09.04.2008 // Т.И. Карпунина, А.А. Олина, Н.В. Чемурзиева.