авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Иммуномодулирующее действие пектиновых полисахаридов

На правах рукописи

ПОПОВ Сергей Владимирович ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕКТИНОВЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Сыктывкар – 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Научный консультант: академик РАН, профессор Оводов Юрий Семенович

Официальные оппоненты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Беседнова Наталья Николаевна доктор биологических наук, профессор Анисимов Михаил Михайлович, доктор биологических наук, профессор Игнатов Владимир Владимирович Учреждение Российской академии

Ведущая организация:

наук Институт физиологии природных адаптаций Уральского отделения РАН

Защита состоится « » 2010 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН.

Факс: (4232) 314-050;

e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН)

Автореферат разослан «» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук, старший научный сотрудник / Авилов С.А /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пектины представляют собой сложные гетерополисахариды, относящиеся к классу гликаногалактуронанов, кислых растительных полисахаридов (Оводов, 2009). Пектиновые вещества инкрустируют стенки растительных клеток и входят в состав межклеточного пространства высших наземных растений, морских трав и ряда пресноводных водорослей (Popper, 2008). Пектины образуют матрикс, связующий микрофибриллы целлюлозы;

обеспечивают ионный транспорт и водный режим, влияют на прорастание семян, рост и развитие растения, выполняют защитную роль во взаимоотношениях растения с фитопатогенами (Cabrera et al., 2008). В этой связи, структура пектиновых веществ зависит от многих параметров и может существенно изменяться в процессе роста и развития растения. Динамичность структуры пектинов обеспечивается нерегулярным блочным характером строения углеводной цепи, которая содержит различные макромолекулярные фрагменты линейной и разветвленной областей (Voragen et al., 2009).

Широкое распространение, относительная легкость выделения и высокая физиологическая активность сделали привлекательным практическое применение пектинов. Поэтому, в настоящее время проводится интенсивное изучение связи между структурой и активностью пектиновых полисахаридов. Исследование действия пектинов на иммунитет заслуживает особого внимания в связи с чрезвычайно важной ролью, которую играет иммунная система в жизнеобеспечении организма.

Пектины являются перспективными кандидатами для разработки средств иммуномодулирующей терапии. Представляется актуальным выяснение изменений иммунной реактивности при пероральном введении пектинов в зависимости от их строения, что является ключевым подходом в выяснении молекулярных основ регуляции резистентности организма посредством влияния на иммунную систему желудочно-кишечного тракта.

Составляющими компонентами пектинов являются следующие структурные элементы: гомогалактуронан, рамногалактуронан-I (RG-I), ксилогалактуронан и апиогалактуронан (Round et al., 2010). Очевидно, что данные полисахариды, существенно отличающиеся своим строением, могут оказывать различное физиологическое действие. Поэтому, итоговый результат действия на иммунитет определяется, в первую очередь, соотношением пектиновых полисахаридов. Однако особенности иммуномодулирующего действия фрагментов пектиновых макромолекул ранее не изучались. Кроме того, сами пектиновые полисахариды отличаются у различных растений: гомогалактуронан – степенью метилэтерифицирования и молекулярным весом;

фрагмент RG-I – тонким строением боковых цепей, состоящих из остатков арабинозы, галактозы и ряда других нейтральных моносахаридов;

ксило- и апиогалактуронаны – степенью разветвленности и.т.д. В зависимости от сырья, метода выделения и полноты очистки в составе пектинов могут присутствовать различные примеси, которые могут сами по себе оказывать действие на иммунную систему. В настоящее время нет достаточных сведений для анализа зависимости иммуномодулирующего действия пектинов от особенностей их строения и наличия сопутствующих примесей.

Сравнение активности пектинов с различным типом построения углеводной цепи представляется целесообразным подходом для решения указанной проблемы. Однако исследования физиологической активности проводятся с использованием коммерческих пектинов, главным образом, цитрусового и яблочного, при этом не учитывается структурное разнообразие пектинов, встречающихся в природе. В этой связи представляют интерес пектины растений европейского Севера России, среди которых обнаружены пектины, имеющие строение, характерное для всех пектинов, а также пектины с уникальными чертами строения (Оводов и др., 2009). Всестороннее изучение пектинов растений европейского Севера России предоставляет возможность выявления структурных особенностей пектиновой макромолекулы, важных для проявления иммуномодулирующей активности. Большое прикладное значение этих исследований заключается в том, что они открывают перспективу создания новых подходов в иммунотерапии и в создании лечебных и профилактических препаратов.

Цель исследования – установить вклад структурных элементов макромолекулы в иммуномодулирующее действие пектинов.

Задачи исследования:

1. Выявить пектины, обладающие иммуномодулирующим действием.

2. Определить зависимость иммуномодулирующего действия от содержания остатков галактуроновой кислоты в пектине.

3. Исследовать влияние пектинов с различной степенью метилэтерифицирования на активность фагоцитов.

4. Установить особенности иммуномодулирующего действия пектинов, содержащих участки разветвленного галактуронана.

5. Сравнить иммуностимулирующее действие пектинов, отличающихся строением разветвленной области макромолекулы.

6. Определить зависимость иммуномодулирующего действия от молекулярной массы пектинов.

7. Установить влияние примесей на иммуномодулирующее действие пектинов.

8. Изучить способность пектинов снижать гиперактивацию лейкоцитов.

9. Выявить область макромолекулы, обуславливающую иммуноадъювантное действие, и определить механизм усиления иммунного ответа лемнаном.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Пектины при пероральном введении оказывают иммуномодулирующее действие, характер и направленность которого зависят от строения линейных и разветвленных областей макромолекулы.

2. Способность снижать иммунную реактивность более распространена среди пектинов, чем иммуностимулирующее действие, так как обусловлена областью галактуронана, образующего главную углеводную цепь всех пектинов.

3. Иммуностимулирующая активность проявляется только при определенном строении боковых цепей в разветвленной области пектиновой макромолекулы.

4. Существует несколько механизмов взаимодействия пектинов с иммунной системой. Часть из них приводит к усилению, а часть к снижению функциональной активности лейкоцитов.

5. В результате перорального введения пектинов происходит как системное, так и локальное изменение функциональной активности лейкоцитов.

Научная новизна. Впервые выявлены области пектиновой макромолекулы, обуславливающие стимулирующее или подавляющее действие на иммунную реактивность. Теоретически обоснован и впервые применен оригинальный методологический подход к изучению зависимости физиологической активности от строения пектиновых веществ. Он включает в себя сочетание сравнительного анализа физиологической активности пектинов с установленным строением и изучение активности фрагментов пектиновой макромолекулы, полученных с помощью кислотного и ферментативного гидролиза.

Впервые проведено сравнительное комплексное изучение иммуномодулирующей активности пектинов всех видов, с которыми может взаимодействовать иммунная система человека. А именно, изучено действие на иммунитет пектинов, выделенных из растений, не употребляемых в пищу, пектинов из клеточных культур, из ряда съедобных растений, а также коммерческих пектинов, применяемых в пищевой промышленности. При этом в качестве мишени воздействия пектинов определена функциональная активность основных звеньев иммунитета – фагоцитоза, антиген-специфического клеточного и гуморального иммунного ответа. В результате скрининговых исследований выявлены растения европейского Севера России, содержащие физиологически активные пектины. Установлены особенности действия на иммунитет пектинов, имеющих необычное химическое строение.

Впервые охарактеризовано иммуномодулирующее действие пектинов при их пероральном введении. Найдены новые виды физиологической активности пектинов: ингибирование токсического действия липополисахарида (ЛПС), защитное действие на стенку толстой кишки и усиление иммунного ответа на перорально введенный антиген. Выявлены особенности противовоспалительного действия пектинов, в частности, его превентивный характер. Обнаружено, что механизм иммуностимулирующего действия связан с увеличением проницаемости кишечной стенки под действием пектинов. На основании множественности и разнонаправленности иммуномодулирующего действия сформулирована концепция о регуляции иммунитета млекопитающих пектинами, поступающими в составе растительной пищи.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования вносят вклад в понимание общебиологических принципов регуляции иммунной устойчивости млекопитающих. Расширены представления о механизме противовоспалительного и противовопухолевого действия пищевых волокон. Выявленные особенности позволяют отличить иммуномодулирующее действие пектинов от эффекта других биологически активных соединений в составе многокомпонентных средств фитотерапии и растительной пищи.

На основе выявленной зависимости активности от строения разработаны рекомендации по усовершенствованию методов выделения пектинов с заданными свойствами. Приоритет конкретных технологических решений подтвержден двумя патентами РФ на изобретения. Получено экспериментальное обоснование применения биотехнологических подходов для получения физиологически активных полисахаридов. Высокомолекулярные галактуронаны можно рассматривать в качестве нового класса биомаркеров, определение содержания которых в продуктах питания, перспективно для оценки рациона питания.

Предложено новое направление в иммуномодулирующей терапии, основанное на многофункциональности пектиновых полисахаридов.

Результаты исследования открывают перспективу создания новых лекарственных препаратов, биологически активных добавок к пище и функциональных продуктов питания для лечения и профилактики воспалительных заболеваний и эндотоксинемий. Пектины, стимулирующие иммунный ответ на совместно вводимый с ними белковый антиген, могут представлять интерес в качестве иммуноадъювантов для пероральных вакцин.

Данные о нарушении нормальной иммунной толерантности цитрусовым пектином должны учитываться при медико-биологической оценке безопасности пищевых продуктов. Использование в пищевой промышленности пектинов, содержащих примеси глюкозы, должно получить оценку с точки зрения доктрины о продовольственной безопасности России.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в Сыктывкарском государственном университете.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены лично в виде устных и стендовых докладов на 20-ом Международном симпозиуме по углеводам (г. Гамбург, Германия, 2000 г.), Международной конференции «Иммунофармакология и иммунотерапия» (г.Флоренция, Италия, 2000 г.), 11-ом Европейском симпозиуме по углеводам (г.Лиссабон, Португалия. 2001 г.), Международном симпозиуме «Функциональные продукты питания. Научные и глобальные перспективы» (г. Париж, Франция, 2001 г.), Второй международной школе по мукозальной иммунологии (г.Неаполь, Италия, 2002 г.), 10-ом Братиславском симпозиуме по углеводам (г.Смоленице, Словакия, г.), Международной конференции по новым функциональным ингредиентам и продуктам питания (г.Копенгаген, Дания, 2003 г.). 5-ом и 7-ом Международных симпозиумах по химии природных соединений (г.Ташкент, Узбекистан, 2003 и 2007 гг.), Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (г. Алматы, Казахстан, 2003 г.), Международной летней школе по гликологии (г. Вагенинген, Нидерланды, 2004 г.), 3-ей и 4-ой Международных конференциях общества по изучению природных веществ (г.Нанкин, Китай, 2004 г.;

г. Лейзин, Швейцария, 2006 г.), Международной конференции «Иммуностимуляторы в современных вакцинах» (г.Малага, Испания, 2005 г.), Международных конгрессах общества по изучению лекарственных растений (г. Хельсинки, Финляндия, 2006 г.;

г. Грац, Австрия, 2008 г.), Международном симпозиуме по фармакологии природных веществ «Фапронатура 2006» (г.Варадеро, Куба, 2006 г.), IV-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г.Сыктывкар, 2006 г.), IV ом Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г.Новосибирск, 2008 г.), Научной конференции «Иммуномодуляторы природного происхождения» (г.Владивосток, 2009 г.), Всероссийской научной конференции «Химия и медицина» (г.Уфа, 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 68 научных работ, в том числе две монографии, два патента Российской Федерации, 11 статей в зарубежных и 11 статей в Российских рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырёх глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и списка литературы.

Работа изложена на 247 страницах машинописного текста, содержит таблиц и 44 рисунка. Список литературы включает 380 источников, в том числе 318 зарубежных авторов.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии и иммунологии Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии УРАН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН в рамках плановых тем НИР «Физиологическая активность полисахаридов в зависимости от структуры (ГР № 01.200 107401) и «Физиологическая активность пектиновых полисахаридов, модифицированных в условиях искусственной гастроэнтеральной среды» (ГР № 0120.0 602858).

Частично работа получила финансовую поддержку Министерства науки и образования в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" (госконтракты №№ 02.512.11. и 02.512.12.0014), Российского фонда фундаментальных исследований Программ (№№ 00-04-48063, 03-04-48136, 06-04-48079), фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки медицине», Программы интеграционных проектов фундаментальных научных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с ДВО РАН.

Сокращения и условные обозначения. ГЗТ – гиперчувствительность замедленного типа, Ил-1 – интерлейкин-1, Ил-10 – интерлейкин-10, ИФА – иммуноферментный анализ, ЛПС – липополисахарид, МПО – миелопероксидаза, ПОЛ – перекисное окисление липидов, СМ – степень метилэтерифицирования, ФБР – фосфатно-буферный раствор, ФНО- фактор некроза опухолей-, ХТ – холерный энтеротоксин, АР – яблочный пектин, OVA – овальбумин, РС – цитрусовый пектин, РМА – форболовый эфир миристиновой кислоты, RG-I – рамногалактуронан-I.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика пектинов и их фрагментов, использованных в работе.

В работе использовали 23 пектина, выделенные из растений европейского Севера России и их каллусных культур, 13 пектинов растений, употребляемых в пищу в свежем виде, и семь коммерческих пектинов.

Выделение пектиновых полисахаридов и установление их химической структуры проведено в лаборатории гликологии и лаборатории биотехнологии Oтдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН. Общая химическая характеристика исследованных пектинов приведена в таблице 1.

Выделенные пектины имеют общие черты химического строения. Все они содержат RG-I в качестве основного фрагмента разветвленной области макромолекулы. Главная углеводная цепь исследованных –D– пектинов состоит из связанных остатков 1,4– галактопиранозилуроновой кислоты.

Основные отличия в строении изученных пектинов заключаются в содержании остатков галактуроновой кислоты (от 50 до 90 %) и тонком строении боковых углеводных цепей разветвленной области. Ряд пектинов имеет необычное химическое строение. Лемнан, пектин ряски малой, содержит в своем составе апиогалактуронан в качестве главного компонента разветвленной области макромолекулы. Комаруман, пектин сабельника болотного, имеет разветвление главной галактуронановой цепи. Схема строения разветвленных областей некоторых пектинов, использованных в работе, приводится ниже.

В работе также использованы фрагменты главной углеводной цепи (галактуронаны) и фрагменты разветвленной области макромолекулы, полученные с помощью частичного кислотного и ферментативного гидролиза соответственно.

Лабораторные животные. В экспериментах использовали 4200 белых лабораторных мышей обоего пола массой 2025 г., полученных из питомника экспериментальных животных Института биологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар) и питомника лабораторных животных РАМН (п.

Рапполово). Работа выполнена в соответствии международными правилами обращения с экспериментальными животными и одобрена локальным этическим комитетом Института физиологии Коми НЦ УрО РАН.

Скрининг иммуномодулирующей активности. Мыши получали 0.5 % водные растворы пектиновых полисахаридов в качестве питья;

контрольные животные пили воду. Через 15–30 дней у группы мышей под эфирным наркозом забирали кровь с помощью кардиопункции и делали смыв из брюшной полости с помощью 5 мл охлажденного фосфатно буферного раствора (ФБР). Определяли количество и клеточный состав лейкоцитов крови и перитонеального смыва с помощью световой микроскопии.

Таблица 1. Общая химическая характеристика полисахаридов, использованных в работе* Название пектина GalA, Нейтральные моносахариды, % Источник выделения % Gal Ara Rha Api Glc Xyl Man Апиуман AG Сельдерей пахучий 81 3.6 2.5 2.6 - - - Apium graveolens Бергенан BC Бадан толстолистный 84 3.1 2.8 1.3 - 2.0 0.2 1. Bergenia crassifolia Бутомосан BU Сусак зонтичный 75 2.3 3.2 0.8 - 0.9 0.5 1. Butomus umbellatus L.

Гераклеуман HS Борщевик сибирский 84 2.8 2.6 1.9 - - - Heracleum sibiricum Комаруман СР Сабельник болотный 64 13.0 6.0 12.0 - - - Comarum palustre L.

Лемнан LM 64 4.9 3.9 3.2 19.6 - 3.7 Ряска малая Lemna minor Оксикоккусан ОР Клюква четырехлистная 82 3.4 8.0 1.3 - 4.7 0.4 0. Vaccinium oxycoccos L.

Потамогетонан PN Рдест плавающий 80 5.7 2.2 1.3 - 1.6 - Potamogeton natans L.

Раувольфиан RS Каллус раувольфии 82 5.0 4.1 2.1 - 5.0 1.8 змеевидной Rauwolfia serpentina Силенан SV Смолевка обыкновенная 63 3.2 4.2 2.2 - 2.7 1.9 1. Silene vulgaris L.

Танацетан TV Пижма обыкновенная 64 8.5 8.4 5.5 - 1.2 0.9 0. Tanacetum vulgare Танацетан TVС Каллус пижмы 68 4.4 5.2 1.5 - 1.4 1.1 0. обыкновенной T. vulgare П р и м е ч а н и я : * – в таблице представлена часть использованных пектинов;

GalA – галактуроновая кислота, Gal – галактоза, Ara – арабиноза, Rha – рамноза, Api – апиоза, Glc – глюкоза, Xyl – ксилоза, Man – манноза.

(1) (2) (3) (4) (5) (6) GalA Rha Gal Ara Api Схема строения фрагментов углеводной цепи пектинов, использованных в работе:

1 – линейный галактуронан;

2 – разветвленный галактуронан (комаруман);

3 – слаборазветвленная область RG-I (бергенан);

4 и 5 – сильноразветвленные области RG-I (силенан и танацетан соответственно);

6 – апиогалактуронан (лемнан).

Суспензию перитонеальных лейкоцитов получали с помощью центрифугирования смыва при 400 g в течение 10 мин (Хант, 1990).

Другой группе мышей внутрибрюшинно вводили 0.5 мл раствора зимозана (Sigma, США), приготовленного на стерильном физрастворе ( мг/мл). Мышей умерщвляли через 24 часа после введения зимозана и получали смыв из брюшной полости (Kolaczkowska et al., 2001).

Адгезию, миелоперксидазную активность и генерацию активных форм кислорода клетками определяли спектрофотометрическим методом (Пинегин и др., 1995).

Определение ингибирующего действия на лейкоциты. Пектины и их фрагменты растворяли в стерильном физиологическом растворе непосредственно перед проведением эксперимента и вводили лабораторным мышам перорально с помощью полиэтиленового зонда (200 мкл). Контрольные животные получали эквивалентный объем стерильного физраствора. Через 24 часа определяли функциональную активность лейкоцитов по способности секретировать цитокины, мигрировать к месту воспаления, адгезироваться на пластик и генерировать свободные радикалы.

Продукцию цитокинов определяли после стимуляции образцов цельной крови с помощью ЛПС (E. coli O111:B4) (10 мкг/мл) ex vivo (Ishihara et al, 2002). Концентрацию фактора некроза опухолей (ФНО-) и интерлейкина-10 в плазме измеряли с помощью (Ил-10) иммуноферментного анализа (ИФА), используя реагенты и протоколы фирмы eBioscience. Подвижность клеток определяли в модели подкожного воздушного пузыря, в который вводили раствор каррагинана для индукции воспаления.

Определение иммуностимулирующего действия. Мышам перорально вводили 1 мг овальбумина (OVA) или смесь OVA с пектином (1 мг) трижды с интервалом 7 дней. Спустя 7 дней после последней иммунизации у животных регистрировали интенсивность иммунного ответа на OVA: измеряли реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и концентрацию антиген специфичных антител. ГЗТ вызывали с помощью инъекции агрегированного нагреванием OVA (25 мкл раствора 1 мг/мл) в левую лапку. В правую лапку вводили 25 мкл ФБР. Через 24 часа измеряли толщину лапок с помощью плетизмометра (Ugo Basil, Italy). Интенсивность ГЗТ определяли, как разность толщины между левой и правой лапкой (утолщение) и выражали в микролитрах. После измерения ГЗТ животных умерщвляли, забирали кровь и в сыворотке определяли титр анти-OVA-антител класса IgG с помощью непрямого ИФА (Kato et al., 2001).

При изучении иммуноадъювантного действия лемнана определяли дополнительно концентрацию анти-OVA антител IgG1, IgG2a, IgE в сыворотке крови, а также концентрацию анти-OVA антител IgA в слизистой кишечника (Кэтти, Райкундалиа, 1991).

Концентрацию OVA в сыворотке определяли через 60 мин после последней иммунизации с помощью конкурентного ИФА, используя поликлональные анти-OVA-антитела фирмы Acris Antibodies (Кэтти, Райкундалиа, 1991).

Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию в стенке тонкой кишки мышей малонового диальдегида (МДА), определенного спектрофотометрическим методом по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Mabley et al., 2003).

Эндотоксиновый шок. Мышам внутрибрюшинно вводили раствор ЛПС (E.

coli O111:B4) (1 мл, 25 мг/ кг) и регистрировали количество выживших и погибших мышей в течение трех суток. Часть мышей умерщвляли через 2 часа после введения ЛПС, получали смыв из брюшной полости, в котором определяли концентрацию цитокинов (Ил-1, ФНО, Ил-10) с помощью ИФА.

Воспаление толстой кишки у мышей индуцировали разовым ректальным введением 5% уксусной кислоты (Itoh et al., 2000). Изучали степень поражения толстой кишки, для чего изолировали и исследовали см фрагмент кишки проксимальней ануса. Степень поражения толстой кишки оценивали по шкале: 0 – нет признаков воспаления, 1 – гиперемия, без язв и эрозий, 2 – поверхностные язвы, без разрушения слизистой, 3 – язвы с разрушением слизистой. Площадь поражения выражали в процентах от площади фрагмента кишки (Mahgoub et al., 2003).

Отек лапки вызывали у мышей подкожной инъекцией 2 %-го водного раствора каррагинана. Утолщение лапки по сравнению с первоначальным уровнем измеряли с помощью плетизмометра.

Статистистическая обработка результатов. При обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение, среднее квадратичное отклонение. При оценке различий между группами применяли непараметрические критерии Манна-Уитни с использованием программного обеспечения “Statistica 6.0” (Stat Soft. Inc).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Зависимость иммуномодулирующего действия от строения главной углеводной цепи пектинов.

Влияние пектинов с различным содержанием остатков галактуроновой кислоты на иммунитет. Скрининг пектиновых полисахаридов растений европейского Севера России выявил пектины, способные как стимулировать, так и подавлять функциональную активность перитонеальных макрофагов. Характер действия на активность макрофагов зависит в первую очередь от содержания остатков галактуроновой кислоты в пектине. Обнаружено, что пектины с содержанием остатков галактуроновой кислоты более 80 % уменьшают накопление макрофагов в брюшной полости, вызванное инъекцией зимозана. К таким пектинам относятся: гераклеуман, пектин борщевика сибирского;

потамогетонан, пектин рдеста плавающего;

оксикоккусан, пектин ягод клюквы обыкновенной и раувольфиан, пектин каллуса раувольфии змеиной. Пектины с содержанием остатков галактуроновой кислоты менее 75 % такой способностью не обладают, а напротив, некоторые из них, такие как лемнан, пектин ряски малой, бутомосан, пектин сусака зонтичного, и силенан, пектин смолевки обыкновенной, стимулируют активность клеток (Рис. 1а).

Усиливающее и ослабляющее действие пектинов на макрофаги приводит к соответствующему изменению антиген-специфичного иммунного ответа, который измеряли как реакцию ГЗТ. Введение OVA в лапку мышам, предварительно сенсибилизированным подкожной инъекцией этого же антигена в полном адъюванте Фрейнда, приводит к образованию отека. Интенсивность отека лапки увеличивается у мышей, которые получили лемнан, силенан, бергенан и бутомосан. В то же время пектины, подавляющие активность макрофагов, ингибируют реакцию ГЗТ на OVA (Рис. 1б).

Исключением являются бергенан и комаруман, пектины бадана толстолистного и сабельника болотного соответственно. Бергенан, имеющий в своем составе 85 % остатков галактуроновой кислоты, не снижает, а увеличивает иммунную реактивность. Комаруман уменьшает подвижность макрофагов и реакцию ГЗТ, хотя содержит лишь около 60 % остатков галактуроновой кислоты. Данные пектины имеют особенности строения, отличающие их от других изученных пектинов. Бергенан характеризуется высокой степенью метилэтерифицирования остатков галактуроновой кислоты. В макромолекуле комарумана наряду с линейным галактуронаном имеются области разветвленного галактуронана.

Фрагменты пектинов, состоящие только из остатков галактуроновой кислоты (98100 %), были получены с помощью частичного кислотного гидролиза пектинов. Обнаружено, что все галактуронаны снижают реактивность макрофагов и ингибируют реакцию ГЗТ независимо от того, обладают такой способностью исходные пектины или нет. В частности, галактуронановые фрагменты апиумана, потамогетонана, оксикоккусана и раувольфиана также как исходные пектины, уменьшают активность клеток. Способность ингибировать активность лейкоцитов выявлена у галактуронановых фрагментов пектинов как не действующих (пектины хвоща, мать-и мачехи и др.), так и стимулирующих деятельность лейкоцитов (бергенан, бутомосан, силенан, лемнан, зостеран).

(а) Активность макрофагов, % * * * * * HS PN OP RS BC BU SV TV CP ZM LM (б) * * * * * Отек лапки, % * * * * HS PN OP RS BC BU SV TV CP ZM LM Пектин HS PN OP RS BC BU SV TV CP ZM LM GalA, % 81 80 82 82 83 75 74 60 65 60 Рис. 1. Накопление макрофагов в брюшной полости в ответ на введение зимозана (а) и реакция ГЗТ (б) у мышей, получавших пектины перорально в течение 28 дней. Обозначения пектинов даны в таблице 1.

ZM – зостеран, пектин зостеры морской Zostera marina.

Данные представлены в процентах по отношению к контролю, принятому за 100 %. * – p 0.05, n – 8.

Таким образом, способность ингибировать лейкоциты характерна для пектинов, состоящих в основном из остатков галактуроновой кислоты, боковые углеводные цепи препятствуют проявлению такой способности.

Влияние на активность фагоцитов пектинов с различной степенью метилэтерифицирования. Галактуронановая цепь отличается у различных пектинов степенью метилэтерифицирования карбоксильных групп (СМ).

Все пектины, за исключением бергенана, полученные с помощью экстракции растительного сырья оксалатом аммония, являются низкометоксилированными (СМ 20%). Высокометоксилированный бергенан (СМ – 57 %) не снижает активность макрофагов, несмотря на высокое содержание остатков галактуроновой кислоты, что указывает на зависимость ингибирующего эффекта от СМ пектина. Поэтому нами было исследовано влияние на активность фагоцитов пектинов с различной СМ, которые были получены с помощью экстракции пищевых растений раствором соляной кислоты. Обнаружено, что капсикуман СА, пектин перца болгарского, СМ которого составляет 25 %, уменьшает накопление макрофагов в брюшной полости, индуцированное зимозаном, а также ингибирует секрецию ФНО- лейкоцитами крови в ответ на стимуляцию ЛПС. Пектины моркови посевной (DS), лука репчатого (AC) и капусты белокачанной (BO), имеющие СМ 51, 60 и 67 % соответственно, не влияют на лейкоциты (Рис.2).

* * ФНО-, % * CA DS AC BO CU701 CU201 AU701 AU Пектин CA DS AC BO CU701 CU201 AU701 AU СМ, % 25 50 60 67 36 72 36 Рис. 2. Влияние пектинов с различной СМ на способность лейкоцитов крови секретировать ФНО-. CU701 и CU201 – цитрусовые, AU701 и AU202 – яблочные пектины фирмы Herbstreith&Fox KG.

Данные представлены в процентах по отношению к контролю, принятому за 100 %. * – p 0.05, n – 8.

Способностью ингибировать активность лейкоцитов обладают цитрусовый и яблочный пектины со степенью метилэтерифицирования 3438 %, тогда как аналогичные высокометоксилированные пектины (СМ – 6876 %) таким действием не обладают (Рис.2).

Полученные данные свидетельствуют о том, что свободные карбоксильные группы остатков галактуроновой кислоты необходимы для реализации ингибирующего действия пектинов и галактуронанов на лейкоциты. Данное заключение подтверждается тем, что амидированный пектин СМ020 не влияет на активность клеток. В пектине СМ020 (СМ – 25 %, степень амидирования – 25 %) значительная часть карбоксильных групп замещена. Известно, что низкометилэтерифицированный пектин проникает в толщу муцинового слоя, выстилающего стенку кишечника, тогда как высокоэтерифицированный пектин образует гель на его поверхности. Это связано с тем, что благодаря отрицательному заряду свободных карбоксильных групп молекулы низкометилэтерифицированного пектина отталкиваются от одноименно заряженных молекул муцина, тем самым препятствуя образованию водородных связей. Очевидно, что проникновение в толщу муцинового слоя способствует взаимодействию низкометилэтерифицированных пектинов с эпителием кишечника.

Таким образом, высокая ( 50 %) СМ остатков галактуроновой кислоты главной углеводной цепи препятствует ингибирующему действию пектинов на активность лейкоцитов. Для получения пектинов, снижающих иммунную реактивность, целесообразно, по-видимому, использовать методы экстракции, способствующие удалению боковых углеводных цепей и деэтерификации полигалактуроновой кислоты.

Особенности иммуномодулирующего действия пектина сабельника болотного содержащего участки разветвленного (комарумана), галактуронана. В результате скрининга иммуномодулирующей активности пектинов, выделенных из растений европейского Севера России, установлено, что комаруман ингибирует активность лейкоцитов, что не характерно для пектинов с содержанием остатков галактуроновой кислоты менее 75 % (см. Рис.1). Детальное структурное исследование выявило наличие в составе главной углеводной цепи комарумана области разветвленного галактуронана (Оводова и др., 2006):

4--GalpA(14)--GalpA(14)--GalpA 4--GalpA-(14)--GalpA В соответствии с данными атомно-силовой микроскопии разветвленные молекулы составляют не менее 50 % общего числа макромолекул в полидисперсном растворе пектина сабельника (Рис.3).

Рис. 3. Атомно-силовое изображение галактуронана комарумана.

Размеры области изображения – 200х300 нм. (Оводова и др., 2006).

Обнаружено, что действие комарумана на активность нейтрофилов имеет двухфазный характер. В течение первых суток после перорального введения комарумана количество нейтрофилов в очаге воспаления существенно снижается. Однако затем количество нейтрофилов у мышей, получивших комаруман, выше, чем у контрольных животных. Данная реакция иммунной системы на комаруман вполне закономерна, поскольку меньшему числу фагоцитов требуется больше времени для элиминации чужеродных объектов.

Действие комарумана на количество нейтрофилов обусловлено снижением продукции цитокинов резидентными клетками воспалительного очага. Установлено, что комаруман снижает концентрацию Ил-1 уже через два часа после индукции воспаления, то есть задолго до инфильтрации очага воспаления нейтрофилами. Через сутки после индукции воспаления концентрация противовоспалительного цитокина Ил-10 у мышей, получивших комаруман, выше, чем у контрольных животных, что отражает компенсаторную реакцию иммунной системы на увеличенное число клеток в очаге воспаления.

Сравнение противовоспалительного действия галактуронанов, полученных из комарумана и бергенана, позволило выявить особенности эффекта разветвленной области галактуронана в составе комарумана.

Галактуронан бергенана, который не содержит разветвлений углеводной цепи, сдвигает баланс цитокинов в противовоспалительную сторону, а именно снижает концентрацию Ил-1 и увеличивает концентрацию Ил- (Рис. 4).

* % от контроля * * Ил-1b Ил-10 Ил-1b Ил- BC-H CP-H Рис. 4. Влияние галактуронановых фрагментов бергенана (ВС-Н) и комарумана (СР-Н) на продукцию цитокинов.

Данные представлены в процентах по отношению к контролю, принятому за 100 %. * – p 0.05, n – 7.

В результате количество нейтрофилов, привлеченных в очаг воспаления, уменьшается (Рис. 5). Галактуронан комарумана, который состоит как из линейных, так и разветвленных молекул, уменьшает содержание Ил-10, что приводит увеличению накопления клеток (Рис. 4 и 5). Полученные данные указывают на то, что действие исходного комарумана в первые и вторые сутки развития воспаления отражает влияние на продукцию цитокинов линейной и разветвленной области его галактуронана соответственно.

* СР-Н нейтрофилы, % 100 * * * ВС-Н 50 * * 72 ч 0 2 12 24 Рис. 5. Влияние галактуронановых фрагментов бергенана (ВС-Н) и комарумана (СР-Н) на количество нейтрофилов в очаге воспаления.

Данные представлены в процентах по отношению к контролю, принятому за 100 %. * – p 0.05, n – 7.

Таким образом, наличие блоков разветвленного галактуронана вызывает двухфазный характер иммуномодулирующего действия пектина – снижение лейкоцитарной активности сменяется ее увеличением.

2. Зависимость иммуномодулирующего действия от строения разветвленной области пектиновой макромолекулы.

В результате скрининга выявлено, что ряд пектинов, содержащих менее 75 % остатков уроновых кислот, стимулирует активность фагоцитов (см. Рис.1). Данные пектины характеризуются развитой разветвленной областью, которая представлена апиогалактуронаном в макромолекуле лемнана и RG-I в макромолекуле бергенана, силенана и бутомосана.

Обнаружено, что тонкое строение боковых углеводных цепей пектинов определяет способность стимулировать активность клеток.

Силенан, пектин смолевки обыкновенной, и танацетан, пектин пижмы обыкновенной, имеют схожее строение, однако силенан стимулирует фагоциты, тогда как танацетан не обладает такой способностью.

Разветвленная область силенана представлена в основном линейными 1, связанными –галактановыми и 1,5 –арабинановыми цепями (1), тогда как боковые углеводные цепи танацетана содержат в большом количестве разветвленные блоки арабинана (2) и галактана. Макромолекула бергенана также, как силенана, содержит в составе рамногалактуронановой области в основном неразветвленные участки, представленные 1,5–связанной -арабинофуранозой и 1,4 и 1,6– связанной –галактопиранозой.

(1) -Galp-(14)--Galp-(1… -Araf-(15)--Araf-(1… (2) 5)--Araf-(15)--Araf-(15)--Araf-(15) 2 -Araf-(15)--Araf- 2--Araf-( -Araf-(15)--Araf- Стимулирующее действие лемнана имеет ряд отличий от действия пектинов с разветвленной областью типа RG-I. Во-первых, лемнан вызывает перераспределение лейкоцитов между тканями и кровью.

Количество нейтрофилов в крови мышей повышается, а в смыве из брюшной полости снижается при пероральном введении лемнана, тогда как силенан не влияет на количество клеток (Рис. 6а). Во-вторых, лемнан стимулирует покоящиеся фагоциты и повышает их ответ на форболовый эфир миристиновой кислоты (РМА). Силенан усиливает активность клеток, вызванную как зимозаном, так и РМА (Рис. 6б). Следовательно, пероральное введение лемнана приводит к изменению физико химических свойств плазматической мембраны фагоцитов и увеличению ее проницаемости для низкомолекулярных активаторов, таких как РМА.

Силенан влияет на функциональную активность клеточных рецепторов.

(а) Количество лейкоцитов * * % кровь бр. полость кровь бр. полость SV LM (б) Генерация кислородных радикалов * * % спонт. индуц. спонт. индуц.

SV LM Рис. 6. Действие пектинов, содержащих RG-I (силенан SV) и апиогалактуронан (лемнан LM) в качестве разветвленной области, на количество (а) и функциональную активность лейкоцитов (б).

Данные представлены в процентах по отношению к контролю, принятому за 100 %. * – p 0.05, n – 7.

Отличия в строении разветвленной области пектиновой макромолекулы определяют также действие пектинов на антиген специфический иммунный ответ. Лемнан, силенан и бергенан увеличивают интенсивность реакции ГЗТ на белковый антиген, введенный перорально. Отек лапки, вызванный инъекцией «разрешающей» дозы антигена, больше в 1,72 раза у животных, сенсибилизированных смесью OVA и пектинов. Лемнан, кроме того, стимулирует продукцию антител - содержание OVA-специфического иммуноглобулина IgG выше в 1,8 раза у мышей, иммунизированных OVA совместно с лемнаном, по сравнению с мышами, получившими только OVA (Рис. 7). Следует отметить, что пектины с высоким содержанием остатков галактуроновой кислоты (потамогетонан), а также комаруман снижают интенсивность реакции ГЗТ, что согласуется с ингибирующим действием данных пектинов на активность фагоцитов.

Полученные данные указывают на возможность, по крайней мере, двух способов стимуляции иммунитета пектинами. Первый из них обеспечивает усиление только клеточных реакций (силенан, бергенан), а второй дополнительно приводит к стимуляции антителообразования, как это происходит в случае с лемнаном. В обоих случаях боковые углеводные цепи пектина участвуют в реализации стимулирующего эффекта. Однако гликозидные связи между остатками нейтральных моносахаридов, входящих в состав боковых цепей, являются более лабильными, чем 1,4- связанные остатки -D-галактуроновой кислоты.

Поэтому вероятность сохранения нативной структуры пектиновой макромолекулы и возможность проявления иммуностимулирующего действия уменьшается при нахождении пектина в желудочно-кишечном тракте, по сравнению с ингибирующим действием, которое опосредуется более устойчивым линейным галактуронаном.

* * * % ГЗТ ГЗТ IgG IgG SV LM Рис. 7. Действие пектинов, содержащих RG-I (силенан SV) и апиогалактуронан (лемнан LM) в качестве разветвленной области, на иммунный ответ.

Данные представлены в процентах по отношению к контролю, принятому за 100 %. * – p 0.05, n – 7.

3. Зависимость иммуномодулирующего действия от молекулярной массы пектинов.

Исследованные пектины состоят из полимергомологов, молекулярная масса которых варьирует в широком диапазоне от 20 до 700 кДа. С помощью ультрафильтрации на мембранах и полых волокнах были получены фракции пектинов и галактуронанов с различной молекулярной массой. Исследование физиологической активности полученных макромолекул выявило зависимость их иммуномодулирующего действия от молекулярной массы.

Установлено, что галактуронаны с молекулярной массой свыше кДа ингибируют активность лейкоцитов, тогда как фракции галактуронанов с молекулярной массой 100300 кДа и 50100 кДа такой способностью не обладают (Табл. 2).

Таблица 2. Влияние галактуронановых фракций на активность лейкоцитов Фракция М, кДа Активность, # % от контроля галактуронана 51±20* СР-Н1 свыше СР-Н2 82± СР-Н3 78± 65±28* ВС-Н1 свыше ВС-Н2 86± ВС-Н3 86± 51±30* свыше LM-Н LM-Н2 102± LM-Н3 89± 55±14* свыше ZM-Н ZM-Н2 84± 56±12* СА-Н1 свыше СА-Н2 99± 68±15* свыше TVC-H TVC-H2 96± # Примечание. – фракции получены последовательной ультрафильтрацией галактуронанов через мембраны с пределом пропускания пор 300 (Н1), 100 (Н2) и 50 кДа (Н3).

Данные представлены в процентах по отношению к контролю, принятому за 100 %. * – p 0.05, n – 7.

Иммуностимулирующее действие, напротив, вызывается полисахаридными цепями с молекулярной массой 20100 кДа С помощью ультрафильтрации силенана, бергенана и бутомосана на полых волокнах были получены фракции пектинов, не содержащие полисахаридные цепи с молекулярной массой менее 100 кДа. Установлено, что полученные фракции, в отличие от исходных пектинов, не проявляют иммуностимулирующего действия (Рис. 8). Полученные данные согласуются с представлением о том, что разветвленная область пектиновой макромолекулы обуславливает стимуляцию лейкоцитов.

* Активность Мф, % Реакция ГЗТ, % * * * * 150 * 50 1 2 1 2 1 1 2 1 2 1 SV BC BU SV BC BU Рис. 8. Иммуностимулирующее действие пектинов, содержащих полисахаридные цепи с Mw 20100 кДа (1) и 100300 кДа (2).

Данные представлены в процентах по отношению к контролю, принятому за 100 %. * – p 0.05, n – 7.

4. Влияние примесей на иммуномодулирующее действие пектинов.

В зависимости от сырья, метода выделения и полноты очистки в составе пектинов могут присутствовать различные примеси, которые могут сами по себе оказывать действие на иммунную систему.

Пектины, используемые в пищевой промышленности, характеризуются высоким содержанием примеси глюкозы, которая добавляется в них для повышения вязкости и улучшения желирующих свойств. С помощью ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе показано, что глюкоза, содержащаяся в большом количестве в цитрусовом пектине, не входит в состав его разветвленных цепей.

Нормальное реагирование иммунной системы на белки, попадающие в кишечник, это толерантность («oral tolerance»), которая регистрируется, как снижение клеточного и гуморального иммунного ответа. В частности, пероральное введение мышам OVA (20 мг) за 7 дней до парентеральной сенсибилизации этим же белком вызывает существенное снижение реакции ГЗТ и продукции IgG. У животных, получивших OVA в смеси с цитрусовым пектином (РС), интенсивность ГЗТ и концентрация антител в сыворотке выше, чем у толерантных мышей. В то же время гиперчувствительность и содержание IgG у мышей, получавших глюкозу или РС, не содержащий примесей глюкозы (РС-1), не отличаются от контрольных значений (Рис. 9). Ингибирование пищевой толерантности может привести к нежелательным последствиям, так как под действием цитрусового пектина активируется продукция иммуноглобулина IgE, играющего ключевую роль в аллергических реакциях (Табл. 3).

(а) ГЗТ (б) анти-OVA IgG 50 16 * * 40 титр log мкл 0 К РС РС-1 Glc К РС РС-1 Glc Рис. 9. Влияние цитрусового пектина на реакцию ГЗТ (а) и концентрацию анти-OVA иммуноглобулина IgG.

Животных иммунизировали OVA (К), смесью OVA с РС-1 или смесью OVA с глюкозой (Glc). * – p 0.05, n – 8.

Таблица 3. Влияние РС на содержание иммуноглобулина IgE в крови у мышей Пероральное введение Общий IgE, Анти-OVA IgE, мкг/мл мкг/мл Физ.раствор 930±159 6.5±1. OVA (контроль) 590±48 4.4±0. 780±59* 6.1±0.8* OVA + РС OVA + АР 630±150 4.8±1. П р и м е ч а н и я : AP – яблочный пектин. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. * – p 0.05, n – 7.

Кроме того, изменяется соотношение между подклассами иммуноглобулина IgG. В сыворотке толерантных мышей концентрация антител существенно ниже, чем в контроле. Концентрация анти-OVA IgG1 у мышей, получавших РС, в два раза выше по сравнению с толерантными животными, тогда как концентрация IgG2а существенно не меняется (Тaбл. 4). Присутствие глюкозы изменяет физико-химические свойства цитрусового пектина и влияет на конформационные характеристики пектиновой макромолекулы, что, возможно, и обуславливает иммуностимулирующий эффект цитрусового пектина.

Таблица 4. Влияние РС на содержание подклассов иммуноглобулина IgG в крови у мышей Пероральное введение IgG1, IgG2a, обратный log2 обратный log Физ.раствор 13.1±1.3 8.5±2. OVA (контроль) 5.7±2.0 4.8±2. 13.4±1.7* OVA + PC 7.1±2. OVA + AP 3.6±2.4 3.0±2. Примечание. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. * – p 0.05, n – 7.

Интерес вызывает присутствие в составе пектинов примесей ЛПС.

ЛПС – структурный компонент наружной мембраны грамотрицательных бактерий, который обладает мощным действием на иммунную систему.

Примесь ЛПС в пектинах, обладающих иммуностимулирующей активностью, составляет от 30 до 13000 нг/мг. Таким образом, при введении пектина мышам в количестве, при котором наблюдается усиление иммунного ответа, животные получают ЛПС в дозе 1, мкг/кг. Установлено, что ЛПС E.coli при пероральном введении в дозе 1000 мкг/кг не влияет на активность макрофагов брюшной полости мышей. Пектины и галактуронановые фракции, обладающие противовоспалительным действием, содержат в своем составе значительно меньше примесей ЛПС (от 1 до 1000 нг/мг).

5. Защитное действие пектинов при гиперактивации иммунной системы.

Нейтрофилы и макрофаги - ключевые участники воспалительного процесса. Высокая активность нейтрофилов и макрофагов может вызывать повреждение тканей собственного организма. Изучено действие пектинов и галактуронанов на развитие у мышей эндотоксинового шока, который обусловлен чрезмерной реакцией макрофагов на ЛПС.

Внутрибрюшинное введение мышам ЛПС в дозе 2025 мг/кг приводит к гибели 100 % животных в течение 24 часов. Обнаружено, что смертность снижается в 1,52 раза в группах мышей, получивших перорально потамогетонан, оксикоккусан OP, апиуман AG, а также раувольфиан Пектины, обладающие RS (Рис. 10).

иммуностимулирующим действием (силенан, бергенан, лемнаны), не влияют на гибель мышей в результате эндотоксинового шока.

PN % AG OP, RS CA K 0 12 15 18 21 24 36 Врямя после инъекции ЛПС, часы Рис. 10. Влияние пектинов (доза 50 мг/кг) на гибель мышей, вызванную внутрибрюшинным введением ЛПС.

Количество животных в каждой точке времени – 1016.

В результате предварительного введения потамогетонана, оксикоккусана, апиумана и раувольфиана существенно снижается накопление в брюшной полости провоспалительных цитокинов. В то же время под действием пектинов увеличивается продукция противовоспалительного цитокина Ил-10 (Табл. 5). Вследствие сдвига баланса цитокинов в противовоспалительную сторону пектины уменьшают инфильтрацию брюшной полости нейтрофилами. Поскольку про- и противовоспалительные цитокины контррегулируют синтез друг друга, возможны три пути модуляции цитокинового баланса пектинами.

Во-первых, первичное подавление продукции провоспалительных цитокинов;

во-вторых, первоочередная стимуляция синтеза Ил-10 и, в третьих, одновременное противоположное действие на клетки продуценты как тех, так и других цитокинов.

Таблица 5. Влияние пектинов (50 мг/кг) на концентрацию цитокинов и содержание полиморфоядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) в перитонеальном смыве у мышей, получивших инъекцию ЛПС Пероральное введение Ил-10, ПМЯЛ, Ил-1, пг/мл тыс.клеток пг/мл /мышь Физраствор (Контроль) 4905±1464 2521±206 13500± 2729±872* 3004±165* 7500±1500* Потамогетонан 2677±1776* 3100±150* 10260±2100* Апиуман Физраствор (Контроль) 6430±1811 2810±206 10500± 4550±960* 3614±365* 5500±980* Раувольфиан 4260±1120* 3981±350* 6100±1300* Оксикоккусан Примечание. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. * – p 0.05, n – 8.

Известно, что механизм патогенетического действия ЛПС включает в себя нарушение барьерной функции кишечной стенки, что приводит к резкому усилению проникновения токсинов и микроорганизмов из просвета кишки в кровь. Поэтому, способность пектинов защищать кишечную стенку от повреждения была изучена с помощью модели острого язвенного колита.

Воспаление и повреждение слизистой оболочки дистальной части толстой кишки развивается через 24 часа после ректального введения уксусной кислоты лабораторным мышам (Рис. 11б). Показано, что раувольфиан, оксикоккусан, а также комаруман предотвращают повреждение кишечной стенки (Рис. 11с-е).

Действие пектинов характеризуется снижением площади поражения более чем в два раза и уменьшением степени повреждения на 40 % (Рис.12). Пектины, обладающие иммуностимулирующим действием:

лемнан и силенан, - способствуют увеличению площади поражения стенки толстой кишки. Однако степень повреждения остается на уровне, характерном для мышей, получивших воду до индукции колита воспаления. Раувольфиан RS содержит в своем составе полисахаридные цепи двух типов: пектина RSP и глюкана RSG. Установлено, что защитным действием при колите обладает пектин RSP, тогда как глюкан не влияет на воспаление толстой кишки.

Рис 11. Образцы стенки толстой кишки мышей до (a) и 24 часа после ректального введения уксусной кислоты (b-d). b – без лечения;

c, d и e – мыши получали комаруман СР, оксикоккусан ОР, раувольфиан RS дважды (за 2 и 1 день) перед введением кислоты соответственно.

Степень повреж дения, баллы * * * * К RS RSP RSG OP CP LM SV 50 Площадь пораж ения, % * * * * * * К RS RSP RSG OP CP LM SV Рис.12. Повреждение стенки толстой кишки у мышей, вызванное ректальным введением уксусной кислоты. Мыши получили воду (К – контроль) или пектины за 48 часов до введения уксусной кислоты. * – p 0.05, n – 7.

Таким образом, противовоспалительное действие пектинов проявляется как локально в стенке кишечника, так и на удалении от него.

Полученные данные указывают на системное снижение иммунной реактивности после перорального введения пектинов. Возможно, пектины активируют в организме регуляторные механизмы, направленные на снижение нежелательной гиперактивации иммунной системы.

Способность пектинов снижать функциональную активность лейкоцитов может быть использована для предотвращения развития нежелательных воспалительных реакций в организме.

6. Иммуноадъювантное действие лемнана.

Влияние лемнана на иммунный ответ сравнимо с действием наиболее эффективного из известных в настоящее время пероральных адъювантов – холерного энтеротоксина и поэтому было изучено более детально.

В соответствии с ранее полученными данными установлено, что пероральная иммунизация с помощью OVA инициирует синтез иммуноглобулинов IgG1 и IgG2a примерно в равной степени. Лемнан стимулирует продукцию антител IgG1 и IgG2a в 2 и 1,7 раза соответственно (Рис. 13), тогда как холерный энтеротоксин усиливает продукцию преимущественно антител подкласса IgG1.

IgG1 IgG2a 8 * * титр, log * * К ХТ К ХТ LM LM Рис. Содержание подклассов 13. OVA-специфического иммуноглобулина IgG в крови мышей, иммунизированных OVA (контроль, К) или OVA совместно с лемнаном (LM) или холерным энтеротоксином (ХТ). * – p 0.05, n – 7.

Пероральная иммунизация мышей OVA вызывает незначительное появление антиген-специфического иммуноглобулина IgA на поверхности слизистой оболочки тонкой кишки. Концентрация анти-OVA IgA антител увеличивается более чем в 7 раз у животных, иммунизированных смесью OVA и лемнана. Кроме того, лемнан увеличивает в два раза общее количество иммуноглобулина IgA, что свидетельствует об усилении неспецифической резистентности слизистой желудочно-кишечного тракта (Рис. 14).

общий IgA, нг/мл анти-OVA IgA, нг/мл 200 * * * 160 * К ХТ LM К ХТ LM Рис. 14. Содержание иммуноглобулина IgA в кишечной слизи мышей, иммунизированных OVA (контроль, К) или OVA совместно с лемнаном (LM) и холерным энтеротоксином (ХТ). * – p 0.05, n – 6.

По-видимому, в иммунный ответ, вызванный совместным введением белкового антигена и лемнана, вовлечены Т-лимфоциты-хелперы как 1 ого, так и 2-ого класса (Th1 и Th2). Хорошо известно, что лимфоциты Th через цитокины (интерлейкин-4 и др.) способствуют продукции антител IgG1 и IgA, тогда как лимфоциты Th1 опосредуют реакцию ГЗТ и синтез IgG2a. Адъювантная активность лемнана имеет сходство с действием на иммунный ответ тритерпенового гликозида – квилайа сапонина QS-21 из Quillaia saponaria, нуклеотидных олигомеров, содержащих мотив CpG, микрочастиц на основе полиакрилового крахмала.

Исследование зависимости иммуностимулирующего действия лемнана от дозы выявило, что лемнан стимулирует как специфический, так и неспецифический иммунный ответ в дозах 40100 мг/кг. Пероральное введение лемнана в количестве менее чем 1 мг/мышь не влияет на иммунитет, тогда как введение более 3 мг/мышь затруднено вследствие высокой вязкости раствора пектина. Известно, что эффективность в узком диапазоне доз характерна для веществ, иммуностимулирующее действие которых обусловлено увеличением проницаемости кишечной стенки для антигена. Поэтому, влияние на проникновение в кровь сопутствующего белка было изучено с целью выяснения механизма иммуностимулирующего действия лемнана.

Установлено, что концентрация OVA в крови мышей через три часа после введения OVA в смеси с лемнаном в 2,5 раза выше, чем у животных получивших только белок (Рис. 15). Совместное введение OVA с комаруманом СР, пектином, который уменьшает иммунный ответ, приводит к снижению концентрации белка в крови. Проникновение в кровь OVA не изменяется в присутствии яблочного пектина (АР).

Холерный энтеротоксин увеличивает проницаемость кишечной стенки в восемь раз.

* нг/мл К ЯП LM CP Рис. 15. Концентрация OVA в крови мышей, получивших OVA (К – контроль) или OVA совместно с лемнаном (LM), комаруманом (CP) и яблочным пектином (AP). * – p 0.05, n – 8.

Увеличение проницаемости кишечного барьера, по крайней мере, частично обусловлено свободно-радикальным повреждением кишечной стенки. Обнаружено, что концентрация МДА, отражающего интенсивность процессов ПОЛ, в стенке тонкой кишки выше у мышей, иммунизированных смесью OVA с лемнаном, чем у животных, иммунизированных только белком (Рис. 16а). Лемнан увеличивает в кишечной стенке содержание МПО, что указывает на накопление гранулоцитов, а также вызывает продукцию воспалительных цитокинов (Рис. 16б и в). Действие лемнана на кишечную стенку можно охарактеризовать как раздражающее. Для нейтрализации действия лемнана увеличивается продукция слизи, выстилающей поверхность кишечника (110±28 и 62±11 мкг связанного красителя альцианового синего).

(а) (б) (в) * * * LM 2 К 1 0 2 0 10 20 0 нмоль/л ед/мг пг/мл/мг Рис. 16. Концентрация МДА (а), МПО (б) в стенке и содержание ФНО- (в) в слизистой тонкой кишки у мышей, получивших OVA (К – контроль) или OVA совместно с лемнаном (LM) перорально. * – p 0.05, n – 8.

Таким образом, механизм иммуностимулирующего действия лемнана можно представить следующим образом. Взаимодействуя с лемнаном, энтероциты и гранулоциты стенки тонкой кишки активируются и начинают продуцировать воспалительные цитокины и кислородные радикалы соответственно. Под действием цитокинов увеличиваются межэпителиальные просветы, а кислородные радикалы инициируют перекисное окисление мембран кишечного эпителия, что приводит к существенному снижению барьерной функции кишечной стенки. В результате белковый антиген, введенный совместно с лемнаном, проникает в кровоток в большей степени, что приводит в конечном итоге к усилению иммунного ответа на него. Кроме того, воспалительные цитокины и клеточный дебрис, образовавшийся в результате частичного разрушения эпителия, активируют фагоцитарную систему.

Минимальной областью лемнана, обладающей иммуностимулирующей активностью, является фрагмент LMP, представляющий собой апиогалактуронан, устойчивый к действию 1,4- D-галактопиранозилуроназы. Установлено, что апиогалактуронан LMP составляет 45 % от молекулы лемнана, содержание галактуроновой кислоты в нем составляет 76 %, апиозы – 18 %. Апиогалактуронановый фрагмент LMP при совместном введении с OVA увеличиваeт образование антигенспецифических IgG антител и усиливает реакцию ГЗТ, а также стимулирует продукцию секреторного иммуноглобулина IgA в слизистой кишечника. Усиление иммунного ответа фрагментом LMP сравнимо с влиянием исходного лемнана LM, а также с действием холерного энтеротоксина. Частичное удаление боковых углеводных цепей фрагмента LMP с помощью кислотного гидролиза приводит к образованию фрагмента, который не обладает иммуностимулирующим действием. Следовательно, иммуностимулирующее действие лемнана обусловлено разветвленной областью пектиновой макромолекулы.

Остатки апиозы в составе лемнана способствуют образованию внутри- и межмолекулярной сети (в последнем случае в присутствии иона металла).

В результате увеличивается площадь поверхности молекулы, и создаются условия для неспецифического связывания полисахарида с другими биополимерами (антигеном) и плазматической мембраной клеток мишеней. Кроме того, благодаря наличию апиогалактуронановой области лемнан менее подвергается пектинолизу, что вероятно, обеспечивает более высокую устойчивость лемнана в условиях желудочно-кишечного тракта в сравнении с другими исследованными пектинами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные исследования выявили вклад структурных элементов макромолекулы в действие пектинов на иммунную реактивность.

Установлено, что макромолекула пектинов содержит фрагменты, способные снижать или увеличивать активность лейкоцитов. Поэтому пектины, находящиеся в клеточной стенке растений, имеют потенциальную возможность как к иммуностимулирующему, так и к иммуносупрессорному действию. Таким образом, пектины обладают уникальным свойством – полипотентностью структуры в отношении действия на иммунную систему.

Изолированный пектин проявляет иммуносупрессорную активность, если при выделении пектина образуются преимущественно высокомолекулярные фрагменты галактуронана со свободными карбоксильными группами. Фрагменты разветвленной галактуронановой цепи частично препятствуют линейному галактуронану стимулировать продукцию противовоспалительных цитокинов, в результате чего эффект пектинов, содержащих такие фрагменты, изменяется со временем. Для проявления иммуностимулирующего действия необходимо наличие в изолированном пектине фрагментов разветвленной области. Однако стимулирующий эффект разветвленной области проявится только в том случае, если ему не препятствует ингибирующий эффект области галактуронана. Значительное присутствие в пектине устойчивых к пектинолизу фрагментов, таких как апиогалактуронан, обуславливает способность пектинов взаимодействовать с белковыми антигенами и стимулировать на них гуморальный иммунный ответ.

Пектиновые фрагменты экстрагируются из растительной пищи при ее переваривании. Соотношение образующихся углеводных цепей галактуронана, рамногалактуронана, апиогалактуронана и других фрагментов определяет функциональную активность лейкоцитов, модулируя тем самым иммунную устойчивость организма. Полученные данные, таким образом, позволяют предложить концепцию регуляции иммунитета млекопитающих пектиновыми полисахаридами. В основе данного представления лежит обусловленная полипотентностью структуры пектиновой макромолекулы возможность реализации различных сценариев влияния растительной пищи на иммунную систему.

Манипулирование составом пектиновых фрагментов в желудочно кишечном тракте открывает новое направление в иммуномодулирующей терапии. Можно выделить три основных преимущества применения пектиновых полисахаридов в иммунотерапии. Во-первых, возможность сочетанного влияния на различные иммунные реакции, что позволяет учесть сложность организации и регуляции иммунной системы. Во вторых, пектиновые полисахариды модулируют иммунную реактивность, воздействуя на стенку кишечника, то есть не нарушая внутренней среды организма. И, в-третьих, использование пектинов безопасно, так как в основе их иммуномодулирующего действия лежат молекулярные механизмы, сложившиеся в ходе эволюции млекопитающих. Выяснение этих механизмов представляется перспективной задачей будущих исследований.

ВЫВОДЫ Пектиновые полисахариды обладают широким спектром 1.

иммуномодулирующей активности, обусловленной строением главной углеводной цепи и разветвленных областей макромолекулы.

Выявлено уникальное свойство пектинов – полипотентность структуры в отношении действия на иммунную систему, которое основано на наличии в пектиновой макромолекуле фрагментов, способных снижать или увеличивать иммунную реактивность.

Обнаружена высокая противовоспалительная активность 2.

галактуронана, представляющего собой фрагмент главной углеводной цепи всех пектинов.

Высокая степень метилэтерифицирования остатков галактуроновой 3.

кислоты (более 50 %) препятствует ингибирующему действию пектинов на активность лейкоцитов.

Наличие блоков разветвленного галактуронана вызывает двухфазный 4.

характер иммуномодулирующего действия пектина – снижение лейкоцитарной активности сменяется ее увеличением.

Пектины, имеющие развитую разветвленную область, стимулируют 5.

неспецифические (фагоцитоз) и антиген-специфические клеточные иммунные реакции, в частности реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Тонкое строение боковых углеводных цепей пектинов определяет способность стимулировать активность лейкоцитов.

6. Иммуномодулирующее действие зависит от молекулярной массы пектинов. Способностью снижать иммунную реактивность обладают пектины и галактуронаны с молекулярной массой свыше 300 кДа.

Иммуностимулирующее действие исследованных пектинов вызывается макромолекулами с молекулярной массой 20-100 кДа.

7. Установлено, что примесь глюкозы в коммерческих пектинах нарушает нормальную толерантность организма к пищевым антигенам.

8. Показано, что пектины и галактуронаны, снижающие активность нейтрофилов, повышают резистентность лабораторных мышей при ЛПС-индуцированной эндотоксинемии, а также защищают стенку толстой кишки от химически индуцированного воспаления.

9. Фрагмент апиогалактуронана обуславливает иммуноадъювантное действие лемнана. Стимуляция гуморального иммунного ответа лемнаном происходит в результате увеличения проницаемости кишечной стенки для антигена.

10. Предложена концепция регуляции иммунитета млекопитающих пектиновыми полисахаридами: усиление или ослабление иммунного ответа происходит при образовании различных фрагментов пектиновой макромолекулы в ходе биотрансформации растительной пищи в желудочно-кишечном тракте.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Монографии Попов С.В. Взаимодействие фагоцитов млекопитающих с 1.

полисахаридами растений // Сыктывкар, 2002. – 100 с. (Коми научный центр УрО Российской АН).

Оводов Ю.С., Головченко В.В., Гюнтер Е.А., Попов С.В. Пектиновые 2.

вещества растений европейского Севера России. – Екатеринбург: УрО РАН, 2009 – 105 с.

Статьи в рецензируемых журналах Оводова Р.Г., Головченко В.В., Попов С.В. Выделение и химическая 1.

характеристика полисахаридов (вибурнанов) из шрота ягод калины обыкновенной Viburnum opulus // Химия раст. сырья. 1999. №1. С.53– 57.

Полле А.Я., Оводова Р.Г., Попов С.В. Выделение и общая 2.

характеристика полисахаридов из пижмы обыкновенной, мать-и мачехи и лопуха войлочного // Химия раст. сырья. 1999. №1. С.33–38.

3. Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G., Bushneva O.A., Ovodov Yu. S.

Effects of polysaccharides from Silene vulgaris on phagocytes // International J. Immunopharmacol. 1999. Vol.21б, №3. Р.617–624.

Оводова Р.Г, Головченко В.В., Попов С.В., Шашков А.С., Оводов 4.

Ю.С. Выделение и предварительное исследование строения и физиологической активности водорастворимых полисахаридов из шрота ягод калины обыкновенной Viburnum opulus // Биоорган.

химия. 2000. Т.26, №1.С.61–67.

Оводова Р.Г, Головченко В.В., Шашков А.С., Попов С.В., Оводов 5.

Ю.С. Структурное исследование и физиологическая активность лемнана, пектина из Lemna minor // Биоорган. химия. 2000. Т.26, №10.

С.743–751.

Злобин А.А., Оводова Р.Г., Попов С.В. Общая химическая 6.

характеристика водорастворимых полисахаридов плодов шиповника морщинистого Rosa rugosa // Химия раст. сырья. 2003. №2. С.39–44.

Попов С.В., Оводова Р.Г., Попова Г.Ю., Никитина И.Р., Оводов Ю.С.

7.

Ингибирующее действие комарумана – пектина сабельника болотного Comarum palustre L. и его фрагментов на адгезию нейтрофилов человека к фибронектину // Биохимия. 2005. Т.70, №1. С.133–138.

8. Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Anti inflammatory activity of the pectic polysaccharide from Comarum palustre L. // Fitoterapia. 2005. Vol.76, №3–4. Р. 281–287.

9. Popov S.V., Popova G.Yu., Nikolaeva S.Yu., Golovchenko V.V., Ovodova R.G. Immunostimulating activity of pectic polysaccharide from Bergenia crassifolia (L.) Fritsch. // Phytotherapy Res. 2005. Vol.19, №12. P.1052– 1056.

Оводова Р.Г., Попов С.В., Бушнева О.А., Головченко В.В., Чижов 10.

А.О., Клинов Д.В., Оводов Ю.С. Разветвление галактуронанового кора макромолекулы комарумана, пектина сабельника болотного Comarum palustre L. // Биохимия. 2006. Т.71, №5. С.666–671.

11. Popov S.V., Golovchenko V.V., Ovodova R.G., Smirnov V.V., Popova G.Yu., Ovodov Yu.S. Characterisation of the oral adjuvant effect of lemnan, a pectic polysaccharide of Lemna minor L. // Vaccine. 2006.

Vol.24, №26. P.5413–5419.

12. Popov S.V., Markov P.A, Nikitina I.R., Petrishev S., Smirnov V., Ovodov Yu.S. Preventive effect of a pectic polysaccharide of the common cranberry Vaccinium oxycoccos L. on acetic acid-induced colitis in mice // World J. Gastroenterol. 2006. Vol.12, №41. P.6646–6651.

13. Popov S.V., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Effect of lemnan, pectin from Lemna minor L., and its fragments on inflammatory reaction // Phytotherapy Res. 2006. Vol.20, №5. P.403–407.

14. Popov S.V., Gunter E.A., Markov P.A., Smirnov V.V., Khramova D.S., Ovodov Yu.S. Adjuvant effect of lemnan, pectic polysaccharide of callus culture of Lemna minor L. at oral administration // Immunopharmacol.

Immunotoxicol. 2006. Vol.28. P.141–152.

15. Popov S.V., Ovodova R.G., Markov P.A, Nikitina I.R., Ovodov Yu.S.

Protective effect of comaruman, pectin of cinquefoil Comarum palustre L.

on acetic acid-induced colitis in mice // Digest. Dis. Sci. 2006. Vol.51, №9.

P.1532–1537.

16. Попов С.В., Оводова Р.Г., Попова Г.Ю., Никитина И.Р., Оводов Ю.С.

Ингибирующее действие пектиновых галактуронанов на адгезию нейтрофилов // Биоорган. химия. 2007. Т.33, №1. С.187–192.

17. Злобин А.А., Жуков Н.А., Оводова Р.Г., Попов С.В. Состав и свойства пектиновых полисахаридов шрота шиповника // Химия раст. сырья.

2007. №4. С.91–94.

18. Попов С.В., Винтер В.Г., Патова О.А., Марков П.А., Никитина И.Р., Оводова Р.Г., Попова Г.Ю., Шашков А.С., Оводов Ю.С. Химическая характеристика и противовоспалительное действие раувольфиана, пектинового полисахарида каллуса раувольфии змеиной // Биохимия.

2007. Т.72, №7. С.955–962.

19. Popov S.V., Popova G.Yu., Koval O.A., Paderin N.M., Ovodova R.G, Ovodov Yu.S. Preventive anti-inflammatory effect of potamogetonan, pectin of common pondweed Potamogeton natans L. // Phytotherapy Res.

2007. Vol.21. P.609–614.

20. Khramova D.S., Popov S.V., Golovchenko V.V., Vityazev F.V., Paderin N.M., Ovodov Yu.S. Abrogation of the oral tolerance to ovalbumin in mice by citrus pectin // Nutrition. 2009. Vol.25. P.226–232.

21. Ovodova, R.G., Golovchenko V.V., Popov S.V., Popova G.Yu., Paderin N.M., Shashkov A.S., Ovodov Yu.S. Chemical composition and anti inflammatory activity of pectic polysaccharide isolated from celery stalks // Food Chem. 2009. Vol.114. P.610–615.

22. Марков П.А., Попов С.В., Никитина И.Р., Оводова Р.Г., Оводов Ю.С.

Противовоспалительная активность пектинов и их галактуронанового кора // Химия раст. сырья. 2010 – №1. С.21–26.

Патенты 1. Пат.2149642 Российская Федерация. Способ получения из растительного сырья полисахаридов, обладающих иммуностимулирующим действием /Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Головченко В.В., Попов С.В., Оводов Ю.С., заявитель и патентообладатель Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН. -№ 99117565;

заявл. 09.08.1999;

опубл. 27.05.2000;

Бюл. №15.

Пат.2344829 Российская Федерация. Способ получения из 2.

растительного сырья галактуронанов, обладающих противовоспалительным действием /Головченко В.В., Витязев Ф.В., Оводов Ю.С., Оводова Р.Г., Попов С.В., Попова Г.Ю., заявитель и патентообладатель Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН. -№ 2007147162/15;

заявл. 18.12.2007;

опубл 27.01.2009;

Бюл. № 3.

Автор выражает свою искреннюю благодарность научному консультанту академику Юрию Семеновичу Оводову за предложенную идею, мудрое руководство и отеческую поддержку инициатив, к.х.н., ст.н.с. Оводовой Р.Г., к.х.н. Головченко В.В. и к.б.н. Гюнтер Е.А. за любезно предоставленные охарактеризованные образцы пектинов и за ценные советы и консультации. Автор благодарит за помощь в выполнении работы сотрудников лаборатории молекулярной физиологии и иммунологии Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН Маркова П.А., Храмову Д.С., Никитину И.Р., Попову Г.Ю., Смирнова В.В., Падерина Н.М.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.