авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Фенотипический и молекулярно-генетический анализ измененных вариантов vibrio cholerae биовара эльтор

На правах рукописи

Шашкова Алена Владимировна ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗМЕНЕННЫХ ВАРИАНТОВ VIBRIO CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬТОР 03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов – 2012

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

доктор биологических наук Заднова Светлана Петровна

Официальные оппоненты:

Тараненко Татьяна Михайловна, доктор биологических наук, профессор ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"» Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и протеомики Швиденко Инна Григорьевна, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития Российской Федерации, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии

Ведущая организация:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится _ 2012 г. в _на заседании совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул.

Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"».

Автореферат разослан _ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Холера – особо опасная инфекционная болезнь с диарейным синдромом, вызываемая токсигенными штаммами Vibrio cholerae. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в последние годы в мире ежегодно регистрируется 3,0-5,0 млн. случаев холеры и более 100-120 тыс. человек умирает (Информационный бюллетень ВОЗ, N107, 2011). Современный период характеризуется наличием стойких очагов холеры в Юго-Восточной Азии и Африке.

Крупные эпидемии и вспышки холеры на эндемичной территории, занос инфекции из эндемичных очагов практически на все континенты и тенденция к росту мировой заболеваемости определяют неблагоприятный прогноз по холере (Онищенко Г.Г. с соавт., 2005;

Москвитина Э.А. с соавт, 2011, 2012). Возникновение эпидемических осложнений по холере в России связано с реальной возможностью ее завоза из зарубежных стран, неблагополучных по этой инфекции. Так, с 2005 г. по 2010 г. в России было зарегистрировано 8 случаев завоза холеры из Индии и Таджикистана (Москвитина Э.А. с соавт, 2011).

К настоящему времени известно о семи пандемиях холеры, среди которых первые шесть (1817-1923 гг.) предположительно были вызваны V. cholerae О классического биовара (Бароян О.В., 1971). Одной из характерных особенностей этого возбудителя является его высокая патогенность, обусловленная эффективной продукцией основных факторов вирулентности – токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА) и холерного токсина (ХТ), которые соответственно определяют развитие двух ключевых этапов инфекционного процесса – колонизацию холерными вибрионами тонкого кишечника и развитие профузной диареи (Kaper J.B. et al., 1995;

De Haan L.et al., 2004). Однако к началу прошлого столетия на эндемичных по холере территориях эти вибрионы были постепенно вытеснены V. cholerae О1 серогруппы, но другого биовара – эльтор. Вследствие этого события возбудителем текущей, 7-ой, пандемии холеры (с 1961 г. по настоящее время) стали токсигенные штаммы V. cholerae О1 биовара эльтор, отличающиеся от классических вибрионов по ряду фенотипических и генетических свойств (Бароян О.В., 1971;

Waldor M.K. et al., 1996;

Dziejman M. et al., 2002). К одним из основных генетических различий классического и эльтор биоваров относят отличия в нуклеотидных последовательностях двух генов, входящих в состав профага CTX – гена ctxB из оперона ctxAB, кодирующего биосинтез ХТ, и гена-репрессора rstR. Вследствие этого аллели указанных генов у классических вибрионов обозначены как ctxВСlass (или ctxB1) и rstRСlass, у вибрионов эльтор – ctxBEltor (или ctxB3) и rstREltor. Разная нуклеотидная последовательность генов ctxB1 и ctxB3 обуславливает различия в аминокислотной последовательности В субъединицы их токсинов, поэтому различают ХТ 1-го типа, продуцируемый классическими вибрионами, и ХТ 2-го типа, характерный для вибрионов эльтор (Olsvik O. et al., 1993;

Waldor M.K. et al., 1996, 1997).

В течение 7-ой пандемии холеры геном ее возбудителя претерпел различные изменения. Одно из важнейших событий в эволюции этого возбудителя в современный период – возникновение новых генетически измененных вариантов (геновариантов) с повышенной вирулентностью, в геноме профага CTX которых содержится аллель ctxB1 (Nair G.B. et al., 2002;

Morita M. et al., 2008;

Safa A. et al., 2010;

Borkakoty B. et al., 2012). К настоящему времени эти геноварианты стали не только доминировать во многих странах Азии и Африки, но и проникать на новые территории (Гаити, Доминиканская Республика, Венесуэла) (Москвитина Э.А. с соавт., 2012;

Nair G.B. et al., 2006;

Grim C.J. et al., 2010;

Safa A. et al., 2010;

Tappero J.W. et al. 2011). В Российской Федерации, согласно последним данным, эпидемические вспышки и единичные случаи холеры во время седьмой пандемии были вызваны как типичными штаммами, так и измененными вариантами V. cholerae биовара эльтор, завезенными из различных стран Азии (Миронова Л.В. с соавт., 2010;

Савельев В.Н. с соавт., 2010;

Смирнова Н.И. с соавт., 2010). Однако в нашей стране отсутствуют комплексные диагностические тест-системы, позволяющие одновременно проводить идентификацию штаммов холерного вибриона О серогруппы, определять их биовар и дифференцировать типичные и генетически измененные варианты V. cholerae биовара эльтор. Несмотря на то, что геноварианты биовара эльтор уже обнаружены на территории России и стран ближнего зарубежья, все еще остаются неизученными их фенотипические свойства, не исследована вирулентность и устойчивость к антибиотикам. Недостаточно сведений о структуре профага СТХ и острова патогенности VPI-1, несущих основные гены вирулентности ctxAB и tcpA-F, кодирующие продукцию ХТ и ТКПА. Вместе с тем, изучение структуры генома и экспрессии генов вирулентности и жизнеобеспечения измененных вариантов эльтор необходимо для оценки их генетического разнообразия и выяснения механизма образования.

Все вышеперечисленное определяет актуальность диссертационной работы, целью которой является проведение сравнительного анализа фенотипических и молекулярно-генетических свойств типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae О1 серогруппы биовара эльтор, выделенных на территории Российской Федерации и сопредельных государств.

Задачи исследования:

1. Разработать мультиплексную ПЦР тест-систему для идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1 классического и эльтор биоваров с одновременной дифференциацией типичных штаммов и измененных вариантов эльтор вибрионов. С помощью разработанной тест-системы провести анализ клинических штаммов, завезенных на территорию Российской Федерации и стран ближнего зарубежья, и выявить измененные варианты возбудителя холеры эльтор.

2. Провести сравнительный анализ фенотипических свойств типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae О1 биовара эльтор. Определить уровень продукции холерного токсина и оценить вирулентные свойства геновариантов.

3. Изучить структуру профага СТХ, кодирующего биосинтез холерного токсина, у измененных эльтор вариантов, завезенных в Российскую Федерацию в современный период. Определить генотипы исследованных штаммов.

4. Определить количество копий профага СТХ в геноме измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор.

5. Выявить наличие островов патогенности VPI-1 и VPI-2 у геновариантов V. cholerae биовара эльтор и провести сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена tcpA.

Научная новизна работы Впервые проведен комплексный фенотипический и молекулярно-генетический анализ 60 штаммов V. cholerae О1 серогруппы биовара эльтор, выделенных в Российской Федерации и странах ближнего зарубежья с 1970 по 2010 гг.

Установлено, что, начиная с 1993 г., причиной эпидемических осложнений на территории Российской Федерации были измененные варианты, содержащие в геноме профага CTX ген ctxB классического типа.

Впервые проведен сравнительный анализ продукции основных и дополнительных факторов патогенности у типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, выделенных на территории России и сопредельных государств. При определении экспрессии холерного токсина выявлено, что генетически измененные варианты в условиях in vitro синтезируют в 2-10 раз больше холерного токсина по сравнению с типичными клиническими штаммами V. cholerae биовара эльтор. Установлено, что геноварианты не отличаются от типичных штаммов по продукции гемолизина, но обладают повышенной подвижностью. На модели лабораторных животных подтверждена высокая токсигенность и вирулентность геновариантов по сравнению с типичными эльтор вибрионами.

Получены новые сведения о вариабельности профага СТХ измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, выделенных на территории Российской Федерации и стран ближнего зарубежья, выражающейся в присутствии в его геноме разных аллелей гена ctxB (ctxB1 или ctxB7), rstR (rstRClass и/или rstREltor), а также разного числа тандемных гептаповторов в промоторной области оперона ctxAB (trp3, trp4, trp5). Полученные данные позволили отнести все изученные штаммы к 4-м генотипам: ctxB1, rstREltor, trp3;

ctxB1, rstREltor, trp4;

ctxB1, rstREltor/rstRClass, trp4;

ctxB7, rstREltor/rstRClass, trp5.

Впервые определено количество копий оперона ctxAB у геновариантов, выделенных на территории России и сопредельных государств. Установлено, что в хромосоме большинства изученных штаммов (90 %) присутствует две копии оперона ctxAB, что свидетельствует о наличии в геноме двух копий профага СТХ.

При определении нуклеотидной последовательности гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии и входящего в состав острова патогенности VPI-1, впервые установлено, что штаммы геновариантов, завезенные в Россию после 2006 г., имеют отличную как от классических, так и от типичных эльтор вибрионов нуклеотидную последовательность гена tcpA.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена получением патента РФ на изобретение (патент № 2458141 от 05.03.2012г.).

Практическая значимость работы Предложен способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae О серогруппы, определения их биовара (классический или эльтор) и дифференциации типичных и генетически измененных холерных вибрионов биовара эльтор. На основе разработанного способа сконструирован «Набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1 классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ)», зарегистрированный в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (РУ № ФСР 2012/ 13427 от 21.05.2012 г.) и рекомендованный для применения в Российской Федерации.

По результатам работы составлены методические рекомендации «Мультиплексный ПЦР-анализ для выявления измененных штаммов Vibrio cholerae О1 биовара эльтор, несущих профаг вирулентности CTX с генами классических вибрионов», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №6 от 13.10.2010 г.) и утвержденные директором.

В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы:

– три штамма (V. cholerae О1 серогруппы классического биовара, V. cholerae О серогруппы эльтор биовара и V. cholerae О139 серогруппы) с изученными молекулярно-генетическими характеристиками, используемых в качестве референс штаммов при проведении геномной паспортизации штаммов возбудителя холеры (КМ259, КМ260, КМ261);

– коллекция из 6 штаммов в качестве генетически измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор с известным генотипом для внутривидовой дифференциации холерных вибрионов (КМ265, КМ266, КМ267, КМ268, КМ269, КМ270).

Полученные в ходе выполнения данные по изучению генетической организации измененных вариантов V. cholerae О1 биовара эльтор используются при чтении лекций «Микробиология и генетика возбудителя холеры» на курсах первичной специализации по особо опасным инфекциям при и курсах повышения квалификации по программе усовершенствования врачей по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Сконструированная мультиплексная ПЦР тест-система позволяет идентифицировать токсигенные штаммы холерного вибриона О1 серогруппы, определять принадлежность к классическому или эльтор биовару и проводить дифференциацию штаммов V. cholerae биовара эльтор на типичные изоляты и генетически измененные варианты.

2. На территории России вспышки и спорадические случаи заболевания холерой, начиная с 1993 года, были вызваны измененными вариантами холерных вибрионов биовара эльтор. Геноварианты V. cholerae биовара эльтор в отличие от типичных эльтор вибрионов в условиях in vitro синтезируют больше холерного токсина и являются более вирулентными для лабораторных животных – крольчат-сосунков.

3. Измененные варианты V. cholerae биовара эльтор, выделенные с 1993 по гг. на территории Российской Федерации при эпидемических вспышках и единичных случаях холеры, отличаются между собой по структуре профага CTX, содержащего разные аллеи генов ctxB, rstR и разное количество тандемных повторов TTTTGAT в промоторной области оперона ctxAB. В геноме большинства изученных штаммов геновариантов профаг CTX присутствует в количестве 2 копий. Штаммы измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор несут полный набор генов островов патогенности VPI-1 и VPI-2. В составе VPI-1 геновариантов, выделенных после 2006 г., содержится аллель tcpETCIRS.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на VII Всероссийской научно практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика – 2010» (Москва, 2010), на III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Протвино, 2011), на совещании специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой (Ростов-на-Дону, 2011), проблемной комиссии (48.04) «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2012), на Х съезде Всероссийского научно практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), на IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012), ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2010-2012).

Работа выполнена в рамках плановой НИР 37-4-09 «Изучение природных и генетически измененных штаммов холерного вибриона и установление связи между вариабельностью генома и патогенными свойствами V. cholerae»;

Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2013 годы) в рамках государственных контрактов № 70-Д от 25.07.2011 г., лот 12, тема «Оценка изменчивости фенотипических и генетических свойств вирулентных штаммов возбудителей инфекционных болезней при смене ими экологических ниш обитания» и № 53-Д от 04.06.2012 г., лот 12, тема «Молекулярно-генетические особенности генетически измененных штаммов возбудителей опасных инфекционных болезней и их значимость в изменении вирулентных свойств и адаптации патогенов к меняющимся условиям окружающей среды».

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из которых 5 статей в рекомендованных ВАК изданиях и один патент.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 197 цитируемых работ, из них 35 отечественных и зарубежных. Общий объем диссертации составляет 131 страницу. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 12 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе были использованы штаммы, выделенные от больных и из окружающей среды: 60 штаммов V. cholerae O1 серогруппы эльтор биовара, 14 штаммов V. cholerae О1 серогруппы классического биовара, 3 штамма V. cholerae О139 серогруппы, а также 15 штаммов V. cholerae других серогрупп и штаммов гетерологичных бактерий. Культивирование штаммов осуществляли на агаре LB, бульоне AKI или LB при температуре 30 и 37 °С с аэрацией и без аэрации.

Питательные потребности определяли в соответствии с методикой, описанной в «Справочнике по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» (1982 г). Гемолитическую активность изучали на плотной среде по методу D.V. Sigh с соавт. (2001). Способность к продукции растворимой гемагглютинин/протеазы (РГА/П) изучали по методу R.A. Finkelstein с соавт. (1992), фосфолипазы – по N.H.

Tan, C.S. Tan (1988). Подвижность холерных вибрионов определяли на 0,3-0,4 % LB агаре. Биосинтез холерного токсина оценивали с помощью иммуноферментного метода GM1ELISA по A.M. Svennerholm с соавт. (1983). Продукцию ТКПА определяли визуально методом самоагглютинации при выращивании бактерий на круговой качалке в LB бульоне (Chiang S.L. et al., 1995). Определение устойчивости к антибактериальным препаратам проводили при выращивании штаммов на плотных средах, содержащих различные антибиотики (Нефедов К.С., 2008). Токсигенность и вирулентность штаммов оценивали соответственно по S.N. De с соавт. (1953) и N.K.

Dutta, M.K. Habbu (1955). Подготовку образцов для ПЦР проводили в соответствии с МУК 4.22218-07 «Лабораторная диагностика холеры» и МУ 1.3.2569- «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение ДНК осуществляли фенол-хлороформным методом (Маниатис Т. с соавт., 1984) и с использованием коммерческих наборов для выделения ДНК в присутствии гуанидинтиоцианата. ПЦР с использованием специфических праймеров проводили на термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия). ДНК-ДНК гибридизацию по Саузерну осуществляли согласно методике, описанной в руководстве (Маниатис Т. с соавт., 1984). Секвенирование генов проводили на приборе «CEQ8000» (Beckman Coulter, США). Анализ последовательностей ДНК осуществляли с использованием программ «Genetic Analysis System Software Version 9.0» «Mega4» и «BioEdit 7.1.3 ». Для сравнения использовали нуклеотидные последовательности изучаемых генов штаммов V. cholerae N16961 биовара эльтор и V. cholerae О395 классического биовара, представленные в GenBank. Для расчета праймеров использовали программу «Oligo 6.0».

1. Конструирование и апробация тест-системы для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1 классического и эльтор биоваров, дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов В настоящее время разработано значительное количество экспресс-методов и тест-систем для индикации и идентификации возбудителя холеры, определения серогруппы, биовара, токсигенности (вирулентности) и эпидемической значимости выделенных штаммов. Однако все они предназначены исключительно для детекции типичных штаммов холерного вибриона биовара эльтор и не способны выявлять токсигенные измененные варианты с повышенной вирулентностью. С целью определения таких штаммов необходимо создание комплексных ПЦР тест-систем, позволяющих быстро и достоверно проводить идентификацию токсигенных штаммов V. cholerae O1 серогруппы, определять биовар и дифференцировать типичные штаммы и генетически измененные варианты эльтор вибрионов. В качестве генетических маркеров для выявления серогруппы исследуемого штамма V. cholerae были использованы фрагменты генов перозаминсинтазы (VC0244) и rfbG (VC0245), входящие в состав локуса rfbO и кодирующего биосинтез О1 антигена (Kumar P. et al., 2009). Определение биовара основывалось на использование праймеров на ген rtxC, который присутствует только в штаммах V. cholerae эльтор биовара (Goel A.K. et al., 2007), и ген cas3, характерный для холерных вибрионов классического биовара.

Олигонуклеотидные праймеры на ген cas3 рассчитывали с помощью программы «Oligo 6.0». Специфичность сконструированных праймеров была подтверждена с использованием 64 штаммов V. cholerae. При этом фрагмент, соответствующий гену cas3, был выявлен только у штаммов V. cholerae классического биовара. Для определения аллеля гена ctxB нами была использована методика МАМА ПЦР (Mismatch Amplification Mutation Assay PCR), разработанная M. Morita с соавт. в 2008 г. и основанная на использовании праймеров, несущих на одном конце специфический для каждого аллеля нуклеотид. Это обстоятельство обусловило необходимость в постановке двух отдельных реакций. В связи с этим мультиплексную ПЦР проводили в один прием, но в двух реакционных смесях.

Измененные варианты V. cholerae О1 серогруппы эльтор биовара определяли по наличию специфических ампликонов с праймерами к rfbO, rtxC и ctxBClass. В качестве положительных контрольных образцов (ПКО) использовали ДНК штаммов холерного вибриона О1 серогруппы – V. cholerae 569В классического биовара (ПКО–Class) и V. cholerae М818 эльтор биовара (ПКО–Eltor), фенотип и генотип которых хорошо изучен.

Для проведения мультиплексной ПЦР ДНК штаммов выделяли из микробной взвеси концентрацией 1х109, на конечном этапе полученную ДНК разводили в 50 раз.

Дополнительно к исследуемым образцам готовили отрицательный контроль выделения (ОКВ). С целью оптимизации условий, при которых обе реакции имели бы высокую эффективность и специфичность, были подобраны температура отжига праймеров и концентрация компонентов реакционной смеси. Общая реакционная смесь кроме праймеров включала Taq-полимеразу, 10-кратного буфера для Taq полимеразы смеси дНТФ, хлорид магния и деионизованную воду. В реакционную смесь добавляли 10 мкл раствора ДНК. Для получения специфичных и четких ампликонов на термоциклере «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) был выбран «Быстрый» (Fast) режим амплификации с использованием следующей программы:

предварительная денатурация при температуре 96 С в течение 2 мин, далее циклов, включающих денатурацию при температуре 96 С в течение 10 с, отжиг праймеров при температуре 58 С в течение 10 с, синтез комплементарной цепи при температуре 72 С в течение 30 с. Заключительным этапом амплификации являлась достройка цепи при температуре 72 С в течение 5 мин. Для регистрации результатов ПЦР использовали метод электрофореза в 2 % агарозном геле. Учет результатов проводили по схеме, представленной в таблице 1.

В итоге нами разработан набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1 классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов, обозначенный как «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB–РЭФ».

Специфичность сконструированного набора подтверждена с использованием штаммов близкородственных видов и 4 штаммов энтеробактерий. Результаты ПЦР тестирования указанных штаммов были отрицательными. При анализе 18 штаммов V. cholerae О139 и неО1/неО139 серогрупп было показано отсутствие фрагмента, соответствующего локусу rfbO1 (638 п.н.). При этом было выявлено, что некоторые штаммы рода Vibrio, а также V. cholerae неО1/неО139 серогруппы содержат гены ctxBClass или rtxC, что соответствует данным литературы (Dalsgaard A. et al., 2001).

Анализ трех штаммов V. cholerae О1 серогруппы с известным генотипом (Дакка rfbO+, cas3+, ctxBClass+, rtxC-, ctxBEltor-, М1013 rfbO+, cas3-, ctxBClass-, rtxC+, ctxBEltor+, МАК757 rfbO+, cas3-, ctxBClass+, rtxC+, ctxBEltor-) подтвердил диагностическую ценность набора.

Таблица 1 - Учет результатов ПЦР-анализа, полученных с использованием мультиплексной ПЦР тест-системы Реакционная смесь №1 Реакционная смесь № Class ctxBEltor Пробы Результаты cas3 ctxB rfbO rtxC 415 п.н. 189 п.н. 638 п.н. 265 п.н. 189 п.н.

Результаты анализа подлежат учету.

Контаминация реактивов – – – – – положительно ОКВ, К– реагирующей ДНК или ампликонами отсутствует Результаты анализа наличие хотя бы одного ампликона не подлежат учету.

Результаты анализа ПКО–Class – – + + + подлежат учету.

Результаты анализа ПКО–Eltor – – + + + подлежат учету.

Штамм не относится к V.

+/– +/- - +/- +/ cholerae О серогруппы Токсигенный штамм V. cholerae О – – + + + классического Исследуемые биовара пробы Токсигенный штамм – – V. cholerae О + + + эльтор биовара Токсигенный измененный вариант – – + + + V. cholerae О эльтор биовара Таким образом, сконструированный набор реагентов «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB–РЭФ» позволяет идентифицировать токсигенные штаммы холерного вибриона О1 и не О1 серогрупп в чистой культуре, определять биовар и дифференцировать типичные штаммы и измененные варианты холерных вибрионов биовара эльтор.

2. Выявление генетически измененных вариантов возбудителя холеры среди клинических штаммов, выделенных на территории России и стран ближнего зарубежья, с помощью разработанного набора Далее с помощью разработанного набора «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB– РЭФ» нами были исследованы 59 клинических штаммов холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных с 1970 по 2010 гг. на территории России и стран СНГ.

Все штаммы обладали фенотипическими свойствами, характерными для вибрионов биовара эльтор.

При изучении взятых для анализа штаммов во всех ПЦР-образцах были выявлены ампликоны, указывающие на их принадлежность к холерным вибрионам О1 серогруппы эльтор биовара – фрагмент размером 638 п.н. (rfbO) и фрагмент размером 265 п.н. (ген rtxC) (рисунок 1). При этом штаммы, выделенные в Российской Федерации с 1970 по 1991 гг., содержали в своем геноме ген ctxBEltor, что говорит об их принадлежности к типичным эльтор изолятам. В то же время, у клинических штаммов, изолированных после 1993 г. во время эпидемических вспышек в Краснодаре (1993 г.), Дагестане (1993-1994 гг., 1998 г.), Ачинске (1997 г.), Казани (2001 г.) и при заносных случаях в Башкирии (2004 г.), Твери (2005 г.), Мурманске (2006 г.), Москве (2010 г.) ампликон размером 189 п.н. образовывался в реакционной смеси №1, что указывает на присутствие в профаге CTX гена ctxBClass (или ctxB1).

Что касается штаммов, выделенных на территории стран ближнего зарубежья, то среди исследованных штаммов выявлено 5 изолятов (Узбекистан, 1988 г.;

Украина 1991 г.), которые также относились к измененным вариантам. Особый интерес вызывает обнаружение геновариантов в 1988 г. на территории Узбекистана, что указывает на их возникновение значительно раньше, чем предполагается (1991 г.) (Nair G.B. et al., 2002).

rfbO cas ctxBClass rfbO rtxC ctxBEltor А – Реакционная смесь №1, Б – реакционная смесь №2.

Типичные штаммы V. cholerae биовара эльтор: 1 – М1013, 2 - С-402, 3 – М1259;

Измененные варианты V. cholerae биовара эльтор: 4 – М1293, 5 – М1295, 6 – Р15384, 7 – Р17644, 8 – М1344, 9 – М1429, 10 – М1430, 11 – Р18899, 12 – Л3226;

Контроли: 13 – ПКО-Class, 14 – ПКО-Eltor, 15 – отрицательный контроль.

Рисунок 1 - Электрофореграмма ампликонов, полученных при исследовании штаммов V. cholerae биовара эльтор с помощью набора «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB–РЭФ».

Таким образом, с помощью разработанного набора «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB–РЭФ» было выяснено, что, начиная с 1993 г., все локальные вспышки и спорадические случаи заболевания холерой на территории России были вызваны измененными вариантами холерных вибрионов биовара эльтор.

Сравнительный фенотипический анализ вирулентных штаммов 3.

V. cholerae биовара эльтор На следующем этапе работы был проведен сравнительный анализ продукции основных и дополнительных факторов патогенности у типичных штаммов и измененных вариантов эльтор вибрионов. В первую очередь была изучена способность к продукции холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии. Известно, что оптимальные условия для продукции ХТ штаммами двух биоваров неодинаковы, что определяется различиями в регуляторных системах, контролирующих экспрессию структурных генов ХТ классических и эльтор вибрионов. Разница заключается в том, что хотя холерные вибрионы обоих биоваров при культивировании в LB-бульоне при 30 оС образуют одинаковое количество регуляторного белка ToxR, непосредственно участвующего в активации транскрипции генов ctxAB, но только у классических вибрионов в этих условиях происходит синтез второго регуляторного белка ТохТ, являющегося транскрипционным регулятором многих генов, в том числе и генов холерного токсина (DiRita V.J. et al., 1996). Вследствие этого исследуемые штаммы выращивали в двух разных условиях: а) оптимальных для биосинтеза ХТ у V. cholerae классического биовара (LB-бульон, рН 6,8;

30 оС, 18 ч с аэрацией) и б) оптимальных для продукции этого белка у V. cholerae биовара эльтор (AKI бульон, рН 7,6, 37 оС, 4 ч.

без аэрации, 16 ч. с аэрацией). Оказалось, что 97 % изученных штаммов измененных вариантов, выделенных в разные годы и на разных территориях, продуцировали значительно больше ХТ (0,1-0,9 мкг/мл) по сравнению с типичными штаммами (0,01 0,03 мкг/мл), что подтверждает данные, полученные зарубежными исследователями (Ghosh-Banerjee J. et al., 2010). При этом установлено, что 17 изолятов из 32 изученных (или 53 %) синтезировали больше ХТ в LB бульоне при 30 оС, т.е. в условиях оптимальных для продукции этого белка классическими штаммами (таблица 2). Можно предположить, что у измененных вариантов эльтор вибрионов появилась способность образовывать в стандартных лабораторных условиях белок ТохТ, независимо от экспрессии белка ToxR. Вместе с тем был обнаружен ряд штаммов, продукция ХТ у которых не зависела от среды выращивания или была в 4-10 раз больше при культивировании в среде AKI (таблица 2). Полученные нами экспериментальные данные при изучении измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, изолированных на территории России и сопредельных государств, подтверждают данные литературы о повышенном биосинтезе ХТ геновариантами (Ghosh-Banerjee J. et al., 2010;

Son M.S. et al., 2011).

Поскольку биосинтез ТКПА, также как и ХТ, регулируется вирулентным каскадом, включающим белки-регуляторы ToxR/ToxT, то мы предположили, что повышение продукции ХТ у штаммов измененных вариантов будет сопровождаться и усилением биосинтеза ТКПА. Однако при изучении биосинтеза ТКПА методом самоагглютинации нами не было обнаружено различий между типичными изолятами и генетически измененными вариантами.

Таблица 2 - Продукция холерного токсина изученными типичными штаммами и измененными вариантами холерных вибрионов биовара эльтор.

Количество ХТ*, мкг/мл при выращивании в Штамм Место и год Аллель выделения гена ctxB V. cholerae AKI-бульоне, LB-бульоне, при 37°C при 30°C измененные варианты Р15653 Украина, 1991 ctxB1 0,23 0, М1264 Украина, 1991 ctxB1 0,03 0, М1272 Краснодар, 1993 ctxB1 0,20 0, М1299 Краснодар, 1993 ctxB1 0,10 0, М1270 Татарстан, 1993 ctxB1 0,06 0, М1275 Дагестан, 1993 ctxB1 0,10 0, М1297 Дагестан, 1993 ctxB1 0,01 0, М1295 Дагестан, 1994 ctxB1 0,20 0, М1266 Пермь, 1994 ctxB1 0,03 0, М1268 Магнитогорск, 1994 ctxB1 0,04 0, Р17644 Ачинск, 1997 ctxB1 0,03 0, М1328 Дагестан, 1998 ctxB1 0,30 0, М1326 Дагестан, 1998 ctxB1 0,04 0, М1344 Казань, 2001 ctxB1 0,10 0, М1430 Тверь, 2005 ctxB1 0,09 0, Л3226 Москва, 2010 ctxB7 0,40 0, Л4150 Москва, 2010 ctxB7 0,41 0, типичные штаммы М295 Туркменистан, 1965 ctxB3 0,01 0, М818 Саратов, 1970 ctxB3 0,03 0, М713 Москва, 1970 ctxB3 0,03 0, М738 Пермь, 1970 ctxB3 0,03 0, М888 Астрахань, 1970 ctxB3 0,01 0, М1013 Башкирия, 1972 ctxB3 0,02 0, С402 Ставрополь, 1990 ctxB3 0,03 0, Примечания: * - приведены средние значения трех опытов.

Далее были проведены исследования по сравнительному изучению токсигенности и вирулентности типичных штаммов и измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор на модели лабораторных животных. Исследования были проведены на 2-х типичных штаммах и 3-х штаммах измененных вариантов.

Токсигенность штаммов оценивали в изолированной петле взрослого кролика (De S.N.

et al., 1953). В концентрации 1,0х107 КОЕ индекс наполнения у всех штаммов был высокий и составлял от 0,7 до 1,4 мл на сантиметр кишечника. При снижении концентрации холерных вибрионов у типичных штаммов наблюдалось и заметное снижение индекса наполнения. Для измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор было характерно сохранение данного показателя на высоком уровне.

Вирулентность штаммов определяли на модели кроликов-сосунков по методу N.K. Dutta и M.K. Habbu (1955). Было установлено, что при заражении в дозе 105 и КОЕ все животные погибали в течение суток. При вскрытии наблюдалась выраженная холерогенная реакция. Заражение животных типичными штаммами V. cholerae биовара эльтор в дозе 102 КОЕ не вызывало гибели животных и изменения внутренних органов.

В то же время при заражении такой же дозой измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор холерогенный синдром у крольчат-сосунков развивался в полной мере, что может указывать на повышенную вирулентность геновариантов.

Далее был проведен сравнительный анализ продукции дополнительных факторов, связанных с вирулентностью. При изучении питательных потребностей, гемолитической активности, способности к продукции растворимой гемагглютинин/протеазы и фосфолипазы, а также подвижности у типичных штаммов и измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор было показано, что исследованные штаммы геновариантов были прототрофами и не отличались от типичных изолятов по продукции термолабильного гемолизина. Однако были обнаружены незначительные отличия по экспрессии ферментов патогенности. В тоже время нами установлено, что измененные варианты V.cholerae эльтор биовара в отличие от типичных штаммов являются более подвижными. Так средний радиус зоны распространения колонии на полужидком агаре у измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор был в среднем в 1,5-2 раза больше, чем у типичных штаммов.

Учитывая, что лекарственная устойчивость штаммов V. cholerae эльтор биовара представляет большую проблему для здравоохранения нами был проведен сравнительный анализ антибиотикоустойчивости штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории России и сопредельных государств с 1970 по 2010 гг. Для исследования были использованы следующие антибиотики - ампициллин, спектиномицин, стрептомицин, рифампицин, канамицин, тетрациклин, хлорамфеникол и триметоприм. В результате было показано, что типичные штаммы, выделенные в начале седьмой пандемии, были устойчивы лишь к 1-2 антибактериальным препаратам, в то время как исследованные штаммы измененных вариантов обладали устойчивостью к 3-5 антибиотикам. Полученные нами результаты согласуются с данными зарубежных исследователей о том, что характерной особенностью штаммов эльтор вибрионов, выделяемых в последние годы, является множественная лекарственная устойчивость, выражающаяся в резистентности к противомикробным препаратам разных групп (Tran H.D. et al., 2012).

Таким образом, проведенный сравнительный анализ фенотипических свойств типичных изолятов и измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных на территории России и сопредельных государств, показал, что геноварианты экспрессируют в 2-10 раз больше ХТ, чем типичные эльтор вибрионы, и являются более вирулентными. Все исследованные штаммы геновариантов не отличались от типичных изолятов по продукции термолабильного гемолизина, но были более подвижными.

4. Молекулярно-генетические особенности измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор При фенотипическом анализе измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор было установлено, что геноварианты в отличие от типичных эльтор вибрионов продуцируют больше ХТ. Учитывая, что гены ctxAB, кодирующие продукцию ХТ входят в состав профага CTX, нами была исследована структура данного мобильного генетического элемента. В результате ПЦР-тестирования 6 генов коровой части и генов RS2-области установлено, что все геноварианты содержат полноценный профаг СТХ.

Для определения нуклеотидной последовательности гена ctxB у измененных вариантов, изолированных в разные годы на территории России, было проведено секвенирование этого гена у 12 типичных штаммов и 27 измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор. Полученные последовательности сравнивали с последовательностями гена ctxB штаммов V. cholerae 569B классического биовара и V. cholerae N16961 биовара эльтор, депонированных в GenBank. В результате было показано, что штаммы, выделенные с 1970 по 1990 гг. содержали ген ctxB3, идентичный гену ctxB референс-штамма N16961. В то же время в последовательности гена ctxB 24 штаммов измененных вариантов обнаружены две нуклеотидные замены (тимина на цитозин) в положениях 115 и 203. Нуклеотидная последовательность данных штаммов полностью совпала с последовательностью гена ctxB штамма V. cholerae 569В.

Измененные варианты помимо разной последовательности гена ctxB могут содержать и различные аллели гена rstR. С целью определения аллеля этого гена все штаммы были исследованы с помощью аллель-специфичной ПЦР (Bhattacharya T. et al., 2006). В результате было установлено, что типичные эльтор вибрионы содержали только ген rstREltor, что подтверждает присутствие в их геноме профага CTX эльтор типа. В тоже время измененные варианты содержали разные аллели rstR. Среди изученных нами изолятов только один штамм (V. cholerae Р15384), имел rstRClass, что указывает на присутствие в хромосоме данного штамма профага классического типа (ctxB1, rstRClass). Девять изолятов (28,1 %) несли только ген rstREltor, что свидетельствует о наличии в их хромосоме гибридного профага CTX (ctxB1, rstREltor). Наибольшее количество штаммов (68,9 %) содержали два аллеля гена rstR – классический и эльтор. Полученные данные указывают на присутствие в хромосоме данных штаммов двух профагов CTX – классического и гибридного. Результаты секвенирования генов rstR подтвердили данные, полученные с помощью ПЦР.

Полученные нами результаты при анализе последовательностей генов ctxB и rstR согласуются с данными других исследователей о циркуляции атипичных эльтор вибрионов, содержащих ctxB классического типа и разных аллелей rstR на территории Кавказа, Сибири и Дальнего Востока (Савельев В.Н. с соавт., 2010;

2011;

Миронова Л.В. с соавт., 2010, 2011).

На следующем этапе была определена копийность профага CTX у 10 штаммов измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор. Количество копий оперона ctxAB определяли с помощью ДНК-ДНК-гибридизации по Саузерну с использованием СТ-зонда, созданного на основе амплифицированного фрагмента гена ctxA. Хромосома исследованных штаммов фрагментировалась с помощью эндонуклеазы рестрикции PstI. Результаты гибридизации показали, что 9 штаммов содержали в геноме две копии оперона ctxAB, расположенные в рестрикционных фрагментах разной длины, и лишь один штамм имел одну копию (рисунок 2).

Далее было проведено секвенирование промоторной области оперона ctxAB 7 типичных и 14 измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных на территории России и сопредельных государств. В результате анализа установлено, что типичные штаммы, как и референс-штамм V. cholerae N биовара эльтор, содержали по 4 повтора TTTTGAT (обозначенных как trp). Такое же количество гептаповторов обнаружено у 9 (64,3 %) из 14 исследованных измененных вариантов V. cholerae эльтор. В тоже время 2 штамма, выделенные в Ачинске в 1997 г. (V. cholerae Р17644, Р17647), содержали в промоторной области оперона ctxAB лишь три гептаповтора, а 3 штамма, завезенные в 2010 г. в Москву, напротив, имели копий.

М – HindIII – рестрикты ДНК фага, взятые в качестве маркеров. Контроли: 1 – V. cholerae 569В классического биовара;

8 – V. cholerae М818 эльтор биовара.

Измененные варианты V. cholerae: 2 – М1272;

3 – Л4150;

4 – М1270;

5 – М1429;

6 – М1268;

7 – Л3226;

9 – М1345;

10 – М1430;

11 – М1293;

12 – Р18899.

Рисунок 2 – Блот-гибридизация хромосомной ДНК генетически измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор с СТ-зондом и рестриктазой PstI.

Таким образом, при изучении структуры профага CTX измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор установлена его вариабельность, что отличает их от типичных изолятов, имеющих однородную структуру данного мобильного элемента. При этом вариабельность профага CTX выражалась в наличии разных аллелей ctxB (ctxB1 или ctxB7), гена rstR (rstRClass и/или rstREltor) и разного числа тандемных повторов TTTTGAT в промоторной области оперона ctxAB (trp3, trp4, trp5). При этом на территорию России и сопредельных государств были завезены штаммы измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, относящиеся к четырем генотипам: ctxB1, rstREltor, trp3;

ctxB1, rstREltor, trp4;

ctxB1, rstREltor/rstRClass, trp4;

ctxB7, rstREltor/rstRClass, trp5, среди которых наиболее распространенными были штаммы с генотипом ctxB1, rstREltor/rstRClass, trp4, содержащие две разные копии профага CTX – классическую и гибридную.

Учитывая, что в вирулентности холерных вибрионов важную роль играют также белки, кодируемые генами, расположенными на острове патогенности VPI-1, нами был изучен его генный состав. При ПЦР тестировании было показано, что по составу генов VPI-1 измененные варианты не отличаются от типичных штаммов биовара эльтор. Сходные данные были получены и при изучении второго острова патогенности – VPI-2, что говорит о стабильности генного состава этих мобильных генетических элементов. Поскольку последовательность гена tcpA, входящего в состав VPI-1 и кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии, отличается у классических и эльтор вибрионов, нами было проведено секвенирование данного гена у пяти произвольно взятых штаммов измененных вариантов, выделенных на территории России. В результате было выявлено, что только штамм V. cholerae Р17644 (Ачинск, 1997) имел последовательность гена tcpA идентичную таковой эльтор вибрионам, в тоже время у остальных штаммов – V. cholerae Р18899 (Мурманск, 2006), V. cholerae Л3225, Л3226, Л4150 (Москва, 2010) была выявлена однонуклеотидная замена в положении 266 от начала гена. Данные штаммы несли в геноме острова патогенности VPI-1 специфичную нуклеотидную последовательность гена tcpA, отличную как от классических, так и эльтор вибрионов, и обозначенную как tcpETCIRS. Данный алель характерен для штаммов, выделяемых в настоящее время на эндемичных по холере территориях (Reimer A.R. et al., 2011;

Talkington D. et al., 2011).

Таким образом, сконструированный нами «Набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1 классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae вариант ctxB–РЭФ)» позволяет выявлять измененные варианты холерного вибриона биовара эльтор. Впервые проведенный комплексный фенотипический и молекулярно-генетический анализ измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор показал, что геноварианты синтезируют больше холерного токсина, чем типичные клинические штаммы V. cholerae биовара эльтор, что может быть одной из причин их повышенной вирулентности. При этом повышение вирулентности может быть обусловлено несколькими различными механизмами, так как изученные нами геноварианты отличались по структуре генома. Выявлена вариабельность профага вирулентности СТХ, выражающаяся в наличии разных аллелей гена ctxB, rstR и разном числе тандемных гептаповторов в промоторной области оперона ctxAB. При этом большинство изученных штаммов содержали две копии профага СТХ (классическую и гибридную). Установлено, что штаммы геновариантов, завезенные в Россию после 2006 г., специфичную нуклеотидную последовательность гена tcpA, обозначенную как tcpETCIRS и характерную для штаммов, выделяемых в настоящее время на эндемичных по холере территориях.

Дальнейшее изучение структуры и функции генома измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор будет способствовать выявлению генетического разнообразия штаммов возбудителя холеры с повышенной вирулентностью, а также созданию новых диагностических тест-систем.

ВЫВОДЫ 1. Разработан способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1, определения их биовара и дифференциации холерных вибрионов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции.

2. Установлено, что причиной эпидемических вспышек и спорадических случаев заболевания холерой на территории России, начиная с 1993 г., являются измененные варианты холерных вибрионов биовара эльтор, несущие аллель ctxB1 (классического типа).

3. При фенотипическом анализе показано, что изученные штаммы геновариантов V. cholerae О1 биовара эльтор продуцируют in vitro в 2-10 раз больше холерного токсина, чем типичные эльтор вибрионы, а также отличаются повышенной токсигенностью и вирулентностью для лабораторных животных.

4. Методом ПЦР и секвенирования выявлены значительные различия в структуре профага СТХ геновариантов V. cholerae биовара эльтор. Вариабельность профага выражается в присутствии разных аллелей гена ctxB (ctxB1, ctxB7), rstR (rstREltor, rstRClass) и разного количества тандемных повторов (trp) в промоторной области оперона ctxAB. Полученные данные позволяют отнести все изученные штаммы к четырем генотипам: ctxB1, rstREltor, trp3;

ctxB1, rstREltor, trp4;

ctxB1, rstREltor/rstRClass, trp4;

ctxB7, rstREltor/rstRClass, trp5. При этом в большинстве случаев эпидемические вспышки и спорадические случаи заболевания холерой на территории России с 1993 по 2010 гг.

были вызваны штаммами с генотипом ctxB1, rstREltor/rstRClass, trp4.

5. Установлено, что среди изученных с помощью блот-гибридизации штаммов измененных вариантов большинство изолятов содержат две копии профага СТХ.

6. Все исследованные штаммы измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор содержат полный набор генов островов патогенности VPI-1 и VPI-2. При этом геноварианты, завезенные на территории России в 2006-2010 гг., содержат аллель tcpETCIRS, который характерен для изолятов, выделяемых в настоящее время на эндемичных по холере территориях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Горяев А.А., Шубина А.В., Смирнова Н.И. Молекулярная диагностика измененных клинических штаммов возбудителя холеры эльтор // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика – 2010», М. – 2010. – С. 379-381.

2. Горяев А.А., Заднова С.П., Шубина А.В., Краснов Я.М., Смирнова Н.И.

Измененные варианты возбудителя холеры, выделенные на территории Российской Федерации // Проблемы особо опасных инф. – 2011. – Вып. 1(107). – С. 49-52. (журнал из перечня ВАК) 3. Шашкова А.В., Горяев А.А., Смирнова Н.И. Строение и функциональная роль CRISPR-системы бактерий // Проблемы особо опасных инф. – 2011. – Вып.

2(108). – С. 49-52. (журнал из перечня ВАК) 4. Шашкова А.В., Горяев А.А., Заднова С.П., Краснов Я.М., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Конструирование ПЦР тест-системы для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов эльтор вибрионов на типичные и измененные // Проблемы особо опасных инф. – 2011. – Вып. 4(110). – С. 49-52. (журнал из перечня ВАК) 5. Смирнова Н.И, Заднова С.П., Шашкова А.В., Кутырев В.В.

Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, завезенных на территорию России в современный период // Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. – 2011. – №4. – С. 11-18. (журнал из перечня ВАК) 6. Шашкова А.В., Краснов Я.М. Генотипы измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, выделенных на территории России // Материалы III научно практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно исследовательских организаций Роспотребнадзора. – Протвино: А-ПРИНТ ЗАО, 2011.

– С. 145-147.

7. Заднова С.П., Шашкова А.В., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. «Молекулярно генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор, завезенных в Российскую Федерацию, и способ их обнаружения» // Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой и материалы проблемной комиссии (48.04) «Холера и патогенные для человека вибрионы». – Ростов-на-Дону, 2011. – Вып. 24. – С. 93-96.

8. Шашкова А.В., Кульшань Т.А., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Молекулярно генетический анализ и изучение генетического родства измененных вариантов холерного вибриона биовара Эль Тор, выделенных в Российской Федерации / Материалы X съезда ВНПОЭМП (Москва) // Инфекция и иммунитет. – 2012. – Т. 2, №1-2. – С.344.

9. Заднова С.П., Шашкова А.В., Краснов Я.М., Смирнова Н.И.

Фенотипический и генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор // Проблемы особо опасных инф. – 2012. – Вып. 1(111). – С. 57-62.

10. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Шубина А.В., Заднова С.П., Кутырев В.В.

Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест система для его осуществления. Патент № 2458141 от 05.03.2012г.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.