авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Механизмы регуляции катионных каналов в эукариотической клетке

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

МОРАЧЕВСКАЯ Елена Алексеевна МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КАТИОННЫХ КАНАЛОВ В ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКЕ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Зоя Иринарховна Крутецкая Санкт-Петербургский государственный университет доктор биологических наук Сергей Михайлович Антонов Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук Людмила Владимировна Щагина Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Институт физиологии им. И.П.Павлова

Ведущая организация:

РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится «30» октября 2009 года в _ часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: cellbio@mail. cytspb.rssi.ru Факс института (812)297-03-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан «_» сентября 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поступление катионов в цитоплазму из внеклеточной среды играет важную роль в поддержании водно-солевого баланса, в запуске и осуществлении процессов передачи сигнала в нативной клетке. В различных клетках, как возбудимых, так и невозбудимых, быстрые изменения проницаемости и пассивного транспорта катионов связаны, в первую очередь, с активацией и инактивацией ионных каналов клеточных мембран. В исследованиях возбудимых мембран определена роль ионных каналов в генерации и распространении нервного импульса, рецепции, синаптической передаче [1]. Значительно менее понятны ионные механизмы клеточной сигнализации в электроневозбудимых клетках. До недавнего времени усилия исследователей были, в основном, сосредоточены на поиске высокоселективных кальциевых каналов как вероятных участников кальциевого ответа [2,3]. К настоящему моменту круг интересов значительно расширился, и в центре внимания оказались катионные каналы различной селективности. Этому во многом способствовали результаты исследования белков семейства TRP [4,5], предположительно формирующих каналы катионного входа в клеточной мембране.

К концу 80-х годов были установлены основные свойства и принципы организации потенциал-управляемых каналов в нервных и мышечных клетках. Надо отметить, что электрофизиологические исследования ионной проницаемости возбудимых мембран с использованием метода фиксации потенциала (voltage clamp) оказали решающее влияние на формирование концептуальных схем и биофизических моделей работы каналов [1,6–8]. Не будет преувеличением сказать, что развитие новых экспериментальных методов, в первую очередь патч-кламп технологий [9,10] и молекулярного клонирования, фактически привело к смене парадигм, стремительно расширив представления о ионных каналах клеточных мембран. Как оказалось, регулирумый перенос ионов через гидрофильные поры, формируемые интегральными мембранными белками — ионными каналами, является важнейшим свойством живых клеток, как электровозбудимых, так и невозбудимых. Показано, что пассивный транспорт катионов вовлечен в важнейшие регуляторные процессы в клетке, включая апоптоз и опухолевую транформацию [5,11,12]. Возрастает интерес к выяснению путей поступления натрия в цитозоль из внеклеточной среды. До недавнего времени наши знания о механизмах трансмембранного переноса натрия в электроневозбудимых клетках ограничивались результатами исследований эпителиальных натриевых каналов (ENaC) [13,14]. Благодаря применению метода патч кламп натрий-селективные каналы, не имеющие потенциал-зависимых воротных структур, идентифицированы в клетках и тканях различной специализации (Ведерникова* и др., 1999). Cформировались представления о суперсемействе потенциал-независимых катионных каналов DEG/ENaC, характеризующихся общностью функциональных характеристик и молекулярной организации [15].

Таким образом, в основном, завершен «описательный» период в изучении многообразия катион-транспортирующих каналов в клетках эукариот. На первый план выходят проблемы регуляции каналов, их участия в реакциях живой клетки на изменения микроокружения. В этом отношении особый интерес представляют ионные каналы, связанные с механочувствительностью мембраны и (или) клетки в целом. Такие каналы, названные механочувствительными, были обнаружены не только в специализированных механорецепторных структурах, но также и в самых разных клетках и тканях [16]. Они были идентифицированы в мембранах бактерий, грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных [17]. Можно полагать, что механочувствительные каналы принадлежат к наиболее ранним в филогенетическом отношении клеточным сигнальным системам. Детально исследованы бактериальные каналы MscL, представляющие большие поры экстремально высокой проводимости (около 1000 пСм) [16]. В клетках эукариот ионные каналы, связанные с клеточной механочувствительностью, имеют значительно более низкую проводимость и, по-видимому, совершенно иную молекулярную природу. В настоящее время это один из наименее изученных классов ионных каналов. Эта область чрезвычайно интенсивно разрабатывается, поскольку представляет интерес с точки зрения как фундаментальных проблем клеточной биологии, так и новых направлений клеточной медицины. Выяснение физиологических путей активации каналов и природы механочувствительности эукариотической клетки предполагает изучение возможного участия липидных компонентов мембраны и структур кортикального цитоскелета.



В настоящее время одной из актуальных проблем биологии и физиологии клетки становится выяснение роли мембранных липидов в процессах клеточной сигнализации. Согласно современным представлениям о латеральной гетерогенности липидного бислоя, важное значение для связи плазматической мембраны и цитоскелета имеют богатые холестерином липидные микродомены (рафты) [18–21].

Ряд данных свидетельствует, что ассоциация с рафтами может быть решающим фактором, определяющим активность интегральных мембранных белков, в том числе ионных каналов [22,23]. Сообщается, что нарушения структуры и целостности рафтов, обусловленные снижением уровня мембранного холестерина, препятствуют реализации клеточных функций, включающих перестройки актиновой сети [21, 24].

Есть основания полагать, что анализ функциональных взаимосвязей * с 2001г. - Морачевская.

ионных каналов с липидным окружением и организацией цитоскелета будет способствовать пониманию фундаментальных основ клеточной регуляции и передачи сигнала.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в выяснении механизмов регуляции катион-транспортирующих каналов в плазматической мембране эукариотической клетки. Основное внимание сосредоточено на исследовании двух крупных классов потенциал независимых (non-voltage-gated) катионных каналов — механочувствительных и натрий-селективных.

В связи с этим поставлены следующие задачи:

1. Выявить физиологические вне- и внутриклеточные факторы, модулирующие активность каналов катионного входа в плазматической мембране электроневозбудимых клеток. Оценить возможность механозависимой регуляции каналов.

2. Исследовать механизмы активации и инактивации потенциал независимых катионных каналов, связанные с реорганизацией структур цитоскелета.

3. Выяснить возможную роль ГТФ-связывающих белков в регуляции потенциал-независимых натриевых каналов.

4. Проанализировать особенности функционирования натриевых каналов и их связь с динамикой актина в условиях деструкции богатых холестерином мембранных микродоменов.

5. Исследовать функциональные свойства механочувствительных катионных каналов, реагирующих на локальное растяжение (stretch) клеточной мембраны.

6. С использованием адекватной экспериментальной модели определить степень участия аппарата микротрубочек и микрофиламентов в регуляции стретч-активируемых механочувствительных каналов.

7. Исследовать возможное участие мембранного холестерина и липидных микродоменов в механозависимой активации каналов и организации актинового цитоскелета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Основные механизмы регуляции потенциал-независимых катионных каналов в плазматической мембране эукариотической клетки связаны с организацией и динамикой примембранного актинового цитоскелета. Существенную роль в модуляции активности каналов играют актин-связывающие кэпирующие белки и мембранный холестерин.

2. В различных электроневозбудимых клетках разборка кортикальной актиновой сети вызывает активацию потенциал независимых натриевых каналов, не обладающих, однако, прямой механочувствительностью – реакцией на растяжение мембраны.

3. Функциональные характеристики механочувствительных катионных каналов в клетках эукариот зависят, в большей степени от взаимосвязей с микрофиламентами и свойств комплекса мембрана цитоскелет, чем от физических параметров липидного бислоя.

4. Реорганизация примембранного цитоскелета с участием актин связывающих белков — необходимое промежуточное звено, опосредующее влияние на активность каналов ряда физиологически значимых вне- и внутриклеточных факторов, таких как двухвалентные катионы, малые G-белки, мембранный холестерин и структура бислоя.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование внутриклеточных и мембранных путей регуляции потенциал независимых катионных каналов — важной составляющей систем транспорта ионов и передачи сигнала в клетках эукариот. Получены приоритетные результаты, раскрывающие универсальные физиологические механизмы активации и инактивации ионных каналов в электроневозбудимых клетках, связанные с липидным окружением и организацией актинового цитоскелета.

Продемонстрирована функциональная связь потенциал независимых натриевых каналов и механочувствительных каналов с динамикой примембранного актина. Впервые показаны изменения унитарной проводимости стретч-активируемых каналов, сопряженные с разборкой кортикальных микрофиламентов.

Впервые показано влияние малых G-белков на активность натриевых каналов. Установлены кальций-зависимые и ГТФ-зависимые механизмы регуляции каналов, опосредованные реорганизацией микрофиламентов с участием актин-связывающих белков. Обоснованы представления о важной роли кэпирующих белков цитоскелета и процессов декэпирования в модуляции активности каналов.

Впервые выявлены особенности поведения каналов в зависимости от содержания холестерина, обязательного липидного компонента эукариотической клетки. Обнаружено подавление активности механочувствительных каналов в культивируемых клетках лейкемии человека при частичной экстракции мембранного холестерина и выяснен механизм эффекта. Предложены гипотезы относительно механизмов реорганизации F-актина, вызванной нарушением целостности рафтов.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в представленной работе данные имеют принципиальное значение для понимания фундаментальных основ клеточной регуляции и транспорта катионов в эукариотической клетке. Результаты работы демонстрируют многообразие взаимосвязей мембранных структур и актинового цитоскелета, открывают перспективы дальнейшего изучения этого круга проблем клеточной биологии. Проведенные исследования дают теоретическую базу и адекватную экспериментальную модель для исследования цитоскелет-зависимой регуляции различных типов ионных каналов. Полученные результаты расширяют представления о роли мембранных липидов в процессах передачи сигнала, способствуют решению проблем клеточной механочувствительности.

Общебиологическая значимость результатов определяется также тем, что исследованы механозависимые ионные каналы, структуры, относящиеся к наиболее ранним в филогенетическом отношении сигнальным системам.

Итоги работы представляют несомненный интерес для современной фармакологии и практической медицины. Данные о механизмах действия различных агентов, в том числе, циклодекстринов, на функции клеток могут быть применены при разработке и тестировании фармакологических препаратов. Продемонстрировано, что снижение содержания холестерина в клетках может приводить к существенным модуляциям, возможно, нарушениям процессов клеточной регуляции и передачи сигнала. Эти результаты заслуживают особого внимания в связи с развитием терапевтических методик, направленных на коррекцию липидного профиля, в частности, уровня холестерина в плазме крови.

Полученные результаты и сформированные на их основе теоретические представления используются в курсах лекций для студентов биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета и факультета медицинской физики и биоинженерии Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994), симпозиумах “Биология клетки в культуре” (Санкт-Петербург, 1995, 1998, 2001, 2006), 40-м (Балтимор, 1996), 46-м (Сан-Франциско, 2002) и 48-м (Балтимор, 2004) Съездах Американского Биофизического общества, Международном физиологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 1997), 2-м съезде Биохимического общества (Москва, 1997), Всероссийской конференции «Цитоскелет и клеточная регуляция» (Пущино, 2000), Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге ХХI века» (Санкт-Петербург, 2000), Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), конференции Британского физиологического общества (Лондон, 2006), I и II Съездах Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003, 2007), Международной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009), на семинарах ИНЦ РАН.

Публикации. Список основных публикаций по теме диссертации включает 37 работ, в том числе 9 тезисов и 28 статей в ведущих отечественных (11) и зарубежных (17) рецензируемых изданиях.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом страницы включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, 79 рисунков, таблицы, заключение, выводы и список литературы. Личный вклад автора являлся определяющим на всех этапах работы и заключался в постановке задач исследования, участии в проведении экспериментов и обработке данных, анализе, обобщении и изложении результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке, полученной автором от Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 99-04 49652а, 02-04-48251а, 05-04-48209а, 08-04-00574а).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клетки. Основными объектами исследования служили клетки, пролиферирующие в культуре, — постоянные клеточные линии Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН).

Клетки миелоидной лейкемии человека К562 и гистиоцитарной лимфомы U937 культивировали на среде RPMI–1640 с добавлением % эмбриональной телячьей сыворотки и, в части работы, антибиотиков.

Эмбриональные фибробласты мыши 3T3 Balb и 3T3 Balb SV40, клетки эпидермоидной карциномы А431, клетки почек эмбрионов человека НЕК293 культивировали на среде DMEM с добавлением сыворотки.

Использовали также перитонеальные макрофаги и нейроны спинальных ганглиев крыс.

Регистрация ионных токов. Функциональные свойства ионных каналов исследовали с использованием электрофизиологических подходов — различных вариантов метода локальной фиксации потенциала (patch clamp, [9,10]). Трансмембранные токи регистрировали с помощью высокоомного операционного усилителя (EPC–7, List Electronics;

HEKA EPC 8) при отведении от участка мембраны нативной клетки (cell-attached вариант) или в изолированных мембранных фрагментах (варианты inside-out и outside-out). При отведении сигнала "от целой клетки" (whole-cell recording), как правило, измеряли интегральные токи. Аналогичный подход использовали при исследовании потенциал-управляемых каналов нервной клетки в условиях фиксации напряжения (voltage clamp). При отведении токов в режиме outside-out фрагмент мембраны обращен внешней поверхностью в камеру, что позволяет варьировать состав наружного раствора. В режиме inside-out цитоплазматическая сторона мембраны доступна для смены раствора, что позволяет исследовать пути регуляции каналов с участием потенциальных цитоплазматических эффекторов. Сопротивление микропипеток, заполненных стандартным раствором, составляло около 2–4 мОм (whole-cell вариант) и 5–15 мОм в остальных режимах. Мембранный потенциал (Е) задавали как потенциал раствора с внутренней стороны мембраны относительно наружного раствора. Для оценки механочувствительности использовали известный способ механической стимуляции участка мембраны локальное растяжение посредством уменьшения (P0) или увеличения (P0) гидростатического давления в регистрирующей пипетке [25].

Обработка данных. Значения проводимости одиночного канала определяли по линейному участку вольт-амперной характеристики, как правило, в области отрицательных потенциалов. Уровень активности каналов оценивали по значению вероятности открытого состояния канала (Ро): Pо=I/Ni, где N – число элементарных уровней проводимости, I – средний ток для заданного временного интервала (рассчитывался из амплитудных гистограмм), i – амплитуда одиночного открывания.

Результаты представлены в виде: среднее±средняя ошибка.

Фильтрация сигнала 100 или 200 Гц.

Для оценки селективности каналов по отношению проницаемостей использовали уравнения электродиффузионной теории Гольдмана Ходжкина-Катца (GHK equations, см. [1]). Для моновалентных ионов, например, Na+ и K+, оно имеет простейший вид:

Eрев=(RT/zF)ln(PNa[Na+]out/PK[K+]in), где Eрев - потенциал реверсии, R – универсальная газовая постоянная, F – константа Фарадея, z – заряд иона, PNa(K) – проницаемость для данного иона и [Na(K)+] – активность иона. В случае, когда два проникающих иона имеют разную величину заряда, например, Mg+ снаружи и K+ внутри клетки, отношение проницаемостей в соответствии с теорией GHK может быть определено следующим образом:

PMg/PK ={[K+]in/4[Mg2+]out}exp(EревF/RT){exp(EревF/RT)+1} При обсуждении результатов рассматриваются ограничения данных подходов, постулирующих независимость движения ионов в канале.

Коэффициенты активности рассчитывали с помощью расширенного уравнения Дебая-Хюккеля.

Основные растворы. Стандартный наружный раствор содержал (мМ): 145 NaCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES/TrisOH. При отведении cell attached использовали калиевый внеклеточный раствор, содержащий (мМ): 145 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES/KOH;

в этих условиях потенциал покоя приближался к нулевому значению. В конфигурации inside-out стандартный раствор в камере, контактирующий с внутриклеточной стороной мембранного фрагмента (cytosol-like solution), содержал (мМ): 140 K-Aspartate (или 145 K-Glutamate, 145 KCl, K2SO4), 5 NaCl, 2 EGTA, 1 MgCl2, 20 HEPES/TrisOH и соответствующее количество CaCl2 (0.176 мМ) для поддержания свободной концентрации ионов кальция на уровне 0.01 мкМ (pCa=8). pH растворов поддерживали на уровне 7.3. Опыты проводили при температуре 22-23° С.

Актин и актин-связывающие белки. Гельзолин и кэпирующий белок CapZ были любезно предоставлены профессором Хинссеном (Билефельд, Германия). CapZ, выделенный из грудной мышцы цыпленка [26], и гельзолин, выделенный из желудка свиньи [27], хранили в виде осадков в сульфате аммония при –70° С;





перед использованием суспендировали и диализовали против буферного раствора, содержащего (мМ): 0.2 EGTA, 0.2 DTT, 0.2 PMSF, 10 Tris-HCl, pH=7.0– 7.5. G-актин, выделенный из скелетных мышц кролика [28], хранили в растворе низкой ионной силы, содержащем (мМ): 2 Tris-HCl, 0.1 CaCl2, 0.2 ATP, pH=7.5, с добавлением 0.02 % NaN3;

использовали в течение суток. Полимеризацию актина in vitro регистрировали как увеличение светорассеяния раствора при 350 нМ под углом 90° или как увеличение вязкости раствора при помощи капиллярного вискозиметра Оствальда.

Флуоресцентная микроскопия. Для визуализации F-актина применяли стандартные методики фиксации и окраски клеток с помощью родамин-фаллоидина (TRITC-phalloidin, 2 мкМ). Для визуализации изменений клеточной поверхности использовали филипин (10 мкг/мл) и FITC-конъюгированную В-субъединицу холерного токсина (CTB, 2.5 мкг/мл);

окрашивание проводили без пермеабилизации клеток.

Модификация липидного состава. Для частичной экстракции холестерина клетки инкубировали (37° С, СО2) в среде без сыворотки в присутствии метил-бета-циклодекстрина (МбЦД, 2.5 или 5 мМ), циклического олигосахарида, селективно связывающего стеролы [29].

Обработка клеток МбЦД является наиболее эффективным методом модификации стерольного состава мембран, в частности, снижения уровня холестерина. С помощью газожидкостной хроматографии показано, что в норме уровень холестерина в клетках К562 составлял около 20 мкг/мг белка, после 2-часовой инкубации с 2.5 и 5 мМ МбЦД содержание холестерина снижалось до 11 и 5 мкг/мг, соответственно. В качестве дополнительного контроля использовали альфа циклодекстрин, структурный аналог, не связывающий холестерин.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ.

Потенциал-управляемые натриевые каналы и роль карбоксильных групп в их активации.

Потенциал-управляемые ионные каналы, экспрессирующиеся преимущественно в возбудимых тканях, обладают двумя ключевыми свойствами — способностью к избирательному пропусканию ионов и к переходу из закрытого состояния в открытое в ответ на сдвиг мембранного потенциала. Натриевые каналы (Nav) определяют генерацию и проведение нервного импульса, интеграционные процессы кодирования информации в сенсорных нейронах. В наших экспериментах на нейронах спинальных ганглиев крыс и культивируемых клетках нейробластомы (линия Neuro 2A) получены данные о молекулярной организации ионофорной структуры и воротного механизма тетродотоксин-чувствительных натриевых каналов (Negulyaev, Vedernikova, 1985). Регистрация интегральных ионных токов в условиях фиксации потенциала (voltage clamp) представляла основной метод исследования потенциал-активируемых натриевых каналов.

Характеристики натриевых токов в контроле и при химической модификации анализировали с применением имеющегося арсенала биофизических подходов, развитых в классических работах Алмерса [7], Армстронга [6,30], Можаевой и Наумова [8], Хилле [1]. Обнаружено, что обработка мембраны сомы нейрона специфическими реагентами на карбоксильные группы — водорастворимыми карбодиимидами, реагентом Вудварда К — ведет к существенным изменениям в работе электрочувствительного механизма натриевых каналов, в том числе двукратному снижению эффективного заряда активационной системы (Негуляев, Наумов, Ведерникова, 1986;

Наумов, Негуляев, Ведерникова, 1987). Эти данные указывают на важную роль отрицательно заряженных карбоксильных групп внешней поверхности мембраны как компонентов подвижного воротного заряда натриевых каналов нервной клетки.

В дальнейшем эффекты блокирования и модуляции натриевых каналов нервной клетки при понижении рН и действии избирательных модификаторов были детально изучены с помощью метода локальной фиксации потенциала (патч-кламп) (Негуляев, Ведерникова, 1989).

Подтверждены предположения об изменениях селективности и воротных свойств канала при действии алкалоида аконитина (Negulyaev, Vedernikova et al., 1990). Важно отметить, что как при химической, так и при фармакологической модификации сохраняется основной механизм активации и инактивации каналов в ответ на сдвиг мембранного потенциала, что и определяет быстрые изменения катионной проницаемости возбудимых мембран. Следующий этап наших исследований включал анализ мембранных путей пассивного переноса катионов через каналы клеточной мембраны в эукариотических клетках различной специализации и уровня дифференцировки.

Потенциал-независимые натриевые каналы.

Применение различных вариантов метода патч-кламп позволило обратиться к выяснению механизмов регуляции ионных каналов в различных типах электроневозбудимых клеток, включая первичные культуры и постоянные клеточные линии. В экспериментах на нативных клетках (cell-attached) после достижения плотного контакта регистрирующей пипетки с поверхностью клетки (о чем судили по увеличению сопротивления) регистрировали электрическую активность клеточной мембраны на уровне элементарных событий — ионных токов через одиночные каналы. Идентификация каналов катионного входа осуществлялась, в первую очередь, на основании вольт-амперных характеристик и экспериментов на изолированных фрагментах мембран (outside-out, inside-out) с заменой катионов или анионов (Negulyaev, Savokhina, Vedernikova, 1993). В плазматических мембранах перитонеальных макрофагов крыс (Negulyaev, Vedernikova, 1994), клеток эпидермальной карциномы человека А431 (Negulyaev, Vedernikova et al., 1994), гистиоцитарной лимфомы U937 и хронической миелоидной лейкемии К562 (Negulyaev, Maximov, Vedernikova et al., 1997) были идентифицированы несколько типов натрий-проводящих каналов, различающихся избирательностью для моновалентных катионов.

Наиболее типичны высокоселективные и низкоселективные каналы, отношение проницаемостей РNa/РK составляло 10 и 3, соответственно (Vedernikova et al., 1997). Величина проводимости составляла 12 пС.

Уровень мембранного потенциала оказывал некоторое модулирующее влияние на активность каналов: в области отрицательных потенциалов значения вероятности открытого состояния были несколько ниже, чем в области положительных значений и вблизи нуля. Такая модуляция совершенно отлична от потенциал-чувствительного воротного механизма, управляющего открыванием и закрыванием каналов в нервной клетке.

Таким образом, можно заключить, что в различных электроневозбудимых клетках присутствуют катионные каналы, характеризующиеся преимущественной проницаемостью для натрия (Na+) и отсутствием потенциал-зависимой активации и инактивации. При физиологических условиях данные каналы могут обеспечивать поступление натрия в цитоплазму из внеклеточной среды. Показано, что потенциал-независимые (non-voltage-gated) натриевые каналы нечувствительны к тетродотоксину (Ведерникова, Негуляев, 1995), известному блокатору потенциал-активируемых натриевых каналов. По своим фармакологическим характеристикам — низкой чувствительности к амилориду и его производным — обнаруженные каналы отличаются и от известных натриевых каналов апикальной мембраны почечного эпителия (ENaC). Как известно, эпителиальные каналы (ENaC) ингибируются амилорилом в микромолярных и субмикромолярных концентрациях, что используется как маркерный признак в электрофизиологических измерениях ионных токов [13,14]. В то же время по проводящим и кинетическим свойствам потенциал независимые (non-voltage-gated) натриевые каналы, обнаруженные в наших исследованиях, близки к каналам семейства ENaC. Надо отметить, что основные пути активации и тех, и других очевидным образом отличаются как от потенциал-активируемых, так и от типичных рецептор-активируемых каналов. В настоящее время есть основания относить их к одному классу (или семейству) потенциал-независимых катионных каналов (Ведерникова и др., 1999), что служит отправной точкой и находит подтверждения при выяснении механизмов их регуляции. Предполагаемая близость к эпителиальным каналам почки послужила основанием для поиска активаторов каналов среди известных гормонов и физиологически активных веществ.

Действительно, мы обнаружили, что минералокортикоид альдостерон может стимулировать Na+ токи в культивируемых клетках миелоидной лейкемии, влияя как на плотность натриевых каналов в плазматической мембране, так и на уровень их активности (Негуляев, Ведерникова и др., 1996). Были также получены данные, свидетельствующие о вероятном участии G-белков и актинового цитоскелета в регуляции натриевых каналов.

Активация и инактивация потенциал-независимых натриевых каналов: роль актинового цитоскелета.

Разборка микрофиламентов вызывает активацию натриевых каналов. В экспериментах с применением известных модификаторов аппарата микротрубочек и микрофиламентов обнаружено, что уровень активности натриевых каналов зависит от состояния актиновой сети.

Показано, что цитохалазины Б и Д (ЦБ, ЦД), агенты, избирательно разрушающие F-актин, вызывают активацию Na-проводящих каналов с проводимостью 12 пСм в клетках К562, U937, HEK293. Значительный рост активности и соответствующее повышение вероятности открытого состояния каналов (Ро) при действии деструкторов F-актина обнаружены в различных условиях регистрации ионных токов, при использовании различных вариантов метода локальной фиксации потенциала (Negulyaev, Vedernikova et al., 1996b). Следует отметить единообразие зффектов цитохалазинов, как в опытах на интактной клетке, так и после отделения фрагмента мембраны. Это позволило в дальнейшем детально исследовать цитоскелет-зависимые механизмы регуляции каналов в опытах на мембранных фрагментах (inside-out вариант) с применением экзогенных белков цитоскелета.

В большинстве экспериментов фоновая активность натриевых каналов была низка, вероятность их открытого состояния (Ро) приближалась к нулевому значению. Добавление ЦД или ЦБ (10 мкг/мл) к цитоплазматической стороне мембраны вызывало, через 2–3 мин, активацию натриевых каналов (рис. 1). Так, в клетках К562 активацию каналов наблюдали в 42 % экспериментов на фрагментах мембран (n=114), в большинстве опытов наблюдалась активность двух и более каналов. Вольт-амперная характеристика дает значение проводимости 11.9±0.5 пСм и потенциал реверсии 22.8±1.3 мВ, что соответствует отношению проницаемостей PNa/PK около 3 (Ведерникова и др., 1997).

В экспериментах на мембранных фрагментах обнаружена активация натриевых каналов с близкими характеристиками при действии гельзолина, кальций-зависимого актин-связывающего белка, фрагментирующего микрофиламенты (Maximov, Vedernikova et al., 1997b). Добавление экзогенного гельзолина (25 мкг/мл) в раствор, содержащий 1 мкМ ионизированного кальция [Ca2+]i, приводит к значительному увеличению канальной активности (рис. 1 А). При этом важно отметить, что, во-первых, добавление гельзолина при 0.01 мкМ [Ca2+]i не имеет эффекта. Во-вторых, варьирование концентрации кальция ([Ca2+]i) в растворе, имитирующем внутриклеточный, не влияет на вероятность открытого состояния натриевых каналов;

в частности, повышение [Ca2+]i до 1 мкМ не изменяет уровень их активности. Таким образом, гельзолин вызывает активацию каналов Ca-зависимым образом, и, следовательно, этот эффект обусловлен фрагментацией актиновых филаментов, ассоциированных с плазматической мембраной.

А Контроль Рис. 1. Активация и инактивация Гельзолин потенциал-независимых натриевых каналов.

Записи токов показывают G-актин активность каналов в ответ на 0,5 пА подачу (А) гельзолина (25 мкг/мл) 400 мс при 1 мкм свободного [Ca2+]i, или Б (Б) цитохалазина Д (10 мкг/мл) к Контроль цитоплазматической стороне мембраны. Регистрация inside Цитохалазин Д out при потенциале -30 мВ.

Последующее добавление G-актин глобулярного актина ( мкг/мл) в присутствии 1 мМ 0,5 пА магния в растворе ингибирует 400 мс натриевые токи. (В) Временной ход инактивации токов после В 1 мин подачи G-актина. Мембранный потенциал –20 мВ. Фильтр Гц.

1,5 мин 2 мин 2,5 мин 3 мин 0,5 пА 400 мс Параллельно с нашим исследованием в литературе появились первые работы, в которых исследовали связь различных типов каналов (калиевых, хлорных) с кортикальными микрофиламентами в экспериментах на изолированных мембранных фрагментах [31,32].

Существование в них фибриллярных внутриклеточных структур было также показано с помощью сканирующего силового микроскопа [33]. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что некоторые белки цитоскелета чрезвычайно прочно связаны с мембраной, характеризуясь повышенной устойчивостью к действию детергентов при биохимической экстракции [20,21]. Выявленный в наших опытах эффект гельзолина подтвердил обоснованность и физиологический смысл экспериментов на фрагментах клеточной мембраны для анализа взаимосвязи ионных каналов с динамикой примембранного актина. Совокупность полученных нами данных доказывает, что разборка примембранных микрофиламентов приводит к активации потенциал-независимых натриевых каналов.

Инактивация каналов при полимеризации актина. Как было показано, высокий уровень активности натриевых каналов сохранялся и после удаления цитохалазинов или гельзолина из раствора, контактирующего с внутриклеточной стороной мембранного фрагмента, что свидетельствует о необратимости эффекта. Подавление активности каналов было обнаружено при добавлении в камеру глобулярного (G) актина (300 мкг/мл), который при повышении ионной силы среды способен к быстрой полимеризации (Ведерникова и др., 1997). Процесс инактивации развивался в течение 2–3 мин (рис. 1 В). Для проверки предположений о возможных механизмах ингибирования каналов были проведены эксперименты с использованием различных форм актина, полимеризующихся с различной скоростью. Известно, что способность мономерного актина к полимеризации зависит от присутствия в растворе ионов магния [34]. В наших экспериментах in vitro было также продемонстрировано, что G-актин, содержащий Mg2+ в качестве связанного катиона (Mg-актин), полимеризуется существенно быстрее, чем актин, содержащий Ca2+ (Ca-актин). Скорость образования филаментов в растворе была оценена по интенсивности светорассеяния. После инициации полимеризации добавлением 0.1 М КСl интактный Mg-актин полимеризуется быстро, за 2 мин. В случае Ca актина наблюдали лишь небольшое увеличение интенсивности светорассеяния в течение 8–10 мин. Использовали также актин, инактивированный нагреванием, который не способен к полимеризации [35], и модифицированный актин, полученный путем расщепления специфической бактериальной протеазой [36]. Протеолитически расщепленный актин полимеризуется медленно, и критическая концентрация для его полимеризации высока по сравнению с интактной формой.

В электрофизиологических экспериментах активность натриевых каналов индуцировали приложением ЦД или ЦБ к цитоплазматической стороне мембраны. Тестирование различных форм актина (300 мкг/мл) показало, что только интактный G-актин в присутствии 1мМ Mg2+ быстро (2–3 мин) ингибирует натриевые токи (Negulyaev, Khaitlina, Hinssen, Shumilina, Vedernikova, 2000). Во всех остальных случаях введение актина не приводило к инактивации каналов. Сопоставление результатов патч-кламп опытов с кинетикой полимеризации актина in vitro свидетельствует, что ингибирующее действие актина на натриевые каналы коррелирует с эффективностью образования филаментов. Было также показано, что предварительно сформированные филаменты, независимо от их длины, не приводят к подавлению активности каналов (Ведерникова и др., 2000). Таким образом, можно заключить, что полимеризация актина на цитоплазматической стороне мембраны является критическим фактором инактивации каналов.

Регуляция активности натриевых каналов при участии кэпирующего белка.

Среди белков, контролирующих сборку актиновых нитей в примембранной части клетки, важное место принадлежит кэпирующим белкам [26,37], связывающимся с плюс-концами актиновых филаментов, что препятствует дальнейшей полимеризации. Задачей следующего этапа работы было исследование возможного участия кэпирующего белка в регуляции натриевых каналов. Использовали экзогенный кэпирующий белок CapZ, типичный для Z-дисков мышечных клеток Рис. 2. Образование актиновых 0, филаментов в растворе в без CapZ 0, присутствии кэпирующего белка 0,30 1: 1: CapZ, оцененное на основании 0, Вязкость измерений вязкости;

указаны 0, молярные отношения CapZ/актин.

1: Полимеризацию актина 0, 1: инициировали добавлением 0, 1:7 раствора, имитирующего 0, внутриклеточный. Конечная 0, концентрация актина 300 мкг/мл 0 5 10 15 20 25 Время, мин Как показывают данные полимеризации актина в присутствии кэпирующего белка, CapZ уменьшает вязкость раствора актина, и это уменьшение определяется соотношением CapZ/актин (рис. 2). Поскольку CapZ связывается только с плюс-концом филаментов, уменьшение вязкости отражает уменьшение средней длины филаментов. Когда актин полимеризовался в присутствии CapZ при низком молярном соотношении CapZ/актин (1:50–1:100), вязкость уменьшалась только на 20 % по сравнению с контролем, что указывает на то, что в этих условиях формируется достаточно большое количество длинных филаментов. При высоком молярном соотношении CapZ/актин (1:7–1:15) вязкость раствора уменьшалась на 70–80 %, что свидетельствует о том, что в растворе преобладают короткие актиновые филаменты (рис. 2).

Влияние кэпирующего белка на активность натриевых каналов в клетках К562, вызванную приложением цитохалазина, исследовали, одновременно добавляя CapZ и актин в различных молярных соотношениях, варьирующих в широких пределах (1:5–1:100). Исходя из гипотезы «коротких филаментов», предложенной для каналов ENaC [38], мы полагали, что активность каналов может зависеть от длины формирующихся филаментов, и таким образом, ингибирующий эффект актина может быть различным при различных соотношениях CapZ/актин.

ЦБ a Рис. 3. Натриевые каналы не могут быть инактивированы комплексами актин/CapZ.

Записи токов показывают CapZ:G-актин=1: б активацию натриевых каналов ЦБ (10 мкг/мл) (а), отсутствие инактивации при подаче смеси G CapZ:G-актин=1:100 актина и CapZ при молярном в соотношении CapZ/актин 1:30 (б) и 1:100 (в) и инактивацию при подаче G-актина (300 мкг/мл) (г).

G-актин г Поддерживаемый потенциал на мембране –20 мВ.

0.5 пА 500 мс Однако мы обнаружили, что при всех использованных соотношениях CapZ/актин G-актин не ингибировал активность каналов в присутствии кэпирующего белка (рис. 3). Последующая отмывка и подача в раствор G-актина (300 мкг/мл) в тех же ионных условиях приводили к полному подавлению натриевых токов в течение 1–2 мин. Таким образом, CapZ препятствует инактивации каналов под действием полимеризующегося актина (Shumilina, Negulyaev, Morachevskaya et al., 2001).

Неспособность G-актина ингибировать активность натриевых каналов в присутствии кэпирующего белка могла быть вызвана специфическим связыванием CapZ с сайтом на мембране, что может изменять свойства канала и предотвращать полимеризацию актина на цитоплазматической стороне мембраны. Чтобы проверить это предположение, после активации каналов цитохалазином белки подавали последовательно. CapZ добавляли в камеру в концентрации 30 мкг/мл (что соответствует молярному соотношению 1:5 в комплексах CapZ/актин). Оказалось, что проводимость одиночного канала, Na+/K+ селективность, значения Ро, измеренные до и после добавления CapZ, практически совпадали. Кроме того, каналы могли быть инактивированы актином после отмывки кэпирующего белка. Следовательно, CapZ не связывается необратимо с плазматической мембраной и не влияет на свойства каналов. По-видимому, эффект кэпирующего белка заключается в его способности модулировать процессы сборки-разборки микрофиламентов.

Для дальнейшего анализа эффектов кэпирующего белка мы добавляли G-актин к мембранному фрагменту до подачи CapZ. Были проведены две серии таких экспериментов. Обнаружено, что при добавлении на ранней стадии полимеризации актина CapZ может остановить процесс инактивации и восстановить активность каналов (рис. 4, Shumilina, Negulyaev, Morachevskaya et al., 2003).

Однако CapZ восстанавливал активность натриевых каналов только в том случае, когда инактивация была частичной. Во второй серии опытов кэпирующий белок добавляли на более поздних стадиях полимеризации. Когда актин находился в камере более 60 с, мы наблюдали полное подавление токов через натриевые каналы. В этом случае последующее добавление CapZ не восстанавливало активности каналов, значение Ро оставалось близким к нулевому уровню.

Po 1, 0, 0, CB G-актин, 7 с G-актин, 14 с G-актин, 30 с CapZ, 50 с CapZ, 90 с з o 1 пА 500 мс Рис. 4. Активность натриевых каналов может быть восстановлена при добавлении кэпирующего белка на ранней стадии полимеризации актина.

Значения вероятности открытого состояния (Ро) отражают уровень активности каналов после подачи цитохалазина Б (СВ), а затем после подачи G актина и последующего добавления в камеру CapZ (молярное соотношение CapZ/актин 1:50). CapZ добавляли через 30 с после подачи актина;

временные интервалы указаны. Показаны фрагменты записей токов при потенциале – мВ. з и о - закрытое и открытое состояние канала.

Эффект кэпирующего белка, вероятно, обусловлен тем, что он связывается с плюс-концами растущих филаментов, препятствуя дальнейшему присоединению мономеров актина. Таким образом, дальнейшая элонгация будет возможна только на минус-конце, что приведет к повышению критической концентрации полимеризации и к снижению скорости сборки филаментов. Кроме того, CapZ обладает нуклеирующей активностью и, следовательно, ускоряет полимеризацию актина в растворе, омывающем фрагмент мембраны. Вследствие этого уменьшится пул мономеров, необходимых для элонгации филаментов, ассоциированных с плазматической мембраной. В результате этих процессов, по-видимому, происходит ингибирование дальнейшей элонгации и частичная разборка филаментов, ассоциированных с мембраной, что, в свою очередь, останавливает инактивацию канала и частично восстанавливает его активность. Результаты экспериментов с CapZ демонстрируют, что именно динамические процессы сборки разборки примембранных филаментов контролируют активность натриевых каналов. Дальнейшие исследования подтвердили, что кэпирующие белки могут модулировать поведение каналов, регулируя полимеризацию кортикального актина.

Данные, полученные в опытах с цитохалазинами, актин связывающими белками (гельзолином и CapZ), различными формами глобулярного актина свидетельствуют о том, что организация и динамика примембранных микрофиламентов существенным образом влияет на функционирование потенциал-независимых натриевых каналов в плазматической мембране, по-видимому, являясь одним из главных факторов, определяющих уровень их активности.

Активация натриевых каналов в нативных клетках при повышении уровня внутриклеточного кальция.

Для проверки возможной кальций-зависимой регуляции натриевых каналов использовали ионофор А23187-4Br, который индуцирует повышение концентрации свободного кальция в цитозоле за счет электронейтрального обмена Ca2+ на протоны или магний [39]. В экспериментах на нативных клетках (cell-attached) показано, что добавление 10 мкМ А23187-Br во внеклеточный раствор приводит к активации натриевых каналов (Maximov, Vedernikova et al., 1997b).

Индуцированную ионофором активность (Ро=0.13±0.04, n=12) натриевых каналов в клетках К562 наблюдали в 15 (39 %) из 38 стабильных патчей.

Развитие токов входящего направления характеризовалось задержкой, 60±12 с (n=12), в то время как Са-зависимые калиевые каналы, регистрируемые в части экспериментов, активировались через 17±9 с (n=5) после добавления ионофора в наружный раствор. Удаление A23187-4Br и отделение изолированного фрагмента не приводили к подавлению натриевых токов. Активность натриевых каналов сохранялась после отделения мембранного фрагмента (переход в конфигурацию inside-out) при регистрации в безкальциевом растворе, содержащем 2 мМ EGTA (Ро=0.13±0.07, n=5). Эти данные подтверждают, что ионы кальция не влияют непосредственно на исследуемые каналы (Maximov, Vedernikova et al., 1997a). Результаты опытов с гельзолином (см. рис. 1) свидетельствуют о возможной Са зависимой регуляции натриевых каналов, опосредованной фрагментацией микрофиламентов. Действительно, последующее добавление во внутриклеточный раствор 300 мкг/мл глобулярного актина приводило к подавлению активности, вызванной А23187-4Br (Ро=0.04±0.03, n=3), что подтверждает предположение об участии актинового цитоскелета в процессе кальций-зависимой активации натриевых каналов. Предполагаемая «актин-опосредованная» кальциевая регуляция совершенно отлична от обнаруженной нами “быстрой” активации и инактивации хлорных (Савохина, Негуляев, Ведерникова, 1991) и калиевых каналов (Negulyaev, Vedernikova et al., 1996a), когда ионы кальция, по-видимому, непосредственно взаимодействуют с канальными молекулами.

-100 -75 -50 -25 0 Рис. 5. Вольт-амперные мВ характеристики натриевых каналов в Контроль клетках К562 в нормальных условиях CD -0, Гельзолин (контроль) и после активации, A23187-4Br вызванной цитохалазином Д (CD), экзогенным гельзолином и -1, ионофором A23187-4Br.

пА -1, Сопоставление характеристик, полученных при анализе ионных токов в различных условиях (рис. 5) — при активации цитохалазином, гельзолином, кальциевым ионофором, а также регистрируемых в контрольных опытах на клетках К562 — демонстрирует хорошее совпадение параметров одиночных каналов, в частности, значений проводимости (12 пСм). Показано, что натриевые каналы, активация которых сопряжена с динамикой примембранного актина, не обладают чувствительностью к механической стимуляции — локальному растяжению мембраны (Ведерникова и др., 2000). При этом в различных типах клеток (К562, U937, Jurkat, Balb3Т3) обнаружена механозависимая активация каналов, явно отличающихся по проводящим и воротным свойствам от натриевых каналов, активирующихся при разборке цитоскелета.

Участие ГТФ-связывающих белков в регуляции натриевых каналов.

Для изучения возможного участия G-белков в регуляции потенциал-независимых натриевых каналов использовали гуанозин 5’-О (3-тиотрифосфат) (GTPS), негидролизуемый аналог GTP, известный активатор как гетеротримерных, так и мономерных G-белков [40] и фторид алюминия (AlF4-), активатор гетеротримерных G-белков [41]. В экспериментах inside-out на клетках К562 наблюдали активацию натриевых каналов после добавления GTPS (100 мкМ) к цитоплазматической стороне мембраны (рис. 6, Shumilina, Khaitlina, Morachevskaya et al., 2003). Характеристики каналов, включая проводимость (12 пСм) и селективность (PNa/PK около 3), были близки к полученным ранее в опытах на культивируемых клетках К562. Фторид алюминия был неэффективен, что указывает на вероятное участие малых G-белков. Повышение Ро происходило c существенной задержкой (6–10 мин), что не соответствует традиционному описанию в рамках простой модели «активированный G-белок ионный канал» [42].

Скорее всего, действие негидролизуемого аналога GTP включает дополнительные звенья в цепи передачи сигнала. Поскольку мы наблюдали активацию натриевых каналов с теми же характеристиками при разрушении цитоскелета (см. рис. 2 и 5), логично предположить, что GTPS-индуцированное повышение активности также связано с разборкой примембранных микрофиламентов. Это нашло подтверждение в нескольких сериях экспериментов с использованием модификаторов цитоскелета и различных видов актина.

A контроль -30 мВ Рис. 6. Влияние негидролизуемого аналога GTP (GTPS) на активность GTPS одиночных каналов.

0 мВ A. Записи токов (inside-out) при различных значениях мембранного -10 мВ потенциала и соответствующие амплитудные гистограммы показывают активацию натриевых -20 мВ каналов через 8 мин после добавления GTPS (100 мкМ) в -30 мВ раствор c цитоплазматической стороны мембраны.

Б. Вольт-амперная -40 мВ характеристика натриевых каналов, активирующихся при -50 мВ подаче GTPS. Проводимость 11.1±0.6 пСм (n=15).

0.5 пА -1,0 -0,5 0, пА 200 мс Б I, пА 0, -60 -40 -20 20 E, мВ -0, -0, -1, Влияние G-актина на активность натриевых каналов, индуцированную GTPS. В первой серии опытов на фрагментах мембран активность натриевых каналов индуцировали GTPS (100 мкМ), после чего добавляли в камеру глобулярный (G) актин (300 мкг/мл). Так же, как в опытах с цитохалазинами, G-актин вызывал быструю, в течение 1– мин, инактивацию натриевых каналов (рис. 7). Ингибирующее действие актина обусловлено именно его полимеризацией на цитоплазматической стороне мембраны, поскольку G-актин в отсутствие ионов магния, а также предварительно сформированные филаменты (F-актин), независимо от их длины, не приводили к подавлению активности каналов (рис. 8). В следующей серии опытов использовали фаллоидин, известный агент, стабилизирующий актиновые филаменты и препятствующий их разборке. Показано, что предварительное добавление в камеру фаллоидина (12 мкМ, экспозиция 1 мин) препятствует развитию активности каналов в ответ на подачу GTPS.

Эти результаты подтверждают, что действие негидролизуемого аналога GTP связано с разборкой актиновых филаментов, ассоциированных с мембраной (Morachevskaya et al., 2004).

A 100 мкМ GTPS -40 мВ Рис. 7. Инактивация натриевых каналов, активированных GTPS, при o добавлении G-актина в раствор с цитоплазматической стороны 300 мкг/мл G-актин мембраны.

10 с -40 мВ А. Записи токов через 10 мин после подачи GTPS, а затем добавления o глобулярного актина (300 мкг/мл, 60 с -10 мВ при 1мМ магния в растворе).

Указаны значения мембранного o потенциала и интервалы времени -60 мВ 120 с после подачи актина, о - открытое состояние канала.

0.5 пА Б. Значения вероятности открытого состояния (Ро).

500 мс Б 0, Pо 0, 0, 0, GTPgS 10 мин G-актин 10с G-актин 60с G-актин 120с Механизм ГТФ-зависимой регуляции натриевых каналов: роль динамики актина. Как известно из данных литературы, малые G-белки семейства Rho регулируют перестройки актинового цитоскелета в клетках [43] и, в частности, могут запускать ряд процессов, приводящих к диссоциации кэпирующих белков от плюс-концов микрофиламентов [44].

В клетке высвобождение плюс-концов актиновых филаментов, как правило, приводит к взрывной полимеризации, поскольку в цитоплазме содержится значительное количество мономерного актина, который быстро присоединяется к свободным концам филаментов. Однако, в отсутствие G-актина, «декэпирование» микрофиламентов, связанных с мембраной, будет приводить к обратному эффекту, а именно к их разборке. Такая ситуация реализуется в типичном эксперименте inside out при подаче активатора G-белка.

F-актин, G-актин GTPS короткие филаменты 1 мин -50 мВ -30 мВ -70 мВ з з з o o o -60 мВ 2 мин -60 мВ -60 мВ з з з 0.5 пА o o 500 мс Рис. 8. Предварительно сформированные филаменты (F-актин) не влияют на активность натриевых каналов, индуцированную GTPS, тогда как полимеризация актина на цитоплазматической стороне мембраны ингибирует натриевые токи.

Записи токов, активированных GTPS до (слева) и после (в середине) подачи F актина к цитоплазматической стороне мембранного фрагмента, затем – после добавления G-актина (справа) в присутствии 1мМ магния в растворе. Указаны значения потенциала и интервалы времени после подачи G-актина. з и о закрытое и открытое состояние канала.

Для проверки наших предположений о роли кэпирующих белков и стадии «декэпирования» в ГТФ-зависимой регуляции каналов мы использовали Са-актин, который, как мы показали ранее, полимеризуется медленно и не способен ингибировать активность каналов, но эффективно присоединяется к свободным концам имеющихся филаментов и препятствует их разборке. После отделения фрагмента мембраны (конфигурация inside-out) в камеру добавляли GTPS (100 мкМ) и Са-актин (300 мкг/мл). Согласно нашей рабочей гипотезе, активация малого G-белка при действии GTPS приведет к диссоциации кэпирующего белка от концов филаментов;

однако в присутствии Са-актина равновесие не будет смещаться в сторону разборки филаментов и, соответственно, каналы не будут активироваться. Действительно, мы не наблюдали открываний каналов в течение 10 мин после добавления в раствор GTPS и Са-актина.

Отсутствие активации было обусловлено наличием в камере мономерного Са-актина, а не отсутствием каналов во фрагменте мембраны. Это было проверено в опытах, когда смесь актина и GTPS отмывали и добавляли стандартный внутренний раствор, содержащий цитохалазин Б (ЦБ, 10 мкг/мл). В 2 экспериментах из 4 через 1-2 мин после подачи ЦБ наблюдали типичную активацию натриевых каналов.

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют, что GTPS действительно вызывает активацию G-белка, запускающего сигнальный каскад реакций, в результате которых происходит высвобождение концов актиновых филаментов, что инициирует процессы сборки-разборки кортикального актина. Направление реакций «полимеризация деполимеризация» будет определяться концентрацией G-актина в цитоплазме. Таким образом, показано, что малые G-белки могут регулировать натриевые каналы в клетках К посредством модификации примембранного актинового цитоскелета.

Функциональная связь натриевых каналов с динамикой актина в клетках с пониженным содержанием холестерина.

Как показали проведенные исследования, активность натриевых каналов в невозбудимых клетках критически зависит от состояния актинового цитоскелета. Задачей следующего этапа работы было выяснение роли липидного окружения в регуляции натриевых каналов Согласно современным представлениям о латеральной гетерогенности клеточных мембран, важное значение для связи кортикального актина и интегральных белков имеют богатые холестерином липидные микродомены (рафты) [18–21]. Нарушения структуры и целостности липидных рафтов, обусловленные снижением уровня мембранного холестерина, могут препятствовать реализации цитоскелет-зависимых функций клетки.

В электрофизиологических экспериментах с использованием различных вариантов патч-кламп метода исследовали функциональные свойства натриевых каналов в клетках с пониженным уровнем холестерина. С использованием ранее апробированных подходов оценивали характеристики каналов, уровень их активности и частоту встречаемости, действие модификаторов цитоскелета. Центральный вопрос данного раздела работы – каким образом реализуется функциональная связь каналов с состоянием примембранного актина в условиях экстракции холестерина и предполагаемой деструкции рафтов.

В частности, необходимо было выяснить, имеет ли место активация каналов при разборке микрофиламентов. Для частичной экстракции холестерина клетки инкубировали с метил-бета-циклодекстрином (МбЦД), олигосахаридом, избирательно связывающим стеролы. После инкубации с МбЦД (2.5 или 5 мМ) наблюдали активацию натриевых каналов при действии цитохалазина Б или Д, как в целых клетках, так и в мембранных фрагментах (рис. 9, Сударикова, Чубинский-Надеждин, Негуляев, Морачевская, 2009). Как видно из сопоставления характеристик, биофизические свойства натриевых каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина были близки к таковым в контроле, проводимость составляла 12 пСм (табл.1).

Таблица 1. Характеристики натриевых каналов в клетках К562 в норме и после инкубации с метил-бета-циклодекстрином (МбЦД, 2.5 и 5 мМ, 60 мин) Контроль МбЦД Режим Проводимость, Частота Проводимость, Частота регистрации пСм встречаемости, пСм встречаемости, % % Cell-attached 12.1±0.7 14 (n=142) 12.1±0.6 13 (n=133) Inside-out 10.8±0.8 15 (n=97) 11.1±0.7 16 (n=101) Inside-out, 11.9±0.7 18 (n=39) 11.6±0.1 13 (n=53) цитохалазин В опытах cell-attached обнаружено, что после инкубации клеток с МбЦД (5мМ, 1ч) развитие активности каналов в ответ на подачу цитохалазина (20 мг/мл) было несколько замедлено по сравнению с типичной кинетикой для нормальных клеток;

при этом регистрировали открывания каналов меньшей проводимости. В опытах с глобулярным актином показано, что сборка филаментов на цитоплазматической стороне мембраны приводит к инактивации натриевых каналов в модифицированных клетках (рис. 9).

0,4 Po актин ЦД Контроль 0, 1 пА 0, Контр. ЦД актин 300 мс Рис. 9. Активация и инактивация натриевых каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина. Регистрация токов (inside-out) до (контроль) и после подачи цитохалазина (ЦД, 20 мкг/мл), затем после подачи G-актина (300 мкг/мл, в присутствии 1 мМ магния в растворе). Мембранный потенциал -30 мВ. Справа показаны значения вероятности открытого состояния (Ро).

Суммируя результаты, полученные на целых клетках и мембранных фрагментах, можно заключить, что в клетках с пониженным содержанием холестерина сохраняется основной механизм регуляции натриевых каналов, сопряженный с разборкой и сборкой примембранного актинового цитоскелета. Судя по имеющимся данным, натриевые каналы в клетках К562 не ассоциированы с богатыми холестерином мембранными микродоменами. Изменения кинетики активации, по-видимому, связаны именно с реорганизацией цитоскелета, вызванной деструкцией рафтов. Это подтверждает визуализация F-актина с помощью флуоресцентного окрашивания в клетках К562 и в других типах клеток после частичной экстракции холестерина.

Идентификация механочувствительных катионных каналов плазматической мембраны.

Согласно Механозависимая активация ионных токов.

распространенной в литературе точке зрения, разрушение актиновой сети должно индуцировать активность механочувствительных каналов плазматической мембраны;

цитохалазины даже рассматривались как потенциальные активаторы данных каналов [45]. Однако, как было показано в наших экспериментах, натриевые каналы, активирующиеся при разборке цитоскелета, не обладают чувствительностью к механической стимуляции — локальному растяжению (stretch) клеточной мембраны (Maximov, Vedernikova et al., 1996).

А 1 пА 1с В Б 1, I( п А ) Ч и сло 0, собы тий V (м В ) -6 0 -4 0 -2 0 20 -0, -1, -1, -2, -2 - I, п А Рис. 10. Активация механочувствительных каналов плазматической мембраны. А. Регистрация тока в режиме cell-attached. Потенциал на мембране – 30 мВ, фильтр 200 Гц. Стрелками показаны подача и снятие стимула — давления в пипетке (20–30 мм рт. ст., P0). Б. Амплитудная гистограмма;

расстояние между пиками соответствует амплитуде одиночного открывания канала В. Вольт-амперная характеристика.

Как показали дальнейшие исследования, в культивируемых клетках крови (К562, U937, Jurkat) присутствуют механочувствительные катионные каналы, характерные для клеток эукариот. Для регистрации механозависимых ионных токов и идентификации каналов мы использовали метод патч-кламп в режиме cell-attached и inside-out. В ответ на подачу стимула (P0, suction) наблюдали быструю активацию ионных токов, отражающую резкое увеличение вероятности открытого состояния каналов, реагирующих на деформацию (или растяжение) мембраны, – механочувствительных каналов (рис. 10, Staruschenko, Negulyaev, Vedernikova, 2000). Во многих случаях наблюдали несколько кратных уровней тока, очевидно, отражающих одновременные открывания нескольких каналов в участке мембраны. Эффект развивался без видимой задержки и, как правило, был полностью обратим. Вероятность открытого состояния возрастала с увеличением натяжения мембраны, в то время как амплитуда одиночных открываний и, соответственно, проводимость канала не изменялись. Таким образом, по своим воротным характеристикам обнаруженные каналы могут быть отнесены к типичным стретч-активируемым (stretch-activated).

Проводимость и селективность механочувствительных каналов. Механозависимую активацию каналов в клетках К наблюдали в 55 % опытов (n=441). Проводимость одиночного канала рассчитывали по значениям токов в области отрицательных потенциалов, где вольт-амперная характеристика могла быть аппроксимирована линейной зависимостью. В ионных условиях, близких к физиологическим, токи в области положительных потенциалов имели выходящее направление, потенциал реверсии был близок к 0 мВ (Старущенко, Мамин, Негуляев, Ведерникова. 2000). Анализ данных выявил присутствие нескольких популяций стретч-активируемых каналов, различающихся по уровню проводимости. Характерные значения проводимости - 17.2±0.3 пСм (n=37) и 24.5±0.5 пСм (n=34).

Селективные свойства механочувствительных каналов определены в сериях экспериментов на изолированном мембранном фрагменте (inside-out). Установлено, что замена анионов (Cl-, аспартат, глутамат или SO42-) не влияет на амплитуду токов, что указывает на их катионную природу. Сдвиг вольт-амперных характеристик в сторону положительных потенциалов на 20 мВ при замене 50 % электролита в растворе на сахарозу доказывает катионную селективность механочувствительных каналов. (Ведерникова и др., 2001). Измерения токов в широком диапазоне потенциала при варьировании катионного состава растворов показали, что большие органические катионы, в частности TRIS+ и NMDG+, не проникают через исследуемые каналы.

Полученные результаты подтверждают, что механочувствительные каналы клеток К562 проницаемы для моновалентных неорганических катионов, но не для анионов, и не дискриминируют Na+ и K+. Эти данные использованы в дальнейших исследованиях проницаемости каналов для двухвалентных катионов (Staruschenko, Vedernikova, 2002).

Действие потенциальных блокаторов и активаторов каналов.

Показано ингибирование механочувствительных каналов при действии (Gd3+) трехвалентного катиона гадолиния в микромолярных концентрациях (Старущенко, Негуляев, Ведерникова, 2002). Обнаружено также ингибирование исследуемых каналов при действии амилорида ( мМ). Таким образом, по фармакологическим свойствам механочувствительные каналы в клетках К562 близки к стретч активируемым катионным (SAC) каналам, обнаруженным в ооцитах лягушки [46], волосковых клетках мыши [47] и морской свинки [48]. Как следует из собственных и литературных данных, блокирование гадолинием отмечено для механочувствительных каналов, имеющих различные проводящие свойства, что предполагает разную структуру и потенциальный профиль поры. Опираясь на имеющиеся данные о взаимодействии Gd3+ с модельными липидными мембранами [49], можно полагать, что для функций механочувствительных каналов существенно липидное окружение, в частности, фосфатидилсерин, присутствие которого во внешнем монослое липидов считается характерной особенностью апоптозных клеток.

Кальциевая проницаемость и блокирование механо– чувствительных каналов.

До нашей работы в литературе имелись разрозненные сведения о влиянии двухвалентных катионов на механочувствительные катионные каналы в клетках эукариот;

в частности, сообщалось об ингибирующем действии кальция в концентрационном диапазоне 0–2 мМ на стретч активируемые токи [50,51]. В наших экспериментах на клетках К показано, что ионы Ca2+ и Mg2+ в физиологических концентрациях (1– мМ) не препятствуют активации механочувствительных каналов.

Специальное внимание было уделено изучению возможной проницаемости исследуемых каналов для двухвалентных катионов.

Механозависимые токи регистрировали при различных концентрациях кальция с наружной стороны мембраны (cell-attached вариант) и замене остальных катионов на непроникающие (TRIS+, NMDG+).

А 1,0 I (пА) 0, +30 мВ V (мВ) -100 -50 0 -100 мВ -0, -1, Б 1,0 I (пА) 0, +30 мВ V (мВ) -100 -50 0 -100 мВ -0, 1 пА -1, 500 мс Рис. 11. Записи токов (cell-attached) через механочувствительные каналы и соответствующие вольт-амперные характеристики при различных концентрациях кальция в растворе с внешней стороны мембраны: (A) 2 мМ, (Б) 20 мM CaCl2;

для поддержания осмотичности и рН растворов использовали NMDGCl и Hepes-Tris.

Удалось измерить токи входящего направления, переносимые ионами Ca2+, и определить проводимость одиночного канала (8 пСм) при физиологической концентрации кальция (2 мМ) (рис. 11, Staruschenko, Vedernikova, 2002). При повышении концентрации наружного кальция наблюдалось частичное (при 10 мМ CaCl2) или полное (при 20 мМ CaCl2) блокирование входящих токов при сохранении токов выходящего направления (рис. 11 Б), переносимых внутриклеточными моновалентными катионами. Полное подавление механочувствительных каналов наблюдалось в присутствии 90 мМ CaCl2.

Таким образом, с помощью прямых измерений ионных токов впервые показано, что механочувствительные каналы могут проводить ионы Са2+ при физиологической внеклеточной концентрации (1–2 мМ).

Повышение уровня внеклеточного Са2+ приводит к ингибированию токов по типу выходящего выпрямления, что может быть обусловлено сильным связыванием ионов Са2+ у наружного устья поры.

Проницаемость механочувствительных каналов для ионов магния.

С помощью аналогичных подходов исследовали влияние внеклеточных ионов магния (Mg2+) на активность механочувствительных каналов, в частности, как потенциального блокатора и (или) проникающего катиона. В литературе приводятся многочисленные данные об ингибирующем действии ионов Mg2+ на различные типы ионных каналов, в том числе и механочувствительных [52,53]. В то же время сведения о проницаемости каналов для магния крайне ограничены. В наших опытах механозависимые токи, переносимые ионами Mg2+, были зарегистрированы в 53 % (n=80) стабильных патчей при различных концентрациях магния в растворе с наружной стороны мембраны (рис. 12, Staruschenko, Sudarikova, Negulyaev, Morachevskaya, 2006). Во всем диапазоне исследуемых потенциалов наблюдали токи как входящего, так и выходящего направления. Входящие токи были обусловлены переносом ионов Mg2+, а выходящие – переносом моновалентных внутриклеточных катионов, скорее всего калия. В присутствии MgCl2 в концентрациях 1–2 мМ проводимость для входящих токов составила около 5 пСм. При увеличении концентрации магния в растворе с наружной стороны мембраны до 20 или 90 мМ мы наблюдали лишь незначительное повышение проводимости: при 90 мМ MgCl проводимость составляла 5.8±0.3 пСм. Таким образом, для токов, переносимых ионами Mg2+, имеет место выраженный эффект насыщения, по-видимому, обусловленный связыванием этих ионов с анионным локусом, характеризующимся константой диссоциации для Mg2+ около 1 мМ. Насыщение токов, вероятно, связано с известной, относительно медленной, реакцией гидратации-дегидратации ионов магния.

Б А -8 0 м В -8 0 м В -7 0 м В -7 0 м В -6 0 м В 10мВ -5 0 м В 20м В 20м В 30мВ 30м В 40мВ 1 пА 0,5 с 0,8 I (п А ) 0,8 I (п А ) 0,6 0, 0,4 0, 0,2 0, V (м В ) V (м В ) - 1 0 0 - 8 0 - 6 0 -4 0 -2 0 20 -1 0 0 -8 0 - 6 0 -4 0 -2 0 20 -0,2 -0, -0,4 -0, -0,6 -0, Рис.12. Записи токов (cell-attached) через механочувствительные каналы при разных уровнях поддерживаемого потенциала. Раствор с наружной стороны мембраны содержал (А) 90 мМ MgCl2. (Б) 2 мМ MgCl2, 137 мМ NMDGCl. Ниже – вольт-амперные характеристики.

Из вольт-амперных характеристик были определены значения потенциала реверсии при различном содержании магния во внеклеточном растворе: –5.2±1.1 мВ (90 мМ MgCl2), –16.0±1.9 (20 мМ MgCl2), –27.4±2.6 (2 мМ MgCl2) и –33±1 мВ (1 мМ MgCl2). Отношение проницаемости PMg/PK, оцененное для 2 мМ MgCl2, равнялось 18, что подразумевает довольно высокую селективность канала для магния.

Однако применимость электродиффузионной теории, основанной на принципе независимости, в данном случае весьма ограничена.

Наиболее важный итог этих экспериментов — это прямые измерения магниевых токов через одиночные каналы. Природу токов подтверждает и наблюдаемое смещение потенциала реверсии при повышении концентрации магния. Проведенные исследования позволяют утверждать, что механочувствительные каналы проницаемы для ионов магния, причем как при физиологических, так и при более высоких концентрациях MgCl2 во внеклеточном растворе.

Влияние модификаторов цитоскелета на характеристики механочувствительных каналов.

Согласно современным представлениям, одной из важнейших клеточных систем, структурно и функционально связанных с механочувствительными каналами в клетках эукариот, может быть кортикальный цитоскелет [16,32,45]. Для изучения взаимосвязей каналов с системой микрофиламентов и микротрубочек мы использовали в качестве основного объекта культивируемые клетки К562 — оптимальную экспериментальную модель, адекватность которой была обоснована в ходе предшествующих исследований. Были проведены серии экспериментов с использованием избирательных модификаторов, при различных вариантах обработки клеток.

Специальное внимание было уделено проверке предположений об активирующем действии деструкторов F-актина на стретч активируемыые каналы.

В экспериментах на нативной клетке (конфигурация cell-attached) и на изолированном фрагменте мембраны (inside-out) показано, что добавление в камеру цитохалазина Д или Б (20 мкг/мл) не вызывало повышения первоначального уровня активности каналов. Кинетические свойства каналов не претерпевали существенных изменений, в то же время снижалась амплитуда одиночных открываний (Staruschenko, Negulyaev, Morachevskaya, 2002). Обнаружено, что разборка актинового цитоскелета при действии цитохалазина Д или латрункулина Б приводит к существенному снижению проводимости механочувствительных каналов. Как показывают записи токов и вольт-амперные характеристики, эффект носил градуальный характер.

А I(п А ) 0, V (м В ) -6 0 -4 0 -2 0 0 20 40 -0, -0,8 4 п А 18 пС м -1, Б I(п А ) 0, V (м В ) -6 0 -4 0 -2 0 0 20 40 -0, -0,6 6 п А 14 пС м -1, I(п А ) 0, В V (м В ) -6 0 -4 0 -2 0 0 20 40 -0,3 5 п А -0, 8 пСм 1 пА 1с -1, Рис. 13. Снижение проводимости механочувствительных каналов при разборке микрофиламентов.

Записи токов (cell-attached, –40 мВ) в контроле (А), через 7 мин (Б) и через 13 мин (В) добавления цитохалазина Б (20 мкг/мл) во внеклеточный раствор. Справа приведены соответствующие вольт-амперные характеристики.

В типичном эксперименте через 7 мин после добавления во внеклеточный раствор цитохалазина наблюдали изменение проводимости с 18 до 14 пСм (рис. 13, Staruschenko, Negulyaev, Morachevskaya, 2005);

спустя еще 6 мин уровень проводимости одиночного канала уменьшился более чем в два раза по сравнению с исходным и составил 8 пСм. В среднем, после действия цитохалазина «окончательный» уровень проводимости в этих опытах составил 8.9±0. пСм (n=9). При этом не было обнаружено какого-либо активирующего действия деструкторов F-актина на механочувствительные каналы.

Некоторое повышение уровня активности каналов, оцененного как Po, выявлено после предварительной инкубации клеток с латрункулином Б (10 мкМ, 30 мин).

После действия колхицина (500 мкМ) или нокодазола (20 мкг/мл), агентов, вызывающих деполимеризацию микротрубочек, наблюдали типичную механозависимую активацию каналов, характеристики которых не отличались от контроля (Staruschenko, Negulyaev, Morachevskaya, 2005). Суммируя полученные данные, можно заключить, что функциональные свойства механочувствительных каналов в клетках К562 зависят от состояния микрофиламентов и, по-видимому, не зависят от перестроек в системе микротрубочек. Результаты свидетельствуют, что целостность актиновой сети – это непременное условие функционирования стретч-активируемых каналов клеточной мембраны. Однако связь механочувствительных стретч-активируемых каналов с микрофиламентами имеет сложный характер, затрагивая, в том числе, и ионофорные свойства поры.

Участие мембранного холестерина в регуляции механочувствительных каналов и актинового цитоскелета.

Присутствие стеринов является характерной особенностью мембран клеток эукариот. Холестерин - один из основных липидных компонентов плазматической мембраны клеток млекопитающих.

Известно, что холестерин влияет на физические свойства и динамику мембран. В модельных системах он регулирует текучесть и повышает жесткость (stiffness) липидного бислоя [54]. Значительно менее понятны изменения мембранных функций в зависимости от уровня холестерина в нативных клетках [55]. Предполагается, что в клеточных мембранах, так же как и в модельных, присутствуют липидные микродомены (рафты) — участки, характеризующиеся более плотной упаковкой и повышенным содержанием холестерина и сфинголипидов [19,21]. Одним из основных подходов для выявления роли рафтов в функциях мембранных белков являются эксперименты в условиях частичной экстракции холестерина.

В опытах cell-attached наблюдали активацию механочувствительных каналов в клетках К562 после инкубации с метил-бета-циклодекстрином (МбЦД, рис. 14) и альфа-циклодекстрином.

В клетках с пониженным уровнем холестерина (обработка МбЦД) обнаружено повышение порога активации и снижение вероятности открытого состояния (Po) механочувствительных каналов;

проводимость одиночного канала оставалась без изменений. Таким образом, частичная экстракция (depletion) холестерина приводит к подавлению механозависимой активации каналов (рис. 15, Morachevskaya et al., 2007). Наблюдаемые эффекты не могут быть объяснены изменением механических свойств липидного бислоя клеточной мембраны.

Возможно, влияние экстракции холестерина связано с нарушением целостности рафтов и обусловлено участием внутриклеточных структур, в первую очередь, актинового цитоскелета.

контроль МбЦД А -40 мВ 1 пА 1с I, пА I, пА 0,8 0, Б 0,4 0, E, мВ E, мВ -60 -40 -20 20 40 60 -60 -40 -20 20 40 -0,4 -0, 15.3 пСм 15.4 пСм -0,8 -0, Рис. 14. Активация механочувствительных катионных каналов в клетках К562 в норме и после инкубации с метил-бета-циклодекстрином (МбЦД, 2.5 мМ, 60 мин).

А. Записи токов при потенциале -40 мВ. Стрелками показаны подача и снятие механического стимула (suction): 25 мм рт. ст. в контроле и 70 мм рт. ст. после экстракции холестерина. Б. Усредненные вольт-амперные характеристики.

С использованием флуоресцентной микроскопии оценено состояние и перестройки цитоскелета в культивируемых клетках К при частичной экстракции холестерина, т.е. в условиях деструкции рафтов. В контрольных препаратах при окрашивании родамин фаллоидином наблюдали типичный для суспензионных клеток кортикальный актиновый слой в виде четкого кольца под мембраной.

После обработки клеток МбЦД обнаружены явные изменения актиновых элементов цитоскелета, вероятно, отражающие развитие фибриллярной сети (Sudarikova, Negulyaev, Morachevskaya, 2006).

Итак, полученные данные позволяют предполагать, что ингибирование каналов в условиях экстракции холестерина опосредовано реорганизацией кортикального цитоскелета, вызванной деструкцией мембранных микродоменов (Morachevskaya et al., 2007).

контроль МбЦД А -50 мВ -40 мВ -30 мВ 20 мВ 30 мВ 1 пА Б 0.20 Po 600 мс 0. 0. 0. n= n= 0. контроль МбЦД Рис. 15. Частичная экстракция холестерина приводит к подавлению активности механочувствительных каналов.

А. Записи токов при различных значениях мембранного потенциала. Уровень «отрицательного» давления составлял около 30 мм рт. ст. в контроле и 60 мм рт. ст. после инкубации клеток с метил-бета-циклодекстрином (МбЦД).

Б. Значения вероятности открытого состояния (Po) для потенциала -40мВ.

Для проверки этой гипотезы в патч-кламп опытах проведено сопоставление характеристик механочувствительных (стретч активируемых) каналов в контроле, при снижении уровня холестерина и при одновременной или последующей разборке F-актина (рис. 16).

Действительно, после обработки клеток МбЦД и цитохалазином Д (или латрункулином Б) минимальный уровень давления, необходимый для активации каналов, возвращался к уровню 25–35 мм рт. ст. Это близко к контролю и существенно ниже порогового значения при пониженном уровне холестерина до обработки деструкторами цитоскелета (50-60 мм рт. ст.). Вероятность открытого состояния (Po) в контроле и после обработки МбЦД составляла 0.35 и 0.095, соответственно. Действие цитохалазина Д (10 мкг/мл) или латрункулина Б (10 мкМ) приводило к обратному повышению активности механочувствительных каналов:

значения Po варьировали в диапазоне 0.3–0.4, что практически соответствует или даже превышает уровень активности в норме (Ефремова, Чубинский-Надеждин, Негуляев, Хайтлина, Морачевская, 2009). Таким образом, разборка F-актина полностью устраняет эффект подавления активации механочувствительных катионных каналов, наблюдаемый при частичной экстракции мембранного холестерина.

Проводимость одиночного канала составляла около 17 пСм, потенциал реверсии близок к нулю, что типично для исследуемых каналов в физиологических ионных условиях.

Контроль Рис.16. Активация механочувствительных каналов в контроле, при частичной МбЦД экстракции холестерина (МбЦД) и при разборке F-актина цитохалазином Д МбЦД+Цит Д (МбЦД+Цит.Д) или латрункулином Б (МбЦД+Лат.Б). Мембранный потенциал – мВ. Стрелкой показана подача стимула.

МбЦД+Лат Б 1 пА 500 мс Полученные данные дают возможность объяснить казавшиеся ранее противоречивыми сведения [16,45] о влиянии модификаторов цитоскелета на стретч-активируемые каналы в клетках различных типов.

Как видно, в зависимости от степени развития актиновой сети ее разборка может влиять на уровень активности данных каналов в большей или меньшей степени.

Результаты наших электрофизиологических экспериментов и визуализация F-актина с помощью родамин-фаллоидина в клетках К указывают на то, что нарушение целостности рафтов при снижении уровня холестерина приводит к формированию филаментов на базе имеющегося в суспензионных клетках пула глобулярного актина. Мы полагаем, что реорганизация примембранных микрофиламентов вследствие деструкции рафтов зависит, в первую очередь, от соотношения глобулярного (G) и фибриллярного (F) актина в клетке.

Для проверки этой гипотезы в качестве экспериментальной модели выбраны линии клеток млекопитающих с развитой в различной степени системой микрофиламентов: эмбриональные фибробласты мыши линий 3Т3 Balb и 3T3 Balb SV40. Результаты микроскопирования показали, что инкубация нормальных фибробластов 3Т3 с МбЦД (5 мМ) приводит к разборке F-актина (рис. 17). Напротив, в трансформированных фибробластах 3Т3 SV40 после экстракции холестерина наблюдали развитие актиновой сети и образование стресс-фибрилл, аналогично процессам, происходящим в клетках линии К-562 (рис. 18). Эти данные подтверждают предположения о механизмах реорганизации F-актина, сопряженной с модификацией структуры микродоменов. Перестройки цитоскелета, вызванные экстракцией мембранного холестерина, по видимому, включают декэпирование микрофиламентов и зависят, в первую очередь, от баланса G- и F-актина в клетке.

Рис. 17. Реорганизация актинового цитоскелета эмбриональных фибробластов мыши линии 3Т3 Balb.

А – контроль. Б – обработка МбЦД (5 mM, 60 мин).

Рис. 18. Реорганизация актинового цитоскелета эмбриональных фибробластов мыши линии 3Т3 Balb SV40.

А – контроль. Б – обработка МбЦД (5 mM, 60 мин).

Это соотношение определяет направление обратимой реакции полимеризации-деполимеризации на свободных концах актиновых нитей. Таким образом, нарушение целостности рафтов может приводить как к разборке, так и к сборке микрофиламентов, в зависимости от состояния актинового цитоскелета в данном типе клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В наших исследованиях определены функциональные свойства и основные пути регуляции потенциал-независимых катионных каналов — натриевых и механочувствительных, характерных для клеток эукариот.

Обнаруженные феномены и закономерности способствуют выявлению универсальных механизмов активации и инактивации ионных каналов в электроневозбудимых клетках. В значительной степени это связано с тем, что в центре внимания — структурные компоненты, обязательные для эукариотической клетки: актин, один из основных белков цитоскелета. и холестерин, один из основных мембранных липидов.

Совокупность полученных данных свидетельствует о значении для функционирования каналов липидного окружения и примембранного цитскелета, в их взаимосвязи и при доминирующей роли последнего.



Pages:   || 2 |
 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.