авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Каталитические свойства рекомбинантной липоксигеназы-3 (zmlox3) кукурузы

На правах рукописи

Осипова Елена Валентиновна КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОЙ ЛИПОКСИГЕНАЗЫ-3 (ZmLOX3) КУКУРУЗЫ 03.01.05 – физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань – 2010 2

Работа выполнена в лаборатории оксилипинов и группе молекулярной биологии Учреждения Российской академии наук Казанском институте биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН Научные руководители: академик РАН, доктор химических наук, Гречкин Александр Николаевич;

кандидат биологических наук, Гоголев Юрий Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Минибаева Фарида Вилевна (КИББ КазНЦ РАН, г. Казань) кандидат биологических наук, Котлова Екатерина Робертовна (Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, г. Санкт-Петербург)

Ведущая организация: Тихоокеанский институт биоорганиче ской химии ДВО РАН (г. Владивосток)

Защита состоится “28” июня 2010 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.005.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учрежде нии Российской академии наук Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я № 30, тел/факс (843)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан “27” мая 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Окисленные производные жирных кислот - оксилипины - выступают в качестве сигнальных молекул, определяющих фи зиологическое состояние растений, животных и микроорганизмов [Guerrero et al., 1997;

Hamberg et al., 1998;

Su, Oliw, 1998;

Hornsten et al., 2002;

Vance et al., 2004;

Vidal-Mas et al., 2005]. Эти вещества участвуют в регуляции роста, развития, ответа на ряд биотических и абиотических стрессоров у растений. Являясь продуктами жиз недеятельности многих микроорганизмов, оксилипины задействованы в процессах коммуникации между патогеном и хозяином.

Ключевым ферментом липоксигеназного пути является липоксигеназа (ЛОГ;

линолеат:кислород оксидоредуктаза EC 1.13.11.12). Липоксигеназы животных, водо рослей, грибов и микроорганизмов используют в качестве субстрата С20-жирные ки слоты (например, арахидоновую кислоту), в то время как липоксигеназы растений ка тализируют превращение С18-жирных кислот (линолевой и -линоленовой кислоты).

У многих видов растений, животных и микроорганизмов определены нуклеотидные последовательности генов липоксигеназ. В то же время лишь некоторые из них кло нированы с целью исследования функциональных белковых продуктов.

В зависимости от образуемых региоизомеров продуктов реакции, липоксигеназы растений разделяются на (9S)- и (13S)-специфичные. Относительно механизмов ката лиза, определяющих специфичность действия ферментов данного класса, единого мнения у исследователей не существует. Классическим объектом для исследования моделей взаимодействия субстрата с активным центром является (13S)-специфичная липоксигеназа-1 сои (GmLOX1), для которой получены данные рентгеноструктурного анализа [Tomchick et al., 2001]. Предложено несколько моделей взаимодействия ак тивного центра липоксигеназ с арахидоновой и линолевой кислотами. Эти модели достаточно хорошо описывают каталитические свойства (13S)-специфичных липок сигеназ, однако не согласуются с экспериментальными данными, полученными при изучении (9S)-специфичных липоксигеназ. Не исследованным остается вопрос о ка талитической активности липоксигеназ растений в отношении других ненасыщенных жирных кислот, кроме линолевой и -линоленовой, в том числе жирных кислот гек садеканового ряда, составляющих до 20% от общего количества липидов в 16:3 рас тениях [Jamieson, Reid 1971;

Mongrand et al., 2005].

У всех изученных видов растений обнаружено несколько изоформ как (9S)-, так и (13S)-специфичных липоксигеназ. Это затрудняет изучение отдельных ферментов, выделяемых из гомогенатов тканей [Gardner, 1989]. В этой связи, перспективным подходом для изучения каталитических особенностей индивидуальных ферментов является клонирование соответствующих генов с последующей их экспрессией в ге терологичных системах. Данная технология также облегчает проведение направлен ных модификаций первичной структуры изучаемых белков, что служит эффективным инструментом для проверки предполагаемых моделей катализа.

Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования являлось выяснение механизма каталитического действия рекомбинантной (9S)-специфичной липоксиге назы-3 (ZmLOX3) кукурузы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получение и характеристика рекомбинантного фермента ZmLOX3.

2. Сравнение регио- и стереоспецифичности действия ZmLOX3 и (13S) специфичной (GmLOX1) липоксигеназы-1 сои при использовании в качестве субстра тов гомологов линолевой и -линоленовой кислот с разной длиной углеродной цепи.

3. Выявление особенностей каталитически важных доменов ZmLOX3 и определе ние вариантов их направленной модификации.

4. Получение мутантных форм ZmLOX3. Сравнение особенностей превращения линолевой кислоты и сложных липидов при участии фермента дикого типа и его му тантной формы.

5. Построение моделей взаимодействия ZmLOX3 и GmLOX1 с субстратами на ос новании экспериментальных данных и компьютерного моделирования.

Научная новизна работы. Проведенные исследования расширяют представле ния о теории специфичности действия ферментов липоксигеназ. На основании ком пьютерного моделирования и полученных экспериментальных данных определены факторы, влияющие на специфичность окисления субстратов при участии (9S)- и (13S)-липоксигеназ растений (ZmLOX3 и GmLOX1). Показано, что позиционирова ние субстратов в активном центре GmLOX1 и ZmLOX3 различается, однако, вне за висимости от региоспецифичности фермента проникновение субстрата в активный центр липоксигеназ осуществляется метильным концом вперед. Специфичность дей ствия ZmLOX3 определяется лимитированным объемом активного центра, его про странственной структурой, положением ключевых аминокислотных остатков и атома железа. Выявлено, что проявление специфичности действия ZmLOX3 возможно при использовании жирных кислот октадеканового и гексадеканового ряда, встречаю щихся в растениях.

Полученные данные открывают перспективы для изучения гексадеканоидного липоксигеназного пути и физиологической роли его продуктов в растениях. Впервые обнаружено, что ZmLOX3 и GmLOX1 диоксигенируют жирные кислоты с укорочен ной по сравнению с линолевой кислотой углеродной цепью по (n-2) и (n+2) типу в за висимости от специфичности действия ферментов. Показано участие (7Z,10Z,13Z) гексадекатриеновой кислоты в классическом 9-липоксигеназном пути растений.

Результаты работы могут способствовать разработке алгоритмов направленной модификации белков с целью получения ферментов с заданными свойствами. На ос нове разработанной модели выявлены консервативные участки полипептидной цепи ZmLOX3 и предложены варианты мутаций, с высокой вероятностью влияющие на ка талитические свойства фермента. В результате единичной аминокислотной замены изменена региоспецифичность действия ZmLOX3.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным условиям. Изучены механизмы образования продуктов функционирования липоксигеназной сигнальной системы – оксилипинов, участвующих в процессах онтогенеза растений, таких как созревание плодов, прорастание семян, образование пыльцы, развитие цветков, корней и других органов, а также в формировании ответа на стрессовые факторы.

Разработаны системы получения и очистки препаративных количеств липокси геназ растений. Использование технологии рекомбинантных ДНК и различных сис тем экспрессии дало возможность получения рекомбинантных белков данного класса для последующего возможного использования в промышленности, поскольку количе ство многих белков часто ограничено низкой доступностью в природе.

Возможность направленных превращений ферментов открывает новые способы модификации их каталитических свойств. Качественное изменение ферментативного катализа при сайт-направленном мутагенезе представляет потенциальный интерес для практического использования в области биоинженерии с целью получения ферментов с заданными свойствами.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, мо гут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биоло гического и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомби нантных ферментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а так же в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в ис следования. Работа проводилась с 2006 по 2009 гг. в соответствии с планом научных исследований УРАН КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы растений. Изучение молекулярных механизмов катализа и поиск новых физиологически активных про дуктов» (гос. регистрационный номер 0120.0 603843). Исследования автора, как ис полнителя данной тематики, поддержаны грантом РФФИ № 06-04-48430-а «Липокси геназы растений. От первичного строения – к пониманию молекулярных механизмов действия», и грантом Президиума РАН (программа «Молекулярная и клеточная био логия»), а также грантом ведущей научной школы академика И.А. Тарчевского НШ 5492.2008.4. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 12-ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2008);

на I Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов «Симбиоз Россия 2008» (Казань, 2008);

на Международной школе-конференции «Генетика мик роорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008);

на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008);

на II Между народной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008);

на Международном симпозиуме «Растительные липиды и оксилипи ны» (Казань, 2008);

на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Швейцария, Лозанна, 2009);

на Международной конференции «Симбиоз-2009: Био логия – расширение границ» (Казань, 2009);

на II Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов «Симбиоз Россия-2009» (Пермь, 2009);

на 13-ой Международной Пу щинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущи но, 2009);

на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009). Работа награждена дипломом I степени I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов «Симбиоз Россия-2008» (Казань, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них три статьи в рецензируемых изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах ма шинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 266 источников, из них 259 зарубежных. В работе представлено 6 таблиц и 33 рисунка.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.1. Бактериальная система экспрессии генов рекомбинантных белков.

Плазмида pRAW2, содержащая ген липоксигеназы-3 кукурузы (zmlox3 GeneID:

542495) любезно предоставлена доктором Н. Келлер (Университет Висконсин, США), плазмида, содержащая ген дивинилэфирсинтазы-3 табака (ntdes1 D:17646110) любез но предоставлена доктором А. Фаммартино (Университет Турина, Италия). Для кло нирования и экспрессии генов zmlox3 и ntdes1 использовали векторы рЕТ30а и рЕТ32а, хозяевами которых служили штаммы E. coli NovaBlue и Rosetta-gami (DE3)pLysS. Индукцию экспрессии и наработку рекомбинантных белков бактериаль ными продуцентами проводили по стандартным методикам, [http://www.merckbiosciences.co.uk/docs/ PROT/TB055.pdf] с модификациями. В пита тельную среду добавляли дополнительный источник железа - Fe2SO4. Клеточные ли заты получали механическим разрушением клеток с использованием аппарата French Press Cell Disrupter (Thermo Scientific, США).

1.2. Манипуляции с ДНК. Плазмидную ДНК выделяли, используя коммерче ские наборы GeneElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma, США). Концентрацию измеряли флуориметрически, качественные характеристики оценивали по результатам элек трофореза в агарозных гелях, регистрируемых с помощью системы Gel-Doc и про граммы Quantity One (Bio-Rad, США). Полимеразную цепную реакцию проводили с помощью амплификатора DNAEngine (BioRad). Сайт-направленный мутагенез осу ществляли методом ПЦР с модифицированными праймерами с использованием ком мерческого набора Quiсk Change (Invitrogen, США). Олигонуклеотидные праймеры синтезировали в НПО «Синтол» (Москва). Определение нуклеотидной последова тельности ДНК проводили с помощью ДНК-анализатора 3130 Genetic Analyser (ABI, США).

1.3. Очистка рекомбинантных ферментов. Рекомбинантные белки из клеточ ных лизатов бактериальных продуцентов осаждали в присутствии (NH4)2SO4, после чего разделяли с помощью анионообменной хроматографии на Q-Sepharose, с исполь зованием системы BioLogic LР (Bio-Rad). Фракции, содержащие ZmLOX3, наносили на Octyl-Sepharose. Белок элюировали буфером с уменьшающейся концентрацией (NH4)2SO4 и концентрировали ультрафильтрацией через мембрану Vivaspin 20 ( MWCO). Препарат фермента диализовали против 50%-ного глицерина и хранили при -86 °С. Содержание белка в пробах определяли с помощью Quick Start Bradford Dye Reagent. Полипептидный спектр препаратов контролировали с помощью электрофо реза в ПААГ по Лэмли [Остерман, 1981]. Белки окрашивали Coomassie R250. Препа раты дивинилэфирсинтазы очищали металлоафинной хроматографией на колонке IMAC (Bio-Rad, США). Препараты нативной алленоксидсинтазы кукурузы получали из ацетонового порошка семян [Grechkin et al., 1991].

1.4. Анализ продуктов реакции липоксигеназ с разными субстратами. Ана лиз продуктов реакции проводили по следующей схеме: 1) инкубация субстрата с ферментом, 2) экстракция продуктов реакции смесью гексан/этилацетат (1:1), 3) упа ривание растворителя, 4) перерастворение в метаноле, 5) метилирование диазомета ном, 6) восстановление боргидридом натрия, 7) нормально-фазовая ВЭЖХ с исполь зованием колонки Separon SIX (3,2150 мм) (Tessek, Чехословакия), 8) хирально фазовая ВЭЖХ с использованием колонки Chiralcel OD-H column (4,6250 мм) (Dai cel Chemical Industries, Франция). После гидрирования над PtO2 и триметилсилирова ние силанизирующей смесью (пиридин:гексаметилдисилазан:триметилхлорсилан (2:1:2)) метиловых эфиров проводили анализ с помощью газовой хромато-масс спектрометрии (ГХ/МС). ТМС-производные метиловых эфиров анализировали с по мощью масс-спектрометра QP5050A, соединенного с газовым хроматографом GC 17A. В качестве газа-носителя использовали гелий со скоростью подачи 30 см/с. Об разцы вводили при начальной температуре колонки 120 °С. Затем температуру повы шали до 240 °C со скоростью 10 °C/мин.

1.5. Анализ аминокислотных последовательностей с помощью методов био информатики. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей липоксигеназ растений и животных проводили по стандартному алгоритму [Altschul et al., 1997]. Трехмерную компьютерную модель строили с помощью пакета программ EXyPred3D [Lambert et al., 2002] на основании 55,6% гомологии аминокислотных по следовательностей ZmLOX3 (NCBI GenPept AAG61118) и липоксигеназы-3 сои (NCBI GenPept AAB41272) [Fukushige et al., 2005] с использованием рентгенострук турных данных последней (PDB 1LNH). Позиционирование субстрата в активном центре исследовали с помощью программ Autodock 4.2 и AutodockTools 1.5.4 (The Scripps Research Institute), трехмерные модели лигандов получали с помощью ChemOffise (CambridgeSoft), визуализацию данных проводили с помощью PyMol APBS Tool (Carlson Group, University of Michigan).

1.6. Статистическая обработка данных. Данные представлены в виде средних значений не менее, чем 4-х измерений в 3-х биологических повторностях. Анализ данных проводили стандартными методами математической статистики (расчет сред неквадратичного отклонения, сравнение средних по критерию Стьюдента).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Получение рекомбинантного фермента ZmLOX Было установлено, что для получения активной рекомбинантной ZmLOX3 в клетках бактериального продуцента E. coli Rosetta-gami (DE3)pLysS критичным фак тором является температура инкубации, которая в наших экспериментах составляла 15 °C. Увеличению выхода активного фермента способствовали также введение в ростовую среду железа в доступной форме (FeSO4) и оптимизация процедуры лизиса.

Комплекс методов очистки ZmLOX3 из клеточного лизата, включающий ионообмен ную и гидрофобную хроматографии, позволил достичь высокой степени гомогенно сти фермента, подтвержденной с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

2.2. Специфичность действия рекомбинантной ZmLOX3 при окислении линолевой кислоты (18:2) Специфичность действия липоксигеназ определяли по соотношению продуктов липоксигеназной реакции. Селективное удалением водорода от прохирального центра пентадиенильного фрагмента ненасыщенной жирной кислоты происходит в соответ ствие со стереоспецифичностью действия липоксигеназы [Grechkin, 1998]. При отры ве от прохирального центра 11-pro-R водорода образуются (9S)- и (13R) гидроперекиси, при удалении 11-pro-S водорода - (9R)- и (13S)-гидроперекиси. Место присоединение кислорода (к углероду в позициях 9 ((n-2) тип) или 13 ((n+2) тип)) оп ределяется региоспецифичностью действия фермента. В растениях встречаются (9S)-, (13S)-липоксигеназы и ферменты, обладающие двойной специфичностью действия.

Согласно ориентационной модели [Gardner, 1989], специфичность действия ли поксигеназы зависит от pH среды. При щелочных pH преобладающим продуктом ли поксигеназной реакции является (13S)-гидроперекись, поскольку ионизация карбок сильной группы субстрата позволяет ему проникать в активный центр только метиль ным концом вперед. При кислых pH преобладающим продуктом реакции является (9S)-гидроперекись, так как карбоксильная группа не ионизирована, и субстрат может проникнуть в активный центр лишь в обратной ориентации. Однако, проведенный нами анализ продуктов окисления линолевой кислоты при участии ZmLOX3 в ще лочных и кислых условиях (pH 6,0;

7,5;

9,0) показал отсутствие зависимости регио- и стереоспецифичности действия ZmLOX3 от значений рН.

Преобладающим HO продуктом окисления O CH HO CH линолевой кислоты O при участии ZmLOX3 H O C H O была 9-гидроперекись HO O (98,5%). Анализ с по- CH HO мощью хирально- CH O HO фазовой ВЭЖХ пока- CH O зал, что 99% 9- Рис. 1. Структуры свободных жирных кислот (сверху вниз):

гидроперекиси лино- линолевая (18:2), -линоленовая (18:3), (13Z,16Z) левой кислоты пред- докозадиеновая (22:2), (11Z,14Z)-эйкозадиеновая (20:2), (9Z,12Z)-гексадекадиеновая (16:2) и (7Z,10Z,13Z) ставлено (S) гексадекатриеновая кислоты (16:3).

энантиомером (рис. 8.) Таким образом, при окислении линолевой кислоты при участии ZmLOX3 происходи ло стереоспецифичное удаление 11-pro-R водорода. Присоединение кислорода про ходило в соответствии с региоспецифичностью действия ZmLOX3 по 9-му атому углерода субстрата. При этом кислотность среды не изменяла ориентации субстрата в активном центре ZmLOX3. Широкий диапазон рН (5.5-9.0) сохранения ферментативной активности и специфичности (9S)-липоксигеназы был установлен нами впервые.

2.3. Специфичность действия ZmLOX3 при окислении высших гомологов линолевой кислоты Особенности специфичности действия ZmLOX3 исследовали используя в каче стве субстратов (13Z,16Z)-докозадиеновой (22:2) и (11Z,14Z)-эйкозадиеновой (20:2) кислот. Структурные формулы субстратов представлены на рис. 1.

Продукты реакции анализировали с помощью ГХ/МС. Полученные данные со поставляли с результатами окисления субстратов коммерческим препаратом липокси геназы-1 (GmLOX1) сои. Под действием ZmLOX3 (pH 7,0) докозадиеновая кислота не окислялась, тогда как эйкозадиеновая кислота окислялась с низкой скоростью (5% от скорости окисления линолевой кислоты). Окисление докозадиеновой и эйкозадиено вой кислот при участии ZmLOX3 при pH 9,0 происходило со скоростями, соответст вующими 9,5% и 1,8% от скорости окисления линолевой кислоты. Преобладающими продуктами окисления докозадиеновой кислоты под действием ZmLOX3 были 13- и 17-гидроперекиси;

минорным продуктом была 18-гидроперекись 22:2 (рис. 2). Обра зование этих продуктов могло происходить при удалении водорода от 15-го и 16-го углерода докозадиеновой кислоты. Продуктами окисления эйкозадиеновой кислоты при участии ZmLOX3 были 11- и 12-гидроперекиси 20:2, которые не полностью раз делялись с помощью нормально-фазовой ВЭЖХ, а также 14- и 15-гидроперекиси 20: (рис. 3). Подобные продукты могли образоваться при удалении водорода от 10-го, 13 го и 16-го атомов углеродной цепи (рис. 2). Анализ с помощью хирально-фазовой ВЭЖХ показал, что все продукты реакций представлены рацемическими смесями (S) и (R)-стереоизомеров.

Рис. 2. Результаты ГХ/МС анализа продуктов инкубации (13Z,16Z)-докозадиеновой кислоты с GmLOX1 (а) и ZmLOX3 (б). а, б – хроматограммы по полному ионному то ку. в, г, д – масс-спектры метиловых эфиров ТМС-производных 13- (1), 17- (2) и 18 (3) гидроксидодекановой кислоты.

Рис. 3. Результаты ГХ/МС анализа продуктов инкубации (11Z,14Z)-эйкозадиеновой кислоты с GmLOX1 (а) и ZmLOX3 (б). а, б – хроматограммы по полному ионному то ку. в, г, д, е – масс-спектры метиловых эфиров ТМС-производных 11- (4), 12- (5), 14 (6) и 15- (7) гидроксиэйкозановой кислоты.

Окисление докозадиеновой и эйкозадиеновой кислот при участии GmLOX1 (pH 9,0) проходило с высокой регио- и стереоспецифичностью. Преобладающие продукты реакций – (17S)-гидроперекись докозадиеновой кислоты и (15S)-гидроперекись эйко задиеновой кислоты – соответствовали региоспецифичности фермента по (n+2) типу.

Скорости реакций сопоставимы со скоростью окисления линолевой кислоты.

Окисление жирных кислот с удлиненной по сравнению с лино левой кислотой углеродной цепью (докозадиеновая и эйкозадиеновая) при участии ZmLOX3 происходило эффективнее в щелочной среде, то есть в условиях диссоциации кар боксильной группы субстрата.

ZmLOX3 катализировала окисление этих субстратов без проявления ре гио- и стереоспецифичности дейст вия. По-видимому, в отличии от GmLOX1, для ZmLOX3 наличие отрицательно заряженной карбок сильной группы необходимо для заякоривания субстрата на положи тельно заряженном аминокислот Рис. 4. Результаты ГХ/МС анализа продуктов ном остатке, как ранее было проде реакции 16:2 с GmLOX1 (а) и ZmLOX3 (б). а, монстрировано для соевой липок б – хроматограммы по полному ионному то сигеназы-3 [Skrypczak-Jankun, ку. в, г – масс-спектры метиловых эфиров 2001]. Возможно, отсутствие спе- ТМС-производных 9- (8) и 13- (9) гидрокси цифичности действия при окисле- гексадекановой кислоты.

нии этих субстратов объясняется большим расстоянием от карбоксильной группы до прохирального центра докозадие новой и эйкозадиеновой кислот по сравнению с линолевой кислотой. Вследствие это го, заякорившийся субстрат позиционировался таким образом, что взаимодействия атома железа и каталитически важных аминокислотных остатков с прохиральным центром субстрата было затруднено.

2.4. Специфичность действия ZmLOX3 при окислении жирных кислот гексадеканового ряда Особенности специфичности действия ZmLOX3 исследовали, используя в ка честве субстрата жирные кислоты, содержащие 16 атомов углерода: (9Z,12Z) гексадекадиеновую (16:2) и (7Z,10Z,13Z)-гексадекатриеновую кислоты (16:3), струк турные формулы которых представлены на рис. 1. Скорость окисления гексадекадие новой кислоты при участии ZmLOX3 была сопоставима со скоростью окисления ли нолевой кислоты. ГХ/МС ана лиз показал, что продуктами ре акции являлись 9-гидроперекись (97%) и 13-гидроперекись (3%) 16:2 (рис. 4). Преобладающим продуктом окисления 16:2 при участии GmLOX1 являлась 13 гидроперекись (95%), минор ным - 9-гидроперекись (5%).

Основные продукты описанных реакций (13-гидроперекись, об разованная при участии GmLOX1, а также 9-гидро перекись, образованная при уча стии ZmLOX3) являлись (S) Рис. 5. Результаты ГХ/МС анализа продуктов энантиомерами. Скорость окис окисления в виде ТМС производных метиловых ления гексадекатриеновой ки эфиров насыщенных жирных гидроксикислот слоты при участии ZmLOX3 со [7,8,10,11,13,14-2H6]16:3 с ZmLOX3. а - хромато ответствовала 8,8% от скорости граммы по полному ионному току 7- (10), 10 окисления линолевой кислоты. (11), 11- (12), 14- (13) гидроксигексадекановой кислоты. б – масс-спектр 7- гидроксигексадека Мажорным продуктом ре новой кислоты.

акции являлась 7-гидроперекись 16:3 (93,3%) (рис. 5). Структура данного соединения была исследована методами 1H-ЯМР и 2D-COSY. Преобладаю щим продуктом реакции 16:3 c GmLOX1 являлась 11-гидроперекись. Согласно ре зультатам хирально-фазовой ВЭЖХ основные продукты реакций при участии ZmLOX3 и GmLOX1 были представлены (S)-энантиомерами. Окисление гексадека диеновой и гексадекатриеновой кислот при участии ZmLOX3 и GmLOX1 происходи ло с высокой стерео- и региоспецифичностью, не смотря на укороченную по сравне нию с линолевой кислотой, углеродную цепь. Скорость реакции, катализируемой ZmLOX3, зависила от расстояния между карбоксильной группой и прохиральным центром субстрата. В случае гексадекадиеновой и линолевой кислот эти расстояния совпадали, сопоставимы и скорости окисления данных субстратов. Удаление водоро да при участии ZmLOX3 происходило из молекулы гексадекатриеновой кислоты в ближайшем к карбоксильному концу прохиральном центре. Это расстояние меньше, чем у линолевой кислоты, ниже и скорость окисления гексадекатриеновой кислоты.

Образование (7S)- и (11S)-гидроперекисей гексадекатриеновой кислоты при уча стии липоксигеназ in vitro было показано впервые. Ранее сообщалось о присутствии этерифицированных (11S)- и 7 гидро(перо)кси производных гексаде катриеновой кислоты в сложных липидах ара бидопсиса, относяще гося к 16:3 растениям [Montillet et al., 2004, Anderson et al., 2006].

Следующим этапом ис следования стал поиск гидрокси-производных гексадеканоидов в 16: и 18:3 растениях.

2.5. Идентифи кация гексадеканои дов в растениях В 18:3 растениях содержание гексаде катриеновой кислоты незначительно, в то время как в 16:3 расте ниях оно составляет до 20% от всех жирных кислот [Jamieson, Reid 1971;

Mongrand et al., 2005]. В корнях капус Рис. 6. Присутствие гексадеканоидов (ГД) в растениях.

ты (16:3 растение) бы Анализ ТМС-производных восстановленных метиловых ли обнаружены 7-, 9- и эфиров ГД выявляемых в корнях капусты (Brassica ol 11-гидрокси-производ eraceae L.) (а), та же хроматограмма с развернутой осью Y ные гексадеканоидов (б), листьях сои (Glycine max L.) (в), листьях гороха (Pisum (рис. 6). Кроме того, sativum L.) (г). 1 –ТМС-производное этилового эфира эн догенной 7-ГГТ, 2 – 7-ГГТ, 3 – 9-ГГТ, 4 – 11-ГГТ, 5 – 10 был обнаружен этило ГГТ, 6 –ТМС-производные этиловых эфиров эндогенной вый эфир 7-гидрокси 11-ГГТ. Данные представлены в виде хроматограмм по производного, который избранным ионным токам.

встречался примерно в 20 раз чаще, чем свободные гидрокси-производные. В корнях картофеля, помимо 7-, 9- и 11-гидрокси-производных гексадеканоидов были обнаружены 8-, 10-, 12-, 13- и 14-изомеры, в то время как их этиловые эфиры отсутствовали.

В листьях и семенах 18:3 растений, таких как соя и горох, были обнаружены 11 гидрокси-производное и в значительно меньших количествах 8-, 9-, 10-, 14-гидрокси производные гексадеканоидов. В листьях гороха, листьях и корнях сои были обнару жены этиловые эфиры 7- и 11-гидрокси-производных. Корни подсолнечника содер жали, в основном, 7-изомеры, тогда как 8- и 10-гидрокси-производные гексадеканои ды содержались в следовых количествах.

Содержание гексадекатриено вой кислоты в ли пидоме 18:3 расте ний крайне незна чительно. В связи с этим, можно пред положить два пути образования гидро перекисей 16:3: в результате окислении 18:3 с Рис. 7. Пути образования гидроперекисей гексадекатриеновой кислоты и их метаболизма в растениях (ЖК – жирная кислота).

последующим окислением до гидроперекисей 16:3 или при -окислении гидроперекисей 18:3 (рис.

7). Отсутствие ожидаемых при -окислении продуктов в виде гидрокси-производных 18:3 с длиной цепи в 14, 12 и менее атомов углерода свидетельствует в пользу перво го пути.

Образование гидрокси-производных гексадеканоидов в корнях картофеля, по видимому, происходило в результате автоокисления. Об этом свидетельствовало при сутствие широкого набора (7-, 8-, 9- 10-, 11-, 12-, 13- и 14-) гидрокси-производных гексадеканоидов. Образование гидрокси-производных гексадеканоидов в корнях ка пусты, растениях гороха и сои могло происходить с участием липоксигеназ. Возмож но, образование этиловых эфиров 7- и 11-гидрокси-производных происходило в рас тении для создания пула этих гексадеканоидов, так как этиловые эфиры отличаются стабильностью. Одним из путей дальнейшего использования этиловых эфиров 7- и 11-гидрокси-производных может являться включение их в галактолипиды и диацилг лицериды.

Образовавшиеся при липоксигеназном окислении линолевой кислоты (9S)- или (13S)-гидроперекиси становятся субстратами для каталитического действия фермен тов семейства CYP74 (цитохромов P450): алленоксидсинтаз, гидропероксидлиаз, ди винилэфирсинтаз [Grechkin, 1998]. Ранее в составе сложных липидов были описаны такие гексадеканоиды, как динор-12-оксо-фитодиеновая [Weber et al., 1997] и динор этероленовая кислоты [Hamberg, 1998]. Предполагалось, что они могут являться про дуктами дивинилэфирсинтазной реакции. Однако экспериментально образование гексадеканоидов, аналогич ных октадеканоидным окси липинам, до настоящего вре мени показано не было. Ис следованию возможности ка талитического преобразова ния 7-гидроперекиси 16:3 при участии ферментами CYP была посвящена следующая часть нашей работы.

2.6. Превращение (7S)-гидроперекиси гекса декатриеновой кислоты при участии ферментов семей ства CYP74 цитохромов P В результате проведен ных нами экспериментов in vitro было установлено, что Рис. 8. Результаты ГХ/МС анализа метиловых (7S)-гидроперекись гексаде эфиров ТМС-производных продуктов инкубации катриеновой кислоты пре- (7S)-гидроперекиси 16:3 с AOC (а) и ДЭС (б).

вращалась при участии 9 алленоксидсинтазы кукурузы в 7-гидрокси-8-оксо-10(Z),12(Z)-гексадекатриеновую кислоту – -кетол (рис. 8). Про дуктом превращения (7S)-гидроперекиси гексадекатриеновой кислоты при участии рекомбинантной 9-дивинилэфирсинтазы табака in vitro являлась динор-колнеленовая кислота. Таким образом, можно предположить участие гексадекатриеновой кислоты в липоксигеназном каскаде растений.

2.7. Получение и исследование специфичности действия мутантной фор мы ZmLOX3 Ala562Gly Согласно существующей модели инверсии субстрата [Coffa et al., 2004] образо вание (9S)- либо (13S)-гидроперекиси зависит от пространственной ориентации ли пидной молекулы в активном центре фермента (метильным или карбоксильным кон цом вперед). Для GmLOX1 показано, что преобладающим продуктом при окислении линолевой кислоты являлась (13S)-гидроперекись, вследствие проникновения суб страта в активный центр метильным концом [Coffa et al., 2005]. Кроме того, для опре деления специфичности действия липоксигеназ в инверсной модели особое значение придается остатку аланина 542. В результате замены Ala542Gly региоспе цифичность действия фермента изменяется, в продуктах обнару живается (9R) гидроперекись. Спе цифичность действия (9S)-липоксигеназ, со держащих аланин в том же сайте, объясня Рис. 9. Анализ нормально-фазовой ВЭЖХ гидроперекисей, ется изменением ори- полученных в результате окисления линолевой кислоты ентации субстрата ZmLOX3 дикого типа (а) и ее мутантной формoй Ala562Gly (карбоксильной груп- (г). Энантиомерный анализ продуктов окисления при уча пой вперед). Согласно стии ZmLOX3 дикого типа (б), (в) и мутантной формы Ala562Gly (д), (е).

этой же модели, (9S) липоксигеназы не способны катализировать окисление жирных кислот в составе сложных липидов, в отличие от (13S)-липоксигеназ, поскольку глицерин, связанный с карбоксильной группой жирной кислоты, препятствует проникновению субстрата карбоксильной группой вперед. При этом изменения специфичности действия (9S) липоксигеназ при аналогичных мутациях показано не было. Нами была получена му тантная форма ZmLOX3 Ala562Gly. Модифицированный рекомбинантный фермент был выделен, очищен и исследован по аналогии с ферментом дикого типа.

Согласно результатам анализа с помощью нормально-фазовой ВЭЖХ, продук тами окисления линолевой кислоты при участии мутантной формы Ala562Gly явля лись 9-гидроперекись (68,5%) и 13-гидроперекись (31,5%) линолевой кислоты (рис.

9). С помощью хирально-фазовой ВЭЖХ было показано, что у 9-гидроперекиси ли нолевой кислоты преобладал (S)-энантиомер (97%), тогда как у 13-гидроперекиси преобладал (R)-энантиомер (96%). Для ZmLOX3 константа Михаэлиса составила 20, мкМ, тогда как для мутанта Ala562Gly – 3,2 мкМ. Понижение значения константы Михаэлиса наблюдалось для мутанта Ala542Gly (GmLOX1) и мутантных форм дру гих ферментов [Coffa, Brash, 2004;

Coffa et al., 2005], что объяснялось эффектом ин гибирования реакции при высоких концентрациях субстрата. Таким образом, мутация Ala562Gly привела к изменению региоспецифичности по сравнению с диким типом ZmLOX3, так как при окисления линолевой кислоты наряду с (9S)-гидроперекисью образовывалась (13R)-гидроперекись (30,2%). Поскольку вопрос ориентации субстра та в субстрат-связывающем кармане остался открытым, то на следующем этапе на шей работы основное внимание было уделено изучению специфичности диоксигени рования сложных липидов при участии ZmLOX3 дикого типа и ее мутантной формы Ala562Gly.

2.8. Окисление сложных липидов при участии ZmLOX3 дикого ти па и ее мутантной формы Ala562Gly Дополнительным доказательством про никновения в актив ный центр (9S) липоксигеназ субстра та карбоксильной группой вперед слу жат данные по окис лению сложных липи Рис. 10. Анализ продуктов окисления МЛГ с помощью нор дов. Показано, что мально-фазовой ВЭЖХ при участии ZmLOX3 дикого типа (13S)-липоксигеназы (а) и мутантной формы Ala562Gly (г): 9-гидроперокси-МЛГ окислять и 13-гидроперокси-МЛГ. Анализ энантиомерного состава способны липиды: продуктов окисления МЛГ при участии ZmLOX3 9- (б), 13 сложные (в) гидроперокси-МЛГ и при участии мутантной формы GmLOX1 окисляет ос Ala562Gly 9- (д), 13- (е) гидроперокси-МЛГ.

татки арахидоновой и линолевой кислот в составе фосфатидилхолина [Brash et al., 1987, Perez-Gilabert et al., 1998], липоксигеназа огурца окисляет трилиноленин сразу по трем остаткам жирных кислот [Hornung et al., 2000]. Считается, что (9S)-специфичные липоксигеназы - такие как: липоксигеназы томата [Regdel et al., 1994], картофеля [Huang et al., 2008] и ячме ня [Holtman et al., 1997] - не способны окислять сложные липиды, поскольку для них характерна обратная ориентация субстрата.

Нами было показано, что ZmLOX3 и ее мутантная форма Ala562Gly способны катализировать окисление сложных липидов, в частности 1-линоленоил-rac-глицерол (МЛГ) и 2-линолеол-sn-глицеро-3-фосфохолин (лизоФХ). Оба фермента окисляли МЛГ с высокой регио- и стереоспецифичностью (рис. 10). Основным продуктом ре акции являлась (9S)-гидроперекись МЛГ (95,1% и 90% соответственно). Мутантная форма Ala562Gly отличалась незначительным изменением региоспецифичности дей ствия, так как (13R)-гидроперекись образовывалась в количестве примерно в 3 раза большем (9,6%), чем при действии фермента дикого типа (3,1%).

Рис. 11. Анализ продуктов окисления лизоФХ с помощью нормально-фазовой ВЭЖХ при участии ZmLOX3 дикого типа (а) и ее мутантной формы Ala562Gly (б): (9Z,11E)-13-гидроперекись, (9E,11E)-13-гидроперекиси, (10E,12Z)-9 гидроперекись, (10E,12Z)-9-гидроперекись. Анализ энантиомерного состава про дуктов окисления при участии ZmLOX3 (б, в) и ее мутантной формы Ala562Gly (е, д) 9- (в, е), и 13- (б, д) гидроперокси-производных.

Среди продуктов окисления 2-лизоФХ (рис. 11) под действием ZmLOX3 были:

обнаружены (9Z,11E)-13-гидроперекись (45%), (10E,12Z)-9-гидроперекись (28%) и (E,E)-гидроперекиси (27%). Анализ хирально-фазовой ВЭЖХ показал, что 66% 13 гидроперекиси являлось (S)-энантиомером, 9-гидроперекись была представлена раце мической смесью энантиомеров. Продуктами окисления лизоФХ при участии ZmLOX3 Ala562Gly являлись (9Z,11E)-13-гидроперекись (30%), (10E,12Z)-9 гидропере-кись (28%), и (E,E)-гидроперекиси (42%). Энантиомерный анализ показал, что 66,6% (10E,12Z)-9-гидроперекиси составлял (S)-изомер, остальные продукты ре акции были представлены рацемической смесью энантиомеров. Образование (E,E) гидроперекисей свидетельствовало об освобождении субстрата в виде радикала из ак тивного центра липоксигеназы до момента присоединения кислорода. Подобное яв ление наблюдалось при окислении линолевой кислоты липоксигеназой-1 кукурузы [Jang et al., 2007].

Таким образом, нами впервые было показано, что ZmLOX3 дикого типа и ее му тантная форма Ala562Gly способны катализировать диоксигенирование сложных ли пидов. Полученные данные свидетельствовали о вхождении субстрата в активный центр фермента исключительно метильным концом. Мутация Ala562Gly приводила к незначительному увеличению количества (13R)-гидроперекиси МЛГ (до 9,6%). При этом происходило удаление 11-pro-R водорода от прохирального центра субстрата как в случае окисления линолевой, гекадекадиеновой и гексадекатриеновой кислот при участии ZmLOX3 дикого типа, так и при окислении линолевой кислоты мутант ной формой Ala562Gly. При окислении лизоФХ ферментом ZmLOX3 дикого типа предпочтительно удалялся 11-pro-S водород с образованием (13S)-гидроперекиси в качестве преобладающего продукта. При окислении лизоФХ при участии мутантной формы Ala562Gly наиболее вероятно удаление 11-pro-R водорода с образованием преобладающего продукта (9S)-гидроперекиси. Удаление pro-R и pro-S водорода от прохирального центра возможно при ориентации субстрата в активном центре «ме тильным концом вперед».

2.9. Модели позиционирования жирных кислот в активном центре липок сигеназ В настоящее время опубликованы данные рентгеноструктурного анализа от дельных липоксигеназ растений. Однако данные о структуре комплекса липоксигена зы и субстрата до настоящего времени не были получены. Вопрос о позиционирова нии субстрата в активном центре и участвующих в этом аминокислотных остатках является важным для выяснения специфичности действия липоксигеназ. В связи с этим, было проведено моделирование взаимодействия субстрата и активного центра для (8R)-липоксигеназы ((8R)-ЛОГ, MMDB ID: 76073), GmLOX1 (MMDB ID: 57726) и ZmLOX3 (рис. 12). Согласно модели активного центра «U»-образной формы, предло женной для (8R)-липоксигеназы коралла [Neau et al., 2008], липоксигеназы имеют две полости, соединяющиеся у атома железа. В случае GmLOX1 и ZmLOX3 полости об разованы консервативными аминокислотными остатками. По сравнению с (8R)-ЛОГ внутренний объем полости GmLOX-1 и ZmLOX3 меньше за счет замен Leu539Ile, Ala540Gly, Ala503Leu. Позиционирование субстрата в активном центре (8R)-ЛОГ происходит благодаря заякориванию карбоксильной группы на поверхности фермен та аргинином 183. Однако у GmLOX1 и ZmLOX3 гомолог Arg183 заменен на Gly и Ser272, соответственно (рис. 12). Консервативный для растительных липоксигеназ аминокислотный остаток Trp498 перекрывает доступ к полости II U-образного карма на. Таким образом, предложенная модель U-образного кармана для GmLOX-1 проти воречит данным рентгеноструктурного анализа липоксигеназ растений.

Построенные нами модели позиционирования субстрата для GmLOX1 и ZmLOX3 также существенно различаются. Так, для GmLOX1 характерны два способа позиционирования субстратов в активном центре. В первом случае карбоксильный конец жирной кислоты заякоривается с помощью водородных связей за Trp259, али фатическая часть располагается в полости I и II. Во втором случае алифатическая часть располагается в полости II и частично I, карбоксильная группа располагается в полости III, не задействованной у (8R)-ЛОГ. Такое положение субстрата характерно для сложных липидов и 20:2, 22:2, 20:4 жирных кислот. В случае свободной жирной кислоты возможно образование водородных связей с Ser567 и Gln495. Так как ранее было показано, что сложные липиды окисляются при участии GmLOX1 с сохранени ем специфичности, можно предположить, что конформация активного центра изме няется при взаимодействии с такими субстратами. Изменение конформации активно го центра возможно и при аллостерической регуляции, однако в данной работе обна ружить аллостерический сайт связывания со слож ным липидом не удалось.

Для ZmLOX3 харак терен значительно мень ший объем субстрат связывающего кармана за счет боковых групп Ile и Ser, перегораживающих полость I. С другой сто роны полость ограничена приподнятым по сравне нию с положением в GmLOX1 атомом железа.

Полость II перекрыта Phe571 (соответствует Ile551 в GmLOX1). Боко Рис. 12. Модели позиционирования субстрата в полости вые группы аминокислот активного центра липоксигеназ. а – «U»-образная мо дна полости III смещены дель (8R)-ЛОГ коралла, б –ZmLOX3, в – GmLOX1 при таким образом, что суб- взаимодействии с субстратами C20, г – GmLOX1 при страт располагается бли- взаимодействии с субстратами C20 и сложными липи дами. Римскими цифрами обозначены соответствующие же к атому железа. Таким полости ферментов.

образом, благодаря зна чительно меньшему внутреннему объему, позиционирование субстрата крайне важно для определения каталитических характеристик ZmLOX3.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Благодаря прогрессу в области молекулярной биологии определены аминокис лотные последовательности множества липоксигеназ, а также условия экспрессии их генов в растениях. В то же время, работы по клонированию генов липоксигеназ рас тений в большинстве случаев завершаются лишь поверхностной характеристикой свойств рекомбинантного белка. Остаются неизученными субстратные предпочтения, регио- и стереоспецифичность действия, что препятствует выяснению общих законо мерностей 9- и 13-липоксигеназных путей. В результате экспериментов с жирными кислотами, имеющими разную длину углеродной цепи (16:2, 18:2, 20:2, 22:2), выяс нено, что для ZmLOX3 определяющим фактором является расстояние от карбоксиль ного конца субстрата до центра пентадиенильного основания. Так, высокие скорость реакции и специфичность липоксигеназы сохраняются в случае, если указанное это расстояние соответствует характерному для линолевой кислоты расстоянию, как на блюдается в случае гексадекадиеновой кислоты. Такое соответствие можно объяснить необходимостью заякоривания карбоксильной группы субстрата на поверхности фермента. Нарушение регио- и стереоспецифичности диоксигенирования 20:2 и 22: может быть связано с неправильным позиционированием субстрата в активном цен тре фермента. Однако в настоящей работе показано сохранение специфичности дей ствия по (n-2) типу фермента GmLOX1 при использовании различных субстратов.

Полученные экспериментальные данные согласуются с построенной нами моделью позиционирования субстрата в активном центре фермента, согласно которой распо ложение пентадиенильного основания может определяться лимитированным объемом субстрат-связывающего центра данного фермента. В связи с этим, окисление субстра тов с удлиненной цепью оказывается затрудненным, что проявляется в снижении скорости, но не специфичности реакции.

Рис. 13. Схема липоксигеназных реакций, катализируемых при участии ZmLOX3 и ее мутантной формы Ala562Gly.

Ранее сообщалось, что замена одного аминокислотного остатка в сайте Коффа приводила к смене регио- и стереоспецифичности действия 13-специфичных липок сигеназ [Coffa, Brash, 2004]. Нами показано, что мутация Ala562Gly 9-специфичной липоксигеназы ZmLOX3 лишь частично изменяет региоспецифичность фермента.

Также получены данные о возможности окисления 9-специфичными липоксигеназа ми сложных липидов. Таким образом, результаты нашего исследования указывают на ограниченность теории специфичности липоксигеназ, связанной с ориентацией суб страта в активном центре и необходимость разработки новой модели, основанной на признании того, что субстрат поступает в активный центр только метильным концом.

Выявленные нами пути метаболизма липидов, катализируемые ZmLOX3, пред ставлены ны на рис. 13. Значительные каталитические возможности фермента пред полагают разнообразие его физиологических функций. Если такие субстраты как 20:2, 22:2, 20:4 не встречаются в растениях, или встречаются в крайне малых количе ствах, то жирные кислоты гексадеканового ряда могут составлять до 20% от общей массы жирных кислот в 16:3 растениях [Mongrand et al., 2005]. Нами в экспериментах in vitro впервые показано, что ZmLOX3 стерео- и региоспецифически катализирует превращение гексадекатриеновой кислоты с образованием (7S)-гидроперекиси.

7-Гидроперекись гексадекатриеновой кислоты обнаружена в 16:3 растениях, и в 18:3 растениях. Присутствие данного оксилипина в 18:3 растениях можно объяснить результатом либо -окислением 9-гидроперекиси 18:3, либо -окислением 18:3 до 16:3 и последующим образованием гидроперекиси с помощью 9-специфичной липок сигеназы. Однако, гидроперекиси жирных кислот с более короткой цепью, которые присутствовали бы в случае -окисления 9-гидроперекиси 18:3, наряду с 7 гидроперекисью 16:3, обнаружены не были. Возможно, образование 7-гидроперекиси 16:3 для растений не является случайным, и физиологическая роль данного оксили пина еще не выявлена. Согласно полученным результатам, 7-гидроперекись 16:3 мо жет использоваться другими ферментами липоксигеназного каскада в качестве суб страта для последующих реакций. (9S)-Специфичная дивинилэфирсинтаза табака преобразует 7-гидроперекись 16:3 in vitro в новый оксилипин – динор-колнеленовую кислоту. Алленоксидсинтаза кукурузы преобразует 7-гидроперекись 16:3 in vitro в кетол – 7-гидрокси-8-оксо-10(Z),12(Z)-гексадекадиеновую кислоту. Полученные ре зультаты предполагают возможность участия 7-гидроперекиси гексадекатриеновой кислоты в липоксигеназном каскаде в растениях. Также показано, что GmLOX1 мо жет использовать в качестве субстрата 16:3, образуя 11-гидроперекись, участвующую в липоксигеназном каскаде. Использование в качестве субстрата гексадекатриеновой кислоты липоксигеназами, принадлежащими к филогенетически отдаленным группам и с различающимися по специфичности действия, предполагает существование еще не известной физиологической роли этих новых оксилипинов. Полученные результа ты открывают новые возможности исследования гексадеканоидного липоксигеназно го пути и механизмов регуляции специфичности действия липоксигеназ.

ВЫВОДЫ 1. Получен препарат очищенной рекомбинантной липоксигеназы (ZmLOX3) ку курузы. Преобладающим продуктом окисления линолевой кислоты при участии ZmLOX3 является (9S)-гидроперекись линолевой кислоты.

2. Специфичность действия ZmLOX3 сохраняется при окислении субстратов с укороченной цепью, но теряется при окислении субстратов с удлиненной углеродной цепью.

3. ZmLOX3 и соевая липоксигеназа-1 (GmLOX1) специфически окисляют (7Z,10Z,13Z)-гексадекатриеновую кислоту с образованием (7S)-гидроперекиси и (11S)-гидроперекиси, соответственно. Впервые обнаружено, что гидроксипроизвод ные кислот гексадеканового ряда содержатся в некоторых растениях.

4. Впервые показано участие (7S)-гидроперекиси гексадекатриеновой кислоты в липоксигеназном каскаде растений. При участии дивинилэфирсинтазы табака и алле ноксидсинтазы кукурузы (7S)-гидроперекись превращается в дивиниловый эфир (ди нор-колнеленовую кислоту) и -кетол, соответственно.

5. Показано, что ZmLOX3 катализирует специфическое окисление 1-линоленоил глицерола и 2-линолеол-глицеро-3-фосфохолина, что свидетельствует о проникнове нии субстрата в активный центр метильным концом вперед.

6. Получена мутантная форма ZmLOX3 Ala562Gly, которая при окислении лино левой кислоты и 1-линоленоил-глицерола проявляет измененную специфичность дей ствия, образуя (13R)-гидроперекиси наряду с обычными для фермента дикого типа (9S)-гидроперекисями. Таким образом, даже минимальные изменения объема полости активного центра приводят к изменению специфичности действия ZmLOX3.

7. Создана модель трехмерной структуры ZmLOX3, а также модели взаимодей ствия субстратов (жирные кислоты, сложные липиды) с активным центром, объяс няющие специфичность действия фермента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Properties of mutant forms of maize recombinant 9-lipoxygenase protein / E.V. Osi pova, I.R.Chechetkin, A.Yu. Yarin, F.K. Mukhitova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Ab stracts / Изд-во КГУ. – Kazan, 2008. - P. 61.

2. Recombinant enzymes: applications in studies of the plant lipoxygenase cascade / Yu.V. Gogolev, E.V. Osipova, Ya.Yu Toporkova, A.N. Grechkin // Abstracts / Изд-во КГУ. – Kazan, 2008. – P. 19.

3. Изменение специфичности мутантной 9-липоксигеназы кукурузы при сайт направленном мутагенезе / Е.В. Осипова, И.Р. Чечеткин, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гого лев, А.Н. Гречкин / Сб. тезисов / Казань, 2008. - C. 97-98.

4. Образование новых оксилипинов в 16:3 растениях / Е.В. Осипова, Н.В. Ланцо ва, Ф.К. Мухитова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин// Сб. тезисов / Изд-во Пущинского НЦ РАН. - Пущино, 2008. - С. 99.

5. Изменение специфичности мутанта рекомбинантного белка 9-липоксигеназы кукурузы / Е.В. Осипова, И.Р. Чечеткин, Ф.К. Мухитова, А.Ю. Ярин, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Сб. тезисов / Изд-во Пущинского НЦ РАН. - Пущино, 2008. - С. 99 100.

6. Специфичность действия некоторых мутантных форм 9-липоксигеназы кукуру зы / Е.В. Осипова, И.Р. Чечеткин, А.Ю. Ярин, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гоголев, А.Н.

Гречкин // Сб. тезисов / Изд-во КГУ. Казань, 2008. - С. 72-75.

7. Осипова, Е.В., Изменение региоспецифичности 9-липоксигеназы кукурузы при сайт-направленном мутагенезе / Е.В. Осипова, Ю.В. Гоголев А.Н. Гречкин // Сб.

тезисов / Москва, Пущино, 2008. - С. 165-166.

8. Получение и свойства рекомбинантного белка 9-липоксигеназы кукурузы и его мутантной формы / Е.В. Осипова, И.Р. Чечеткин, А.Ю. Ярин, Ф.К. Мухитова, Ю.В.

Гоголев, А.Н. Гречкин // Сб. тезисов / Изд-во Арта. - Новосибирск, 2008. - С. 9. Specifity of maize 9-lipoxygenase / L. Coronel, E.V. Osipova, N.B. Tarasova, I.R.

Chechetkin, N.V. Lancova, F.K. Muhitova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Abstracts / Изд-во КГУ. - Kazan, 2009. - Р. 45.

10. Специфичность 9-липоксигеназы кукурузы / Л.К. Коронель, Е.В. Осипова, Н.Б. Тарасова, И.Р. Чечеткин, Н.В. Ланцова, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гоголев, А.Н.

Гречкин // Сб. тезисов / РИО ПГУ. - Пермь, 2009. - С. 215-216.

11. Специфичность 9-липоксигеназы / Е.В. Осипова, Н.В. Ланцова, Н.Б. Тарасова, Ф.К. Мухитова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин / Сб. тезисов // Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. - Казань, 2009. - С. 348.

12. Особенности специфичности 9-липоксигеназы кукурузы / Л.К. Коронель, Е.В.

Осипова, Н.Б. Тарасова, И.Р. Чечеткин, Н.В. Ланцова, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин //Сб. тезисов / Изд-во Пущинского НЦ РАН. - Пущино, 2009. - С. 25.

13. Специфичность окисления гомологов линолевой кислоты липоксигеназами растений / И.Р. Чечеткин, Е.В. Осипова, Н.Б. Тарасова, Ф.К. Мухитова, М. Хамберг, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин / Биохимия. – 2009. – Т.74. - С. 1052 – 1059.

14. Гексадеканоидный путь в растениях: диоксигенирование (7Z,10Z,13Z) гексадекатриеновой кислоты липоксигеназами / Е.В. Осипова, Н.В. Ланцова, И.Р.

Чечеткин, Ф.К. Мухитова, М. Хамберг, А.Н. Гречкин // Биохимия. – 2010. – Т.75. – Вып. 6. С. 796-806.

15. Рекомбинантная 9-липоксигеназа кукурузы: экспрессия, очистка, свойства / Е.В. Осипова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. Гоголев, Н.Б. Тарасова // Биохимия. – 2010. – Т.75. – Вып. 7. С. 978-983.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.