авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Физиологические характеристики суспензионных культур клеток polyscias filicifolia, panax japonicus и dioscorea deltoidea при мас штабировании процесса выращивания.

На правах рукописи

Титова Мария Владимировна Физиологические характеристики суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при мас штабировании процесса выращивания.

03.01.05 – физиология и биохимия растений 03.01.06 – биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в лаборатории физиологии культивируемых клеток Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им.

К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

Научный консультант:

доктор биологических наук, Носов Александр Михайлович профессор

Официальные оппоненты:

Лобакова Елена Сергеевна, доктор биологических наук, профессор кафедра биоинженерии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, Москва, профессор.

Цоглин Лев Наумович, доктор биологических наук лаборатория управляемого фотобиосинтеза Федерального государственного бюджет ного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Россий ской академии наук, Москва, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

ОАО «БИОХИММАШ» Институт прикладной биохимии и машиностроения, Москва

Защита состоится 23 апреля 2013 г. в 13 часов на заседании Совета по защите диссер таций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 002.210.01 по специальностям 03.01.05 – “Физиология и биохимия растений” и 03.01.06 – «Биотехнология» (Биологические науки) при Федеральном го сударственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им.

К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаниче ская, 35. Факс: (495) 977 8018, электронная почта:

m-azarkovich@ippras.ru;

ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук.

Автореферат разослан «22» марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Азаркович Марина Ивановна Актуальность проблемы. Культура клеток высших растений – это экспери ментально созданная популяция соматических клеток, нуждающаяся в тщательней шем изучении. Помимо теоретического интереса к исследованию поведения расти тельных клеток вне организма, культура клеток имеет прямое практическое значение.

Известно, что в настоящее время значительное количество лекарственных препаратов создаются на базе растительного сырья. Между тем возможности их получения силь но ограничены сокращающимися ресурсами дикорастущих растений. В связи с этим культуры клеток лекарственных растений представляют собой перспективный источ ник биологически активных веществ для нужд косметической, фармацевтической и пищевой промышленности. (Ramachandra et al., 2002;

Bourgaud et al., 2001;

Collin et al., 2001) Однако успешных примеров масштабного промышленного использования клеток высших растений in vitro немного. Это связано, прежде всего, с трудностью получения штаммов-продуцентов, трудоемкостью работ по оптимизации их выращи вания и, наконец, сложностью масштабирования процессов культивирования. Кроме того, известно, что культуры клеток высших растений часто характеризуются неста бильностью процессов роста и синтеза целевых вторичных метаболитов при длитель ном выращивании. Для решения этих проблем и создания эффективных биотехноло гий на основе растительных клеток in vitro необходим комплекс как фундаменталь ных, так и прикладных работ, в том числе исследование общих закономерностей рос та, первичного и вторичного метаболизма клеток растений in vitro;

особенностей вы ращивания в различных системах культивирования;

создание оптимальных схем про мышленного выращивания. (Verpoorte et al., 2002) Тем не менее, подобное комплексное изучение культур клеток – продуцентов биологически-активных веществ с учетом как продуктивности и индивидуальных фи зиологических особенностей клеток in vitro, так и технологических характеристик ис пользуемого оборудования до сих пор не получило широкого распространения.

Большой интерес с практической точки зрения представляют работы по иссле дованию культур клеток лекарственных растений, синтезирующих тритерпеноиды с высокой биологической активностью - женьшеня Рanax japonicus (продуцент гинзе нозидов), полисциаса Рolyscias filicifolia (комплекс биологически-активных соедине ний, в том числе тритерпеновых гликозидов на основе олеаноловой кислоты) и дио скореи Dioscorea deltoidea (продуцент фуростаноловых гликозидов). Как было пока зано многочисленными исследованиями, суспензионные культуры клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea обладают достаточно высокими росто выми и биосинтетическими характеристиками для проведения исследований по изу чению возможностей аппаратного выращивания для рентабельного получения кле точной биомассы. (Липский и др., 1985;

Орешников и др., 1994;

Клюшин и др., 2000) В связи с этим комплексный анализ изменения их физиологических показателей при масштабировании процесса культивирования с учетом технологических ограничений, обусловленных особенностями аппаратурного оформления, представляется актуаль ной фундаментальной и прикладной задачей.

Цель работы. Исследовать особенности физиологических характеристик сус пензионных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea при длительном выращивании в различных системах (колбах и биореакторах различ ного типа), провести масштабирование процесса выращивания и отработать эффек тивную технологию получения клеточной биомассы в аппаратах полупромышленного объема (630 л).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

Охарактеризовать по физиологическим показателям суспензионные культуры 1.

клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea при стандарт ных условиях выращивания (в колбах) Провести сравнительное исследование физиологических и продукционных (по 2.

биомассе и целевым продуктам вторичного метаболизма) характеристик сус пензионных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea при периодическом и полупроточном режимах выращивания в биоре акторах различного типа и объема.

Исследовать возможность длительного непрерывного аппаратурного выращи 3.

вания суспензионных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea при сохранении максимальной продуктивности по клеточ ной биомассе и целевым продуктам вторичного метаболизма.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование ростовых и биосинтетических характеристик суспензионных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea при полупроточном выращивании в биореакто рах различного типа и объема. Показано влияние характеристик биореакторов (интен сивность аэрации и перемешивания, конструктивных особенностей) на физиологиче ские показатели штаммов-продуцентов. Впервые осуществлено длительное непре рывное полупроточное выращивание суспензионных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea в полупромышленных аппаратах при сохранении продуктивности по клеточной биомассе и синтезируемым вторичным ме таболитам. Показана воспроизводимость основных ростовых и биосинтетических ха рактеристик при использовании предлагаемой схемы масштабирования процесса культивирования.

Практическая значимость работы. Отработанная в результате проведенных исследований технология является основой создания технологических регламентов получения биомассы культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea глубинным способом в пилотных и промышленных установках. Основные ростовые и физиологические показатели исследованных штаммов, полученные при выращивании в различных системах культивирования, не уступают мировым анало гам разработанных технологий получения биомассы культур клеток высших расте ний. Полученная в результате проведенных работ биомасса клеток была использована НПК «Биофармтокс» (Санкт-Петербург) при производстве пищевых добавок, обла дающих тонизирующими и адаптогенными свойствами.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на VIII и IХ Международных конференциях «Биология растительных клеток in vitro и биотех нология» (Саратов, 2003;

Звенигород, 2008), Международной конференции 1st Work shop on Molecular Biotechnology / XV Biotechnology Summer School (Gdansk, Poland, 2009), Международной конференции «Перспективы фитобиотехнологии для улучше ния качества жизни на севере» (Якутск, 2010) Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 19 пе чатных работ в отечественных и зарубежных научных журналах, материалах конфе ренций и научных сборниках (в том числе 7 в журналах ВАК), а также получено 2 ав торских свидетельства.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 15 таблиц. Список ци тируемой литературы включает 210 наименований.

Автор выражает особую благодарность за помощь в проведении аппаратного культивирования сотрудникам Отдела Шумило Николаю Анатольевичу и к.б.н.

Орешникову Александру Викторовичу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве объектов исследования использовали следующие суспензионные культуры клеток, депонированные в ВККК ВР ИФР РАН: Dioscorea deltoidea Wall штамм ИФР ДМ-05 – сверхпродуцент фуростаноловых гликозидов (коллекционный № 6);

Polyscias filicifolia Bailey - штамм BFT-001-95 (коллекционный № 58);

Panax japonicus C. A. Mey. var. repens Maxim - штамм-продуцент гинзенозидов (коллекци онный № 62). Культуры выращивали на модифицированных питательных средах с минеральной основой по Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962) и с добавлением источников углеводов, витаминов и регуляторов роста (в соответствии с коллекцион ными паспортами).

Культивирование проводили в колбах и в биореакторах. Культивирование в колбах на круговой качалке осуществляли в темноте при температуре 26-27°С, влажности 70-75 % и частоте оборотов 95-100 об/мин. Для аппаратного выращивания использовали биореакторы 3-х типов: 1) барботажный ферментер (разработка Отдела биологии клетки и биотехнологии РАН);

точечное аэрирующее устройство;

общий объем 20 л;

рабочий объем 15 л.;

2) аппарат с барботажем и механическим перемеши ванием (фирма "Electrolux", Швеция);

общий объем 75 л;

рабочий объем 50 л;

точеч ное аэрирующее устройство;

тип перемешивающего устройства "морской винт";

3) барботажный аппарат (1Т, ОКБА, Йошкар-Ола);

кольцевое аэрирующее устройст во;

общий объем 630 л;

рабочий объем 550 л. В зависимости от типа биореактора и фазы ростового цикла расход воздуха на барботаж составлял 0,1-1,0 л/л/мин. Концен трацию растворенного кислорода рО2 поддерживали на уровне 10-30% от насыщения при отсутствии интенсивного пенообразования.

Для характеристики роста и физиологического состояния культур использовали сухую и сырую массы клеток, степень агрегированности культур, жизнеспособность и концентрацию клеток, которые определяли по общепринятым методикам. (Бутенко, 1964;

Носов, 2008) По первичным результатам, характеризующим рост культуры, рас считывали индекс роста I, удельную скорость роста в экспоненте, время удвоения T, продуктивность по сухой биомассе Р. (Носов, 2008) Количественное определение общего содержания фуростаноловых гликозидов в клеточной биомассе проводили спектрофотометрическим методом с использовани ем реактива Эрлиха. (совместно с н.с. Куличенко И.Е.) (Васильева и др., 1987) Количественное содержание и качественный состав гинзенозидов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (совме стно с с.н.с., к.ф.н. Решетняк О.В.). (Решетняк и др., 2008) Определение доли различных путей дыхательного обмена в общем процессе поглощения кислорода клетками исследуемых штаммов производили полярографиче ским методом на полярографической установке с ячейкой открытого типа и электро дом Кларка с применением ингибиторного анализа. (Kapulnik et al., 1992) Для оценки коэффициента массопередачи по кислороду (КLа) в бесклеточной среде использовали оригинальную методику, примененную ранее для оценки массо передачи при выращивании культур клеток животных, и адаптированную в дальней шем для культур растительных клеток. (Алеева и др., 1977;

Данилов, Зайцева и др., 1981) Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам (Рокицкий, 1964). На графиках и в таблицах представлены средние арифметические значения из 3 биологических повторностей (по 3 колбы или по 3 фиксированных объ ема клеточной суспензии (при отборе проб из биореакторов) на точку) для каждого срока, пассажа и варианта культивирования. Стандартные отклонения менее 10% от величин средних значений на графиках не отображали.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Изучение ростовых и биосинтетических характеристик суспензион 1.

ных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea при выращивании в колбах в стандартных условиях. Для разработки успешной тех нологии аппаратного культивирования необходимо знать особенности физиологии используемых культур клеток. В связи с этим на первом этапе работы проводили изучение ростовых и биосинтетических характеристик исследуемых штаммов поли сциаса папортниколистного, женьшеня японского и диоскореи дельтовидной при стандартном периодическом выращивании в колбах на качалке. Данный способ вы ращивания является основным для поддержания суспензионных культур раститель ных клеток в лабораторных коллекциях, и физиологические показатели штаммов, по лученные в процессе такого культивирования, обычно принимают в качестве кон трольных.

Для всех штаммов были исследованы ростовые характеристики и построены кривые роста по всем изученным параметрам (сырой и сухой массе и числу клеток) (рис.1). Рассчитанные по полученным данным основные ростовые показатели пред ставлены в табл.1. Проведенный комплексный анализ полученных результатов позво лил выявить характерные физиологические особенности исследуемых культур кле ток.

Все штаммы были представлены двумя типами клеток – меристемоидными и паренхимоподобными. Причем число последних увеличивалось к концу стационарной фазы цикла субкультивирования у всех вариантов. Для суспензионной культуры кле ток P.filicifolia отмечено присутствие незначительного количества клеток удлиненной изогнутой формы, что, по-видимому, является специфической особенностью данного штамма (Клюшин и др., 2000) По степени агрегированности клеток в суспензии отличаются от остальных штамм D.deltoidea: он является относительно мелкоагрегированным – более 80 % аг регатов в суспензии составляют кластеры, состоящие из 10 – 50 клеток. Штаммы Рolyscias filicifolia и Рanax japonicus крупноагрегированные – более 50% приходится на агрегаты, размером 50 клеток. Количество жизнеспособных единичных клеток и мелких агрегатов (до 5 клеток) незначительно для всех вариантов.

Для исследуемых культур (при контрольной начальной плотности посадки около 1.5-2.0 г/л по сухой биомассе клеток и жизнеспособности около 88-92 %) цикл субкультивирования при определении ростовых характеристик составлял 21-22 суток, продолжительность лаг-фазы роста находилась в пределах 3 – 5 суток, фазы экспо ненциального роста – 7 – 9 суток. Характерная особенность роста штамма культуры клеток D.deltoidea - короткая фаза стационара (около 2-3 суток), что является специ фическим признаком этой культуры клеток. (Носов, 1992) Стационарная фаза для культур клеток P.filicifolia и P.japonicus наступала довольно поздно (на 16–18-е су тки), в течение эксперимента для этих штаммов фазу деградации зафиксировать не удалось.

Рolyscias filicifolia Dioscorea deltoidea Рanax japonicus Рис. 1. Динамика роста суспензионных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea в полулогарифмической системе коор динат при стандартном выращивании в колбах объемом 250 мл Таблица 1. Ростовые характеристики суспензионных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea Культура Mmax_dw, г/л µ dw, сут- v, % I dw 9.31 - 10.81 89 - 95 0.15 – 0.20 4.75 – 6. Dioscorea deltoidea Рolyscias filicifolia 11.60 - 12.80 96 - 98 0.15 – 0.22 5.53 – 7. Рanax japonicus 7.56 - 8.78 92 - 97 0.11 – 0.17 3.63 – 4. где Mmax_dw – максимальное значение концентрации биомассы клеток по сухому весу;

v – жизнеспособность клеток;

µ - удельная скорость роста;

I – индекс роста.

Как следует из представленных результатов, исследуемые штаммы обладают достаточно высокими характеристиками роста (табл.1). Наиболее высокие ростовые показатели наблюдали для суспензионной культуры Рolyscias filicifolia, для которой были получены максимальные значения Mmax_dw, µ и I. (12.80 г/л, 0.22 сут-1 и 7.20 со ответственно).

Отмечена характерная для культур растительных клеток несбалансированность роста по различным критериям, связанная с растяжением клеток в заключительные стадии ростового цикла (по сырой массе) и частичной синхронизацией деления клеток (по числу клеток).

Известно, что измерение общей скорости поглощения кислорода является ин формативным методом контроля метаболической активности растительных клеток in vitro при культивировании в колбах или биореакторах и может адекватно отражать их реакцию на изменение условий выращивания. Также представляет интерес сравнение доли цианидрезистентного дыхания (активности альтернативной оксидазы, АО) для штаммов культур клеток высших растений, принадлежащих к разным видам, отли чающихся механизмами адаптации к стрессовым условиям и по классам синтезируе мых вторичных метаболитов.

На рис.2 представлены результаты измерений интенсивности дыхания иссле дуемых культур в течение ростового цикла при стандартном культивировании в кол бах. Все исследуемые штаммы суспензионных культур растительных клеток отлича лись по общей скорости поглощения кислорода. Наиболее высокий уровень дыха тельной активности был получен для клеток Dioscorea deltoidea и Рanax japonicus – на протяжении всего цикла роста общая интенсивность дыхания этих культур продуцентов была в 3-4 раза выше, чем у Polyscias filicifolia. Также отмечены разли чия в динамике изменения общей скорости поглощения кислорода для разных штам мов по фазам ростового цикла. Максимальные значения для Dioscorea deltoidea. на блюдали в лаг фазе (161.75±19.19 мгО2/ч*г сухой массы) с постепенным снижением общей интенсивности дыхания в последующие фазы роста. Для штамма Polyscias filicifolia в лаг-фазе и экспоненциальной фазе общая скорость поглощения кислорода изменялась незначительно, однако в фазе стационара отмечено повышение дыхатель ной активности – до 52.43±1.46 мгО2/ч*г сухой массы. Максимальная интенсивность дыхания для штамма Рanax japonicus показана в экспоненциальной и стационарных фазах роста – до 153.59+9.81 мгО2/ч*г сухой массы. У исследуемых штаммов также различен вклад альтернативного пути дыхания в общее поглощение кислорода. Дыха тельная активность клеток Dioscorea deltoidea на протяжении ростового цикла была обеспечена в основном митохондриальным дыханием, максимальное участие АО на блюдали в экспоненциальной фазе роста (до 35 %). Для культуры клеток Polyscias filicifolia высокая активность АО сохранялась в течение всего цикла выращивания (не ниже 43%) и достигала максимальных значений в экспоненциальной фазе (до 52 %).

Для Рanax japonicus активность АО была максимальна в лаг фазе и постепенно сни жалась в процессе последующего роста (от 49 до 21 %).

А. Б.

Рис. 2. Общая интенсивность дыхания (А) и вклад АО (Б) на разных стадиях роста культур клеток Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia и Рanax japonicus (выращива ние в колбах).

Важнейшей характеристикой штаммов-продуцентов является содержание в клеточной биомассе целевых продуктов вторичного метаболизма. В связи с этим для культур клеток Dioscorea deltoidea и Рanax japonicus была изучена динамика накопле ния вторичных метаболитов (фуростаноловых гликозидов и гинзенозидов соответст венно) в цикле субкультивирования (рис. 3 и 4).

Рис. 3. Динамика накопления фуростаноловых гликозидов в цикле субкультивирования для суспензионной культуры клеток D.deltoidea при стандартном выращивании в колбах объемом 250 мл А. Б.

Рис. 4. Динамика накопления гинзенозидов в цикле субкультивирования для суспензионной культуры клеток Р.japonicus при стандартном выращивании в колбах объемом 250 мл: а – общее содержание гинзенозидов;

б – содержание индивиду альных гинзенозидов.

Для штамма D. deltoidea активный синтез фуростаноловых гликозидов сохра нялся на протяжении всего цикла роста, причем максимум их содержания наблюдали в основном в стационарной фазе роста (12-16 сутки) - до 12.9 % к сухой массе кле ток. (рис. 3) У суспензионной культуры Рanax japonicus наиболее активный синтез приходился на 12-14 сутки и достигал 1.70 % к сухой массе клеток по общему содер жанию гинзенозидов. (рис. 4а) Количественное содержание индивидуальных гинзено зидов представлено на рис. 4б. Показано присутствие основных гинзенозидов дамма ранового ряда - Rb-группы (агликон протопанаксадиол – Rb1, Rc, Rb2, Rd) и Rg группы (агликон протопанаксатриол – Rg1, Re, Rf). Из результатов произведенного анализа следует, что мажорными являются Rg1- и Re-гинзенозиды (до 4.0-4.8 и до 11.3 мг/г абс. сухой массы соответственно), что соответствует данным, полученным для Р.japonicus раннее. (Чайко и др., 1999;

Смоленская и др., 2001) Таким образом, на первом этапе работы суспензионные культуры клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea были охарактеризованы по основным физиологическим параметрам при стандартном периодическом культиви ровании в колбах. Все исследуемые штаммы обладали достаточно высокими росто выми и биосинтетическими показателями для проведения дальнейших экспериментов по аппаратному выращиванию.

2. Изучение физиологических показателей суспензионных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea при выращивании в био реакторах.

При проведении экспериментов по длительному полупромышленному аппара турному выращиванию использовали следующий алгоритм:

- предварительные эксперименты в лабораторном и пилотном биореакторах по выращиванию штаммов в периодическом режиме;

- полупроточное выращивание в лабораторном и пилотном биореакторах (ре жим «отъем суспензии-долив среды»);

- масштабирование выращивания в полупроточном режиме до полупромыш ленного биореактора.

Режимы перемешивания и аэрации суспензионных культур клеток подбирали экспериментально с учетом следующих требований:

- изменение расхода воздуха на аэрацию должно происходить с таким расчетом, что бы концентрация растворенного кислорода (рО2) не опускалась ниже 10-15 %;

- скорость вращения мешалки необходимо сочетать с интенсивностью аэрации таким образом, чтобы в биореакторе отсутствовали застойные зоны.

2.1. Культивирование в периодическом режиме.

Культивирование в лабораторном биореакторе объемом 20 л.

2.1.1.

Проведенные ранее в Отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН работы по казали, что наименьшее стрессовое воздействие на клетки оказывают барботажные ферментеры V-типа, в которых перемешивание осуществляется за счет потока сте рильного воздуха, подаваемого в аппарат под давлением. (Липский, 1992;

Клюшин и др., 2000) Для штаммов Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea было проведено периодическое выращивание в лабораторных барботажных биореакторах (с рабочим объемом 15 л). Для оптимизации плотности инокулюма были выбраны два варианта начальной концентрации клеточных суспензий – 2 г/л и 3 г/л по сухой массе клеток. В процессе культивирования определяли накопление сухой биомассы клеток и изменение жизнеспособности. Полученные в результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Ростовые показатели суспензионных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea при периодическом выращивании в л барботажном биореакторе.

Культура о, г/л Mmax_dw, г/л µ dw, сут- v, % I dw 2 г/л 8.12 80 – 90 4.06 0. Dioscorea 3 г/л deltoidea 8.97 82 – 88 3.00 0. 2 г/л 13.40 88 – 92 6.68 0. Рolyscias 3 г/л filicifolia 15.10 88 – 90 5.03 0. 2 г/л 9.32 90 – 92 4.66 0. Рanax 3 г/л japonicus 8.20 85 – 90 2.73 0. где Mmax_dw – максимальное значение концентрации биомассы по сухому весу;

v – жизнеспособность клеток;

µ - удельная скорость роста клеток;

I – индекс роста;

– начальная концентрация клеточных суспензий по сухой массе клеток.

Общий характер роста исследуемых культур клеток в аппаратах данного ти па при периодическом режиме был сходен с характером их роста в колбах. Установ лено, что увеличение начальной плотности до 3 г/л по сухой массе клеток приводило к увеличению удельной скорости роста у штаммов Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea (на 25, 15 и 10 % соответственно). Однако для клеточной сус пензии Р.japonicus при этом наблюдали снижение жизнеспособности к концу цикла субкультивирования (до 85%) и уровня максимального накопления клеточной био массы (на 10 %).

В целом, как показали полученные результаты, увеличение начальной плотно сти клеточной суспензии при инокуляции 20л биореактора до 3 г/л по сухому весу оп тимально для штаммов D.deltoidea и P.filicifolia, тогда как для штамма Рanax japonicus предпочтительней о 2 г/л.

Культивирование в пилотном биореакторе объемом 75 л.

2.1. При использовании аппарата с механическим перемешивающим устройством, для снижения стрессового механического воздействия на начальных фазах роста ус танавливали минимальную скорость перемешивания порядка 35-40 об/мин (по отсут ствию седиментации клеток). По мере роста культур клеток скорость вращения ме шалки увеличивали до максимально возможной, не приводящей к разрушению клеток – 55-60 об/мин. При увеличении скорости вращения выше 75 об/мин наблюдали бы строе падение жизнеспособности и появление в культуральной среде значительного количества разрушенных клеток. (табл.3). Дальнейшие эксперименты проводили при наиболее щадящих условиях механического перемешивания – при скорости вращения мешалки в пределах 35-50 об/мин.

Таблица 3. Влияние скорости вращения перемешивающего устройства на жиз неспособность исследуемых штаммов при периодическом выращивании в 75л биоре акторе.

скорость вращения перемешивающего устройства, об/мин Культура 35-40 55-60 79 – 83 % 75 – 77 % 70 % D.deltoidea 79 – 84 % 76 – 80 % 70 % P. filicifolia Р. japonicus 79 – 83 % 79 – 81 % 70 % Таблица 4. Ростовые показатели исследуемых штаммов при периодическом выращивании в 75л биореакторе (скорость вращения мешалки 35-50 об/мин).

Культура Mmax_ dw г/л µ dw, сут-1 I dw 8.19 0.08 3. D. deltoidea 11.80 0.10 4. P. filicifolia Р. japonicus 9.05 0.09 3. Обозначения см. Таблицу 1.

В процессе культивирования также определяли накопление сухой биомассы клеток и изменение жизнеспособности. Полученные в результате проведенных экспе риментов ростовые показатели представлены в сводной таблице 4.

Показано, что в сравнении с проведенным ранее периодическим культивирова нием в колбах и барботажных биореакторах при выращивании в аппарате данного ти па происходило значительное снижение ростовых характеристик всех исследуемых штаммов. Наиболее выраженное изменение наблюдали для жизнеспособности и удельной скорости роста – эти показатели снизились в среднем на 15-20 %. Такой ха рактер изменения ростовых параметров обусловлен, по-видимому, повреждающим действием перемешивающего устройства на клетки суспензии (несмотря на выбран ный максимально щадящий режим перемешивания), а также особенностями его кон струкции.

Полученные на данном этапе работ результаты показывают, что ростовые пока затели суспензионных культур клеток Рolyscias filicifolia, Рanax japonicus и Dioscorea deltoidea в значительной степени зависят от условий культивирования, в частности от технических характеристик аппаратов (интенсивности аэрации и перемешивания, конструктивных особенностей), а также, по видимому, обусловлены различной спо собностью к адаптации исследованных клеточных штаммов вследствие цитологиче ских различий.

Культивирование в режиме полупротока (многоцикличная схема).

2.2.

Для реализации «отъемно-доливного» режима культивирования был использо ван ряд аппаратов с рабочим объемом от 15 до 550 литров и различной системой пе ремешивания, причем аппараты меньшего объема использовали как инокуляторы для аппаратов большего объема.

В течение 10 лет для каждого штамма были проведены многократные экспери менты по длительному полупроточному культивированию во всех типах биореакто ров. Процесс «отъем суспензии - долив среды» осуществляли при достижении плот ности суспензии, соответствующей началу фазы замедления роста. Разбавление сре дой в каждом цикле проводили до концентрации биомассы, исключающей появление лаг-фазы (не ниже 2.0-2.5 г/л среды по сухому весу). В процессе культивирования оп ределяли физиологические и продукционные (по биомассе и целевым продуктам) по казатели исследуемых суспензионных культур клеток.

2.2.1. Культивирование в лабораторном биореакторе объемом 20 л. При вы ращивании исследуемых штаммов «отъемно-доливным» способом в 20 л барботаж ном биореакторе общая продолжительность мультициклов варьировала в пределах 60 150 суток, причем каждый мультицикл состоял из 6-14 циклов субкультивирования.

В ряде экспериментов выращивание осуществляли параллельно в 2 – 3 биореакторах.

Полученные типичные кривые роста, а также соответствующие им основные ростовые характеристики приведены на рис.5 и в табл.5. Из представленных резуль татов следует, что ростовые показатели штаммов соответствуют таковым, получен ным раннее при периодическом выращивании в колбах и барботажном биореакторе.

Жизнеспособность клеток сохранялась на уровне 80-90% для всех штаммов, макси мальное накопление сухой биомассы наблюдали на 11-14 день культивирования (до 12 г/л, 15 г/л и 10 г/л по сухой массе клеток для Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia и Рanax japonicus соответственно). (табл.5.) На том же уровне при длительном полу проточном выращивании сохраняется и скорость прироста клеточной биомассы.

Аналогичную картину наблюдали при проведении повторных экспериментов.

Таблица 5. Ростовые показатели суспензионных культур клеток при полупро точном выращивании в 20л барботажном биореакторе.

Культура Mmax_dw, г/л µdw, сут- v, % Idw 8.50 – 12.50 80 – 85 0.11 – 0.13 2.28 – 3. Dioscorea deltoidea 10.00 – 15.12 85 – 90 0.16 – 0.23 6.51 – 7. Polyscias filicifolia Рanax japonicus 8.65 – 10.78 84 – 91 0.12 – 0.14 3.32 – 4. Обозначения см.Таблицу 1.

Dioscorea deltoidea Polyscias filicifolia Рanax japonicus Рис. 5. Динамика роста суспензионных культур клеток при полупроточном вы ращивании в 20 л барботажном биореакторе 2.2.2. Культивирование в пилотном биореакторе объемом 75 л.

При отработке длительного полупроточного культивирования в пилотном 75 л биореакторе для всех штаммов проводили выращивание в режиме «отлива-долива», где каждый мультицикл состоял из 2-4 циклов субкультивирования. Общая продол жительность мультициклов для всех вариантов не превышала 60 суток. Следует отме тить, что получить устойчивый рост штаммов с сохранением продуктивности по биомассе и целевым продуктам вторичного метаболизма в течение более длительного времени в 75л биореакторе не удалось.

Режим аэрации и механического перемешивания соответствовал схеме, отрабо танной при периодическом культивировании в аппарате данного типа.

Полученные основные ростовые характеристики приведены в табл.6.

Таблица 6. Ростовые показатели суспензионных культур клеток при полупро точном выращивании в 75л пилотном биореакторе.

Культура Mmax_dw, г/л µdw, сут- v, % Idw 7.70 – 8.40 74 – 79 0.08 – 0.11 2.11 – 3. Dioscorea deltoidea 10.70 – 12.10 79 – 82 0.12 – 0.14 3.76 – 5. Polyscias filicifolia Рanax japonicus 8.50 – 9.50 80 – 85 0.09 – 0.10 2.62 – 3. Обозначения см. Таблицу 1.

Показано характерное для данного биореактора снижение основных ростовых показателей культур клеток – жизнеспособности и скорости накопления клеточной биомассы (в среднем на 15-20% в сравнении с контрольными). Отмечали появление большого количества разрушенных клеток в среде культивирования, что затрудняло дальнейшее отделение клеток от культуральной жидкости при фильтрации.

2.2.3. Культивирование в полупромышленном барботажном биореакторе объемом 630 л.

Основным этапом исследований были эксперименты по длительному непре рывному полупроточному выращиванию в полупромышленном барботажном биоре акторе с кольцевым барботёром и объёмом 630 литров. Алгоритм культивирования и режимы перемешивания соответствовали отработанным ранее в аппаратах меньшего объема. На рис 6 и в табл.7 представлены полученные динамики роста штаммов, а также основные ростовые показатели.

Dioscorea deltoidea Polyscias filicifolia Рanax japonicus Рис. 6. Динамика роста суспензионных культур клеток при полупроточном вы ращивании в 630 л барботажном биореакторе.

Продемонстрировано, что при переходе к непрерывному длительному вы ращиванию в полупромышленных аппаратах ростовые показатели исследуемых штаммов также сохраняются на достаточно высоком уровне.

Таблица 7. Ростовые показатели суспензионных культур клеток при полупро точном выращивании в 630л барботажном биореакторе Культура Mmax_dw, г/л µdw, сут- v, % Idw 8.87 – 11.13 79 – 86 0.11 – 0.14 2.78 – 3. Dioscorea deltoidea 13.00 – 16.55 85 – 90 0.12 – 0.19 3.21 – 5. Polyscias filicifolia Рanax japonicus 9.85 – 8.60 88 – 92 0.11 – 0.13 2.54 – 3. Обозначения см. Таблицу 1.

2.2.4. Влияние смены системы культивирования на степень агрегированно сти суспензионных культур растительных клеток.

В процессе масштабирования процесса выращивания определяли изменение степени агрегированности клеточных суспензий. Показано, что при переходе к выра щиванию в аппарате с механическим перемешиванием вследствие травматического разрушающего воздействия перемешивающего устройства почти в 2 раза снижается число крупных агрегатов с числом клеток 50 у крупноагрегированных суспензий Рanax japonicus и Polyscias filicifolia, а также уменьшается количество одиночных клеток и мелких агрегатов (от 1 до 10 клеток) для всех штаммов. Напротив, при вы ращивании в 630л барботажном аппарате для всех вариантов отмечено некоторое уве личение степени агрегированности (количество крупных клеточных кластеров увели чивается в среднем на 15-20%).

2.2.5. Влияние смены системы культивирования на дыхательную актив ность суспензионных культур растительных клеток.

При масштабировании аппаратного выращивания культур клеток до промыш ленных объемов важнейшей задачей является мониторинг физиологического состоя ния клеток. В работе была оценена возможность использования в качестве подобного экспресс-теста анализ активности дыхательного метаболизма клеток. Кроме того, по скольку кислород является одним из основных лимитирующих факторов при глубин ном выращивании растительных клеток in vitro, представлялось актуальным изучить влияние массообменных характеристик используемых систем культивирования на дыхательную активность штаммов. Исследования проводили на примере штамма продуцента Dioscorea deltoidea, для которого при полупроточном выращивании в барботажных биореакторах (20 л и 630 л) в экспоненциальной фазе роста измеряли общую скорость поглощения кислорода и долю АО в этом процессе. Полученные ре зультаты представлены на рис. 7.

А.

Б.

Рис. 7. Вклад различных путей дыхания (в % от общей интенсивности, Б) в об щее поглощение кислорода (А) клетками Dioscorea deltoidea Wall. в экспоненциаль ной стадии роста при культивировании в различных системах.

Для каждого биореактора измерения проводили на протяжении 3 циклов суб культивирования, начиная со 2-ого цикла от момента инокуляции. Коэффициенты массопередачи по кислороду (KLa, ч-1) определяли при оптимальных режимах переме шивания и аэрации.

По представленным данным видно, что максимальная доля цианидрезистентно го дыхания наблюдалась при выращивании в 20 л барботажном биореакторе с точеч ным аэрирующим устройством. Для этого же аппарата были получены минимальные значения KLa, а также был отмечен более низкий уровень содержания фуростаноловых гликозидов (см.табл. 8) и более низкая продуктивность по накоплению клеточной биомассы (см.табл. 5). Минимальная активность АО была отмечена для системы с бо лее интенсивным массообменом по кислороду – 630 л барботажного биореактора с кольцевым аэратором. Для этого же биореактора отмечали более высокие ростовые и биосинтетические показатели (см.табл. 8 и 7).

2.2.6. Влияние смены системы культивирования на накопление вторич ных метаболитов у штаммов продуцентов Dioscorea deltoidea и Рanax japonicus.

Для изучения влияния смены условий культивирования на синтез вторичных метабо литов у штаммов-продуцентов проводили исследование изменения содержания фуро станоловых гликозидов и гинзенозидов в биомассе клеток Dioscorea deltoidea и Рanax japonicus соответственно при полупроточном выращивании в биореакторах различно го типа. Полученные результаты представлены в табл. 8 и 9.

В целом динамика накопления целевых метаболитов соответствовала динамике их накопления при стандартном выращивании штаммов-продуцентов в колбах. Мак симальное содержание фуростаноловых гликозидов и гинзенозидов отмечали к концу циклов субкультивирования при достижении соответствующих значений Mmax_dw.

Показано варьирование уровня максимального накопления целевых метаболитов при переходе к длительному аппаратному культивированию по сравнению с результата ми химического анализа, полученными при стандартном выращивании в колбах. При выращивании в 20л биореакторе содержание фуростаноловых гликозидов в биомассе клеток D.deltoidea в среднем не превышало 8.0 % к сухой массе клеток (при 5.6 – 12. % к сухой массе клеток при выращивании в колбах). Для культуры клеток Р.japonicus наблюдали снижение общего содержания гинзенозидов и изменения в соотношении индивидуальных гинзенозидов, в частности – в 2.0 раза снизилось содержание Re гин зенозидов, в 1.5 раза – Rd и Rb2 гинзенозидов, в 2.5-3 раза – Rb1 гинзенозидов.

Таблица 8. Содержание фуростаноловых гликозидов в биомассе клеток Dioscorea deltoidea при полупроточном выращивании в различных системах системах (в % к сухой массе клеток в период максимального накоплении биомассы) 75л биореактор Колбы Параметр 20л биореактор 630л биореактор (контроль) “Electrolux” F max_dw, [% к сухой 3.4 – 4.7 7.7 – 13.9 5.6 – 12. 4.2 – 8. массе клеток] F max_dw – максимальное содержание фуростаноловых гликозидов в биомассе клеток Таблица 9. Содержание индивидуальных гинзенозидов в биомассе клеток Рanax japonicus при полупроточном выращивании в различных системах (в мг/г су хой массы клеток в период максимального накоплении биомассы) 75л биореактор Колбы 20л биореактор 630л биореактор Gi max_dw (контроль) “Electrolux” 0.14 – 0.36 0.16 – 0.27 0.16 – 0.34 0.41 – 1. Rb 0.07 – 0.20 0.19 – 0.24 0.05 – 0.44 0.12 – 0. Rc 0.05 – 0.19 0.05 – 0.13 0.05 – 0.11 0.11 – 0. Rb 0.05 – 0.28 0.08 – 0.10 0.05 – 0.08 0.11 – 0. Rd 0.16 – 0.22 0.22 – 0.31 0.14 – 0.42 0.10 – 0. Rf 2.32 – 4.26 2.33 – 4.84 2.31 – 5.80 2.27 – 4. Rg 2.50 – 4.29 4.00 – 10.20 2.00 – 3.83 6.70 – 8. Re Gi max_dw – максимальное содержание индивидуальных гинзенозидов в биомассе кле ток При культивировании в 75 л аппарате для D.deltoidea наблюдалось снижение уровня содержания фуростаноловых гликозидов в среднем в 2.0-2.5 раза (до 3.4-4.7 % к сухой массе клеток). Для Рanax japonicus не отмечено существенных изменений в содержании гинзенозидов Re, Rc, Rf и Rg1, однако показано уменьшение уровня со держания Rb1 гинзенозидов – в среднем в 2.5-3.0 раза, а также Rd и Rb2 гинзенозидов – в 2.0 раза. Аналогичный эффект для Рanax japonicus наблюдали при масштабирова нии выращивания до 630 л биореактора, однако для клеток D.deltoidea уменьшения уровня накопления фуростаноловых гликозидов в этом аппарате не отмечено.

На основании представленных данных можно предположить, что уменьшение уровня накопления Rb1, Rd и Rb2 гинзенозидов является специфической стрессовой реакцией клеток Рanax japonicus на изменение условий культивирования при перехо де к аппаратному выращиванию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ При масштабировании аппаратного глубинного культивирования растительных клеток, как правило, достаточно сложно точно предсказать адаптационные изменения поведения используемых штаммов, т.к. сложно точно выдержать геометрическое и технологическое подобие используемого оборудования. Мы рассмотрели эту пробле му при помощи поэтапного анализа наиболее существенных физиологических пара метров культур растительных клеток на всех стадиях процесса масштабирования - от колб до биореакторов полупромышленного объема.

Были выявлены характерные отличия исследуемых культур по динамике роста и накопления вторичных метаболитов. Полученные результаты показали, что ото бранные штаммы являются лабильными системами, достаточно чувствительными к смене условий культивирования и претерпевающими определенные перестройки в ре зультате изменений условий выращивания. Представленные данные также позволяют сделать вывод, что дыхательная активность клеток штаммов-продуцентов является информативной характеристикой физиологического состояния культуры и может быть использована для мониторинга и оптимизации роста клеток при масштабиро вании процесса выращивания. При анализе полученных результатов отмечена опре деленная корреляция между изменением интенсивности дыхания и динамикой накоп ления вторичных метаболитов для культур-продуцентов Dioscorea deltoidea и Рanax japonicus – максимальную скорость поглощения кислорода наблюдали перед началом активного синтеза соответствующих вторичных метаболитов. Кроме того, на примере Dioscorea deltoidea показана зависимость активности АО от условий выращивания, в частности - от массообменных характеристик систем культивирования.

Подтверждено, что для проведения длительного аппаратного культивирования штаммов-продуцентов предпочтительной системой является барботажный биореак тор. При использовании аппаратов этого типа (20 л и 630 л биореакторы) для иссле дуемых штаммов наблюдали наиболее высокие ростовые и биосинтетические харак теристики. Выращивание «отъемно-доливным» способом в данном случае в целом было более продуктивно как по выходу клеточной биомассы, так и по целевым про дуктам вторичного метаболизма. Анализ полученных данных также показывает, что для создания наиболее оптимальных условий массообмена и предотвращения лими тирования роста скоростью переноса кислорода в аппаратах различной емкости пред почтительно использовать не точечные, а кольцевые аэраторы. Пилотный аппарат с механическим перемешиванием, для которого были получены более низкие физиоло гические показатели, может быть рекомендован для краткосрочного культивирования в качестве промежуточного звена при переходе к промышленным аппаратам.

Важно отметить воспроизводимость основных ростовых и биосинтетических характеристик для всех выбранных штаммов при переходе к длительному аппаратно му культивированию. Масштабирование выращивания суспензионных культур клеток Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia и Рanax japonicus по представленной схеме с использованием «отъемно-доливного» метода повторяли неоднократно при сохране нии удовлетворительных физиологических показателей штаммов. Эту же схему ус пешно использовали для аппаратного глубинного культивирования клеток высших растений других видов (Stephania glabra, Polyscias fruticosa).

На основе отработанных в результате проведенных работ технологий составле ны проекты опытно-промышленных технологических регламентов получения био массы культур растительных клеток в полупромышленных установках.

ВЫВОДЫ.

Проведено комплексное исследование основных закономерностей роста, а так 1.

же дыхательной и биосинтетической активности суспензионных культур клеток P.

filicifolia, P. japonicus и D. deltoidea при стандартном выращивании в колбах. Все штаммы обладали достаточно высокими физиологическими характеристиками для проведения аппаратного выращивания – жизнеспособность в пределах 90-97%, удель ная скорость роста в среднем в пределах 0,15-0,20 сут.-1, индекс роста в среднем в пределах 4,00-6,00.

Проведено масштабирование и впервые осуществлено длительное (до 8-12 цик 2.

лов субкультивирования) непрерывное выращивание суспензионных культур клеток P. japonicus и D. deltoidea «отъемно-доливным» методом в пилотных и полупромыш ленных аппаратах при сохранении высокой продуктивности штаммов по биомассе клеток и целевым вторичным метаболитам. Показана стабильность и воспроизводи мость основных показателей штаммов при выращивании по предложенной схеме.

Отработана и усовершенствована технология длительного непрерывного выра 3.

щивания суспензионной культуры клеток Polyscias filicifolia «отъемно-доливным» методом в полупромышленных аппаратах объемом 630 л при сохранении высокой продуктивности по клеточной биомассе.

На примере аппаратного культивирования клеток D. deltoidea показана зависи 4.

мость активности цианидрезистентного дыхания от условий выращивания, в частно сти - от массообменных характеристик систем культивирования. Показана возмож ность использования этого показателя для мониторинга физиологического состояния культуры при масштабировании процесса выращивания.

Показано, что предпочтительной системой для длительного непрерывного глу 5.

бинного культивирования клеток Dioscorea deltoidea, Polyscias filicifolia и Рanax japonicus являются барботажные биореакторы с кольцевыми аэраторами – для аппара тов именно этого типа получены наиболее высокие ростовые и биосинтетические по казатели отобранных штаммов.

С использованием трех культур клеток высших растений, относящихся к раз 6.

личным таксономическим группам, показано, что переход к аппаратурному выращи ванию можно проводить по единой технологической схеме с учетом индивидуальных особенностей штаммов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В журналах, рекомендованных ВАК:

Титова М.В., Шумило Н.А., Куличенко И.Е., Коростелев В.В., Орешников А.В., Но сов А.М. (2006) Длительное аппаратурное выращивание суспензионной культуры Dioscorea deltoidea Wall в полупроточном режиме. Биотехнология, № 2, с. 28- Титова М.В., Шумило Н.А., Черняк Н.Д., Кривохарченко А.С., Орешников А.В., Но сов А.М. (2007) Использование криосохранения для поддержания стабильности штамма при аппаратном культивировании суспензии клеток Polyscias filicifolia Bailey:

1.Оценка ростовых характеристик возобновленной культуры. Биотехнология, № 5, с. 60- Титова М.В., Решетняк О.В., Осипова Е.А., Осипьянц А.И., Шумило Н.А., Орешни ков А.В., Носов А.М. (2011) Выращивание суспензионной культуры клеток Stephania glabra (Roxb. ) Miers в различных системах: особенности роста и накопления алка лоида стефарина. Биотехнология, № 4, с. 40- Титова М.В., Беркович Е.А., Решетняк О.В., Куличенко И.Е., Орешников А.В., Носов А.М. (2011) Дыхательная активность суспензионных культур клеток Polyscias filicifoia Bailey, Stephania glabra (Roxb.) Miers и Dioscorea deltoidea Wall. Прикладная биохи мия и микробиология, том 47, № 1, с. 95- Титова М.В., Решетняк О.В., Осипова Е.А., Суханова Е.С., Осипьянц А.И., Шумило Н.А., Орешников А.В., Носов А.М. (2012) Глубинное культивирование клеток Stephania glabra (Roxb) Miers: оптимизация гормонального состава питательных сред.

Вестник Марийского Государственного Технического Университета, № 1 (14), с. 101 Кочкин Д.В., Зайцев Г.П., Качала В.В., Чижов А.О., Демидова Е.В., Титова М.В., Чирва В.Я., Носов А.М., Кузнецов Вл В. (2012) Обнаружение гипенозида XVII в сус пензионной культуре клеток женьшеня Panax japonicus var. repens. Доклады РАН, том 442, с. 705- Суханова Е.С., Кочкин Д.В., Титова М.В., Носов А.М. (2012) Ростовые и биосинте тические характеристики разных штаммов культур клеток растений рода Polyscias.

Вестник ПГТУ, № В прочих изданиях:

Титова М.В., Шумило Н.А., Куличенко И.Е., Орешников А.В., Носов А.М. (2003) Длительное культивирование суспензионной культуры Dioscorea deltoidea Wall в по лупроточном режиме. Сборник тезисов докладов VIII Международной конференции «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология», с. 167- Титова М.В., Коростелев В.В., Орешников А.В., Носов А.М. (2003) Культивирование клеток Polyscias filicifolia Bailey в пилотном аппарате отъемно-доливным методом.

Сборник тезисов докладов VIII Международной конференции «Биология раститель ных клеток in vitro и биотехнология», с. 317- Tomczyk A., Kropczynska D., Ptak A., Titova M.V., Shumilo N., Oreshnikov A., Nosov A., Furmanova M. (2007) Effect of Polyscias filicifolia extracts on the behavior of the Liaf minor Camereria ohridella Deschka and Dimic on horse chestnut trees. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, том 49, № 1, с. 50- Титова М.В., Шумило Н.Ан, Куличенко И.Е., Беркович Е.А., Орешников А.В., Носов А.М. (2008) Аппаратное культивирование суспензионной культуры Dioscorea deltoidea Wall. Сборник тезисов докладов Материалы IX конференции «Биология кле ток растений in vitro и биотехнология», 8-12 сентября 2008 г., Звенигород, Россия, с. 400- Демидова Е.В., Решетняк О.В., Орешников А.В., Титова М.В., Шумило Н.А., Носов А.М. (2008) Выращивание суспензионной культуры клеток Panax japonicus var.repens с использованием сахарозы разной степени очистки в аппарате полупромышленного объема. Сборник тезисов докладов Материалы IX конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», 8-12 сентября 2008 г., Звенигород, Россия, с. 106 Решетняк О.В., Титова М.В., Осипова Е.А., Шумило Н.Ан, Коростелев В.В., Осипь янц А.И., Орешников А.В., Носов А.М. (2008) Изучение ростовых и биосинтетиче ских характеристик трех штаммов суспензионной культуры STEPHANIA GLABRA (ROXB.) MIERS. при выращивании в колбах и биореакторах. Сборник тезисов докла дов Материалы IX конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехноло гия», 8-12 сентября 2008 г., Звенигород, Россия, с. 322- Беркович Е.А., Титова М.В., Куличенко И.Е., Орешников А.В., Носов А.М. (2008) Особенности процесса дыхания в культивируемых in vitro клетках Dioscorea deltoidea Wall. Сборник тезисов докладов Материалы IX конференции «Биология клеток рас тений in vitro и биотехнология», 8-12 сентября 2008 г., Звенигород, Россия, с. 46- Титова М.В., Шумило Н.А., Куличенко И.Е., Орешников А.В., Носов А.М. (2009) Оптимизация выращивания суспензионных культур клеток Dioscorea deltoidea Wall и Polyscias filicifolia Bailey в полупроточном режиме в биореакторах различного объема.

Труды Никитского Ботанического Сада, том 131, с. 68- Titova M.V. (2009) Scale-up of plant cell suspension culture growth for biomass and sec ondary metabolites production. Сборник Materials of the 1st Workshop on Molecular Bio technology / XV Biotechnology Summer School (Gdansk, Poland), с. 58- Титова М.В., Суханова Е.С., Куличенко И.Е., Решетняк О.В., Носов А.М. (2010) Влияние ингибиторов мевинолина и фомидомицина на биосинтез стероидных глико зидов в суспензионной культуре клеток Dioscorea deltoidea Wall. Сборник Материалы Международной конференции «Перспективы фитобиотехнологии для улучшения ка чества жизни на севере», с. 121- Суханова Е.С., Титова М.В., Носов А.М. (2010) Исследование суспензионных куль тур клеток Polyscias fruticosa (L.) Harms и Polyscias filicifolia Bailey. Сборник Мате риалы Международной конференции «Перспективы фитобиотехнологии для улучше ния качества жизни на севере», с. 117- Кочкин Д.В., Демидова Е.В., Титова М.В., Носов А.М. (2012) Влияние степени очи стки сахарозы на накопление гинзенозидов в культуре клеток PANAX JAPONICUS VAR. REPENS при выращивании в аппаратуре полупромышленного объема. Сборник тезисов докладов Материалы Международной конференции "Биология - наука XXI века". Москва, 24 мая 2012, с. 422-

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.