авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 ||

Эволюция и механизмы регуляции экспрессии повторяющихся генов в геноме drosophila

-- [ Страница 2 ] --

Это F-элемент (Minchiotti and Di Nocera 1991) и micropia (Lankenau et al.1994) у Drosophila, а также L1 у человека (Speek 2001). Теломерный ретротранспозон дрозофилы TART также обладает двунаправленной экспрессией (Danilevskaya et al. 1999;

Рис.13 Картирование антисмыслового промотора НеТ-А А А Определение старта антисмысловой транскрипции НеТ-А с помощью 5’ RACE.

Схематически представлен ретротранспозон НеТ-А;

позиции старта смысловой, антисмысловой транскрипции и сайта полиаденилирования обозначены в соответствии с последовательностью клона DMU6920, представленном в GenBank. Верхняя строка сиквенса представляет собой фрагмент из этого клона, нижняя - фрагмент элемента НеТ-А z2, клонированного в составе репортерной конструкции (рис. 13Б). Точками обозначены сайты инициации транскрипции, выявленные с помощью 5’ RACE для эндогенных копий (верхняя строка) и для конструкции HeTA-as в экспериментах по трансфекции культуры клеток. Б Антисмысловая промоторная активность 3’ области НеТ-А, определенная в результате экспериментов по трансфекции культуры клеток дрозофилы Schneider2. Конструкции НеТА-s и HeTA-as содержат фрагмент 3’ области НеТ-А в прямой и обратной ориентации, соответственно, заклонированный в вектор pCaSpeR-AUG--gal. Ферментативная активность -галактозидазы для HeTA-as выражена как % от таковой для НеТА-s. Старты транскрипции обозначены короткими стрелками. Транскрипт НеТА/lacZ обозначен длинной стрелкой с указанием позиции интрона. Сиквенс отражает экзон интронную структуру НеТ-А в составе конструкции, определенную в результате секвенирования продуктов 5’ RACE (последовательность экзонов и интрона обозначена большими и малыми буквами, соответственно, консервативные последовательности на границах интрона обозначены жирным шрифтом).

Maxwell et al. 2006). Попытки выявить антисмысловые транскрипты ретроэлемента НеТ А до сих пор были безуспешными (Danilevskaya et al. 1999;

Walter and Biessmann 2004), хотя антисмысловые короткие РНК НеТ-А детектируются в библиотеках коротких РНК у Drosophila (Aravin et al. 2003;

Brennecke et al. 2007). Нозерн-блот анализ был применен для исследования смысловых и антисмысловых piРНК НеТ-А в яичниках у мутантов piРНК пути. piРНК обеих полярностей выявляются в яичниках гетерозигот spn-E/+, piwi/+, aub/+, в то время как и те и другие piРНК отсутствуют в яичниках гомозигот spn E/spn-E и piwi/piwi (рис. 14А). В яичниках aub/aub количество piРНК снижено. В данном опыте использовался зонд, соответствующий 3’ концу НеТ-А, где расположен его прямой промотор (Danilevskaya et al. 1997). Т.к. этот зонд эффективно выявляет антисмысловые piРНК НеТ-А, было предположено, что экспрессия антисмысловых транскриптов НеТ-А осуществляется с промотора, расположенного в 3’ области элемента или в прилегающей последовательности. Например, фрагменты теломерных ретротранспозонов выявляются в прицентромерном гетерохроматине, где они могут транскрибироваться с прилегающих промоторов. Для определения старта антисмысловой транскрипции НеТ-А в яичниках был применен метод 5’ RACE с использованием праймеров, специфичных к 3’ области НеТ-А. РНК выделялась из яичников линии D. melanogaster y1;

cn1 bw1 sp1, использованной для секвенирования генома, что облегчило анализ последовательностей 5’RACE продуктов. В результате секвенирования 25 5’ RACE клонов было обнаружено, что антисмысловая транскрипция НеТ-А инициируется в районе, расположенном на 190 п.н. раньше, чем старт смысловой транскрипции (рис.13А). Несмотря на наличие гетерогенности в сайтах инициации антисмысловой транскрипции, есть наиболее часто встречающиеся положения.

Секвенирование полученных клонов показывает, что антисмысловые транскрипты образуются с различных полиморфных копий НеТ-А. Выявлены также транскрипты, начинающиеся в укороченной копии НеТ-А и продолжающиеся в следующую копию, причем последовательности таких клонов четко соответствуют теломерному району хромосомы. Это говорит о том, что в образовании антисмысловых транскриптов принимают участие теломерные копии НеТ-А. Антисмысловые транскрипты НеТ-А содержат множественные интроны;

для большинства интронов выявлено соответствие консервативным последовательностям сайтов сплайсинга. В различных копиях НеТ-А используются альтернативные пути сплайсинга. Протяженных ОРС в этих транскриптах не выявлено. Ранее было показано, что антисмысловые транскрипты теломерного ретротранспозона TART также сплайсируются. Роль сплайсинга в некодирующих транскриптах ретроэлементов остается загадкой. Показано, что антисмысловые транскрипты TART полиаденилированы, т.к. они присутствуют в поли(А)-содержащей фракции РНК из яичников.

Промоторная активность 3’-области НеТ-А была исследована в экспериментах по трансфекции культуры клеток. Для этого фрагмент НеТ-А размером 434 п.н., расположенный перед сайтом полиаденилирования, был заклонирован в прямой и обратной ориентациях в вектор, содержащий репортерный ген lacZ (конструкции НеТ Аs и НеТ-Аas). Активность антисмысловой конструкции составила около 15% от активности смысловой конструкции (рис. 13Б). Для определения старта транскрипции конструкции НеТ-Аas был проведен также 5’ RACE анализ. Показано, что старт антисмысловой транскрипции НеТ-А для этой конструкции совпал с таковым, определенным для эндогенных копий (рис. 13А). Более того, транскрипт, считываемый с конструкции НеТ-Аas, также как и эндогенные транскрипты, подвергался сплайсингу (рис. 13Б). Т.о., НеТ-А обладает двунаправленным промотором, расположенном в его 3’ области. Исследование такого двунаправленного промотора представляет собой отдельный интерес с точки зрения понимания механизмов регуляции транскрипции.

Анализ антисмысловой экспрессии теломерных ретротранспозонов Исследования роли РНКи в сайленсинге ретротранспозонов в основном фокусируется на поведении смысловых кодирующих транскриптов, являющихся интермедиатами транспозиций в геноме. Однако смысловые короткие РНК также присутствуют в клетке (рис. 14А), что ставит вопрос о том, не являются ли длинные антисмысловые транскрипты ретротранспозонов также мишенью системы РНКи.

Поведение антисмысловых транскриптов НеТ-А и TART исследовалось с помощью метода РНК in situ гибридизации однонитевых зондов с яичниками мутантов piРНК пути. Антисмысловые транскрипты теломерных ретротранспозонов накапливаются в виде дискретных точек в ядрах питающих клеток мух spn-E/spn-E (рис.14Б). Показано также накопление антисмысловых транскриптов TART в ядрах питающих клеток у мутантов по гену aub и локусу vasa. Эти данные указывают на то, что piРНК путь участвует в регуляции экспрессии антисмысловых транскриптов ретроэлементов.

Интересен тот факт, что смысловые транскрипты НеТ-А и TART накапливаются не только в цитоплазме герминальных клеток, но и в ядрах. Аналогичные данные по накоплению антисмысловых транскриптов в ядрах питающих клеток мутантов по гену spn-E получены для нетеломерного ретротранспозона дрозофилы I-элемента.

Накопление как смысловых, так и антисмысловых транскриптов ретротранспозонов в ядрах у мутантов по piРНК пути указывает на то, что этот путь работает не только в цитоплазме, но и в ядре. Методом RT-PCR анализа было проведено сравнение количества смысловых и антисмысловых транскриптов НеТ-А и TART в цитоплазматической и ядерной фракциях яичников мутантов spn-E (рис.14Г).

Накопление антисмысловых транскриптов НеТ-А и TART в ядерной фракции яичников мутантов spn-E/spn-E подтверждает данные, полученные с помощью РНК in situ гибридизации. Видна заметная разница в поведении смысловых и антисмысловых транскриптов. Смысловые транскрипты накапливаются в большей степени в цитоплазме, чем в ядре, в то время как накопление антисмысловых транскриптов происходит в основном в ядрах. Можно предположить, что некодирующие антисмысловые транскрипты способны выходить в цитоплазму, где они являются мишенью деградационной машины, распознающей аберрантные транскрипты, например, NMD (nonsense codon mediated decay).

Итак, показано, что эндогенные длинные антисмысловые транскрипты ретротранспозонов, так же как и смысловые, являются мишенями механизма сайленсинга с участием piРНК. Длинные транскрипты необходимы для образования коротких РНК обеих полярностей, которые, в свою очередь, контролируют количество этих транскриптов. Такое сложное взаимодействие с участием piРНК обеспечивает регуляцию экспрессии ретротранспозонов в герминальных тканях.

Нас заинтересовал характер накопления транскриптов НеТ-А и TART в ядре в виде дискретных точек. Сочетание методов иммуноокрашивания, РНК FISH и ДНК FISH показывает, что накопление транскриптов теломерных ретроэлементов в ядре, как смысловых так и антисмысловых, происходит в районе геномного локуса, соответствующего теломере. На рис. 14В приведены результаты гибридизации с антисмысловой РНК TART в сочетании с окрашиванием теломеры с помощью зонда к НеТ-А. Эти данные указывают на то, что регуляция экспрессии теломерных ретроэлементов в ядре с помощью коротких РНК происходит на транскрипционном или ко-транскрипционном уровне, однако, хроматиновые компоненты этого пути пока остаются неизвестными. По-видимому, если говорить о механизме piРНК-зависимого сайленсинга ретротранспозонов, важны оба пути, как пост-транскрипционный, работающий в цитоплазме на уровне деградации мишени, так и транскрипционный, работающий на уровне изменения структуры хроматина.

Рис. 14 Антисмысловые транскрипты теломерных ретроэлементов А НеТ-А-специфичные piРНК, как смысловые (s), так и антисмысловые (as), выявляются с помощью Нозерн-анализа с однонитевыми зондами в яичниках гетерозигот (+/-) spn-E/+, piwi/+ и aub/+ и отсутствуют или убывают у гомозигот (-/-) spn-E/spn-E7, piwi/piwi и aub/aub.

Гибридизация с олигонуклеотидами, комплементарными микроРНК mir13b или 2S РНК сделана в качестве контроля нагрузки. Обозначена позиция РНК маркера размером 25 н.. Б Антисмысловые РНК НеТ-А и TART накапливаются в ядрах питающих клеток (nc) у гомозиготных мутантов spn-E (-/-) (обозначено стрелками). In situ РНК гибридизация с использованием однонитевых смысловых зондов и антител, коньюгированных со щелочной фосфатазой (верхняя панель) или родамином (нижняя панель). В Антисмысловые транскрипты TART (зеленый) колокализуются с ДНК зондом НеТ-А (красный), детектирующим теломеру.

ДНК окрашена DAPI. Г Сравнение количества смысловых (s) и антисмысловых (as) транскриптов HeT-A и TART в тотальной РНК (T), цитоплазматической (C) и ядерной (N) фракциях яичников spn-E/+ (+/-) и spn-E/spn-E (-/-) с помощью RT-PCR с использованием цепь специфичных праймеров. Высота столбцов гистограммы отражает отношение количества транскриптов ретротранспозонов HeT-A/TART к количеству транскриптов конститутивного гена rp49 в яичниках мух spn-E/spn-E (-/-), нормированное на таковое соотношение для мух spn-E/+ (+/-).

Выводы:

.

1. Установлены эволюционные взаимоотношения семейства родственных генов, участвующих в сперматогенезе. Впервые показано эволюционное происхождение в геноме протяженных участков конститутивного гетерохроматина дрозофилы в результате амплификации функционального эухроматического гена. Обнаружен новый функциональный ген, кодирующий семенник-специфичную регуляторную субъединицу казеин-киназы 2 (CK2tes). Являясь функциональной ретрокопией гена CK2, этот ген, в свою очередь, является предком семейств тандемно-повторяющихся генов X и Y хромосом (Ste и Su(Ste)).

2. Показано существование в одном геноме нескольких структурно функциональных вариантов ретротранспозона 1731. Исследованы структурные варианты регуляторной и кодирующей областей ретротранспозона 1731. Выявлено наличие двух типов копий, различающихся изменениями в области трансляционного сдвига рамки считывания, а также исследован полиморфизм регуляторной области длинного концевого повтора. Показано, что недавно возникшие копии этого элемента, обладающие широким спектром экспрессии, вытеснили более древний вариант.

3. Гены, кодирующие компоненты РНК интерференции, участвуют в контроле экспрессии и частоты перемещений ретротранспозонов в герминальных тканях Показано, что компоненты РНКи подавляют экспрессию широкого спектра ретротранспозонов в герминальных клетках яичников. Белок Piwi участвует в регуляции экспрессии и частоты транспозиций ретротранспозонов в семенниках.

4. Экспрессия и частота перемещений теломерных ретротранспозонов в яичниках дрозофилы регулируется с помощью коротких РНК, т.о., система РНКи осуществляет негативную регуляцию длины теломер у дрозофилы.

5. Экспрессия репортерных генов, находящихся под контролем промотора теломерного ретротранспозона НеТ-А, регулируется по механизму РНКи в герминальных тканях самок дрозофилы независимо от положения репортерных конструкций в геноме.

6. Ретротранспозон TAHRE способен перемещаться на конец хромосомы, и, следовательно, этот элемент является полноправным участником поддержания теломер у дрозофилы. Установлено, что промотор ретротранспозона TAHRE, так же как у HeT-A, находится в 3’-конце нетранслируемой области данного элемента.

7. Изучено происхождение и биогенез антисмысловых транскриптов теломерных ретротранспозонов, необходимых для образования коротких РНК. Картирован антисмысловой промотор теломерного ретротранспозона НеТ-А. Показано, что некодирующие антисмысловые транскрипты процессируются и полиаденилируются.

Антисмысловые транскрипты теломерных ретроэлементов НеТ-А и TART являются мишенями РНКи, так же как и смысловые транскрипты, и накапливаются в ядрах герминальных клеток у мутантов по генам РНКи в области теломеры, что указывает на транскрипционный механизм сайленсинга теломерных повторов.

Список публикаций:

1. А.И.Калмыкова, А.А.Добрица, В.А.Гвоздев. Экспрессия гена Y-хромосомы Drosophila melanogaster, кодирующего изоформу регуляторной -субъединицы казеинкиназы 2. Молекулярная биология, 31, 462-468, 1997.

2. А.И. Калмыкова, А.А. Добрица, В.А. Гвоздев Ген CK2tes кодирует образование тканеспецифичной регуляторной -субъединицы казеинкиназы 2 у Drosophila melanogaster, Биохимия, 62, 535-540, 1997.

3. A. I. Kalmykova, Y. Y. Shevelyov, A. A. Dobritsa, and V. A. Gvozdev. Acquisition and amplification of a testis expressed autosomal gene, SSL, by the Drosophila Y chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 6297-6302, 1997.

4. A. I. Kalmykova, A. A. Dobritsa, V. A. Gvozdev. The Su(Ste) repeat in the Y chromosome and betaCK2tes gene encode predicted isophorms of regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in Drosophila melanogaster. FEBS Let., 416, 164-166, 1997.

5. A. I. Kalmykova, A. A. Dobritsa, V. A. Gvozdev. Su(Ste) diverged tandem repeats in a Y-chromosome of Drosophila melanogaster are transcribed and variously processed.

Genetics, 148, 243-249, 1998.

6. A. Kalmykova, C. Maisonhaute & V. Gvozdev. Retrotransposon 1731 in Drosophila melanogaster changes retrovirus-like expression strategy in host genome. Genetica, 107: 73-79, 1999.

7. A. I. Kalmykova, Y. Y. Shevelyov, O. O. Polesskaya, A. A. Dobritsa, A. G. Evstafieva, B. Boldyreff, O-G. Issinger, V. A. Gvozdev. 2002. CK2tes gene encodes a testis specific isoform of the regulatory subunit of casein kinase 2 in Drosophila melanogaster. Eur. J. Biochem., 269, 1418-1427, 2002.

8. G.L. Kogan, A.V. Tulin, A.A. Aravin, Y.A. Abramov, A.I. Kalmykova, C.

Maisonhaute, V.A. Gvozdev. The GATE retrotransposon in Drosophila melanogaster:

mobility in heterochromatin and aspects of its expression in germline tissues. Mol Genet Genomics 269: 234-242, 2003.

9. V.V. Vagin, M.S. Klenov, A.I. Kalmykova, A.D. Stolyarenko, R.N. Kotelnikov, and V.A. Gvozdev. The RNA interference proteins and vasa locus are involved in the silencing of retrotransposons in the female germline of Drosophila melanogaster. RNA Biology 1: 54-58, 2004.

10. A.I. Kalmykova, D.A. Kwon, Ya.M. Rozovsky, N. Hueber, P. Capy, C. Maisonhaute, and V.A. Gvozdev. Selective expansion of the newly evolved genomic variants of retrotransposon 1731 in the Drosophila genomes. Mol. Biol. Evol. 21: 2281-2289, 2004.

11. A.I. Kalmykova, M.S. Klenov, and V.A. Gvozdev. Argonaute protein PIWI controls mobilization of retrotransposons in the Drosophila male germ line. Nucl. Acids Res. 33:

2052-2059, 2005.

12. M. Savitsky, D. Kwon, P. Georgiev, A. Kalmykova, V. Gvozdev Telomere elongation is under the control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline. Genes Dev. 20: 345-354, 2006.

13. Р.Н. Котельников, С.Г. Шпиз, А.И. Калмыкова, В.А. Гвоздев. Белки, связывающие РНК, в процессах РНК-интерференции. Молекулярная биология.

40:595-608, 2006.

14. С.Г. Шпиз, А.И. Калмыкова. Структура теломерного хроматина у Drosophila.

Биохимия 70: 759-773, 2007.

15. S. Shpiz, D. Kwon, A. Uneva, M. Kim, M. Klenov, Y. Rozovsky, P.. Georgiev, M.

Savitsky, A. Kalmykova Characterization of Drosophila telomeric retroelement TAHRE: transcription, transpositions and RNAi-based regulation of expression.. Mol.

Biol. Evol. 24:2535-45, 2007.

16. S. Shpiz, D. Kwon, Y. Rozovsky, A. Kalmykova rasiRNA pathway controls antisense expression of Drosophila telomeric retrotransposons in the nucleus Nucl. Acids Res.

37: 268-278, 2009.

17. S. Shpiz and A. Kalmykova Epigenetic transmission of piRNAs through the female germline Genome Biology 10: 208, 2009.



Pages:     | 1 ||
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.