авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Комплексы видов кровососущих комаров рода anopheles (diptera, culicidae) россии и ближнего зарубежья

На правах рукописи

Безжонова Оксана Владимировна Комплексы видов кровососущих комаров рода Anopheles (Diptera, Culicidae) России и ближнего зарубежья Специальности 03.02.05 – энтомология и 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА – 2011

Работа выполнена на кафедре энтомологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории сравнительной генетики животных Учреждения Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Научный руководители: кандидат биологических наук Федорова Марина Вадимовна кандидат биологических наук Горячева Ирина Игоревна

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук Андрианов Борис Витальевич Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН доктор биологических наук Ганушкина Людмила Алимпиевна Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского ММА имени И.М. Сеченова

Ведущая организация: Московский Государственный областной университет

Защита диссертации состоится «10» октября 2011 г. в «17» часов «00» минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.20 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1,Москва, Ленинские горы, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, д. 1 стр. 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

Факс: 8(495)939-17-46;

E-mail: irbeme@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « » сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, И.Р. Бёме доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. До настоящего времени малярия остается одним из самых распространенных трансмиссивных заболеваний: ежегодно в мире этой инфекцией болеют около 300 миллионов человек, а количество летальных случаев исчисляется сотнями тысяч (WHO, 2009, 2010).

В результате интенсивных мероприятий на европейском континенте и на всей территории СССР передача малярии была практически прервана к 1950г., и в 1955г. ВОЗ объявила об окончательной ликвидации этого заболевания в Европе (Mendis et al, 2009).

Однако во многих странах европейского региона ВОЗ плотность популяций переносчиков малярии, комаров рода Anopheles, оставалась высокой. Это создавало условия для возобновления местной передачи на основе завозных случаев или вследствие активизации местных остаточных очагов, и привело к развитию полномасштабных эпидемий малярии в Азербайджане и Таджикистане с середины 90-х годов, а потом и по всей территории европейского региона ВОЗ (Касумов, Гусейнов, 2001;

Сабатинелли, 2002). В связи со сложившейся ситуацией ВОЗ была разработана программа «Обратим малярию вспять», которая вступила в действие в 1998 г. Одной из центральных задач программы стала ревизия фауны малярийных комаров с целью уточнения основных переносчиков заболевания и контроля их численности (Региональная стратегия, 2006).

Ареал малярии ограничивается в основном областью распространения переносчиков этого заболевания - комарами рода Anopheles. В мировой фауне насчитывается 484 вида этого рода (Sallum et al., 2000;

Harbach, 2004;

Harbach et al., 2005), но далеко не все они представляют опасность для человека. Эпидемиологическое значение имеют лишь те, которые удовлетворяют критерию ”основной переносчик”, т.е.

обладают биологическими особенностями, повышающими вероятность контакта комаров с человеком. К таким биологическим особенностям комаров относятся высокая численность, способность развиваться вблизи жилья человека в антропогенных биотопах, высокий уровень антропофилии, эндофагии и эндофильности (Беклемишев, 1944). В настоящее время к числу основных переносчиков относят около 60 видов комаров рода Anopheles (Service, 2004;

Fontenille et al.,2005).

Исследования особенностей пищевого и репродуктивного поведения, суточного ритма активности, сезонного хода численности и других биологических характеристик у ряда видов малярийных комаров показали, что они представляют собой комплексы близкородственных видов, морфологические различия между которыми выражены крайне слабо, а часто и вовсе отсутствуют, тогда как эпидемическая роль может существенно отличаться. Описание комплексов в роде Anopheles началось с европейского вида An.maculipennis в 1920-годах и в дальнейшем затронуло значительное число видов (Norris, 2002). Уже в 30-40-е годы в Индии были найдены внутривидовые формы комара An.

stephensi (Sweet, Rao, 1937), в Южной Америке - подвиды An.albitarsis, An. darlingi, An.crusians, An.quadrimaculatus, в Северной Америке – An.maculipennis, An.pseudopunctipennis (Aitken, 1945). Начавшееся в 40-е годы изучение An.gambiae, основного переносчика малярии в Африке (Coluzzi, 1964), привело к описанию по меньшей мере семи новых видов, образовавших комплекс An.gambiae (Coluzzi et al., 2002).

Среди них пять видов являются переносчиками малярии. К настоящему времени показано, что около 77% видов - переносчиков малярии представляют собой комплексы видов.

Разработка методов их идентификации является важной, но сложной задачей, которая в настоящее время далека от завершения.

На территории России и в других странах СНГ наиболее распространены представители комплекса An.maculipennis, к числу которых относятся основные переносчики малярии (Gordeev et al., 2008). Кроме того, большое эпидемиологическое значение в некоторых регионах имеют комары An. claviger (Бубликова, 2001), а в Средней Азии - An.superpictus (Gordeev et al., 2008). По современных представлениям, оба эти вида также представляют собой комплексы.

Цель и задачи исследования. Целью работы была ревизия видового статуса комаров комплексов An.maculipennis, An.claviger и An.superpictus, их распространения на территории России и ближнего зарубежья и оценка области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2) как универсального маркера для идентификации видов указанных комплексов.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) уточнение видового состава комаров комплекса An.maculipennis на территории России и некоторых стран СНГ методами морфологического, цитогенетического и молекулярно-генетического анализа;

2) оценка внутривидовой изменчивости первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) кластера рибосомных генов комаров комплекса An.maculipennis;

3) разработка молекулярно-генетического ключа для идентификации видов комплекса An.maculipennis;

4) оценка внутривидовой изменчивости первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) кластера рибосомных генов комаров комплекса An.claviger;

5) изучение комаров комплекса An.superpictus методами морфологического и молекулярно-генетического анализа.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов идентификации видов-двойников, распространенных на территории России и ближнего зарубежья.

Показано, что применение морфологических признаков для идентификации всех видов комплекса An.maculipennis затруднено из-за наличия промежуточных вариантов окраски экзохориона яйца и схожести морфологии яиц у некоторых видов (например, An.maculipennis, An.atroparvus). Применение анализа структуры политенных хромосом для идентификации видов ограничено существованием гомосеквентных видов (An.labranhiae и An.atroparvus;

An.maculipennis, An.melanoon и An. artemievi). Показано, что наиболее перспективным является молекулярно-генетический подход, основанный на использовании первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2) как универсального маркера для идентификации видов комплекса An.maculipennis. С использованием этого маркера впервые разработан молекулярный ключ для идентификации видов комплекса An.maculipennis, обитающих на территории России и ближнего зарубежья.

У An.messeae, представителя комплекса An.maculipennis, впервые обнаружен внутригеномный полиморфизм ITS2. Изучение степени внутригеномного полиморфизма указанного вида на территории России показало, что недавно описанный в Европе вид An.daciae представляет собой одну из внутригеномных форм An.messeae и не может считаться самостоятельным видом. Другие исследованные виды комплекса An.maculipennis оказались мономорфными по маркеру ITS2. Использование молекуляро генетических методов позволило выявить новый для фауны СНГ вид – An.persiensis, а также уточнить границы ареалов An.messeae, An.maculipennis, An.atroparvus, An.artemievi, An.melanoon и An.sacharovi.

В ходе цитогенетических исследований впервые получены данные по кариотипической структуре популяций An.messeae юго-восточной части Русской равнин.

Выявлены три четко дифференцированные зоны, различающиеся по частоте встречаемости разных кариотипов.

Впервые выявлена и исследована внутригеномная изменчивость первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2) у An.claviger. Различия по этому маркеру между популяциями из Абхазии, с одной стороны, и Беларуси и Германии с другой, значительно превосходили различия на популяционном уровне. Эти результаты дают основу для дальнейшей исследовательской работы на уровне комплекса видов.

Впервые проведен молекулярно-генетический анализ An.superpictus в Туркменистане и Кыргызстане Показано, что морфологические формы An.superpictus не соответствуют молекулярным формам по ITS2 и COI-II;

выявлены два новых митотипа Х (в Кыргызстане и Туркменистане) и Х2 (в Кыргызстане).

Теоретическое и практическое значение работы. Данные о внутривидовом и межвидовом полиморфизме в комплексах видов-двойников An.maculipennis, An.claviger и An.superpictus по изученным маркерам являются важными для дальнейших систематических и эволюционных исследований, а также мониторинга биоразнообразия.

Разработанный молекулярно-генетический ключ для идентификации видов комаров комплекса An.maculipennis успешно применяют для изучения переносчиков по программе «Обратим малярию вспять» ВОЗ и в центрах эпидемиологии (Акт о внедрении от 21.04.2004 г.) Полученные результаты внесли изменения в видовой состав и распространение переносчиков малярии на территории РФ и некоторых стран ближнего зарубежья.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований были представлены в виде докладов на 3 международных и 1 российской конференциях:

Международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и ее практическое применение» (Москва, 2006), XII Международной орнитологической конференции (Ставрополь, 2006), I Всероссийском Совещании по проблемам изучения кровососущих насекомых (Санкт-Петербург, 2006), III международном совещании "Молекулярная и популяционная биология комаров и других переносчиков заболеваний" (Колимбари, Крит, Греция, 13-20 июля 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатные работы, в том числе 10 статей, из которых 9 – в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», четырех глав, «Заключение», «Выводы», «Список литературы» (включающий 240 источник, из них 144 на иностранных языках). Текст изложен на 120 страницах (без учета приложений), содержащий 13 таблиц и проиллюстрированный 20 рисунками. Приложения содержат таблиц.

БЛАГОДАРНОСТИ Я выражаю глубочайшую благодарность научным руководителям кандидату биол.

наук М В. Федоровой и кандидату биол. наук И. И. Горячевой. Особую благодарность выражаю члену-корресполнденту РАН, доктору биол.наук И.А. Захарову-Гезехусу за всестороннюю помощь и поддержку при выполнении работы в руководимой им лаборатории. Я благодарю профессора, доктора биол. наук М.И. Гордеева и кандидата биол. наук Е.В. Шайкевич за совместную работу. Я искренне признательна за предоставление материала А.Б. Званцову, доктору биол. наук М.Ю.Щелканову, А.Бабуадзе, кандидатам биол. наук А. Кешишьян, Т.В.Волковой, Н.К. Потаповой. Я очень благодарна за всестороннюю помощь и профессиональные советы доктору биол. наук Н.

А. Тамариной, кандидатам биол. наук Н.Я. Маркович и Р.М. Горностаевой.

Работа финансировалась Глобальным фондом по борьбе со СПИДом, туберкулезом и малярией, Европейским региональным бюро Всемирной Организации Здравоохранения, а также по грантам РФФИ 05-04-49047, 05-04-49035, 06-04-08347, 08-04-01674-а;

по грантам Президента РФ НШ-827.2003.4;

НШ-15.2003.4;

НШ-10122.2006.04, по программе РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ I.I. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.MACULIPENNIS Комплекс видов Anopheles maculipennis – основной переносчик малярии в Палеарктике. Комплекс An. maculipennis включает в себя 11 Палеарктических видов (An.

artemievi Gordeev, Zvantzov, Goryacheva, Shaikevich and Ejov, An. atroparvus van Thiel, An.

beklemishevi Stegnii & Kabanova, An. daciae Linton, Nicolescu & Harbach, An. labranchiae Falleroni, An. maculipennis Meigen, An. martinius Shingarev, An. melanoon Hackett, An.

messeae Falleroni, An. persiensis Linton, Sedaghat & Harbach and An. sacharovi Favre) и Неоарктических видов (An. occidentalis Dyar and Knab, An.aztecus, Hoffman, An.freeborni Aitken, An.earlei Vargas, An.hermsi Barr and Guptavanij) (Nicolescu et al., 2004;

Kampen, 2005b).

В странах СНГ найдены 8 видов: An. artemievi, An. atroparvus van Thiel, An.

beklemishevi Stegnii & Kabanova, An. maculipennis Meigen, An. martinius Shingarev, An.

melanoon Hackett, An. messeae Falleroni и An. sacharovi Favre (Горностаева, 2000, 2003, 2009;

Горностаева, Данилов, 2002;

Мамедниязов, Ерохин, 2005;

Мамедниязов, 1995;

Ejov, 2005;

Gordeev et al., 2008).

Изучение систематики видов комплекса не прекращалось на протяжении всего ХХ столетия. Первые работы были посвящены поиску морфологических особенностей и доказательствам существования репродуктивной изоляции между членами комплекса. Во второй половине столетия с успехом были использованы цитогенетические и биохимические подходы, а в последнее десятилетие широкое распространение получили методы молекулярной генетики. Итогом этих работ явилось открытие новых видов, часть из которых описана на основании молекулярно-генетических различий, а часть - с использованием методов цитогенетики.

I.2. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.CLAVIGER В 40-х годах Del Vecchio на основании морфологических отличий яиц, личинок и куколок выделил два вариетета An.claviger: An.cl.petragnani и An.cl.missiroli (Del Vecchio, 1939;

Lupascu, 1941;

Senevet, Andranelli, 1955;

Coluzzi, 1963). Видовая самостоятельность An.petragnani и An.claviger s.s.обсуждалась до 60-х г.г. XX в., когда Колуцци показал репродуктивную изоляцию этих форм (Coluzzi, 1963).

На территории бывшего СССР Устиновым (1946) и Маркович (1951) были выявлены две физиологические расы вида An.claviger, отличающиеся по признаку автогенности (способности самок откладывать первую кладку яиц без кровососания).

Неавтогенные популяции были обнаружены в окрестностях Сочи (Шленова, 1938), в Адлере (Шипицина, 1941) и Абхазии (Устинов, 1945, 1946), тогда как популяции из европейской части Российской Федерации, Украины, Молдавии, Прибалтики, Казахстана и республик Средней Азии были способны к автогенному развитию яиц. Полученные данные поставили вопрос о видовом статусе комаров из автогенных и неавтогенных популяций на территории СНГ.

I.3. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.SUPERPICTUS An.superpictus в последнее время рассматривается как комплекс видов. Известны две морфологические формы имаго (A и В), различающиеся по наличию или отсутствию темного пятна (кольца) на апикальном сегменте максиллярных щупиков (Amani, 1999).Молекулярно-генетический анализ области гена малой субъединицы цитохромоксидазы I (COI) и участка COI-II методом ПЦР-ПДРФ позволил выделить три молекулярные формы этого локуса, которые были обозначены как Х, Y и Z (Oshagi et al, 2007a). Параллельно для выявления внутри- и межвидовых различий велись исследования другой маркерной области генома переносчика – первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2).

Исследования показали отсутствие корреляции между молекулярными маркерами и морфологическими формами личинок и имаго (Oshaghi et al., 2007a, 2007b, 2008), но выявили соответствие между митохондриальными и ядерными молекулярными формами.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II.1. Места сбора. Материалом для работы послужили личинки и имаго малярийных комаров, собранные с 2004 по 2009 г.г. в Волгоградской, Астраханской, Ростовской, Пензенской областях, Краснодарском крае, Абхазии, республиках Адыгея и Калмыкия. Имаго собирали энтомологическим сачком, световыми ловушками, в местах дневок cамок – заплечным пылесосом (BioQuip, USA), а также ловили на себе с помощью ловушки Кришталя. Среди самок отбирали особей, напитавшихся кровью, которых помещали в индивидуальные пробирки для получения кладок. Сбор личинок проводили с помощью ковша. Кроме собственных сборов были проанализированы также личинки, имаго и яйца комаров из Воронежской области, республики Карачаево-Черкесия, Якутии, а также из Беларуси, Грузии, Армении и Азербайджана, любезно предоставленные местными энтомологами. Материал из Московской и Томской областей, Алтайского края, республики Калмыкия, из Казахстана, Кыргызстана, Узбекистана, Туркменистана и Таджикистана предоставлен М.И. Гордеевым и А.Б. Званцовым. Для определения имаго и личинок использовали стандартные ключи (Гуцевич и др., 1970).

II.2. Цитогенетический анализ. Для цитогенетических исследований личинок IV возраста фиксировали в смеси 96% спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1). Слюнные железы комаров выделяли в капле фиксатора под микроскопом МБС–10.

Хитиновый покров личинки приподнимали с помощью препаровальных игл. Затем из грудного отдела извлекали парные слюнные железы. Железы окрашивали 2%-ным лактоацеторсином в течение 30 минут. Затем излишки краски убирали фильтровальной бумагой. Железы дифференцировали в 45% уксусной кислоте. Далее железы накрывали покровным стеклом и раздавливали легкими постукиваниями тупым концом препаровальной иглы. Цитогенетический анализ политенных хромосом проводили под микроскопом Micros (Австрия). Видовой и половой состав личинок малярийных комаров определяли путем сравнения препаратов политенных хромосом с фотокартами политенных хромосом видов-двойников рода Anopheles (Стегний, 1991). Для оценки достоверности различий в частоте встречаемости инверсий в разных популяциях An.

messeae европейской части ареала использовали метод 2 (Гершкович, 1968).

II.3. Молекулярно-генетические методы.

Выделение ДНК. Для молекулярно-генетических исследований комаров фиксировали в 96 спирте. ДНК выделяли с помощью набора для выделения ДНК DIAtom DNA Prep (Изоген, Россия) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Принцип действия данного набора основан на использовании Лизирующего реагента с гуанидинтиоцианатом, последний предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса и денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии Лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoS™-сорбенте, а затем легко отмывается от других компонентов (белков, солей) спиртовым раствором. ДНК элюируется с сорбента ЭкстраГеном Е™ или деионизованной водой. Полученную ДНК использовали для проведения ПЦР. В реакцию амплификации брали по 0,01 мкг выделенной тотальной ДНК.

ПЦР. Амплификацию фрагментов ДНК проводили в объеме 25 мкл с использованием набора реактивов Encyclo PCR kit (Евроген, Россия).

Реакционную смесь готовили в соответствии с рекомендациями производителя: 2, мкл 10х Encyclo-буфера, 0,5 мкл смеси dNTP, содержащей по 0,2 мМ каждого нуклеотида, 0,5 мкл 50х- Encyclo-полимеразы (конечная концентрация 0,5 ед.), по 0,2 мкМ каждого праймера, 100 нг/25 мкл тотальной ДНК, бидистиллированная вода добавлялась до конечного объема 25 мкл.

Амплификацию фрагментов ДНК проводили в течение 35 циклов на термоциклере GeneAmpR RCR System 2700 (Applied Biosystems, США). Структура использованных праймеров представлена в таблице.

Таблица 1. Последовательность использованных в работе праймеров Название праймера Последовательность праймера Источник 5,8S 5’-TGT GAA CTG CAG GAC ACA TG-3’ Porter,Collins, 28S 5’- ATG CTT AAA TTT AGG GGG TA-3’ Porter,Collins, 28S1 5’- TAT GCT TAA ATT CAG GGG GT -3’ Beebe, Saul, COIIR1 5’-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3’ Roehrdanz, COIIR2 5’-CCACAAATTTCTGAACATTGACC-3’ Crozier and Crozier, Полимеразную цепную реакцию с праймерами, комплементарными 3’-концу гена 5,8S рРНК и 5’-концу гена 28S рРНК и фланкирующими область второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов, проводили по условиям, описанным ранее (Proft et al., 1999;

Oshaghi et al, 2007a, 2007b). Для амплификации данной области генома использовали праймеры 5,8S и 28S для комаров комплекса An.

maculipennis и комаров An. claviger, и праймеры 5,8S и 28S1 для комаров An. superpictus.

Полимеразную цепную реакцию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация – 3 мин 980С, за которой следовали 35 циклов: денатурация – 20 сек 950С, отжиг - 20 сек, полимеризация – 720С – 40 сек;

заключительная полимеризация 7 мин 720С. Отжиг праймеров проводили при t=500С для праймеров 5,8S и 28S, и при t=530C для праймеров 5,8S и 28S1. Полимеразную цепную реакцию с праймерами COIIR1 и COIIR2, комплементарными фрагменту между генами субъединиц I и II цитохромоксидазы проводили при следующих параметрах: предварительная денатурация – 3 мин 980С, циклов: денатурация – 20 сек 950С, отжиг - 20 сек 560С, полимеризация – 720С – 40 сек;

заключительная полимеризация - 7 мин 720С.

ПЦР-ПДРФ. Видовую идентификацию комаров комплекса An. maculipennis проводили методом ПЦР-ПДРФ на основании различий в паттернах рестрикции продуктов амплификации по ряду диагностических рестриктаз. Идентификацию видов осуществляли в несколько этапов. На первом этапе ПЦР-продукты, полученные в результате полимеразной цепной реакции с праймерами 5,8S и 28S, обрабатывали эндонуклеазой рестрикции CfoI (HhaI) (Promega Corporation, USA). Для этого 15 мкл ПЦР продукта смешивали с 2мкл 10х буферного раствора для рестриктазы CfoI и 5 ед рестриктазы. Смесь инкубировали при 370С в течение часа. Результаты ПЦР-ПДРФ визуализировали методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле.

Использование данного подхода, предложенного Николеску с соавторами (Nikolescu et al., 2004), позволяет идентифицировать 3 вида из комплекса – An. atroparvus, An. maculipennis, An. sacharovi. Паттерны рестрикции видов An. messeae, An. daciae, An.

melanoon, An. artemievi оказываются сходными. Для идентификации этих четырех видов автором был разработан подход, основанный на использовании эндонуклеаз рестрикции, имеющих сайты рестрикции в нуклеотидной последовательности только одного из четырех вышеназванных видов (специфически расщепляющими ПЦР-продукт лишь одного из вышеназванных видов с образованием паттернов рестрикции специфического размера). Поиск специфических эндонуклеаз был проведен с использованием программы «Restriction of DNA sequences» (Bikandi et al., 2004).

Для выявления митохондриальных гаплотипов An. superpictus проводили рестрикцию продуктов амплификации области генов цитохромоксидазы субъединицы I и субъединицы II (COI-COII) с использованием эндонуклеазы рестрикции AluI (Fermentas, Литва) по ранее описанной методике (Oshaghi et al., 2008a). Для этого 15 мкл ПЦР продукта смешивали с 2мкл 10х буферного раствора для рестриктазы AluI и 5ед рестриктазы. Реакцию проводили в течение часа и останавливали реакцию добавлением EDTA до конечной концентрации 20mM.

Клонирование ПЦР фрагментов, их фракционирование в агарозном геле, элюция фрагментов ДНК и их секвенирование проводили согласно стандартным протоколам.

Методы биоинформационного анализа. Анализ хроматограмм проводили с помощью программы CromasPro 13.3 (Technelysium, Australia). Выравнивание последовательностей, полученных в результате секвенирования, с последовательностями, размещенными в базах данных, проводили с помощью ресурсов, расположенных на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov, программ CLUSTAL W 1.83 (Thompson et al., 1994) и CLUSTAL X 2.1. (Larkin et al., 2007). Для статистической обработки последовательностей использовали программы BioEdit 7.0.5.3. (Hall, 1999). Для построения дендрограмм применяли программу MEGA 4.0. (Tamura et al., 2007) c использованием алгоритма neighbor joining (NJ). Для оценки статистической достоверности полученных дендрограмм была выбрана величина бутстрэп-поддержки не менее 70%.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ III.1. Морфологические признаки, цитогенетические и молекулярно генетические особенности комаров комплекса An. maculipennis С помощью морфологических, цитогенетических и молекулярно-генетических методов были исследованы 8 видов комаров комплекса An.maculipennis. Всего проанализировано 2151 особей комаров, собранных в 10 странах. В 300 кладках, полученных от напитавшихся самок, были изучены морфологические особенности яиц.

III.1.1. Морфология яиц у комаров комплекса An.maculipennis Морфология яиц была изучена у 8 представителей комплекса. На территории европейской части России An.maculipennis, An.messeae и An.atroparvus являются наиболее многочисленными видами, в южных и центральных регионах их ареалы симпатричны (Горностаева, Данилов, 2002). При анализе индивидуальных кладок An.maculipennis были обнаружены промежуточные варианты яиц. Количество пятен между черными перевязями на экзохорионе варьировало от практически полного их отсутствия до значительного количества. Изменчивость по признаку «количество пятен на экзохорионе яйца» была впервые отмечена в Македонии (Rice, Barber, 1937) и на Среднем Урале (Маркин, 1938), а впоследствии - в Армении, Одесской области и некоторых других регионах (Чубкова, 1948, Cеленс, 1953). При получении массовых кладок подобная картина изменчивости рисунка яиц существенно затрудняет видовую идентификацию.

В ряде исследованных регионов при получении индивидуальных кладок у An.messeae и An.atroparvus были обнаружены промежуточные варианты, у которых в разной степени были развиты темные поперечные перевязи у основания воздушных камер. Яйца еще одного представителя комплекса An.maculipennis – An.melanoon были либо полностью темные, либо с темными поперечными полосами и пятнами между полосами;

в последнем случае яйца An.melanoon были практически неотличимы от яиц An.messeae. Сходство кладок An.melanoon и An.messeae в свое время создало трудности при идентификации переносчиков малярии в ряде стран, в том числе в Грузии (Гакетт, Барбер, 1935;

Каландадзе, Сагателова, 1938) и Азербайджане (Ременникова, 1953, 1958;

Киясов, 1970, 1973;

Региональная стратегия, 2006), Турции (Postiglione et al., 1970), Греции (Linton et al., 2002) и на юге России (Маркович, 1936;

Калита, 1939). Во всех указанных регионах отмечали оба вида (An.messeae и An.melanoon), основываясь на признаках морфологии и окраски экзохориона яиц. В дальнейшем было показано, что в странах Закавказья, Турции и, вероятно, на юге России (начиная от Адлера - 43°4`c.ш.) распространен только An.melanoon, тогда как в Греции эти виды являются симпатричными (Postiglione et al., 1970;

Linton et al., 2002). Более того, темные яйца An.melanoon явно не отличались от хорошо пигментированных яиц в кладках An.messeae и An.atroparvus, что вызывало дополнительные сомнения в правильности идентификации этих видов. Проблема в изучении распространения An.melanoon усложнилась после описания нового вида, An.persiensis, обнаруженного на севере Ирана, яйца которого похожи на яйца An.melanoon (Sedaghat et al, 2003) Яйца An.sacharovi (Закавказье), An.martinius и An.artemievi (Средняя Азия) без воздушных камер и не различимы между собой. Идентификация этих видов проводилась нами с использованием цитогенетических и молекулярно-генетических методов анализа Таким образом, использование морфологических признаков для идентификации всех видов комплекса An.maculipennis затруднено из-за наличия промежуточных вариантов окраски экзохориона яйца и сходства морфологии яиц у некоторых видов.

.

III.1.2. Цитогенетический анализ комаров комплекса An.maculipennis Цитогенетическими методами было изучено 205 кариотипов An.maculipennis и An.melanoon, 48 An.atroparvus, 12 An.sacharovi и 425 An.messeae.

Кариотип An.atroparvus принят как «стандартный» (Frizzi, 1947,1953) При изучении полученных нами препаратов не удалось выявить каких-либо особенностей.

Кариотипы всех особей, собранных в южных регионах России (Краснодарский и Ставропольский край, Ростовская область, Калмыкия) по рисунку не отличались от фотокарт, сделанных в Западной Европе (Frizzi, 1947,1953) и на Украине, Молдавии, Ростовской области (Стегний, 1976, 1991;

Шуваликов,1986).

При изучении рисунка политенных хромосом An.maculipennis, собранных в регионах, не выявлено отличий от кариотипов, полученных ранее в Молдавии, Абхазии, на Украине, европейской части России и других исследованных ранее регионов (Стегний, 1976, 1991;

Шуваликов, 1986;

Гордеев, 1997). Редкая инверсия на левом плече второй аутосомы, описанная в молдавской популяции An.maculipennis Стегнием и Кабановой (1978), нами не обнаружена. Полученные нами данные показывают, что на всем изученном нами ареале этот вид является мономорфным. Сравнение кариотипов An.maculipennis с An.melanoon, собранного в Грузии и идентифицированного молекулярно-генетическими методами, подтвердило, что эти виды являются гомосеквентыми, т.е. имеют идентичную структуру политенных хромосом, и поэтому не могут быть диагностированы цитогенетическими методами.

Кариотипы An.sacharovi были исследованы в популяциях Грузии. Этот вид отличается от рассмотренных выше фиксированной инверсией в правом плече хромосомы 3R. В изученном нами материале никаких отличий от полученных ранее кариотипов выявлено не было.

Характерной особенностью полиморфных видов является наличие флуктуирующих хромосомных инверсий. Среди исследованных нами видов это явление было обнаружено у An. messeae. В изученных популяциях An.messeae нами выявлены только известные ранее хромосомные инверсии: XL1, XL4, 2R1, 3R1, 3L1 (табл. 2). Все они, кроме XL4, широко распространены по ареалу вида. Инверсия XL4 является эндемичной и встречается с низкой частотой (2%) в Пензенской и Московской областях.

На основании сходства кариотипической структуры популяций на территории Русской равнины нами было выделено три зоны - юго-западная, юго-восточная и центральная, - которые отличались по набору хромосомных перестроек и частотам отдельных инверсий (табл.2).

По хромосоме XL: В юго-западной и юго-восточной зонах отмечена высокая частота инверсионной последовательности XL0. В центральной зоне встречается инверсия XL4 и наблюдается повышенная частота инверсии XL1 (X2=73,3;

число степеней свободы df=2;

p0,001).

По хромосоме 2R: В юго-западной и юго-восточной зонах отсутствуют варианты с инверсией 2R1. В центральной зоне отмечена высокая частота гомо- и гетерозигот с этой инверсией (X2=218;

df=1;

p0,001).

По хромосоме 3R: Юго-восточная зона отличается от юго-западной и центральной зон по соотношению инверсионных генотипов (X2=35,8;

df=4;

p0,001). В юго-восточной зоне наблюдается максимальная частота гомозигот 3R11. Самая низкая частота вариантов с инверсией 3R1 отмечена в юго- западной зоне.

По хромосоме 3L: Три зоны отличались друг от друга по составу инверсионных вариантов (X2=93,5;

df=4;

p0,001). Юго-восточная зона характеризуется высокой долей вариантов 3L01 и 3L11. В центральной зоне отмечена минимальная частота особей с инверсией 3L1.

Три рассматриваемые зоны четко дифференцируются по кариотипическому составу. Центральная зона характеризуется более высоким уровнем инверсионного полиморфизма по всем хромосомам, кроме плеча 3L. Для двух южных зон отмечена высокая частота инверсии XL0, наблюдается полное отсутствие гомо- и гетерозигот по инверсии 2R1 и высокая доля особей с инверсией 3L1. Одновременно эти южные зоны имеют ряд различий. Особенностью юго-восточной зоны является увеличение частоты гомо - и гетерозигот по инверсиям 3R1 и 3L1.

Данные по кариотипической структуре популяций юго-восточной зоны Русской равнины получены впервые и хорошо согласуются с выводами В.Н. Стегния (1991) о клинальном характере изменчивости по инверсии 3R1 (увеличение частоты с запада на восток) и об увеличении доли гомозигот 3L11 на южной и восточной периферии ареала.

Таблица 2. Частоты инверсий у An.messeae в изученных зонах Русской равнины.

Частота Частота Частота Инверсии Центр Юго-Запад Юго-Восток (f ± sf, %) (f ± sf, %) (f ± sf, %) XL0 16 9,4±2,3 71 47±4,1 147 45,7±2, XL1 151 88,3±2,5 80 53±4,1 175 54,3±2, XL4 4 2,3±1,2 0 0 0 n` 171 151 2R00 44 39,6±4,6 207 100 96 2R01 49 44,2±4,7 0 0 0 2R11 18 16,2±3,5 0 0 0 3R00 59 53,2±4,7 76 79,2±3,5 106 51,2±3, 3R01 46 41,4±4,7 19 19,8±3,2 67 32,4±3, 3R11 6 5,4±2,1 1 1±1,0 34 16,4±2, 3L00 108 97,3±1,5 75 78,125±4,2 97 46,8±3, 3L01 3 2,7±1,5 20 21±4,2 85 41,1±3, 3L11 0 0 1 1±1,0 25 12,1±2, n 111 96 Примечание: n-число особей, n`-число половых хромосом XL у самцов и самок, f-частота инверсий по отдельным хромосомам, sf-стандартная ошибка.

III.1.3. Видовая идентификация комаров комплекса An. maculipennis методами молекулярно-генетического анализа Всего методами молекулярно-генетического анализа была исследована 1461 особь (табл.3).

Для определения видовой принадлежности комаров комплекса An.maculipennis были проанализированы размер и первичная структура второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2).

Видовая идентификация комаров An.beklemishevi проводилась на основании оценки размера продукта амплификации. Размер продукта An.beklemishevi, получаемого в результате ПЦР с праймерами 5,8S и 28S, составляет около 750 п.н., что почти в два раза больше, чем у остальных представителей комплекса (рис.1).

Рис.1. Электрофоретическое фракционирование ПЦР-продуктов транскрибируемого спейсера ITS2. M100 маркер молекулярного веса, дорожки 1-3 – An. maculipennis s.l., 4-6 - An.beklemishevi.

Идентификация комаров An. atroparvus, An.sacharovi, An.melanoon, An.messeae, An.persiensis и An.artemievi непосредственно после реакции амплификации с праймерами 5,8S и 28S была затруднена из-за сходства размеров ПЦР-продуктов. Идентификация этих видов осуществлялась в несколько этапов методом ПЦР-ПДРФ с использованием разработанных нами подходов. На первом этапе была проведена рестрикция ПЦР продукта с использованием эндонуклеазы CfoI (HhaI). Размеры фрагментов рестрикции представлены в таблице 4.

Таблица 4. Паттерны CfoI рестрикции ПЦР продукта области ITS2 комаров комплекса An.maculipennis Длина фрагментов рестрикции (п.н.) Вид 48 78 102 107 108 111 113 129 135 136 141 207 272 286 An. sacharovi + + + + An. messeae + + + + An. melanoon + + + + An. persiensis + + + An.maculipennis + + + An. atroparvus + + An. artemievi + + + + An. martinius + + + Таблица 3. Виды малярийных комаров комплекса An.maculipennis, определенные молекулярно-генетическими методами Области/ Виды и количество исследованных комаров, в скобках приведены номера секвенированных последовательностей ПЦР-продуктов (клонов) Страны ITS2, зарегистрированных в GenBank входе настоящего исследования An. An. An.messeae s.l. An.melanoon An.beklemishevi An. An. An.artemievi maculipennis atroparvus sacharovi persiensis Россия Карачаево- 83 Черкесия (AM409759, (AM409761) AM409760) Краснодарс- 76 35 кий край и (AM409773, республика AM Адыгея (FN646207. FN646206.1)) Ростовская 14 18 36(AM409770 обл. AM409772) Воронежс- 6 кая обл.

Калмыкия 5 14 27 (5(4)) (AM409762, AM409763, AM409764(FN 6211, FN646212), AM409765, AM (AM409767, AM409768)) Астраханс- 82(2(9) кая обл. (AM409784, AM (AM409786 AM409788) (FN FN646218) (FN FN646217) (AM AM409783)) Ставропольс- 3 кий край Пензенская 7 5(1(2)) обл. (AM409781) (AM (FN646204, FN646205)) Московская 1 10 (3(3)) обл. (AM409780) (AM409797, AM (FN646215) AM (FN646213, FN646214)) Республика 36 Алтай Якутия Томская обл. 6 (AM409775, AM409776) Беларусь 85 Закавказье Абхазия 57 1 Грузия 58 AM (AM269898 (AM271001) AM269738) Армения 48 Азербайд- 42 235 жан FN665790- FN665793, AM FN665792 FN665795, FN FN Центральная Азия Киргизия 18 15 (FN908225) Узбекистан 9(FN908219 FN908224) Казахстан 3(FN FN908218) Таджикис- тан Всего 485 (10) 89 (2) 500 (20(31)) 22 (1) 46 286 (4) 2 (2) 31 (9) Анализ полученных данных показал, что только три вида комплекса- An.atroparvus, An.sacharovi, An.maculipennis – могут быть идентифицированы на основании структуры паттернов рестрикции по рестиктазе CfoI. Паттерны рестрикции видов An.messeae, An.daciae, An.melanoon и An. artemievi плохо различались из-за сходства в размерах фрагментов рестрикции, в связи с чем для дифференциации этих видов был проведен дополнительный рестрикционный анализ.

Для этого был разработан подход, основанный на использовании эндонуклеаз рестрикции, имеющих сайты рестрикции в нуклеотидной последовательности только одного из четырех вышеназванных видов (специфически расщепляющих ПЦР-продукт лишь одного из вышеназванных видов с образованием паттернов рестрикции специфического размера). В каждом случае на начальном этапе исследования была проведена амплификация образцов ДНК с праймерами 5,8S и 28S. Для дифференциации видов An.messeae, An.daciae и An.melanoon были использованы рестриктазы MroXI, SacII и BstEII, а для дифференциации видов An.messeae и An. artemievi – эндонуклеазы рестрикции BstACI и BsuI.

ПЦР-ПДРФ ITS2 видов комплекса An.maculipennis CfoI CfoI CfoI CfoI CfoI An. An. An. An. messeae, An. daciae, An. messeae, atroparvus maculipennis sacharovi An. melanoon An. artemievi MroXI SacII BstEII BstACI BsuI An. messeae An. daciae An. melanoon An. messeae An. artemievi Рис.2. Схема пошаговой рестрикции видов комплекса An.maculipennis.

Наши результаты показали, что дифференциацию и идентификацию видов комплекса An.maculipennis можно проводить с помощью методов ПЦР и ПЦР-ПДРФ с использованием в качестве маркера области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2). Идентификация проводится в несколько этапов. На начальном этапе на основании размера продукта амплификации идентифицируется вид An. beklemishevi. Применение метода ПЦР-ПДРФ позволяет за несколько последовательных шагов идентифицировать 7 других представителей комплекса.

III.1.3.1. Первичная структура ITS2 у комаров An. maculipennis, An.atroparvus, An.sacharovi, An.persiensis, An.artemievi Для изучения внутривидового индивидуального полиморфизма области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов было проведено секвенирование продуктов амплификации образцов ДНК An. maculipennis, An.atroparvus, An.sacharovi, An.persiensis, An.artemievi. Анализ хроматограмм и сравнение нуклеотидных другими последовательностей, полученных в результате секвенирования, с последовательностями, размещенными в GeneBank, выявили идентичность последовательностей в пределах каждого из изученных видов. Комары An.maculipennis, An.atroparvus, An.artemievi, An.persiensis, An.melanon, An.sacharovi на изученной территории являются мономорфными по структуре второго внутреннего транскрибируемого спейсера, что позволяет считать эту область генома исключительно удобным маркером для видовой диагностики видов-двойников комплекса An.maculipennis.

III.1.3.2. Первичная структура ITS2 у An.messeae Особый интерес для исследования представляли два вида комплекса An.maculipennis – An. messeae и An. daciae. Последний вид описан в 2004 году. An. daciae был выделен из вида An. messeae (Linton et al., 2005). У An. daciae были обнаружены пять позиций, по которым нуклеотидная последовательность этой области генома вида отличалась от нуклеотидной последовательности второго внутреннего транскрибируемого спейсера комаров An. messeae.

Паттерны рестрикции An.messeae и An.daciae после обработки эндонуклеазой рестрикции CfoI не отличались. Для дифференциации видов были отобраны рестриктазы MroXI и BseGI. Эндонуклеаза MroXI имеет сайт рестрикции в последовательности нуклеотидов второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов An. messeae в положении 161, в котором у An. messeae находится тимин. Для рестриктазы MroXI не было выявлено сайтов рестрикции в соответствующей последовательности комаров An. daciae, в том числе и в положении 161, поскольку у An.

daciae в этом положении располагается аденин. Наличие аденина в положении последовательности второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов An. daciae приводит к возникновению сайта рестрикции эндонуклеазы BseGI, отобранной для идентификации этого вида и дифференциации An. daciae от An.

messeae.

ПЦР-ПДРФ анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции MroXI и BseGI был выполнен для 150 особей An.messeae. Паттерны рестрикции продуктов амплификации образцов ДНК 44 особей по эндонуклеазе рестрикции MroXI соответствовали An. messeae.

Обработка продуктов амплификации этих особей рестриктазой BseGI не выявила специфических сайтов рестрикции для данной эндонуклеазы. ПЦР-ПДРФ анализ образцов ДНК 106 особей из Московской, Астраханской, Пензенской, Воронежской, Волгоградской, Ростовской областей, республики Калмыкия и Краснодарского края показал, что в геноме этих особей обнаруживаются оба варианта последовательностей, один - специфичный для An. messeae и второй – специфичный для An. daciae. Например, после обработки образцов эндонуклеазой рестрикции MroXI и проведения электрофореза выявлялись как фрагменты длиной 152 п.н. и 275 п.н., характерные для An. messeae, так и нерестрицированный продукт амплификации длиной 427 п.н., характерный для An. daciae.

Полученные результаты свидетельствовали либо об отсутствии репродуктивных барьеров и частых межвидовых скрещиваниях симпатрических видов, либо о наличии предкового полиморфизма An. messeae как особенности вида. Для выбора альтернативной гипотезы было проведено прямое секвенирование продуктов амплификации. Анализ хроматограмм образцов, имеющих паттерны рестрикции, характерные для An. messeae ( особей), показал, что в изученных последовательностях обнаруживается только по одному сигналу в каждом из положений 161, 165, 167, 362, 382 (GenBank, Калмыкия: AM409762 AM409764, Астраханская область: AM409783, AM409784, Томская область: AM409775, AM409776), что соответствует нуклеотидам TTC GG. Анализ образцов, для которых был выявлен внутригеномный полиморфизм, показал, что в положениях 161 п.н., 165 п.н., п.н., 362 п.н., 382 п.н. на хроматограммах обнаруживается по два сигнала во всех или нескольких сайтах 161 п.н., 165 п.н., 167 п.н., 362 п.н., 382 п.н.

Для дальнейшего анализа были отобраны образцы, для которых внутригеномный полиморфизм был подтвержден методами ПЦР-ПДРФ и прямого секвенирования.

Продукты амплификации 16 особей из Московской (2), Пензенской (1), Волгоградской (3), Астраханской (3) областей, республики Калмыкия (2) и Краснодарского края (3) были клонированы. Всего было получено и секвенировано 29 клонов. При сравнении нуклеотидных последовательностей была выявлена их значительная изменчивость, как индивидуальная, так и внутривидовая (2,3%). Анализ только филогенетически значимых замен для образцов из центра европейской части (Московская и Пензенская области) показал, что варианты ITS2 в этих образцах соответствуют молекулярным формам 1, (An.messeae) и 5 (An.daciae) согласно классификации, предложенной Ди Лука и др. (Di Luca et al. 2004) (табл.5). На юго-западе европейской части (Краснодарский край) выявлены варианты ITS2 №4 (An.messeae) и №5 (An.daciae). Варианты последовательностей образцов из юго-восточных областей европейской части (Волгоградская, Астраханская области и Калмыкия) соответствовали № 1, 2, 3, (An.messeae) и 5 (An.daciae). Нами впервые были найдены еще две уникальные формы по филогенетически значимым сайтам. В трех особях (двух из Ростовской, одной из Астраханской областей) найдены комбинации нуклеотидов, характерные как для An.messeae, так и для An.daciae.

Полученные нами данные указывают на то, что европейская часть России как центр ареала и происхождения An.messeae, характеризуется высоким полиморфизмом первичной структуры второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов. Наши результаты не совпадают с результатами западных исследователей (Di Luca et al., 2004;

Nicolescu et al., 2004), также изучавших полиморфизм первичной структуры спейсера у комаров An. messeae. В цитируемых работах первичная структура ITS2 изучалась у комаров из локальных популяций, обитающих по краю ареала вида, где полиморфизм этого многокопийного элемента кластера может быть снижен и где в силу указанной причины, вероятно, представлен лишь один из вариантов последовательностей.

Таблица 5. Филогенетически значимые замены в области ITS2 у An.messeae Европейская часть РФ Молекулярные формы An.messeae Центр (по Di Luca et al, 2004) TTC AC- TTC AC-1 ATC AC- AAT AC- ATC AC- Юго-запад ATC GG-3 TTC GG - AAT AC- TTC GG-4=An.messeae s.s.

AAT AC-5=An.daciae (Linton et al,2004) Юго- Восток TTC AC- ATC AC- AAC AC- TTC GG - AAT AC- ATC AC ТТС АС Исходя из изложенного выше, можно считать неправомерным выделение An.daciae в качестве самостоятельного вида. Очевидно, что для An. messeae с его высоким инверсионным полиморфизмом, огромным ареалом и высокой пластичностью характерны внутривидовая и индивидуальная изменчивости второго внутреннего транскрибируеого спейсера, являющиеся, возможно, адаптивно значимыми для этого вида. Дальнейшие исследования изменчивости ITS2 An.messeae по всему ареалу помогут выявить закономерности во встречаемости разных вариантов этого маркера.

III. 2. Молекулярно-генетические особенности комаров An. claviger Проведено изучение особенностей первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов у 13 комаров An.

claviger из локальных географически удаленных популяций Абхазии, Краснодарского края и Беларуси.

Длина второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов у исследованных комаров An. claviger равна 315-336 п.н. Изменчивость размера фрагмента связана с многочисленными инсерциями/делециями длиной от двух до двадцати пар нуклеотидов.

Belarus 1. 80 Belarus. AY129232germany 91 Belarus. DQ229314.1Iran 98 DQ229313Iran Abhazia 100 Abhazia petragnani Gyuamskoe An.maculipennis 0, Рис. 3. Филогенетические связи между представителями комплекса An.claviger по данным анализа ITS2.

Филогенетический анализ, выполненный с привлечением базы данных GeneBank, позволяет выделить четыре варианта последовательностей второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов у An. claviger (рис.). Три группы, которые можно назвать: западно-европейской, иранской и абхазской, образуют кластер, обособленный от кластера, сформированного единственным вариантом ITS2, обнаруженным у комара из Гуамского ущелья, и An. petrognani (GenBank:AY129233). В пользу высказанного предположения о наличии четырех вариантов последовательностей ITS2 у комаров An. claviger свидетельствует высокий уровень бутстреп поддержки (94%).

Следует отметить, что каждая группа последовательностей маркируется специфическими инсерциями/делециями.

В ранних исследованиях An. claviger указывалось, что популяции вида различаются по признаку автогенности/неавтогенности самок. Специфическая структура последовательности ITS2 комаров из популяции Абхазии и кластеризация в отдельную группу с высокой бутстрэп поддержкой являются указанием на генетическую обособленность неавтогенной популяции. Биологические характеристики, которые сопровождают подобную обособленность, могли бы существенно дополнить популяционно-генетические данные.

Особый интерес представляют данные о структуре последовательности ITS2, обнаруженной у комара из Гуамского ущелья. Статистический анализ указывает на то, что данная последовательность имеет весьма высокий уровень различия с последовательностями ITS2 An. claviger, описанными другими авторами (GenBank:

DQ229313, DQ229314, AY129232) и нами – до 34,4 % при попарном сравнении. Различия первичной структуры ITS2 комара из Гуамского ущелья и комара близкородственного вида An. petrognani из Франции составили 30,5%. При попарном сравнении последовательностей ITS2 комаров из абхазской и белорусской популяций, а также немецкого и иранских вариантов с первичной структурой ITS2 An. petrognani различия достигают 39,6%. Отсутствие дополнительных данных, прежде всего данных по морфологии имаго и куколок и цитогенетике, не позволяют сделать однозначного вывода о таксономическом статусе находки. Высокая изменчивость структуры второго внутреннего транскрибируемого спейсера может быть особенностью вида An. claviger. С другой стороны, возможно существование криптических видов в комплексе An. claviger.

Несмотря на вышесказанное, на современной стадии исследований представляется возможным и желательным использование данных о первичной структуре второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов как маркера для диагностистики видов An. claviger и An. petrognani. С нашей точки зрения исключительно интересным представляется еще и возможность использования этого маркера для характеристики изменчивости локальных популяций вида An. claviger.

III.3. Морфологические и молекулярно-генетические особенности An.superpictus Интерес к этому виду обусловлен тем, что в Иране в 2007 году были описаны три молекулярные формы, открытие которых позволило авторам предположить, что An.superpictus является комплексом видов-двойников. Этот вид широко распространен в среднеазиатских республиках, что создает благоприятные условия для проверки этого предположения. Мы начали исследования с морфологического анализа. Известно, что форма А не имеет темного кольца на последнем членике максилярных щупиков, которое присутствует у формы В. Нами было просмотрено 39 самок из разных районов Туркменистана и Кыргызстана. Результаты показали, что на этих территориях преобладали морфологические типы A. Форма В была обнаружена в двух точках: в д.Сузак (Кыргыстан) - из 4-х исследованных самок 3 относились к форме В и в с.Узген самки из 13 были определены как форма В.

Анализ первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера был проведен с использованием 28S1 обратного праймера. Сравнение полученных последовательностей с материалом из международных баз данных показал, что в исследованных районах Кыргызстана и Туркменистана распространена только одна молекулярная форма, которая соответствует форме Х, описанной в Иране. Уровень сходства оказался равен 100%. Эта молекулярная форма обнаружена также в Греции, Узбекистане, Пакистане. По нашим данным, она представлена обеими морфологическими вариантами, т.е. формой А и В.

Для изучения молекулярно-генетической структуры популяций в целях оценки уровня полиморфизма и генетического разнообразия популяций An. superpictus был проведен ПЦР-ПДРФ анализ области COI-COII митохондриального генома переносчика.

В Туркменистане и Кыргызстане преобладал митотип X, наряду с ним, в Туркменистане и Кыргызстане отмечен митотип Y в единичных экземплярах. Более того, было выявлено два новых гаплотипа X1 в Туркменистане и Кыргызстане с паттернами рестрикции около 540 п.н., 420 п.н., 200 п.н., 150 п.н., 140 п.н. (1, 4 дорожки, рис. 4) и X2 в Кыргызстане около 540, 360, 280, 150, 140 (дорожка 2, рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма результатов рестрикции области COI-COII An. superpictus по сайту рестрикции AluI. 1 - An. superpictus из Туркменистана (Лебапский велоят, Керки);

2,3 - An. superpictus г. Ташкумыр;

4,5 - An. superpictus, пос. Сузак (Кыргызстан).

Таким образом, исходя из полученных результатов, морфологические формы An.superpictus не соответствуют молекулярным формам по ITS2 и COI-II. Более того, выявлено и несоответствие митотипов и молекулярных форм по ITS2, что не подтверждает ранние исследования. Обнаружены два новых митотипа Х1 (в Кыргызстане и Туркменистане) и Х2 (в Кыргыстане).

ГЛАВА IV. ФАУНИСТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Разработанный нами молекулярно-генетический подход был использован для уточнения видового состава комплекса An. maculipennis на территории России и сопредельных государств: Грузии, Армении, Азербайджана, Кыргызстана, Казахстана, Узбекистана, Таджикистана, Белоруссии.

При анализе 75 кладок комаров, собранных в Азербайджане в Ленкоранской низменности (с. Пенсар Астаринского р-на), в одной были обнаружены яйца, сходные по рисунку экзохориона с яйцами An. melanoon. Согласно данным, полученным в 30-40 г.г. и основанным на традиционных морфологических исследованиях, An. melanoon являлся одним из основных переносчиков малярии в Ленкоранской низменности (Киясов, 1970, 1973, Ременникова, 1953, 1958). Для определения видовой принадлежности самки, отложившей кладку, были проведены молекулярно-генетические исследования.

Сравнение последовательности нуклеотидов, полученной в результате секвенирования продукта амплификации (GenBank: AM409777), с последовательностями, размещенными в банке данных GenBank, показало, что первичная структура исследованной последовательности имеет полное (100%) сходство с нуклеотидными последовательностями (GenBank: AY137847-AY137817) недавно описанного на севере Ирана вида An. persiensis (Sedaghat et al, 2003). Таким образом, мы впервые обнаружили на территории Азербайджана новый для фауны стран СНГ вид - An. persiensis. Эта находка подтвердилась при исследовании материала, полученного из соседнего района (с.

Герматук Ленкоранский р-н) в 2009 г. (GenBank: FN665794). Очевидно, что ранние находки An. melanoon (=subalpinus) в Ленкоранском районе не относятся к An. persiensis.

Последний выявлен только на юге Азербайджана и встречается с низкой частотой.

Эпидемиологическое значение An. persiensis как переносчика малярии остается неясным.

В 2005 г. в Кыргызстане был описан An.artemievi (Гордеев и др., 2005).

Последовательность нуклеотидов второго внутреннего транскрибируемого спейсера этого вида отличается на 9% от последовательности наиболее близкого ему вида An.maculipennis, а кариотипы обоих видов идентичны. Яйца An.artemievi похожи с яицами An.sacharovi и An.martinius. Ареал этого нового вида до настоящего времени оставался практически не изученным. Чтобы восполнить этот пробел, мы проанализировали материал, полученный из Казахстана, Кыргызстана и Узбекистана с целью выявления An.artemievi. Был использован метод ПЦР-ПДРФ с последующим секвенированием продуктов амплификации. В результате было показано, что An. artemievi в пределах Кыргызстана распространён по всему Приферганью: Джалал-Абадская обл., нижнее течение р. Нарын (гг. Кара-Куль, Ташкумыр), г. Майлуу-Суу;

Ошская обл., окрестности г.

Узген, предгорья Алайского хребта (Кара-Суйский р-н., пос. Лангар, Алайский р-н., пос.

Гульча), Баткенская обл., пос. Кара-Токой (граница с анклавом Узбекистана Сох), вдоль границы области с Таджикистаном: пос. Кара-Бак (Баткенский р-н.), пос. Алга (Ляйлякский р-н.). Также этот вид обилен в Таласской обл. от г. Талас до пос. Кизил-Адыр (среднее течение р. Талас). Cамка этого вида отмечена на западе Нарынской обл. (пос.

Угют, среднее течение р. Нарын) на высоте 1600 м над у.м.

В Западном Узбекистане этот вид был обнаружен в Ферганской, Ташкентской и Кашкадарской областях. Ранее в этих регионах были отмечены An. maculipennis и An.

sacharovi (Чинаев, 1945, Таджиева, 1949). Нам не удалось обнаружить эти виды в проанализированном материале. Поэтому распространение An.maculipennis и An.sacharovi на указанной территории нуждается в дополнительной проверке. Нельзя исключить, что находки этих видов относятся к An.artemievi.

В Таджикистане An.artemievi отмечен в Согдийской области (Джаббад Расуловском районе (уч. Дехмой);

окрестности Худжанд (уч. Ева);

Исфаринский р-н).

An.artemievi был впервые обнаружен нами также на территории Казахстана (Южно Казахстанская область). Проведение дальнейших исследований позволит уточнить его ареал в этой стране.

Мы также уточнили распространение An. melanoon, впервые применив молекулярно-генетические методы анализа. Комары этого вида были найдены в Западной Грузии и Абхазии. Ранние находки в этих республиках An.messeae, который был определен по окраске яиц (Каландадзе, Сагателова, 1938, Cичинава, 1973), вероятно, также соответствуют An.melanoon, поскольку эти виды не различаются по морфологии яиц. Распространение An.melanoon в Восточной Грузии пока нами не установлено, хотя ранее этот вид единично находили в Алазанской долине (Каландадзе, Сагателова, 1938).

Представляется интересным в будущем с использованием методов молекулярно генетического анализа подтвердить здесь присутствие An.melanoon, т.к., возможно, именно в Восточной Грузии проходит восточная граница ареала вида, а все его находки в Прикаспийской низменности относятся к An.persiensis. Остается нерешенным вопрос о распространении An.melanoon на юге РФ. Ранее его отмечали на юге Краснодарского края (Калита, 1939), в Кабардино-Балкарии (Маркович, 1936) и Дагестане (Калита, 1939). В ходе работы обнаружить этот вид не удалось.

Специальные исследования были посвящены анализу распространения основных переносчиков в Закавказье;

к числу таких переносчиков относятся An.maculipennis и An.sacharovi. Результаты подтвердили данные, полученные ранее: An.maculipennis распространен по всей территории Грузии, а An.sacharovi - только в Восточной ее части (Канчавели, 1955).

Результаты изучения комплекса An.maculipennis в Армении согласуются с данными других исследователей. Согласно этим данным на территории Армении распространены только комары An.maculipennis и An.sacharovi (Чубкова, 1949).

Результаты молекулярно-генетического анализа, касающиеся распространения и относительной численности An.maculipennis и An.sacharovi в Азербайджане, совпадают с имеющимися в литературе сведениями (Лемер,1948;

Киясов, 1970;

Ануфриева и др.,1975).

An.sacharovi преобладает на сухих и теплых равнинах Азербайджана, An.maculipennis тяготеет к горным районам, а также встречается на севере страны в Самур-Дивичинской низменности.

Северная граница ареала An.sacharovi вероятно проходит на юге России, где его отмечали только в Дагестане (Шипицина, 1936). К сожалению, мы не имели возможность изучить фауну этой республики.

На территории России An.maculipennis обнаружен во всех изученных областях европейской части, что подтверждает результаты предыдущих исследований (Поликарпова, 1936;

Покровский, Муратова, 1936;

Беклемишев, Желоховцев,1937;

Данилова, Лаппин, 1937;

Данилова, Будымко, 1938;

Калита,1937, 1938;

Зима, 1964;

Шаркова, 1964). Неясным пока остается вопрос о северной границе распространения An.maculipennis. Вероятно, An.maculipennis викарирует на некоторой территории с An.beklemishevi в районе 55-60 градусов с.ш., а далее полностью замещается An.beklemishevi (Новиков, Алексеев, 1989). Последний вид найден нами на территории Алтайского края, что соответствует литературным данным (Стегний, 1991, Горностаева, 1998). В азиатской части Российской Федерации распространен именно An. beklemishevi, которого ранее не отличали от An. maculipennis из-за сходства в окраске яиц (Стегний, 1991).

An.atroparvus чаще встречается в приморской части Ростовской обл. и севера Краснодарского края;

на восток доходит вплоть до Волгорадской области, и на юг – до Черкесска и Гудаутского р-на (с. Приморский) Абхазии, что соответствует литературным данным (Беклемишев, Желоховцев, 1937;

Данилова, Лаппин, 1937;

Калита, 1937, 1938).

Несмотря на довольно большой проанализированный материал из Белоруссии, этот вид не был найден нами в этой стране, хотя ранее An.atroparvus там отмечали (Волкова, 2006).

An.messeae является самым распространенным видом в Палеарктике, он отмечен нами во всех исследованных регионах на территории России и Белоруссии. Остается нерешенным вопрос о самой южной границе его ареала на территории европейской части РФ. Вероятно, уже начиная от Адлера- 43°4`c.ш. распространен только An.melanoon, который проникает далее в страны Закавказья. На территории Средней Азии в соответствии с полученными нами данными An.messeae распространен в Иссык-Кульской обл. (гг. Балыкчи, Чолпон-Ата, Караколь), на севере Нарынской обл. (пос. Кочкорка, наиболее высокая точка, где нами встречен данный вид - 1879 м н.у.м.), в Чуйской обл.

(пос. Мраморное, окрестности аэропорта "Манас"). Не обнаружен в Таласской области и не проникает в южный регион Кыргызстана.

ВЫВОДЫ 1. В результате исследований уточнен видовой состав комплекса An.maculipennis: на территории России выявлено 4 вида (An.atroparvus, An.beklemishevi, An.maculipennis, An.messeae), в Ближнем зарубежье - 7 (An.atroparvus, An.artemievi, An.maculipennis, An.melanoon, An.messeae, An. persiensis, An.sacharovi). Впервые обнаружен новый для фауны стран СНГ вид - An. persiensis. Доказана неправомерность выделения An.daciae в качестве самостоятельного вида.

2. На основании анализа кариотипов An.messeae на территории Русской равнины выделены три зоны: центральная, юго-восточная и юго-западная. Комары центральной зоны характеризуется более высоким уровнем инверсионного полиморфизма по всем хромосомам, кроме плеча 3L. Для комаров южной зоны отмечена высокая частота инверсии XL0, наблюдается полное отсутствие гомо- и гетерозигот по инверсии 2R1 и высокая доля особей с инверсией 3L1.

Особенностью комаров юго-восточной зоны является увеличение частоты гомо - и гетерозигот по инверсиям 3R1 и 3L1.

3. По первичной структуре второго внутреннего транскрибируемого спейсера An.maculipennis, An.atroparvus, An.artemievi, An.persiensis, An.melanon, An.sacharovi мономорфны на изученной территории, An.messeae является полиморфным на внутривидовом и внутригеномном уровнях. Разработан молекулярно-генетический ключ для идентификации видов комплекса An.maculipennis.

4. На Европейской части России, Абхазии и Беларуси комплекс An.claviger представлен единственным видом - An.claviger. Для вида характерен инсерционно делеционный внутривидовой и внутригеномный полиморфизм первичной структуры второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов.

5. Выявленные на территории Кыргызстана и Туркменистана морфологические формы и митотипы An.superpictus не соответствуют молекулярным формам по ITS2 и COI-II. Обнаружены два новых митотипа Х1 (в Кыргыстане и Туркменистане) и Х2(в Кыргыстане).

6. Уточнены ареалы An.messeae, An.artemievi, An.melanoon и An.sacharovi. Южная граница распространения An.messeae проходит по территории Южного Казахстана и северного Кыргызстана;

северная граница ареала An.artemievi находится на территории южного Казахстана, а северная граница ареала An. persiensis доходит до Ленкоранской низменности на территории Азербайджана. Подтверждены ареалы An.melanoon, An.sacharovi An.messeae, An.maculipennis, An.atroparvus.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Bezzhonova OV, Goryacheva II. Intragenomic heterogeneity of rDNA internal transcribed spacer 2 in Anopheles messeae (Diptera: Culicidae).// J Med Entomol. May;

45(3):337-41.

2. Gordeev M., Zvantsov A., Goriacheva I., Shaikevich E., Bezzhonova O.V. Mosquitoes of the genus Anopheles (Diptera, Culicidae) in countries of the WHO European Region confronted with resurgence of malaria // World Health Organization Regional Office for Europe, Copenhagen. 2008. 34 p.

3. Безжонова О.В., Бабуадзе.А., Гордеев М. И., Горячева И. И., Званцов А. Б., Ежов М. Н.,Имнадзе П., Иосава М., Курцикашвили Г. Малярийные комары комплекса Anopheles maculipennis (Diptera, Culicidae) Грузии // Мед. паразитол. 2008.

Вып.3:32-6.

4. Безжонова О.В., Горячева И.И. Изучение видового состава комаров комплекса Anopheles maculipennis (Diptera, Culicidae) юга европейской части России и стран Закавказья // В сб.: Тезисы I Всероссийское Совещание по проблемам изучения кровососущих насекомых (Санкт-Петербург, Россия, 24-27 октября 2006 г.) Санкт Петербург: Изд-во ЗИН, 2006. - С. 20-22.

5. Безжонова О.В., Иваницкий А.В., Федорова М.В. Ночная активность нападения комаров (Diptera, Culicidae) в Волгограде и его окрестностях // Мед. паразитол.

2004. Вып. 4. С. 5-27.

6. Гордеев М.И., Безжонова О.В., Горячева И.И., Шайкевич Е.В., Званцов А.Б., Мамедов С., Мутдалибов Н., Гасымов Э., Ежов М.Н. Молекулярно-генетический анализ малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis (Diptera, Culicidae) Азербайджана // Мед. паразитол. 2010. Вып. 4:43-5.

7. Горячева И.И., Званцов А. Б., Гордеев М. И., Безжонова О.В., Усенбаев Н.Т., Ежов М. Н. Изучение переносчиков малярии в Кыргызстане An. superpictus, An. messeae и An. artemievi методами ПЦР-ПДРФ и прямого секвенирования // Мед. паразитол.

2011. Вып. 1:34-8.

8. Кешишьян А., Гордеев М. И., Безжонова О.В., Горячева И.И., Шайкевич Е.В., Званцов А. Б., Ежов М. Н. Генетический анализ малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis (Diptera, Culicidae) Армении// Мед. паразитол. 2009. Вып. 3.

С. 24 - 9. Лопатина Ю.В., Безжонова О.В., Федорова М.В., Булгакова Т.В., Платонов А.Е.

Комплекс кровососущих комаров (Diptera, Culicidae) в очаге лихорадки Западного Нила в Волгоградской области. III Виды, питающиеся на птице и человеке, и ритмы их ночной активности. // Мед. паразитол. 2007. Вып. 4. :37-43.

10. Львов Д.Н., Щелканов М.Ю., Джаркенов А.Ф., Галкина И.В., Колобухина Л.В., Аристова, В.А., Альховский С.В., Прилипов А.Г., Самохвалов Е.И., Дерябин П.Г., Воронина Ф.Г., Васильев А.В., Безжонова О.В., Львов Д. К. Популяционные взаимодействия вируса Западного Нила (Flaviviridae, Flavivirus) с членистоногими переносчиками, позвоночными животными, людьми в среднем и нижнем поясах дельты Волги, 2001-2006 гг. // Вопросы вирусологии. 2009. №.54. Вып.2. С.36-43.

11. Платонова О.В., Федорова М.В., Лопатина Ю.В., Безжонова О.В., Булгакова Т.В., Платонов А.Е. Комплекс кровососущих комаров (Diptera, Culicidae) в очаге лихорадки Западного Нила в Волгоградской области. II Особенности питания комаров в разных биотопах // Мед. паразитол. 2007. Вып. 2.:49-52.

12. Федорова М.В., Лопатина Ю.В., Безжонова О.В., Платонов А.Е. Комплекс кровососущих комаров (Diptera, Culicidae) в очаге лихорадки Западного Нила в Волгоградской области. I Видовой состав, сезонный ход численности // Мед.

паразитол. 2007. Вып. 1:41-6.

13. Федорова М.В., Безжонова О.В., Щелканов М.Ю., Львов Д.Н., Бушкиева Б.Ц., Куликова Л.Н. Орнитофильные комары (Diptera, Culicidae) России // В сб.:

Тезисы XII Международной орнитологической Конференции (Ставрополь, Россия, 31 января – 5 февраля 2006 г.). – Ставрополь: Изд-во СГУ, 2006.– С.528.

14. Федорова М.В., Безжонова О.В., Щелканов М.Ю. Орнитофильные комары Северо-Западного Прикаспия: видовой состав и сезонный ход численности // В сб.: Тезисы XII Международной орнитологической Конференции (Ставрополь, Россия, 31 января – 5 февраля 2006 г.). – Ставрополь: Изд-во СГУ, 2006. – С. 526-528.

15. Яшкова С.Е., Пашкович В.В., Себут Н.С., Самойлова Т.И., Ерофеева Н.И., Верещак Н.С., Волкова Т.В., Якович М.М., Сибатаев А.К., Храброва Н.В., Бухарская Е.Д., Безжонова О.В., Камлюк Г.Г. Энтомологический надзор за акаро-энтомофауной и другими биологическими объектами, имеющими энтомологическое значение в республике Беларусь. Информационно-аналитический бюллетень ГУ «Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» Министерства здравоохранения Республики Беларусь. 2008. Минск. 36 с.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.