авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Молекулярная экология метаногенных и метанотрофных архей гидротермальных мест обитания

На правах рукописи

МЕРКЕЛЬ АЛЕКСАНДР ЮРЬЕВИЧ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ МЕТАНОГЕННЫХ И МЕТАНОТРОФНЫХ АРХЕЙ ГИДРОТЕРМАЛЬНЫХ МЕСТ ОБИТАНИЯ Специальность 03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2013 1

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН).

Черных Николай Алексеевич, Научный руководитель кандидат биологических наук Дедыш Светлана Николаевна, доктор Официальные оппоненты биологических наук, ИНМИ РАН, заведующая лабораторией.

Кузнецов Борис Борисович, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" РАН, старший научный сотрудник, руководитель группы молекулярной диагностики.

Московский государственный Ведущая организация университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет.

Защита состоится «20» февраля 2013 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.224.01 при ИНМИ РАН по адресу: 117312, г. Москва, Проспект 60 летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН.

Автореферат диссертации разослан « » января 2013 г.

Ученый секретарь кандидат биологических наук, диссертационного совета Хижняк Татьяна Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Процессы образования и окисления метана – это количественно значимые компоненты глобального цикла углерода на Земле и, по видимому, они являлись таковыми на протяжении всего времени существования биосферы нашей планеты. Тем не менее, далеко не все филогенетические группы микроорганизмов, образующих и окисляющих метан, изучены в достаточной степени.

Процессы метаногенеза и сульфатзависимого окисления метана осуществляются археями, объединенными в родственные группы микроорганизмов, относящихся к типу Euryarchaeota (Strous & Jetten, 2004). Эти микроорганизмы широко распространены в природе, где метаногенные археи осуществляют терминальный этап в процессе анаэробного разложения органического вещества в условиях отсутствия высокопотенциальных акцепторов электронов, тогда как метанотрофные археи в составе синтрофных ассоциаций и при условии наличия сульфата осуществляют анаэробное окисление метана (Whitman et al., 2006;

Knittel & Boetius, 2009).

Использование гена 16S рРНК для детекции и идентификации метаногенных и метанотрофных архей в сложных микробных сообществах затруднено, поскольку обе эти физиологические группы не являются монофилетичными (Bapteste et al., 2005;

Knittel & Boetius, 2009). В связи с этим внимание ряда исследрвателей было обращено на ген метил-коэнзим М редуктазы (mcrA) (Springer et al., 2005;

Hales et al., 2006). Результаты, полученные во многих работах подтвердили эффективность использования данного функционального и филогенетического маркера для оценки разнообразия и распространения метаногенных и метанотрофных архей (Luton et al., 2002;

Hallam et al., 2003).

В экосистемах, ассоциированных с геотермальной активностью, где водород и метан образуются в результате высокотемпературных абиотических реакций, метаногенные и метанотрофные археи способны выполнять роль первичных продуцентов. Для некоторых термальных экотопов, таких как нефтяные месторождения, гидротермальные осадки, «черные курильщики», уже проведен ряд исследований по разнообразию и распространению метаногенных, а в некоторых случаях и метанотрофных архей (Teske et al., 2002;

Dhillon et al., 2005;

Jeanthon et al., 2005;

Miroshnichenko & Bonch-Osmolovskaya, 2006;

Ollivier & Cayol. 2010).

Настоящее исследование посвящено слабо изученным в этом отношении экотопам:

диффузным глубоководным гидротермальным выходам и наземным горячим источникам.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования была молекулярная детекция, идентификация и количественная оценка метаногенных и метанотрофных архей в гидротермальных экосистемах и реконструкция филогении этих групп микроорганизмов на основании общего функционального и филогенетического маркера – гена субъединицы метил-коэнзим М редуктазы (mcrA).

Основные задачи

исследования состояли в следующем:

1. Оценка распространения, численности и филогенетического разнообразия метаногенных архей в образцах диффузных флюидов глубоководных гидротермальных систем и в образцах наземных горячих источников с использованием молекулярных и культуральных подходов.

2. Создание масштабной реконструкции филогении метаногенных и метанотрофных архей на основе гена субъединицы метил-коэнзим М редуктазы (mcrA) c использованием обширной и современной базы данных.

3. Выявление из всего многообразия метанотрофных архей конкретных филогенетических групп, для представителей которых мы сможем прогнозировать адаптацию к высоким температурам.

4. Разработка систем праймеров для детекции термофильных групп метанотрофных архей.

5. Оценка распространения термофильных групп метанотрофных архей в образцах диффузных флюидов глубоководных гидротерм и в образцах наземных горячих источников.

Научная новизна и значимость работы. Впервые на большой выборке образцов проведена оценка количества и распространения метаногенных микроорганизмов в диффузных гидротермальных флюидах нескольких районов Тихого океана. Значительно расширены представления о разнообразии метаногенов в данных экотопах. Выявлена взаимосвязь между содержанием водорода в диффузных гидротермальных флюидах и характером метаногенной популяции этих флюидов.

Получены веские доказательства существования экстремально термофильных метанотрофных архей, а также получены данные об их распространении.

Впервые на большой выборке образцов проведена оценка распространения метаногенных микроорганизмов в наземных горячих источниках. Осуществлена количественная оценка структуры микробного сообщества трех горячих источников. Выявлены новые филогенетически обособленные кластеры некультивируемых метаногенных архей, и впервые показана их широкая распространенность в наземных горячих источниках. С помощью сочетания молекулярных и культуральных методов значительно расширены представления о разнообразии метаногенов, обитающих в наземных горячих источниках.

Проведена масштабная реконструкция филогении метаногенных и метанотрофных архей. Подтверждено отсутствие случаев горизонтального переноса гена mcrA.

Практическая значимость. Определен диапазон Г+Ц состава 16S рРНК, позволяющий прогнозировать адаптацию к высоким температурам архей некультивируемых групп.

Разработаны, а также in-silico и экспериментально проверены системы праймеров, позволяющие с высокой степенью специфичности амплифицировать гены 16S рРНК анаэробных метанотрофных архей кластера ANME-1, включая термофильные микроорганизмы этого кластера.

Получена стабильная синтрофная метанол-использующая метаногенная накопительная культура, растущая при 65С, представляющая интерес для очистки сточных вод целлюлозных производств.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на международных конференциях «AGU Fall Meeting 2009», «Biodiversity, molecular ecology and biogeochemistry of thermophiles – 2010», «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний 2011», на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии – 2011» и на на международной конференции «9th international congress on extremophiles – 2012».

Публикации. Материалы диссертации содержатся в 10 печатных работах: экспериментальных статьях и 6 тезисах.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на _ страницах машинописного текста и включает 20 рисунков и 10 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и их обсуждение, выводов и списка литературы, который содержит _ наименований.

Место проведения работы и благодарности. Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (ИНМИ РАН) и в лаборатории Джулии Хубер (The Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory). Секвенирование последовательностей генов 16S рРНК и mcrA выполнялось в Центре Биоинженерии РАН и в Центре сравнительной молекулярной биологии и эволюции MBL, США. Подбор олигонуклеотидных праймеров, а также анализ зависимости Г+Ц состава 16S рРНК архей и их температурного оптимума был проведен совместно с к.б.н. Лебединским А.В. (ИНМИ РАН). Автор выражает глубокую признательность д.б.н. Бонч-Осмоловской Е.А., к.б.н. Лебединскому А.В., к.б.н. Черных Н.А., д.б.н. Соколовой Т.Г., а также доктору Хубер Д.А. за практическую помощь и ценные советы. Автор приносит искреннюю благодарность всем сотрудникам Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

Объекты и методы исследования.

I.

Объектами исследования служили 16 проб воды и осадков наземных горячих источников полуострова Камчатка (Россия) и острова Сан-Мигель (Португалия), а также 50 проб диффузных гидротермальных флюидов из глубоководных сайтов, расположенных в семи районах Тихого Океана: вулкан Аксиал Симаунт, сегмент Индевор, а также пять глубоководных вулканов, расположенных вдоль Марианской Дуги. Для отработки методов детекции метаногенных и метанотрофных архей использовали пробы осадков Гданьской впадины (Балтийское море), осадков гиперсоленых содовых озер Кулундинской равнины, гидротермальных осадков Бассейна Гуаймас (Калифорнийский залив) и поверхностных осадков метановых сипов Мексиканского залива.

Молекулярные методы. ДНК выделяли ранее описанными методами (Tsai & Olson, 1991;

Huber et al., 2007). РНК выделяли с использованием набора RNAqueous 4 PCR (Ambion, Inc.) в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР амплификацию, гель-электрофорез, клонирование, денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ), количественную ПЦР, ПЦР с обратной транскрипцией проводили согласно общепринятым методикам (Маниатис и др., 1984;

Saiki, 1989;

Muyzer et al., 1993;

Kubista et al., 2006).

Анализ полученных нуклеотидных последовательностей. Нуклеотидные последовательности редактировали и собирали в программе BioEdit 7.1.3 (Hall, 1999), выравнивали в программе ClustalW (Thompson et al., 1994), объединяли в репрезентативные операционные таксономические единицы (ОТЕ) в программе cd hit (Li & Godzik, 2006). Совокупность всех полученных ОТЕ была проверена на наличие химер с помощью программы Pintail (Ashelford et al., 2005).

Филогенетичская реконструкция проводилась в программе ARB (Ludwig et al., 2004) с использованием алгоритма maximum-likelihood и непараметрического bootstrap анализа (100 повторов).

Разработка и проверка специфичности систем праймеров. Для разработки специфичных праймеров на ген 16S рРНК филогенетического кластера ANME- были использованы нуклеотидные последовательности из баз данных ARB-SILVA (www.arb-silva.de) и RDP (rdp.cme.msu.edu). Разработку праймеров проводили в программе MultiPot (Лебединский, неопубликованные данные). Проверку специфичности праймеров in silico осуществляли с помощью программы OligoReport и онлайн серверов Probe Match (RDP), probeCheck (Loy et al., 2008) и TestPrime (Klindworth et al., 2012).

Получение накопительных культур метаногенов проводили на среде № 203 DSMZ, с вариациями концентрации дрожжевого экстракта, соды и цистеина при различных температурах и значениях рН и с использованием ряда субстратов: H2/ CO2, формиат, ацетат, метанол, пропионат.

Результаты исследования и их обсуждение.

II.

1. Молекулярный анализ микроорганизмов диффузных флюидов глубоководных гидротерм на основе гена mcrA и 16S рРНК.

В ходе данной работы было проанализировано 50 образцов диффузных гидротермальных флюидов, отобранных в 42 глубоководных сайтах, расположенных в семи районах Тихого океана. Во всех случаях флюиды отбирали из выходов в базальтовой породе, не имеющих видимого осадочного слоя. Анализ проводили с использованием двух систем праймеров, специфичных к гену mcrA.

Ампликоны гена mcrA были получены из восьми образцов флюидов пяти различных гидротермальных сайтов (Табл. 1.). Для всех этих образцов были сконструированы Таблица 1. Характеристики образцов гидротермальных флюидов c положительным результатом амплификации гена mcrA.

Объем Общее Год Географические Координаты и Тип пробы, кол-во T, Образец Сайт отбора положение глубина матрицы л.* клеток °C проб ** ДНК Н.Д.

45.937 с.ш. 129. A3Sx10 2007 25.7 3. Zen з.д., 1519 м. ДНК Garden A3Sx11 2007 7.7 2. РНК A4Sx11 2007 31.1 2.6 1. Вулкан 45.922 с.ш. 129. Marker 109 л- Хребет ДНК A4Sx12 2007 31. з.д., 1526 м.

Axial Хуан де ДНК FS612 2008 24.8 Фука 45.926 с.ш. 129.979 2 5. ДНК FS619 9m 2008 35. з.д., 1519 м. 107 л- Сегмент 47.948 с.ш. 129. Easter 2 1. ДНК FS625 2008 22. з.д. 2198 м. 108 л- Endeavour Island Мариан. Вулкан NW 14.600 с.ш. 144. Fault 3 3. ДНК FS448 2006 25. Дуга в.д., 568 м. 107 л- Rota-1 Shrimp Объем отфильтрованного флюида, использовавшегося для выделения ДНК/РНК. ** * Концентрация клеток в окружающей морской воде была приблизительно равна 2.5 107 Л- (Данные любезно предоставлены D.A. Butterfield с соавторами).

библиотеки клонов гена mcrA, а также гена архейной 16S рРНК. Всего было получено 620 последовательностей гена mcrA и 338 последовательностей гена архейной 16S рРНК. На основании сходства (более 95%) транслированные нуклеотидные последовательности гена mcrA были объединены в 41 ОТЕ. На основании такого же уровня сходства нуклеотидные последовательности гена архейной 16S рРНК были объединены в 47 операционных таксономических единиц (ОТЕ). С целью определения филогенетического положения всех выявленных на основе гена mcrA микроорганизмов, была проведена масштабная филогенетическая реконструкция (Рис. 1), для чего из баз данных GenBank и FunGene было выбрано более шести тысяч полных и частичных последовательностей гена mcrA, которые в дальнейшем были объединены в 366 репрезентативных ОТЕ ( последовательностей некультивируемых микроорганизмов и 155 культивируемых видов метаногенов). В результате проведенного анализа было выяснено, что выявленные в образцах последовательности гена mcrA относятся к 3 порядкам культивируемых метаногенов: и Methanosarcinales, Methanomicrobiales Methanococcales, а также к двум кластерам некультивируемых архей: ANME-1 и MCR-2a (Рис. 1). Относительная представленность филогенетических групп в библиотеках клонов гена mcrA и гена 16S рРНК отображена на Рис. 2 и соответственно. Для всех проб, в которых были выявлены гены mcrA (за исключением A4Sx11), была проведена количественная ПЦР с целью оценки численности бактерий и архей (на основе гена 16S рРНК), а также метаногенов и анаэробных метанотрофов (на основе гена mcrA (Рис. 4)). Для подсчета количества копий гена mcrA методом количественной ПЦР использовали праймер qmcrA-F (5’ разработанный нами на основании GARGACCACTTYGGHGGTTC-3’), выравнивания всех полученных в ходе этой части работы нуклеотидных последовательностей гена mcrA. Данный праймер использовали в паре с праймером ML-R (Luton et al., 2002).

Рисунок 1. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа аминокислотных последовательностей субъединицы метил-коэнзим М редуктазы, полученных в ходе исследования диффузных флюидов гидротермальных систем Тихого океана. Дерево построено в программе ARB с использованием алгоритма maximum likelihood и bootstrap анализа (100 повторов, значения ниже 50% не показаны). Справа в виде таблицы черными квадратами обозначен положительный результат детекции определенных групп, цифрами внутри квадратов обозначено количество ОТЕ.

100% Отностительная представленность 80% филогенетических групп 60% 40% 20% 0% A3Sx10 A3Sx11 A4Sx11 A4Sx12 FS612 FS619 FS448 FS Methanococcoides Methermicoccus unidentified rice field soil mcrA Methanocorpusculum Methanococcus Methanothermococcus Methanocaldococcus Methanotorris ANME- MCR-2a Methanohalophilus related Рисунок 2. Отностительная представленность филогенетических групп в библиотеках клонов гена mcrA, полученных в ходе исследования диффузных флюидов гидротермальных систем Тихого океана.

100% Отностительная представленность филогенетических групп 80% 60% 40% 20% 0% A3Sx10 A3Sx11 A4Sx11 A4Sx12 FS612 FS448 FS619 FS MG II DHVEG- ANT06-052 DSEG MHVG MEG Methanococcus & Methanothermococcus Methanocaldococcus Thermococcus unclassified Pyrodictiaceae Firvidicoccaceae Ignisphaera Thermoproteaceae Thermofilum MG I THSCG SAGMEG Рисунок 3. Относительное содержание ОТЕ различных таксономических групп в библиотеках клонов гена архейной 16S рРНК, полученных в ходе исследования диффузных флюидов гидротермальных систем Тихого океана.

Рисунок 4. Количество копий генов бактериальной 16S рРНК, архейной 16S рРНК и mcrA в расчете на 10 нг ДНК, выделенной из образцов диффузных флюидов гидротермальных систем Тихого океана. Указан интервал стандартного отклонения. Показатели для калибровочных кривых: R20.99, эффективность от 91% до 96%.

Таким образом, на большой выборке образцов нами была проведена оценка количества, распространения и разнообразия метаногенных и метанотрофных архей в диффузных гидротермальных флюидах нескольких районов Тихого океана. Тот факт, что только в 5 из 42 сайтов удалось обнаружить метаногенов, свидетельствует об относительно слабом распространении микроорганизмов этой физиологической группы в исследуемом типе экосистем. Данный вывод подтверждается также и результатами количественной ПЦР: на метаногенов приходится от 0.2 до 6% архейной составляющей и до 0.5% от общей микробной популяции флюидов (Рис.

4). В 3 из 5 сайтов метаногены имели численность, достаточную для их детекции с помощью универсальных архейных праймеров на ген 16S рРНК, при этом были выявлены только преобладающие филогенетические группы (Рис. 3). В образцах двух сайтов (Marker 113 и 9m), в которых копийность гена mcrA была наиболее высокой (Рис. 4), доминировали представители порядка Methanococcales. Кроме того, представители порядка Methanococcales были обнаружены во всех образцах с положительным mcrA сигналом, за исключением образцов сайта Zen Garden (Рис. 2).

Таким образом представители именно этого порядка метаногенов наиболее распространены в гидротермальных экосистемах, что подтверждается литературными данными (Ollivier & Cayol, 2010).

Современные исследования (Wankel et al., 2011) выявили существенное (80%) обеднение по водороду диффузных гидротермальных флюидов хребта Хуан де Фука с температурой ниже 100С по сравнению с высокотемпературными флюидами тех же районов. Ванкель с соавторами объясняют снижение концентрации водорода в диффузных гидротермальных флюидах деятельностью гидрогенотрофных микроорганизмов, в том числе и метаногенов. Полученные в данной работе результаты позволяют предположить, что деятельность метаногенов не является основной причиной обеднения диффузных флюидов по водороду и что причину потребления водорода следует искать в деятельности микроорганизмов других физиологических групп.

Концентрация водорода в гидротермальных флюидах района вулкана Axial превышает значения константы полунасыщения в уравнение Моно (Ks) для штаммов Methanocaldococcus, выделенных из данной географической области (Ver Eecke et al. 2012). Для двух других районов (гидротермальное поле Endeavour и вулкан NW Rota-1) концентрация водорода в гидротермальных флюидах на выходе близка или ниже минимального значения, способного поддерживать рост этих микроорганизмов (Lupton et al., 2008;

Ver Eecke et al. 2012). Эти данные коррелируют с полученными нами результатами: в образцах вулкана Axial 96-100% последовательностей в библиотеке mcrA представлены гидрогенотрофными метаногенами культивируемых родов, тогда как в библиотеках mcrA образцов гидротермального поля Endeavour и вулкана NW Rota-1 значительная часть последовательностей (23% и 61% соответственно) относится к метилотрофным родам метаногенов (Methermicoccus и Methanococcoides) и к филогенетическим кластерам некультивируемым форм, субстратная специализация которых неизвестна (Рис. 2). Эти результаты указывают на важность использования отличных от водорода метаногенных субстратов для выделения представителей новых таксонов и оценки биоразнообразия метаногенов культуральными методами в изучаемых экотопах.

На сегодняшний день обнаружено более 500 гидротермальных выходов (Takai & Nakamura, 2011). При изучении таких экосистем внимание микробиологов в большинстве случаев сфокусировано на высокотемпературных (250-350С) концентрированных флюидах «черных курильщиков». Однако значительная доля морской воды циркулирует через диффузные гидротермальные выходы, температура которых на выходе в большинстве случаев не превышает 50С (Bemis et al., 2012;

Bourbonnais et al., 2012). Постепенно смешиваясь с морской водой при прохождении через океаническое дно, гидротермальные флюиды диффузных выходов образуют обширные зоны с температурами, оптимальными для развития различных групп термофильных микроорганизмов. Проведенный нами анализ Г+Ц состава нуклеотидных последовательностей гена архейной 16S рРНК показал, что во всех образцах низкотемпературных флюидов с положительным результатом детекции гена mcrA, за исключением A3Sx11, присутствуют филотипы термофильных микроорганизмов. Отсутствие седиментов в изучаемых сайтах и техника, применявшаяся для отбора образцов, минимизируют вероятность попадания термофильных микроорганизмов в образец из экотопов, расположенных над поверхностью океанического дна. Эти данные еще раз подтверждают обоснованность использования низкотемпературных гидротермальных флюидов для изучения микробной популяции, развивающейся в высокотемпературных зонах под поверхностью океанического дна.

На примере сайта Marker 113 у нас была возможность оценить изменчивость метаногенной популяции диффузных гидротермальных флюидов, сравнив результаты для образцов, собранных с интервалом в один год (образцы A4Sx12 и FS612). При небольшом изменении соотношения отдельных групп микроорганизмов структура популяции сохранялась, на что указывают данные анализа библиотек клонов как гена mcrA, так и гена архейной 16S рРНК. Наши результаты свидетельствуют о стабильности термальных анаэробных микрониш под поверхностью океанического дна изучаемого географического района. Кроме того, для сайта Marker 113 мы провели сравнение библиотек клонов гена mcrA, полученных на основе ДНК и мРНК. В библиотеке, основанной на мРНК, присутствуют последовательности mcrA метаногенов из родов Methanothermococcus, Methanocaldococcus, Methanococcus и незначительное количество Methanotorris, свидетельствуя о том, что данные микроорганизмы находились во флюиде в жизнеспособном состоянии (Рис. 2). Основным отличием библиотеки на основе мРНК являлось отсутствие гена, кодирующего изоэнзим метил-коэнзим М редуктазы (тип II), который преимущественно экспрессируется в экспоненциальной фазе роста микроорганизмов при оптимальной концентрации водорода (Pennings et al., 2000). Отсутствие экспрессии данного изоэнзима указывает на то, что микроорганизмы в изучаемом экотопе существуют в условиях субоптимальной концентрации водорода.

2. Детекция термофильных метанотрофных архей с помощью новых систем праймеров.

Мы провели анализ корреляции между Г+Ц составом гена 16S рРНК (PGC) и оптимальной температурой роста (Topt) для всех типовых штаммов архей (Рис. 5). В результате было установлено, что среди типовых штаммов архей с PGC выше 60% нет мезофилов, а с PGC выше 63% нет умеренных термофилов (Рис. 5). Кроме того, проведенный нами PGC анализ всех последовательностей архейных изолятов имеющихся в базе данных RDP (около 2500 последовательностей) подтвердил, что показатель PGC выше 60% может использоваться как пороговая величина для определения адаптации к архей к высоким температурам. Анализ Г+Ц состава более 900 нуклеотидных последовательностей 16S рРНК представителей метанотрофных архей (ANME), показал, что PGC шести ANME групп (ANME-1a, ANME-1b, ANME 1AT, ANME-2ab, ANME-2c и ANME-3) не превышает 58 мол % (Рис. 6), тогда как значение этого показателя для группы ANME-1GBa равно 63.34±0.58 мол %. Эти результаты позволили обоснованно прогнозировать адаптацию микроорганизмов группы ANME-1GBa к росту при высоких температурах. Кроме того, так как PGC других филогенетических кластеров анаэробных метанотрофов не превысел 58% процентов, то, основываясь на анализе полученной нами корреляции, мы можем считать представителей группы ANME-1GBa единственными кандидатами на экстремальную термофилию среди метанотрофных архей.

В ходе данной работы было in silico проверено 13 ранее опубликованных праймеров, специфичных к последовательностям 16S рРНК микроорганизмов кластера ANME-1. Было установлено, что только одна пара ранее опубликованных праймеров пригодна для амплификации генов 16S рРНК микроорганизмов группы ANME-1GBa (Miyashita et al., 2009), но она была разработана на основе лишь четырех весьма сходных нуклеотидных последовательностей, что резко повышает вероятность ее избыточной специфичности.

Рисунок 6. PGC анализ известных групп метанотрофных архей, с указанием интервала стандартного отклонения.

Рисунок 5. Корреляция между оптимальной температурой роста (Тopt) типовых штаммов архей и Г+Ц составом гена 16S рРНК (PGC).

Рисунок 6. PGC анализ известных групп метанотрофных архей, с указанием интервала стандартного отклонения.

Мы разработали праймеры, способные с высокой степенью специфичности амплифицировать гены 16S рРНК микроорганизмов всего ANME-1 кластера, включая его наиболее глубокое ответвление – группу ANME-1GBa: ANME-1_19F (5’-GAGGCYACTGCYATCAGMGT-3’), (5’ ANME-1_1118F (5’ CYCRCAGTTGCCAGCATCT-3’), ANME-1_1406R AYCYCACTCGGYTGGCTTGA-3’). Для экспериментального подтверждения специфичности праймеров использовали образцы морских осадков, в которых ранее уже были выявлены филотипы кластера ANME-1 (Табл. 2). В качестве первого объекта использовали образцы осадков сайта MC118 в Мексиканском заливе. Сайт MC118 (Mississippi Canyon Block 118) характеризуется наличием метановых сипов (Lapham et al., 2008;

Lloyd et al., 2010). На данном образце были протестированы три системы праймеров: ANME-1_19F — ANME-1_1406R, ANME-1_1118F — ANME 1_1406R, а также ANME-1_19F — ARCH_915R, где реверс-праймер является универсальным для всех архей (Stahl & Amann, 1991). Для каждой системы праймеров было получено 24 клона (Табл. 2;

Рис. 7). Несмотря на обилие микроорганизмов глубоких некультивируемых филогенетических линий в осадках сайта MC118 (Lloyd et al., 2010), при использовании систем праймеров ANME 1_19F — ANME-1_1406R и ANME-1_19F — ARCH_915R удалось специфично амплифицировать представителей двух групп: ANME-1a и b (83 и 17% библиотеки клонов соответственно). При этом выявляемое разнообразие филотипов и их соотношение в библиотеках клонов при применении этих двух систем праймеров были идентичны. При использовании системы праймеров ANME-1_1118F — ANME-1_1406R был получен один филотип (ANME-1b), что послужило подтверждением сниженной специфичности праймера ANME-1_1118F к группе ANME-1a. Еще одним объектом, на котором осуществлялась проверка разработанных праймеров, являлся образец геотермальных осадков сайта BIG Бассейна Гуаймас (Табл. 2). В геотермальных осадках Бассейна Гуаймас ранее уже было обнаружено значительное разнообразие филотипов анаэробных метанотрофов, в том числе относящихся к группам ANME-1AT и ANME-1GBa (Teske et al., 2002).

С использованием системы праймеров ANME-1_19F — ANME-1_1406R для сайта BIG 1 была секвенирована библиотека из 28 клонов, которые затем были объединены в 4 ОТЕ. Два из них были отнесены к группе ANME-1AT (7% библиотеки), и два — к группе ANME-1GBa (93% библиотеки) (Табл. 2). Таким образом, была экспериментально подтверждена пригодность разработанных праймеров для выявления двух наиболее глубоких ответвлений кластера ANME-1:

ANME-1AT и ANME-1GBa.

Скрининг анаэробных метанотрофов клаcтера ANME-1 проводили на той же коллекции образцов, которую использовали в первой части работы. Для четырех образцов (Табл. 2) из пятидесяти был получен положительный результат ПЦР реакции с системой праймеров ANME-1_19F — ARCH_915R. 366 секвенированных последовательностей гена 16S рРНК были объединены в 6 ОТЕ (Рис. 7). Все нуклеотидные последовательности 16S рРНК, полученные при анализе сайтов Bag City и Easter Island, и большинство (98%) последовательностей сайта Boardwalk были отнесены к группе ANME-1GBa. Г+Ц состав этих последовательностей составлял около 64%.

Таблица 2. Детекция метанотрофных архей с помощью систем праймеров, разработанных в ходе данного исследования. Характеристика образцов и результаты.

Образец Географические Координаты и Использовавшиеся Детектированные T, положение и сайт глубина системы группы ANME- °C праймеров* (количество ОТЕ) 1 2 3 AT a b GBa Мексиканский 28°,51.47 с.ш., MC118 5 +(2) +(1) +(2) - + + Залив, Каньон 88°,29.52 з.д., Миссисипи, сайт 880 м MC Хребет Хуан де 129°,59.354' з.д., НО НО 11,2 +(1) - - - + FS Фука, вулкан Axial, 45°,54.974' с.ш., сайт Bag City 1410 м Хребет Хуан де 129 °,5.967' з.д., НО НО 17.8 +(2) - - - + FS Фука, поле 47°,56.88' с.ш., Endeavour, сайт 2150 м Easter Island Хребет Хуан де 129 °,5.24' з.д., НО НО 16.4 +(2) + - - + FS Фука, поле 47°,58.11' с.ш., Endeavour, сайт 2150 м Boardwalk Марианская Дуга, 144°,46.62' в.д., НО НО 25 +(1) - + - FS вулкан NW Rota-1, 14°,36.06' с.ш., сайт Fault Shrimp 520 м Калифорнийский 111°,24.56' з.д., НО НО BG410 50- +(4) + - - + залив, Бассейн 27°,00.37' с.ш., Гуаймас, сайт BIG 1 2000 м * 1=ANME-1_19F - ANME-1_1406R, 2= ANME-1_1118F - ANME-1_1406R, 3= ANME-1_19F – ARCH_915R. НО – не определялось. Жирным шрифтом обозначены образцы гидротермальных флюидов Все последовательности 16S рРНК ANME-1, полученные при анализе сайта Fault Shrimp, принадлежали группе ANME-1a, а 2% последовательностей сайта Boardwalk - группе ANME-1AT. Использование разработанных систем праймеров для анализа образцов наземных горячих источников (см. третью часть работы) не дало результатов.

Только в образцах сайта Easter Island нам удалось выявить представителей кластера ANME-1 при амплификации генов метил-коэнзим М редуктазы (см. первую часть работы). В этом же сайте при использовании 16S рРНК-специфичных праймеров были детектированы только представители группы ANME-1GBa, что позволяет приписать полученные mcrA последовательности именно к этой группе.

На сегодняшний день не существует прямых доказательств участия группы ANME 1GBa в процесс анаэробного окисления метана (АОМ). Тем не менее, сравнение аминокислотных последовательностей метил-коэнзим М редуктазы ANME-1GBa c кристаллизованной и детально описанной метил-коэнзим М редуктазой анаэробных метанотрофных архей (Meyerdierks et al., 2010;

Shima et al., 2012) выявило высокий уровень сходства (92%), что является веским подтверждением метанотрофной специализации микроорганизмов группы ANME-1GBa.

Рисунок 7. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнительного анализа фрагментов гена 16S рРНК. На данной дендрограмме последовательности, полученные в ходе настоящей работы, объединены в 14 ОТЕ (на дереве они обозначены жирным шрифтом). Первые пять символов в названии ОТЕ обозначают использованный образец, в скобках указан номер системы праймеров ( 1=ANME-1_19F - ANME-1_1406R, 3= ANME-1_19F – ARCH_915R). Черным квадратом обозначены детектированные ОТЕ с высоким содержанием ГЦ пар (более 62%).

Представленные ОТЕ депонированы в базе данных GenBank под номерами JQ740748-JQ740762.

Превалирующая в клональных библиотеках сайтов Bag City, Easter Island и Boardwalk группа ANME-1GBa ранее была выявлена только в Бассейне Гуаймас (Teske и др., 2002;

Biddle и др., 2011). Полученные нами данные свидетельствуют о более широком распространении этой группы термофильных метанотрофных архей в гидротермальных сайтах различных по географическому положению и геологическим характеристикам. Кроме того, опираясь на полученные результаты можно предположить, что микроорганизмы группы ANME-1GBa являются доминирующими представителями метанотрофных архей кластера ANME-1 в диффузных гидротермальных системах Тихого океана.

Тот факт, что метанотрофные археи кластера ANME-1 были выявлены лишь в четырех из 42 неседиментированных сайтах говорит только об эпизодическом присутствии этих микроорганизмов в изучавшихся экотопах. Литературные данные также свидетельствуют о том, что неседиментированные экотопы не являются характерными местами обитания метанотрофных архей. Это может быть объяснено отсутствием метаногенеза и соответственно метана в подобных местах обитания.

Однако, при отсутствии видимых осадков в исследованных сайтах существуют химические данные, указывающие на наличие обширных залежей осадочных пород в сайтах поля Endeavour. Содержание метана во флюидах этого сайта очень высоко (до 3мМ). Указаний на существование подобных залежей в сайтах вулканов Axial и NW Rota-1 нет. Однако метаногены, присутствующие в тех же сайтах (см. первую часть работы) могут снабжать метаном анаэробных метанотрофов. Учитывая (1) предполагаемую термофилию микроорганизмов группы ANME-1GBa, (2) низкую температуру изучавшихся флюидов на выходе, (3) отсутствие осадков на поверхности изучавшихся сайтов, (4) данные о залежах осадочных пород под поверхностью изучавшихся сайтов мы можем предположить, что детектированные нами метанотрофные микроорганизмы выносятся на поверхность потоком флюида из высокотемпературных зон, расположенных под поверхностью океанического дна.

Несмотря на большой интерес к микроорганизмам, осуществляющим анаэробное окисление метана, ни один представитель данной физиологической группы до настоящего момента не был выделен в чистую культуру. Предполагается, что одной из основных причин сложности их выделения является низкий уровень изменения свободной энергии Гиббса (Go 40 kJ mol1) в проводимой ими реакции и, как следствие, низкая скорость роста (Knittel & Boetius, 2009). В связи с этим, особый интерес многих исследователей вызывает термофильный процесс AOM, так как теоретические расчеты показывают, что G сульфатзависимого AOM возрастает при повышении температуры (Holler et al., 2011). В настоящей работе было получено убедительное подтверждение существования термофильных микроорганизмов, относящихся к кластеру анаэробных метанотрофных архей ANME-1.

3. Оценка разнообразия, распространения и численности метаногенных архей в наземных горячих источниках на основе молекулярных и культуральных подходов.

Мы провели скрининг 16 горячих источников п-ова Камчатка (Россия) и о-ва Сан-Мигель (Португалия) с использованием праймеров, специфичных к гену mcrA (Табл. 3). Целевые последовательности были успешно амплифицированы из ДНК горячих источников. Полученные ампликоны были разделены с использованием ДГГЭ. Все отсеквенированные полосы были объединены в 26 ОТЕ на основании сходства аминокислотных последовательностей выше 95% (Табл. 3). Полученные ОТЕ были отнесены к нескольким таксономическим группам культивируемых метаногенов: Methanosaeta, Methanocellales, Methanobacteriales, и двум кластерам некультивируемых микроорганизмов: MCR-2a и MCR-2c (Рис. 8).

С целью оценки численности метаногенных архей, архей в целом и бактерий была проведена количественная ПЦР для проб из трех горячих источников:

Термофильный, Заварзина и 2012 (Рис. 9). Самую высокую численность метаногены имеют в горячем источнике 2012, при этом составляя менее 0.1% от общей численности прокариот.

Таблица 3. Характеристики горячих источников.

Горячий источник Географическое положение. TC pH mcrA Термофильный 72 6.3 + (5) Заварзина Восточное 57 6.2 + (2) Кальдера Узон термальное поле Трещинный 74 6.5 П-ов. Камчатка 1831 77 6.5 + (2) Бурящий (котел) 89 6.0 + (1) Центральное Бурящий (ручей) 52 7.7 + (2) термальное поле Подводный грот 79 5.7 + (1) Кухонный оз. Восьмрка 51 5.9 + (1) 2012 58 5.7 + (6) Долина Гейзеров 2009 91 7.9 2202 80 7.5 + (1) 2203 49 2 Португалия, остров Сан 2205 66 6.5 + (2) Мигель 2209 74 5.7 + (2) 2210 61 6.5 2213 75 5.5 + (1) Рисунок 8. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей субъединицы метил-коэнзим М редуктазы, полученных в ходе исследования наземных горячих источников. Дерево построено в программе ARB с использованием алгоритма maximum likelihood и bootstrap анализа (100 повторов, значения ниже 50% не показаны). Справа в виде таблицы черными квадратами обозначена положительная детекция групп в образцах, цифрами внутри квадратов обозначено количество ОТЕ.

Рисунок 9. Количество копий генов бактериальной 16S рРНК, архейной 16S рРНК и mcrA в расчете на 1 нг выделенной ДНК с указанием интервала стандартного отклонения.

Характеристики калибровочных кривых: R20.997, эффективность от 70% до 99%.

Источник 2012 был выбран для оценки соотношения различных групп метаногенов и для определения состава архейной популяции в целом. Для этого были сконструированы библиотеки клонов генов mcrA и 16S рРНК. Результаты секвенирования библиотек клонов показали доминирование некультивируемых микроорганизмов кластера MCR-2c (по гену mcrA) и некультивируемых микроорганизмов кластеров pSL12 и THSCG (по гену 16S рРНК). Соотношение выявленных таксономических групп представлено на Рис. 10.

Для оценки разнообразия метаногенов в горячем источнике 2012 на основе культурального подхода использовались различные вариации параметров накопительных культур: температура от 55 до 70 С, pH от 5.0 до 7.5 и ряд субстратов: H2/CO2, формиат, ацетат, метанол, пропионат. Во всех случаях использовали среду DSM №203 (Methanothermus fervidus medium). В итоге было получено пять стабильных накопительных культур (Табл. 4). Для идентификации метаногенов в накопительных культурах были амплифицированы, разделены с помощью ДГГЭ и секвенированы гены mcrA и 16S рРНК. Было идентифицировано три метаногенных микроорганизма, отнесенных к родам Methanothermobacter, Methanosaeta, Methanomethylovorans (Рис. 11;

Табл. 4).

В метаногенной накопительной культуре на метаноле, полученной при 65С и рН 7.0 (2012-MDEC65) в качестве единственного метаногенного микроорганизма нами идентифицирован представитель вида Methanothermobacter thermautotrophicus.

Представители рода Methanothermobacter могут использовать только H2/ CO2 и в некоторых случаях формиат в качестве метаногенных субстратов. Микроскопия культуры 2012-MDEC65 помимо характерных для рода Methanothermobacter относительно тонких и длинных палочек выявила также большое количество коротких и относительно широких палочек, морфология которых не характерна представителям рода Methanothermobacter.

5% 3% 1% 7% 21% 8% 30% 9% 4% 9% 9% 68% 26% B A pSL12 THSCG Methanosaeta MCR-2a MCR-2c Thermoprotei SAGMEG TMCG Methanobacteriales mcrA DSEG ANT06-05 OPPD Methanosaeta Рисунок 10. Соотношение филогенетических групп в библиотеках последовательностей гена mcrA (A) и гена архейной 16S рРНК (B) горячего источника 2012.

Таблица 4. Метаногенные накопительные культуры (горячий источник 2012).

Процент Процент Ближайший Тем., сходства сходства по Культура Субстрат* культивируемый pH по гену гену °C метаноген.

16S рРНК.

mcrA Methanothermobacter 2012-HTEC 60°С 6.5 H2/ CO2 97% 99% thermautotrophicus.

Methanothermobacter Формиат 2012-FREC 60°С 6.5 97% 99% thermautotrophicus.

88% 98,2% Methanosaeta thermophila Ацетат 2012-ACEC 55°С 6.0 Methanothermobacter 97% 99% thermautotrophicus.

2012- Methanomethylovorans Метанол Н. О.

55°С 7.0 99% MDEC55 thermophila 2012- Methanothermobacter Метанол 65°С 7.0 97% 99% MDEC65 thermautotrophicus.

*1. Концентрация вносимого субстрата – 20мМ для жидких субстратов, 14.5 ммоль/л для водорода.

В результате идентификации бактериальной составляющей культуры 2012 MDEC65 с помощью амплификации, ДГГЭ и секвенирования гена 16S рРНК было установлено, что основной бактериальный филотип данной культуры отдаленно родственен микроорганизмам родов Thermacetogenium и Syntrophaceticus. Данный микроорганизм имеет 90% сходства к Thermacetogenium phaeum и 89% сходства к Syntrophaceticus schinkii по гену 16S рРНК (Рис. 12).

2012-MDEC55 2012-ACEC 2012-MDEC Рисунок 11. Накопительные метаногенные культуры. Световая микроскопия. Шкала 10 мкм.

A Рисунок 12. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа последовательностей гена бактериальной 16S рРНК, построенное в программе ARB с использованием алгоритма maximum likelihood и bootstrap анализа (100 повторов, значения ниже 50% не показаны). Черным квадратом обозначен идентифицированный бактериальный филотип метанол-использующей метаногенной накопительной культуры 2012-MDEC Результаты проведенного анализа показали, что ген метил-коэнзим М редуктазы присутствует в микробных сообществах большого количества наземных горячих источников: в данном исследовании он был выявлен в 75% образцов горячих источников. При этом результаты, полученные с использованием количественной ПЦР, свидетельствуют о низкой численности метаногенов в исследованных источниках. В ходе данной работы представители ряда филогенетических групп метаногенов: MCR-2a, MCR-2c, Methanocellales, Methanomethylovorans, - впервые были детектированы в наземных горячих источниках.

Микроорганизмы, представляющие порядки культивируемых метаногенов (Methanosarcinales, Methanocellales и Methanobacteriales), обнаружены лишь в некоторых горячих источниках (в 4 из 12 источников с положительным mcrA сигналом), тогда как представители некультивируемого кластера MCR-2a были выявлены в каждом источнике с положительным результатом амплификации гена mcrA.

Только в одном случае два разных подхода - культуральный и молекулярный дали сходные результаты при оценке разнообразия метаногенов в горячих источниках. В библиотеках по гену mcrA и по гену 16S рРНК был детектирован тот же филотип рода Methanosaeta, что и в накопительной культуре 2012-ACEC.

Основываясь на уровне сходства к Methanosaeta thermophila по гену mcrA и по гену 16S рРНК, полученный нами в виде накопительной культуры микроорганизм может представлять новый вид рода Methanosaeta. В обеих библиотеках филотипы рода Methanosaeta были представлены значительным количеством последовательностей (21% для библиотеки по гену mcrA и 9% для библиотеки по гену 16S рРНК). Все выделенные на сегодняшний день микроорганизмы этого рода способны только к ацетокластическому метаногенезу. В проведенных ранее исследованиях (Ward & Olson, 1980;

Sandbeck & Ward, 1981) на ряде горячих источников Йеллоустона было показано, что по сравнению с гидрогенотрофными метаногенами, активность ацетокластических метаногенов очень низкая или недектируемая. Полученные нами данные на примере источника 2012 свидетельствуют о значимости ацетокластических метаногенов в общем процессе метаногенеза в горячих источниках при умеренно высоких температурах.

Два других полученных в виде накопительной культуры метаногенных микроорганизма - Methanothermobacter thermautotrophicus и Methanomethylovorans thermophila - не были выявлены при использовании молекулярных подходов, что, вероятно, говорит о их низкой численности в микробном сообществе и приверженности к r-стратегии.

В данной работе удалось получить две метанол-использующие метаногенные культуры, осуществляющие этот процесс при двух различных температурных режимах: 55 и 65С. В первом случае метаногенез осуществлялся представителем рода Methanomethylovorans. Филотипы, относящиеся к данному роду, ранее не были детектированы в геотермальных экосистемах. Примечательно, что полученный нами из горячего источника Камчатки микроорганизм имеет сходство 99% по белок кодирующему гену (mcrA) к штамму, выделенному из метанол-использующего анаэробного реактора в Голландии. Во втором случае (65С) образование метана из метанола предположительно осуществлялось синтрофной культурой, состоящей из гидрогенотрофного метаногена, отнесенного к роду Methanothermobacter, и синтрофной бактерии, представляющей новую филогенетическую линию внутри семейства Thermoanaerobacteraceae (Рис. 12).

Одним из важных результатов данной работы можно считать масштабную реконструкцию филогении метаногенных и метанотрофных архей, проведенную с использованием более 6000 нуклеотидных последовательностей гена mcrA. Это позволило упорядочить имеющийся на сегодняшний день значительный объем данных по детекции некультивируемых микроорганизмов на основе гена mcrA, а также провести независимый от набора референсных последовательностей филогенетический анализ. Данная реконструкция показала, что кластеры некультивируемых архей MCR-2а и MCR-2с, которые в ходе данной работы впервые были детектированы в гидротермах, являются одними из наиболее глубоких и филогенетически обособленных ответвлений микроорганизмов, обладающих метил коэнзим М редуктазой. Кластер MCR-2а представляет особый интерес, так как последовательности, отнесенные к этому филогенетическому ответвлению были выявлены не только во всех исследовавшихся горячих источниках с положительной амплификацией гена mcrA, но также и в диффузных флюидах глубоководных гидротермальных систем, что свидетельствует о широкой распространенности данного кластера в экосистемах, ассоциированных с геотермальной активностью. В ряде других исследований (данные получены при анализе базы данных Genbank) кластер MCR-2a был обнаружены в подземных экосистемах, грязевых вулканах, болотах и метантенках. Второй детектированный нами филогенетический кластер MCR-2с интересен в связи с тем, что последовательности именно этого глубокого ответвления архей значительно превалировали в клональной библиотеке гена mcrA источника 2012 (68%). Кластер MCR-2с также широко распространен в природе (данные получены при анализе базы данных Genbank). Он был детектирован в таких местах обитания как болота, метантенки, пищеварительные тракты животных, почвы, гиперсоленые и подземные экосистемы. Именно на характере распространения представителей кластеров MCR-2a и MCR-2с основана наша гипотеза о принадлежности этих микроорганизмов к метаногенным, а не к метанотрофным археям, так как перечисленные выше экотопы основываясь на литературных данных можно считать не характерными для анаэробных метанотрофных микроорганизмов. При анализе созданной реконструкции филогении гена mcrA, не было выявлено ни одного случая несоответствия между филогенетическим положением культивируемого метаногена на основе гена mcrA и на основе гена 16S рРНК. Этот результат подтвердил отсутствие случаев горизонтального переноса гена mcrA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе с использованием гена метил-коэнзим М редуктазы (mcrA) в качестве функционального и филогенетического маркера на большой выборке образцов проведена оценка количества, распространения и разнообразия метаногенных микроорганизмов в диффузных гидротермальных флюидах нескольких районов Тихого океана. Показано, что метаногенные микроорганизмы относительно редко выявляются в диффузных флюидах глубоководных гидротерм и составляют незначительную часть микробной популяции. Эти данные позволяют предположить, что деятельность метаногенов не является основной причиной обеднения диффузных флюидов по водороду. Было выяснено, что в большинстве случаев доминирующими и наиболее распространенными метаногенами в данных экотопах являются представители порядка Methanococcales, при этом характер метаногенной популяции в значительной степени зависит от концентрации водорода: во флюидах с высоким его содержанием метаногенное сообщество представлено культивируемыми гидрогенотрофными микроорганизмами родов Methanocorpusculum, Methanothermococcus, Methanocaldococcus, Methanococcus и Methanotorris, а в диффузных флюидах с низким содержанием водорода существенная доля метаногенного сообщества (23 - 61%) представлена метилотрофными микроорганизмами родов Methanococcoides и Methermicoccus, а также некультивируемыми микроорганизмами, субстратная специализация которых неизвестна.

При изучении архейной популяции с использованием гена 16S рРНК в качестве филогенетического меркера в большинстве образцов низкотемпературных гидротермальных диффузных флюидов были выявлены филотипы термофильных микроорганизмов. Кроме того, результаты анализа образцов, собранных в разные годы, свидетельствуют о стабильности термальных анаэробных микрониш, образуемых диффузными выходами. Эти данные подтверждают предположения, что флюиды диффузных гидротерм образуют стабильные зоны с температурами, оптимальными для развития различных групп термофильных микроорганизмов.

Детальный анализ корреляции между Г+Ц составом гена 16S рРНК и оптимальной температурой роста типовых штаммов архей, а также анализ Г+Ц состава более 900 нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК метанотрофных архей позволил выявить конкретную филогенетическую группу анаэробных метанотрофов (ANME-1GBa), представители которой наиболее вероятно являются экстремальными термофилами. В дальнейшей работе были разработаны, а также in-silico и экспериментально проверены системы праймеров, позволяющие с высокой степенью специфичности амплифицировать гены 16S рРНК анаэробных метанотрофных архей кластера ANME-1, включая представителей группы ANME-1GBa. C помощью этих систем праймеров значительно расширены представления о распространении этих термофильных микроорганизмов.

С использованием культурального и молекулярно-экологического подходов проведена оценка распространения и разнообразия метаногенных микроорганизмов в наземных горячих источниках. Осуществлена количественная оценка структуры микробного сообщества трех горячих источников. Показано, что метаногенные микроорганизмы присутствуют в большинстве наземных горячих источников, составляя при этом незначительную часть микробной популяции. Существенно расширены представления о разнообразии метаногенов в данных экотопах: впервые для наземных горячих источников показано присутствие метаногенов таких филогенетических групп как MCR-2c, Methanocellales, Methanomethylovorans и Кластер представляет особый интерес, так как MCR-2a. MCR-2а последовательности, отнесенные к этому глубокому филогенетическому ответвлению, были выявлены не только в большинстве горячих источниках, но также и в диффузных флюидах глубоководных гидротерм. Это свидетельствует о широком распространении данного кластера в экосистемах, ассоциированных с геотермальной активностью.

В результате использования культурального подхода был получен ряд накопительных культур, метаногены в которых были представлены микроорганизмами родов Methanothermobacter, Methanosaeta, Methanomethylovorans. Две метанол-использующие накопительные культуры, были способны осуществлять метаногенез при различных температурных режимах. Эти культуры могут представлять интерес для биотехнологической очистки сточных вод целлюлозных производств.

ВЫВОДЫ 1. На большой выборке образцов показано, что метаногенные микроорганизмы относительно редко выявляются в диффузных флюидах глубоководных гидротермальных систем и составляют незначительную часть микробной популяции. В большинстве случаев доминирующими и наиболее распространенными метаногенами в данных экотопах являются представители порядка Methanococcales.

2. Установлено, что в диффузных гидротермальных флюидах с высоким содержанием водорода метаногеное сообщество представлено культивируемыми гидрогенотрофными микроорганизмами родов Methanocorpusculum, Methanothermococcus, Methanocaldococcus, Methanococcus и Methanotorris. В диффузных гидротермальных флюидах с низким содержанием водорода существенная доля метаногеного сообщества (23 - 61%) представлена метилотрофными микроорганизмами родов Methanococcoides и Methermicoccus, а также некультивируемыми микроорганизмами, субстратная специализация которых неизвестна.

3. На примере образцов сайта Marker 113 разных годов была продемонстрирована стабильность метаногенной популяции. При анализе мРНК образцов сайта Marker 113 была выявлена жизнеспособная популяция представителей порядка Methanococcales, которая существует при субоптимальной концентрации водорода.

4. Определено, что значение Г+Ц состава 16S рРНК выше 60% позволяет обоснованно прогнозировать адаптацию к высоким температурам некультивируемых групп архей.

5. Получены веские доказательства существования экстремально термофильных метанотрофных архей (группа ANME-1GBa). Показано присутствие данных микроорганизмов в различных гидротермальных сайтах.

6. Показано, что метаногенные микроорганизмы присутствуют в большинстве наземных горячих источников с температурным диапазоном 51-89С, составляя при этом незначительную часть микробной популяции.

7. Впервые для наземных горячих источников показано присутствие представителей филогенетических групп метаногенов MCR-2c, Methanocellales и Methanomethylovorans и MCR-2a, являющейся из них наиболее распространенной. Выявленное разнообразие культивируемых метаногенов сводится к представителям родов Methanothermobacter, Methanosaeta, Methanomethylovorans.

8. Проведена масштабная филогенетическая реконструкция метаногенных и метанотрофных архей на основе гена mcrA, подтверждающая глубокое обособленное положение кластеров MCR-2a и MCR-2c. Подтверждено отсутствие случаев горизонтального переноса гена mcrA.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Экспериментальные статьи 1. Меркель А.Ю., Черных Н.А., Канапатский Т.А., Пименов Н.В. Детекция метанотрофных архей в осадках покмарка (Гданьская впадина, Балтийское море) путем анализа последовательностей гена, кодирующего -субъединицу метил коэнзим М редуктазы. Микробиология, 2010, Т. 79, № 6, С. 852-855.

2. Nolla-Ardvol V., Strous M., Sorokin D.Y., Merkel A.Y., Tegetmeyer H.E. Activity and diversity of haloalkaliphilic methanogens in Central Asian soda lakes. J. Biotechnol. 2012.

V. 161(2). P. 167-173.

3. Ver Eecke H.C., Butterfield D.A., Huber J.A., Lilley M.D., Olson E.J., Roe K.K., Evanse L.J., Merkel A.Y., Cantin H.V., Holden J.F. Hydrogen-limited growth of hyperthermophilic methanogens at deep-sea hydrothermal vents. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. 2012. V. 109(34). P. 13674-13679.

4. Merkel A.Y., Huber J.A., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Lebedinsky A.V.

Detection of putatively thermophilic anaerobic methanotrophs (ANMEs) in diffuse hydrothermal vent fluids. Appl. Environ. Microbiol. 2013. V. 79(3). P. 915-923.

Тезисы конференций 1. Huber J.A., Merkel A.Y., Holden J.F., Lilley M.D., Butterfield D.A. Molecular Diversity and Activity of Methanogens in the Subseafloor at Deep-Sea Hydrothermal Vents of the Pacific Ocean. AGU Fall Meeting. San Francisco (USA), December, 2009. Book of abstracts, P. 243-244.

2. Merkel A.Y., Sokolova T.G., Bonch-Osmolovskaya E.A., Chernych N.A. Assessment of methanogens diversity in hot springs of Uzon Caldera, Kamchatka (Russia) using molecular and cultural approaches. The International Workshop ‘’Biodiversity, molecular ecology and biogeochemistry of thermophiles’’. Petropavlovsk-Kamchatsky (Russia), August, 2010. Book of abstracts, P. 26.

3. Merkel A.Y., Chernych N.A., Kanapatsky T.A., Pimenov N.V. Detection of methanotrophic archaea in pockmark sediments (Gdansk deep, Baltic sea) by sequence analisis of the gene encoding methyl-coenzyme M reductase -subunit. 10th International Conference on Gas in Marine. Lake Baikal (Russia), September, 2010. Book of abstracts, P. 128-129.

4. Меркель А.Ю., Хубер Дж.A. Филогенетическое разнообразие, распространенность и экспрессия функциональных генов метаногенеза во флюидах глубоководных гидротермальных систем. VII Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные апекты современной микробиологии». Москва (Россия), Октябрь, 2011. Сборник тезисов, С. 84-85.

5. Chernykh N.A., Merkel A.Y., Miroshnichenko M.L., Lebedinsky A.V., Bonch Osmolovskaya E.A. Characterization of microbial communities in thermal springs of Uzon caldera, Kamchatka by analysis 16S rRNA and metabolic genes. International conference «Ecology and geochemical activity of microorganisms of extreme environments». Ulan Ude (Russia) and Ulaanbaatar (Mongolia), September, 2011. Book of abstracts, P. 185 187.

6. Merkel A.Y., Huber J.A., Lebedinsky A.V. Detection of putatively thermophilic methanotrophic archaea by using new primer systems. 9th International congress on extremophiles. Sevilla (Spain), September, 2012. Book of abstracts, P. 141.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.