авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Изучение динамики митохондриального ретикулума при окислительном стрессе

На правах рукописи

Непряхина Ольга Константиновна Изучение динамики митохондриального ретикулума при окислительном стрессе 03.00.25-03 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: директор НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, академик РАН В.П. Скулачёв Научный консультант: зав. лабораторией биоэнергетики клетки НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, кандидат биологических наук Б.В. Черняк

Официальные оппоненты: профессор биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, доктор биологических наук Г.Е. Онищенко зав. лабораторией мембранологии Научного центра здоровья детей РАМН, доктор медицинских наук В.Г. Пинелис

Ведущая организация: Институт биохимии А.Н. Баха

Защита состоится 21 апреля 2009 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет МГУ, в аудитории М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ Изучение митохондриальной динамики занимает значительное место в современных научных исследованиях. Накоплен большой массив данных, описывающих механизм фрагментации митохондрий при апоптозе, известны основные белки, участвующие в этом процессе. В то же время, изменения динамического состояния митохондрий играют важную роль во многих физиологических реакциях клетки, не связанных с апоптозом. Большинство реакций клетки на внешние стимулы, а также начальные этапы апоптоза сопровождаются изменениями окислительно-восстановительного статуса клетки. Такие изменения всегда связаны с образованием активных форм кислорода внутри клетки. Роль активных форм кислорода в фрагментации митохондрий на данный момент неизвестна, и ее исследование представляет большой научный интерес.

Генетические нарушения, затрагивающие белки, участвующие в фрагментации и слиянии митохондрий, приводят к развитию наследственных заболеваний, например синдрома Шарко-Мари-Тут. Окислительный стресс, сопровождающийся повреждением митохондрий, является причиной многих серьезных патологий, в частности инфарктов, инсультов. Патофизиология многих нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, также связана с окислительным стрессом. Изучение механизма фрагментации митохондрий при окислительном стрессе, возможно, позволит разработать более эффективные методы борьбы с этими заболеваниями.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью данной работы было исследование фрагментации митохондрий при окислительном стрессе, не приводящем к гибели клеток. Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать вторичную продукцию АФК при окислительном стрессе.

Используя митохондриально-направленные антиоксиданты, выяснить роль митохондрий в этом процессе.

2. Изучить роль АФК, образующихся в митохондриях, в фрагментации митохондриального ретикулума.

3. Исследовать роль белка Drp-1 в фрагментации митохондрий при окислительном стрессе.

4. Проанализировать изменение распределения белка BAX в клетке при окислительном стрессе и роль в этом процессе АФК.

5. Изучить взаимосвязь фрагментации митохондрий и транслокации белка BAX из цитоплазмы на внешнюю мембрану митохондрий.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ В работе мы исследовали окислительный стресс в клетках HeLa, вызываемый пероксидом водорода в нетоксических концентрациях. Использование специфических митохондриально-направленных антиоксидантов позволило установить, что основным источником АФК при окислительном стрессе служат митохондрии. Показано, что АФК образуемые в митохондриях играют основную роль в индукции фрагментации митохондриального ретикулума. Было обнаружено, что при окислительном стрессе происходит транслокация Вах из цитоплазмы на внешнюю мембрану митохондрий. Этот процесс зависит от продукции АФК в митохондриях и предшествует фрагментации митохондриального ретикулума, но не является ее причиной. Впервые было показано, что распределение Вах зависит от конформации переносчика адениновых нуклеотидов в мембране митохондрий, которая может изменяться под действием АФК. Эффективное защитное действие митохондриально-направленных антиоксидантов при окислительном стрессе позволяет надеяться на их терапевтический эффект при патологиях, связанных с нарушением митохондриальной динамики.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ Изучение митохондриальной динамики в последнее время приобретает все большее значение. Было обнаружено, что многие наследственные заболевания – такие как синдром Шарко-Мари-Тут, оптическая атрофия, болезнь Паркинсона и даже наследственная шизофрения – вызваны мутациями в генах, играющих важную роль в поддержании нормальной морфологии митохондрий. Многие из этих заболеваний, а также другие патологические состояния, такие как инсульт, инфаркт, воспаление, диабет, ассоциированы с окислительным стрессом. Изучение процесса фрагментацией митохондрий при окислительном стрессе может пролить свет на многие вопросы, связанные с патогенезом этих заболеваний, и, возможно, позволит разработать новые эффективные средства их лечения. Так эффективное защитное действие митохондриально-направленных антиоксидантов на структуру митохондрий позволяет надеяться на их терапевтический эффект при подобных патологиях.





АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы были представлены на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006);

на международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» памяти проф. М.В. Гусева (Москва, 2006);

на 14ой Европейской конференции по биоэнергетике «EBEC» (Москва, 2006);

на курсе «Передовые разработки в области молекулярной биохимии митохондрий» (Варшава, 2006);

14 и 15 Европейских конференциях по апоптозу «ECDO» (Сардиния, Италия, 2006 и Портороз, Словения, 2007), 32ом Конгрессе Международного общества биохимиков и молекулярных биологов «Молекулярные машины» (Вена, Австрия, 2007), на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) и на Международном симпозиуме по митохондриальной физиологии и патологии (Бари, Италия, 2008).

ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 10 тезисов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертационная работа изложена на 112 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 31 рисунками.

Список литературы содержит 132 источника.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Реагенты Все использованные реагенты (если не указано иначе) были производства Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Для исследования продукции АФК в митохондриях были использованы новые митохондриально направленные антиоксиданты SkQ (10-(6’-пластохинолил)децилтрифенилфосфоний) и его флуоресцентный аналог SkQR1, а также MitoQ (10-(6’-убихинолил)децилтрифенилфосфоний) и контрольное соединение децилтрифенилфосфоний (C12TPP), синтезированные в НИИ ФХБ им.

А. Н. Белозерского под руководством В.П. Скулачева.

Объект исследования В работе использовали клетки карциномы человека HeLa. Культуры клеток выращивали в среде DМЕМ с высоким содержанием глюкозы (25 мМ), без пирувата, с добавлением 100 ед/мл стрептомицина и 100 ед/мл бензилпенициллина (Gibco) в присутствии 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone) в атмосфере 5% СО2 при 37 С. Клетки HeLa-Bcl-2 c гиперэкспрессией белка Bcl- были предоставлены Г.А. Беловым (ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН) и подробно охарактеризованы в нашей лаборатории ранее (Щепина и др., 2002).

Измерение продукции АФК методом проточной цитофлуориметрии Для изучения содержания АФК клетки окрашивали раствором CM-DCFH2-DA (диацетиловый эфир 5'-6'-хлорметил-2',7'-дихлородигидрофлуоресцеина, Molecular Probes, Invitrogen) 1,8 мкМ в среде DMEM без сыворотки в течение 15 минут при 37°С. Флуоресценцию анализировали с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter Cytomics FC 500 (содержит однофазный аргоновый лазер, длина волны возбуждающего света которого равна 488 нм, мощность 20 мВт, узкополосный оптический фильтр 525 нм BP). Статистическую обработку результатов проводили в программах Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2003.

Визуализация митохондрий и других внутриклеточных структур Митохондрии в живых клетках окрашивали с помощью специфического флуоресцентного красителя MitoTracker Green 100 нМ 30 минут (Molecular Probes).



Для окраски с помощью антител клетки фиксировали 15 мин в 3,7% формальдегиде и пермеабилизировали с помощью 0,5% тритона Х-100 10 мин. Для окрашивания использовали антитела к цитохрому с (Pharmingen), тубулину (Sigma), белку Вах (Pharmingen) и вторичные антитела, конъюгированные с красителями Oregon Green и Texas Red-X (Pharmingen). Для окрашивания актиновых филаментов использовали фаллоидин, меченый TRITC (Sigma). Клетки на покровных стеклах заключали в среду Vectashield (Vector). Препараты анализировали с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии, используя конфокальный микроскоп LSM 510 (Carl Zeiss), а также флуоресцентный микроскоп Axiovert 200M (Carl Zeiss) Анализ клеточного цикла Для изучения клеточного цикла клетки переводили в суспензию, фиксировали 100 % спиртом на льду, окрашивали раствором йодистого пропидия (50 мкг/мл) в течение 1 часа при 37оС в темноте и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Определение клеточной гибели Для определения апоптоза и некроза клетки переводили в суспензию, добавляли к ним 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ HEPES;

140 мМ NaCl и 2,5 мМ CaCl (рН 7,4), добавляли аннексин V, конъюгированный с AlexaFluor 488 (Invitrogen, разведение 1:100) и йодистый пропидий (1 мкг/мл), инкубировали в темноте 10- минут и анализировали на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter FC500).

Также гибель клеток оценивали с помощью реагента CellTiter Blue (Promega) согласно инструкции изготовителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС В КЛЕТКАХ HELA Окислительный стресс является одним из важнейших изменений гомеостаза клетки. Он возникает при различных патологических состояниях организма, в частности – при воспалении, ишемии-реперфузии, инсультах, инфарктах. При окислительном стрессе происходит образование избыточного количества активных форм кислорода (АФК) внутри клетки, которые могут активизировать различные сигнальные пути, а также вызывать повреждение молекулярных компонентов клетки. В нашей работе мы исследовали окислительный стресс в культуре клеток HeLa. В качестве индуктора окислительного стресса использовали пероксид водорода, который является распространенным индуктором окислительного стресса в организме. Используя специфический флуоресцентный краситель СМ-DCF мы обнаружили, что пероксид водорода вызывает продукцию АФК в клетках. При этом в течение первого часа количество АФК не отличалось от контрольного. Через два часа оно увеличивалось и затем резко спадало (см. ниже рис. 2а). Ранее в нашей лаборатории было показано, что пероксид водорода, добавленный к культуре клеток, разрушается в среде инкубации за первые полчаса (Плетюшкина и др., 2006). Таким образом, наши данные указывают на то, что под действием пероксида в клетке индуцируется эндогенная продукция АФК. Можно предполагать, что накопление АФК в дальнейшем компенсируется благодаря увеличению активности антиоксидантных систем клетки.

Митохондрии служат в клетках важнейшим источником активных форм кислорода. Мы предположили, что именно они вырабатывают АФК в ответ на пероксид водорода. Для проверки этой гипотезы мы исследовали действие ингибитора комплекса III дыхательной цепи митохондрий миксотиазола на продукцию АФК в клетках. Миксотиазол вызывал медленное накопление АФК (максимальный уровень наблюдался через 21-24 часа), что было связано с образованием радикалов в начальных сегментах дыхательной цепи. При совместном действии пероксида водорода и миксотиазола мы наблюдали максимальный уровень АФК уже через 1 час. Тот факт, что миксотиазол ускоряет продукцию АФК, вызванную пероксидом водорода, подтверждает гипотезу об образовании АФК в митохондриях при окислительном стрессе.

Для дальнейшего изучения роли митохондриальной продукции АФК при окислительном стрессе мы использовали специфический митохондриально направленный антиоксидант SkQ1. Он состоит из положительно заряженного децилтрифенилфосфония и остатка пластохинона (рис. 1). Ранее в нашей лаборатории было показано на модельных мембранных системах и на изолированных митохондриях, что SkQ Рисунок 1. Структура молекулы SkQ1.

чрезвычайно эффективен как антиоксидант (Скулачев, 2007). Его эффективность была значительно выше, чем у аналогичного антиоксиданта на основе убихинона (MitoQ). С помощью флуоресцентного аналога SkQ1 (SkQR1) мы показали, что он селективно накапливается в митохондриях клеток благодаря разности потенциалов на их мембране.

А Б Рисунок 2. Пероксид водорода вызывает продукцию АФК в митохондриях клеток HeLa.

А: Клетки HeLa инкубировали с пероксидом водорода 250 мкМ указанное время, и затем проводили окрашивание CMDCF-DA и измерение флуоресценции так, как описано в разделе «Объекты и методы исследования». Представлены данные 5х независимых экспериментов. Б: Клетки преинкубировали с 20 нМ SkQ1 в течение 7 дней, затем обрабатывали H2O2 100 мкМ в течение 45 минут. Окрашивание CMDCF-DA и измерение флуоресценции проводили так, как описано в Материалах и методах. Черным контуром показано распределение клеток в контроле.

Преинкубация клеток HeLa в течение 7и дней с 20 нМ SkQ1 предотвращала накопление АФК, вызванное пероксидом водорода (Рис. 2б). Этот результат подтвердил митохондриальное происхождение вторичных АФК и показал высокую эффективность антиоксидантного действия SkQ1 на клетках в культуре.

При обработке культуры пероксидом водорода (в концентрации 200-300 мкМ) мы не наблюдали нарушений морфологии клеток или значительного изменения их количества. Для описания состояния клеток при окислительном стрессе мы провели окрашивание на компоненты цитоскелета, актин и тубулин, и не обнаружили значительных изменений в их структуре. Мы обнаружили, что пероксид водорода вызывает торможение клеточного цикла, так что через 24 часа после добавки H2O значительно возрастает количество клеток в G2/М фазе. Количество апоптотических клеток при этом было минимально. При дальнейшей инкубации с пероксидом водорода происходило частичное восстановление клеточного цикла.

Мы проанализировали гибель клеток, вызванную окислительным стрессом, методом проточной цитофлуориметрии, использовав аннексин V в качестве индикатора апоптоза и иодистый пропидий для окраски некротических клеток. При добавке 200-300 мкМ пероксида водорода через 24 часа мы наблюдали лишь незначительную (не более 25%) гибель клеток. При увеличении концентрации пероксида водорода до 600 мкМ погибало около 60% клеток. На основании полученных данных мы сделали вывод, что выбранные нами концентрации пероксида водорода (200-300 мкМ) вызывают мягкий, нетоксический стресс в культуре клеток HeLa.

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ФРАГМЕНТАЦИИ МИТОХОНДРИЙ Окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода, приводил к фрагментации митохондриального ретикулума (рис. 3). Изменения морфологии митохондрий проявлялись через 8-12 часов после добавки пероксида водорода.

Через 20-24 часа количество клеток с полностью фрагментированным митохондриальным ретикулумом варьировало от эксперимента к эксперименту, и составляло 35-65 %. В индивидуальных клетках культуры фрагментация начиналась после лаг-фазы различной длительности и затем очень быстро завершалась. В ответ на добавку миксотиазола к H2O2 фрагментация Рисунок 3. Динамика митохондриального митохондрий происходила значительно ретикулума при окислительном стрессе Клетки линии HeLa инкубировали с пероксидом водорода 250 мкМ и/или миксотиазолом 2 мкМ в быстрее (рис. 3), что коррелировало с течение указанного времени. Митохондрии выявляли MitoTracker Green по стандартной ускорением продукции АФК. Сам методике. Бар – 10 мкМ.

миксотиазол также вызывал фрагментацию митохондриального ретикулума, но значительно позже, через 36-48 часов после добавки, что также соответствовало медленному накоплению АФК.

Для изучения роли митохондриальных АФК в фрагментации митохондрий мы использовали митохондриально-направленные антиоксиданты. Мы показали, что SkQ1, SkQR1 или MitoQ вызывают эффективную защиту митохондрий от фрагментации под действием пероксида водорода (рис. 4). Защитный эффект митохондриально-направленные антиоксиданты проявляли в чрезвычайно низких концентрациях – 2-20 нМ. Использованные нами антиоксиданты общего действия Trolox и N-ацетилцистеин также предотвращали фрагментацию митохондрий, вызванную пероксидом водорода, однако, в значительно больших концентрациях – 100 мкМ и 10 мМ соответственно.

А B Рисунок 4. Митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают фрагментацию митохондриального ретикулума при окислительном стрессе.

Клетки HeLa предынкубировали с антиоксидантами (2 нМ) в течение 2 часов, затем добавляли пероксид водорода (250 мкМ). Через 18 часов проводили окрашивание MitoTracker Green по стандартной методике. А: Бар – 10 мкМ. В: Представлены данные трех независимых экспериментов.

Из рис. 4 видно, что митохондриально-направленные антиоксиданты различались по своей эффективности: SkQ1 и SkQR1 практически полностью подавляли фрагментацию митохондрий, в то время как MitoQ был не столь эффективен. SkQ предотвращал фрагментацию, вызванную ингибиторами дыхательной цепи митохондрий, миксотиазолом, антимицином А и пиерицидином, и не влиял на фрагментацию, вызванную ингибитором протеинкиназ клетки ставроспорином.

Последнее позволяет утверждать, что SkQ1 не нарушает механизм фрагментации митохондрий. Во всех экспериментах C12TPP (аналог SkQ1, способный накапливаться в митохондриях, но не обладающий антиоксидантным действием) не оказывал никакого эффекта. При повышении концентрации митохондриально направленных антиоксидантов (рис. 4, 100 нМ) их защитный эффект исчезал и наблюдалось повреждающее действие, связанное, по-видимому, с прооксидантным эффектом.

Важно отметить, что защитный эффект SkQ1 развивался за 2 ч, что соответствовало времени накопления SkQR1 в клетках. В то же время, общий уровень АФК в клетке за это время не снижался. Для предотвращения накопления АФК требовалась значительно более длительная инкубация (7 суток). Можно предполагать, что SkQ1 при кратковременной инкубации нейтрализует АФК в митохондриях (в частности в их внутренней мембране), и именно это определяет его защитное действие, а общий уровень АФК в клетке не столь существенен для изменений морфологии митохондрий.

ИЗУЧЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКА DRP ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ Для того, чтобы определить мишень действия АФК при индукции фрагментации митохондрий, мы обратились к механизму дробления. Ключевым белком в этом процессе является динамин-подобный белок Drp1, относящийся к семейству малых ГТФаз. Известно, что в норме он находится в динамическом равновесии между сайтами на внешней мембране митохондрий и цитоплазмой, а в ответ на апоптозные стимулы стабилизируется на митохондриях и образует перетяжку мембран при фрагментации. При окрашивании специфическими антителами к белку Drp1 в контрольных клетках мы обнаружили белок как в цитоплазме клетки, так и в локусах на мембране митохондрий. После обработки клеток пероксидом водорода мы обнаружили, что комплексы на мембране митохондрий увеличились в размере, однако, достоверного увеличения фракции белка, связанной с митохондриями, не наблюдалось. Полученные данные не позволяют нам однозначно оценивать роль белка Drp1 в фрагментации митохондрий при окислительном стрессе. Возможно, в условиях мягкого окислительного стресса дополнительной транслокации Drp1 на митохондрии не происходит, но перестраиваются его предсуществующие комплексы, что способствует фрагментации.

ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСЛОКАЦИИ БЕЛКА BAX ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ Белок BAX является важнейшим компонентом системы индукции апоптоза. В норме он, как и Drp1, располагается в цитоплазме клетки. В ответ на различные проапоптозные стимулы BAX переселяется на внешнюю мембрану митохондрий, затем изменяет конформацию с образованием олигомеров, которые, предположительно, формируют поры для выхода цитохрома С из межмембранного пространства митохондрий.

Мы исследовали распределение BAX в клетке при окислительном стрессе и показали, что уже через два часа после добавки пероксида водорода фракция BAX на митохондриях увеличивается и снижается его содержание в цитоплазме (рис. 5).

Рисунок 5. Активные формы кислорода изменяют распределение белка BAX в клетке.

Клетки HeLa предынкубировали с SkQ1 2 нМ 2 часа, затем обрабатывали пероксидом водорода 250 мкМ 20 часов. Белки BAX и цитохром С визуализировали с использованием антител так, как описано в разделе «Объекты и методы исследования». Бар – мкм.

Перераспределение BAX не сопровождалось выходом цитохрома С из митохондрий в цитоплазму (рис. 5). Это полностью согласуется с отсутствием признаков апоптоза у этих клеток. Для изучения роли митохондриальной продукции АФК в перераспределении BAX мы использовали митохондриально-направленные антиоксиданты. Мы обнаружили, что SkQ1 (20 нМ, 2 часа) эффективно предотвращает транслокацию BAX, вызванную окислительным стрессом (рис. 5).

Антиоксидант общего действия Trolox также обладал защитным действием, но в значительно больших концентрациях (0,1 мМ). Как и в случае фрагментации митохондрий, эффект SkQ1 развивался очень быстро. Следуя логике, приведенной выше, можно полагать, что транслокация ВАХ определяется уровнем АФК, локализованных внутри митохондрий. Этот вывод находится в кажущемся противоречии с представлениями о том, что ВАХ получает сигнал, ведущий к транслокации, находясь в цитоплазме. Дальнейшие эксперименты позволили разрешить это противоречие.

Предполагают, что белок BAX для осуществления своей проапоптозной функции взаимодействует с другими белками в комплексе т.н. «митохондриальной поры».

Одним из белков, участвующих в образовании этого комплекса, является транслокатор адениновых нуклеотидов (ANT). Мы исследовали влияние конформации ANT на транслокацию BAX при окислительном стрессе. Для этого мы использовали ингибиторы ANT, бонгкрековую кислоту и атрактилозид, фиксирующие транслокатор в различных конформациях. Мы обнаружили, что бонгкрековая кислота предотвращает транслокацию BAX на мембрану митохондрий при окислительном стрессе, вызванном пероксидом водорода (рис. 6а).

Атрактилозид, напротив, вызывал транслокацию BAX на мембрану митохондрий в значительной части клеток (рис. 6б). Атрактилозид усиливал действие H2O2 на транслокацию ВАХ, и SkQ1 при этом уже не оказывал значительного защитного эффекта.

А Б Рисунок 6. Конформация транслокатора адениновых нуклеотидов определяет локализацию BAX в клетке.

Белки BAX и цитохром С (cyt c) визуализировали с импользованием антител так, как описано в разделе «Объекты и методы исследования». Бар – 4 мкм. А: Клетки HeLa предынкубировали с бонгкрековой кислотой (10 мкМ) в течение 2 часов, и затем добавляли пероксид водорода (300 мкМ) на 24 часа. Б: Клетки HeLa предынкубировали с SkQ1 (2 нМ, 2 часа) и затем добавляли атрактилозид (100 мкМ) и пероксид водорода ( мкМ) на 24 часа.

Итак, мы обнаружили, что конформация транслокатора адениновых нуклеотидов влияет на локализацию BAX в клетке. Поскольку атрактилозид способствует открытию «митохондриальную поры», а бонгкрековая кислота ее закрытию, мы исследовали роль поры в транслокации ВАХ. Для этого мы использовали ингибиторы митохондриальной поры циклоспорин А и его аналог N-метил-4 изолейцин-циклоспорин, обладающий более селективным действием. Было показано, что и циклоспорин А и его аналог вызывают частичную транслокацию BAX в клетках контрольной культуры, и не влияют на изменение локализации этого белка при окислительном стрессе. Следовательно, определяющим фактором в транслокации ВАХ является конформация ANT, а не состояние поры. Это вывод согласуется с данными, полученными на частично очищенных препапратах поры, где изменение конформации ANT вызывало изменение сродства ВАХ к комплексу в целом (Vyssokikh et al., 2002). ANT может непосредственно взаимодействовать с ВАХ в составе т. н. «контактных сайтов», а может влиять на связывание его с другими белками комплекса на поверхности митохондрий. Известно, что окисление дитиола на матриксной стороне молекулы АNT может приводить к изменению его конформации, подобно атрактилозиду. Возможно, окислительный стресс вызывает окисление этого дитиола, что и приводит к увеличению сродства АNT к ВАХ и транслокации ВАХ на митохондрии. SkQ1, в таком случае, мог бы предотвращать транслокацию ВАХ, защищая дитиол АNT от окисления.

Мы использовали ингибиторы ANT для изучения возможной взаимосвязи между транслокацией BAX и фрагментацией митохондриального ретикулума при окислительном стрессе. Несмотря на то, что бонгкрековая кислота предотвращала транслокацию BAX, она никак не влияла на фрагментацию митохондрий, вызванную Н2О2. На основании этих данных мы полагаем, что транслокация BAX при окислительном стрессе не является причиной фрагментации митохондриального ретикулума.

ВЛИЯНИЕ БЕЛКА BCL-2 НА МОРФОЛОГИЮ МИТОХОНДРИЙ И ЛОКАЛИЗАЦИЮ BAX ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ Белок Bcl-2 является основным клеточным ингибитором проапоптозной функции BAX. Гиперэкспрессия Bcl-2 характерна для многих опухолей и определяет их резистентность к радио- и химиотерапии. Мы исследовали участие этого белка в фрагментации митохондрий и транслокации BAX на мембрану митохондрий при окислительном стрессе. Мы обнаружили, что в клетках HeLa с гиперэксперссией Bcl-2 структура митохондриального ретикулума изменена по сравнению с контролем. В этих клетках митохондрии более короткие, а около 30 % клеток содержат полностью фрагментированный митохондриальный ретикулум (рис. 7б). В ответ на пероксид водорода эти органеллы фрагментировались значительно интенсивнее, чем в контрольной культуре. Несмотря на это, гиперэксперссия Bcl- эффективно предотвращала гибель клеток, вызванную высокими концентрациями пероксида водорода (рис. 7а). При изучении распределения BAX мы обнаружили, что во многих клетках, гиперэкспрессирующих Bcl-2, BAX локализован на мембране митохондрий (рис. 7в). При обработке пероксидом водорода это распределение становилось общим для всех клеток культуры. Таким образом, мы обнаружили, что несмотря на выраженный антиапоптозный эффект, Bcl-2 не предотвращал ни фрагментацию митохондрий, ни транслокацию BAX, вызванную окислительным стрессом. Это указывает на то, что апоптоз и фрагментация митохондрий являются событиями, не связанными друг с другом причинно следственной связью.

В А Б Рисунок 7. Гиперэкспрессия белка Bcl-2 предотвращает гибель клеток от окислительного стресса, однако, не защищает от фрагментации митохондриального ретикулума и транслокации BAX.

А: Клетки HeLa, контрольные и гиперэкспрессирующие Bcl-2, обрабатывали пероксидом водорода 700 мкМ в течение 20 часов, и затем жизнеспособность клеток оценивали методом CellTiter Blue (Promega) согласно инструкции изготовителя. Б: Клетки HeLa, контрольные и гиперэкспрессирующие Bcl-2, обрабатывали пероксидом водорода 250 мкМ в течение 20 часов. Представлены данные трех независимых экспериментах. В: Клетки HeLa, гиперэкспрессирующие Bcl-2, обрабатывали пероксидом водорода мкМ в течение 20 часов. Белки BAX и цитохром С (cyt С) визуализировали с импользованием антител так, как описано в разделе «Объекты и методы исследования». Бар – 4 мкМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследование нетоксического окислительного стресса в культуре клеток HeLa показало, что в ответ на пероксид водорода в клетках активируется эндогенная продукция активных форм кислорода. Накопление АФК стимулируется ингибитором дыхательной цепи митохондрий миксотиазолом, и ингибируется специфическим митохондриально-направленным антиоксидантом SkQ1. Это говорит о том, что АФК при окислительном стрессе образуются внутри митохондрий.

При окислительном стрессе происходит фрагментация митохондрий, которая усиливается под действием ингибиторов дыхательной цепи, и предотвращается митохондриально-направленными антиоксидантами. Можно предполагать, что АФК, образующиеся в митохондриях в ответ на пероксид водорода, вызывают активацию механизмов, приводящих к фрагментации митохондриального ретикулума.

Мы обнаружили, что при окислительном стрессе происходит транслокация проапоптозного белка Bax из цитоплазмы на поверхность митохондрий, но при этом не наблюдается выход цитохрома С из митохондрий и другие признаки апоптоза.

Митохондриально-направленные антиоксиданты блокируют транслокацию ВАХ, следовательно, для этого процесса необходимо накопление АФК в митохондриях.

Оказалось, что локализация BАХ в клетке зависит от конформации транслокатора адениновых нуклеотидов во внутренней мембране митохондрий. Мы полагаем, что митохондриальные АФК вызывают окисление критического дитиола в транслокаторе, что изменяет его конформацию и служит сигналом к транслокации BАХ при окислительном стрессе. Транслокация BАХ происходит значительно раньше, чем фрагментация митохондрий. Ингибитор транслокатора адениновых нуклеотидов бонгкрековая кислота предотвращает транслокацию ВАХ, но не останавливает фрагментацию митохондрий. Таким образом, можно полагать, что транслокация ВАХ не является сигналом к фрагментации митохондрий при окислительном стрессе.

Таким образом, использование митохондриально-направленных антиоксидантов позволило нам описать возможные механизмы фрагментации митохондрий и транслокации BАХ при окислительном стрессе. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о функционировании клеток в условиях нарушения редокс-статуса и вносят существенный вклад в понимание механизмов окислительного стресса.

ВЫВОДЫ 1. Пероксид водорода индуцирует эндогенную продукцию активных форм кислорода (АФК) в клетках. Ингибиторы дыхательной цепи митохондрий ускоряют продукцию АФК, а митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают ее, что указывает на митохондриальное происхождение этих АФК.

2. При окислительном стрессе АФК, образуемые в митохондриях, вызывают фрагментацию митохондриального ретикулума. Митохондриально-направленные антиоксиданты защищают митохондрии от фрагментации.

3. Фрагментация митохондрий при окислительном стрессе не сопровождается транслокацией белка Drp-1 на мембрану митохондрий, характерной для фрагментации митохондрий при апоптозе.

4. Митохондриальные АФК вызывают транслокацию белка BAX из цитоплазмы на внешнюю мембрану митохондрий. При нетоксическом окислительном стрессе транслокация ВАХ предшествует фрагментации митохондрий и не приводит к выходу цитохрома с из митохондрий.

5. Транслокация ВАХ под действием митохондриальных АФК зависит от конформационного состояния переносчика адениновых нуклеотидов, но не от циклоспорин-чувствительной поры во внутренней мембране митохондрий.

Транслокация BAX и фрагментация митохондрий могут происходить независимо друг от друга.

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Лямзаев К.Г., Непряхина О.К., Сапрунова В.Б., Бакеева Л.Е., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В., Скулачев В.П. (2008) Новый механизм избирательного уничтожения поврежденных митохондрий (митоптоз). Сборник трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, изд. «АРТА», Новосибирск, стр.334.

2. Лямзаев К.Г., Плетюшкина О.Ю., Непряхина О.К., Черняк Б.В. (2006) Митохондриальные ингибиторы вызывают деградацию митохондрий в клетках линии HeLa, Цитология, № 9, 48, 777—778, Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре».

3. Непряхина О.К., Кузнецова А.Ю., Лямзаев К.Г., Изюмов Д.С., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В., академик РАН Скулачев В. П. (2008) Активные формы кислорода, генерируемые в митохондриях, индуцируют фрагментацию митохондриального ретикулума в клетках HeLa. Доклады Академии наук, т.420, №4, стр. 559-561.

4. Непряхина О.К., Кузнецова А.Ю., Лямзаев К.Г., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В. (2008) Митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают фрагментацию митохондрий, вызванную окислительным стрессом. Сборник трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, изд. «АРТА», Новосибирск, стр.171.

5. Непряхина О.К., Попова Е.Н. (2006) Влияние гиперэкспрессии мутантного онкогена N-Ras на межклеточные и субстратные взаимодействия эпителиальных клеток, в Материалах международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» памяти проф.

М.В. Гусева, МАКС Пресс, М, 29.

6. Непряхина О.К., Попова Е.Н., Плетюшкина О.Ю. (2006) Митохондриальный антиоксидант MitoQ влияет на цитоскелет и подвижность эпителиальных клеток в культуре, Цитология, «Наука», СПб, № 9, 48, 784—785, Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре».

7. Antonenko YN, Avetisyan AV, Bakeeva LE, Chernyak BV, Chertkov VA, Domnina LV, Ivanova OY, Izyumov DS, Khailova LS, Klishin SS, Korshunova GA, Lyamzaev KG, Muntyan MS, Nepryakhina OK, Pashkovskaya AA, Pletjushkina OY, Pustovidko AV, Roginsky VA, Rokitskaya TI, Ruuge EK, Saprunova VB, Severina II, Simonyan RA, Skulachev IV, Skulachev MV, Sumbatyan NV, Sviryaeva IV, Tashlitsky VN, Vassiliev JM, Vyssokikh MY, Yaguzhinsky LS, Zamyatnin AA Jr, Skulachev VP. (2008) Mitochondria-Targeted Plastoquinone Derivatives as Tools to Interrupt Execution of the Aging Program. 1. Cationic Plastoquinone Derivatives:

Synthesis and in vitro Studies. Biochemistry (Mosc). Dec;

73(12):1273-87.

8. Nepryakhina O., Kuznetsova A., Lyamzaev K.G., Domnina L.V., Ivanova O.Yu Pletjushkina O.Yu., Chernyak B.V, Skulachev V.P. (2008) Mitochondria-targeted antioxidants protect mitochondria from fission induced by oxidative stress, Bari International Symposium on “Mitochondrial Physiology and Pathology”, Bari, Italy, June 22-26, SC 2.27.

9. Nepryakhina O., Lyamzaev K.G., Pletjushkina O.Yu., Skulachev I.V., Domnina L.V., Ivanova O.Yu., Chernyak B.V. (2006) Intramitochondrial reactive oxygen species are important for dynamics of mitochondrial reticulum in living cells, 14th European Bioenergetics Conference, Moscow, Russia, July 22-27,, p. 10. Nepryakhina O.K., Lyamzaev K.G., Pletjushkina O.Y., Chernyak B.V. (2007) Oxidative stress triggers the changes of mitochondrial reticulum morphology in HeLa cells, FEBS Journal, Abstracts of 32nd FEBS Congress «Molecular Machines», V.274, sup. 1, p. 211.

11. Pletjushkina O., Nepryakhina O., Chernyak B. (2007) Oxidative stress triggers the changes of mitochondrial reticullum morphology in HeLa cells. Book of Abstracts of 15th ECDO Euroconference on Apoptosis, Portoroz, Slovenia, p.249.

12. Pletjushkina O.Y., Lyamzaev K.G., Popova E.N., Nepryakhina O.K., Ivanova O.Y., Domnina L.V., Chernyak B.V., Skulachev V.P. (2006) Effect of oxidative stress on dynamics of mitochondrial reticulum, Biochim Biophys Acta.,;

1757, 518-24.

13. Pletjushkina O.Yu., Lyamzaev K.G., Popova E., Nepryakhina O., Ivanova O.Yu., Domnina L.V., Chernyak B.V. (2006) Effect of oxidative stress on dynamics of mitochondrial reticulum, 14th European Bioenergetics Conference, Moscow, Russia, July 22-27,, p. 14. Pletjushkina O.Yu., Lyamzaev K.G., Popova E.N., Nepryakhina O.K., Ivanova O.Yu., Domnina L.V., Chernyak B.V. (2006) Reactive oxygen species affect structural and functional unity of mitochondrial network in Abstracts of 14th ECDO conference, University of Cagliary, Sardinia, Italy, 191.



 


Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.