авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и антиангиогенных агентов

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Фельдман Наталия Борисовна РАЗРАБОТКА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ ПЕПТИДНЫХ ВЕКТОРОВ И АНТИАНГИОГЕННЫХ АГЕНТОВ Специальность 03.00.04. – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 2007

Работа выполнена в Государственном учреждении здравоохранения Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Луценко Сергей Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Берман Альберт Ефимович доктор биологических наук Никитина Зоя Кимовна доктор биологических наук Глухов Александр Иванович

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «26_»_апреля 2007 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н.

Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, Погодинская ул., д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, Погодинская ул., д. 10.

Автореферат разослан «_»_ 2007 г.

Учёный секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук В.С. Былинкина Актуальность проблемы.

В настоящее время фундаментальной проблемой практической онкологии является высокая токсичность и низкая избирательность действия противоопухолевых препаратов известных классов. Применение систем направленного транспорта с использованием моноклональных антител в качестве векторов не оправдало надежд на их высокую терапевтическую активность. Одним из наиболее перспективных путей решения данной проблемы, а также повышения эффективности действия цитотоксических противоопухолевых химиопрепаратов, является разработка способов их направленной доставки в раковую клетку в составе коньюгатов с векторными полипептидами. Избирательность транспорта при этом достигается за счет способности лиганда (вектора) к высокоаффинному связыванию со специфическими рецепторами, экспрессированными только/или преимущественно на клетках-мишенях. Для практического применения подобные векторы должны отвечать ряду требований, к числу которых относятся доступность в препаративных количествах, стабильность, сохранение высокого сродства к рецептору после химической модификации. В полной мере этим требованиям отвечают эпидермальный фактор роста (ЭФР), аномально высокий уровень экспрессии рецепторов которого отмечается в клетках опухолей эпителиального происхождения, и онкофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП), рецепторы которого экспрессируются практически всеми типами раковых клеток, но отсутствуют на клетках нормальных тканей. Поэтому ЭФР и АФП были использованы нами для создания систем направленного действия, предполагающих наличие специфического рецептора и ковалентно связанных векторного белка и модулятора клеточной активности. Подобные системы могут найти применение в различных областях медицины для изучения возможностей направленного влияния на физиологические процессы и повышения эффективности действия известных химиотерапевтических средств при лечении целого ряда заболеваний, включая онкологические. Сравнительное исследование в модельных экспериментах in vitro и in vivo уровня противоопухолевой активности полученных систем направленного действия позволяет оценить возможности их применения в области практической онкологии. Изучение динамики накопления и внутриклеточного распределения химиопрепаратов, доставляемых в клетку в составе систем направленного действия, имеет существенное теоретическое и прикладное значение, поскольку позволяет прояснить механизм их цитотоксического действия и наметить пути повышения его эффективности.

В последние десятилетия значительным достижением в области поиска новых эффективных методов терапии злокачественных новообразований явилось доказательство необходимости процесса ангиогенеза для роста злокачественных солидных опухолей и создание концепции противоопухолевой терапии, основанной на подавлении ангиогенеза. Ангиогенез – процесс роста капилляров из кровеносных сосудов, в результате которого образуются новые сосудистые сети. При этом патологический рост новых сосудов обусловливает прогрессию ряда заболеваний, прежде всего рост и метастазирование злокачественных опухолей. Подавление ангиогенеза ведёт к торможению опухолевого роста и развития метастазов. Среди известных в настоящее время эндогенных ингибиторов ангиогенеза наиболее перспективными являются белки ангиостатин и эндостатин. Однако эти полипептидные ингибиторы ангиогенеза проявляют высокую терапевтическую эффективность преимущественно в высоких дозах (25100 мг/кг массы тела) и требуют продолжительного курса лечения. В связи с этим особенно актуальной задачей представляется разработка высокотехнологичных методов получения ангиостатина и эндостатина, а также поиск возможностей изменения существующих схем терапии этими полипептидами, в частности, путём применения их липосомных форм.

Следует отметить, что несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы при становлении и развитии антиангиогенной терапии, для полной ремиссии применение только антиангиогенных препаратов часто является недостаточным. Более эффективным подходом представляется комбинированная противоопухолевая химиотерапия, сочетающая в себе препараты с различными механизмами действия. Терапия антиангиогенными полипептидами, разрушающая инфильтрирующие опухоль кровеносные сосуды и уничтожающая раковую клетку опосредованно, могла бы успешно сочетаться с применением высокоэффективных противоопухолевых препаратов, проявляющих в малигнизированных тканях прямое цитотоксическое действие. Очевидно, что комбинированная терапия антиангиогенными агентами и препаратами направленного действия является наиболее перспективным избирательным и эффективным путём воздействия на злокачественные опухоли.



Исходя из этого, актуальной целью данного исследования являлось создание и изучение терапевтического потенциала антиангиогенных полипептидов и препаратов направленного действия в схемах комбинированной противоопухолевой терапии.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

- получить векторные пептиды, способные к избирательному проникновению в клетки злокачественных опухолей путём рецепторопосредованного эндоцитоза;

- осуществить синтез цитотоксических препаратов направленного действия, включающих противоопухолевые химиопрепараты (фталоцианины, хлорины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды) и векторные белки (эпидермальный фактор роста и альфа-фетопротеин человека, а также их рецепторсвязывающие фрагменты);

- исследовать свойства, динамику поступления и внутриклеточного распределения полученных препаратов направленного действия и их противоопухолевую активность в системах in vitro и in vivo;

- разработать технологичный метод получения рекомбинантного эндостатина человека;

- получить липосомные формы эндостатина и ангиостатина человека и изучить их противоопухолевую терапевтическую эффективность in vivo в сравнении с нелипосомными формами;

- исследовать in vivo терапевтическую эффективность сочетанного применения антиангиогенных полипептидов и цитотоксических препаратов направленного действия.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Терапевтическая активность фталоцианинов, антрациклиновых антибиотиков и растительных алкалоидов может быть значительно увеличена за счет их избирательного рецепторопосредованного транспорта в опухолевые клетки в составе препаратов направленного действия на основе АФП и ЭФР.

• Лекарственная резистентность опухолевых клеток к антрациклиновым антибиотикам может быть существенно снижена при их применении в составе препаратов направленного действия.

• Пептидные фрагменты ЭФР, ТФР и АФП могут быть использованы в качестве эффективных векторов для направленной доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам-мишеням.

• Рецепторопосредованный эндоцитоз является эффективным механизмом избирательной доставки и транспорта в клетку цитотоксических веществ в составе препаратов направленного действия на основе пептидных векторов.

• Сконструированные плазмидные векторы, несущие ген эндостатина человека, позволяют осуществлять эффективную экспрессию целевого белка в клетках штамма-продуцента. Разработанные методы выделения и ренатурации рекомбинантного эндостатина позволяют получать биологически активный белок в препаративных количествах.

• Сочетанное применение антиангиогенных агентов, способных разрушать опухолевую кровеносную сеть, и препаратов направленного действия, оказывающих прямое цитотоксическое воздействие на раковые клетки, позволяет существенно повысить эффективность противоопухолевой терапии.

Научная новизна работы.

Разработаны оптимальные схемы получения эффективных противоопухолевых препаратов направленного действия, включающих фталоцианины, антрациклиновые антибиотики, растительные алкалоиды и векторные белки (эпидермальный фактор роста и альфа-фетопротеин человека). Убедительно продемонстрировано, что терапевтическая активность исследуемых препаратов может быть значительно увеличена за счет их избирательного рецепторопосредованного транспорта в опухолевые клетки в составе коньюгатов с векторными полипептидами.

Продемонстрирована возможность значительного снижения лекарственной устойчивости опухолевых клеток к антрациклиновым антибиотикам при использовании препаратов направленного действия. Впервые исследована динамика накопления и внутриклеточное распределение антибиотика антрациклинового ряда доксорубицина, доставляемого в опухолевые клетки в составе препарата направленного действия, включающего эпидермальный фактор роста в качестве вектора. Полученные данные проливают свет на механизм цитотоксического действия полученных препаратов направленного действия и позволяют наметить пути увеличения их противоопухолевой активности.

Впервые получены синтетические пептиды ЭФРМФ и ТФРМФ, представляющие собой модифицированные рецепторсвязывающие фрагменты соответственно эпидермального фактора роста (ЭФР) и трансформирующего фактора роста (ТФР) человека. Показана способность этих пептидов проникать в раковые клетки путём рецепторопосредованного эндоцитоза.

Впервые получены ковалентные коньюгаты пептидов ЭФРМФ, ТФРМФ и рекомбинантного белка – 3-го домена -фетопротеина человека (АФП3Д) с доксорубицином и продемонстрирована их высокая специфическая цитотоксическая и противоопухолевая активность in vitro и in vivo.

Сконструированы плазмидные векторы E. coli, позволяющие эффективно осуществлять индуцированный биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента. Разработан простой и эффективный метод выделения и ренатурации рекомбинантного эндостатина, позволяющий получать биологически активный белок.

Впервые получены липосомные формы ангиостатина и эндостатина человека и продемонстрировано, что противоопухолевая эффективность данных форм in vivo выше, чем соответствующих нелипосомных форм.

Впервые in vivo продемонстрирована более высокая терапевтическая эффективность комбинированного применения антиангиогенных полипептидов и цитотоксических препаратов направленного действия по сравнению с монотерапией каждым из данных терапевтических агентов.

Практическая значимость исследования.

Разработанные противоопухолевые препараты направленного действия, наряду с оптимизированными методами их получения и тестирования, могут быть использованы для дальнейших исследований в области практической онкологии с перспективой перехода в разряд препаратов, проходящих доклинические испытания.

Применение рецепторсвязывающих фрагментов ЭФР, ТФР и АФП в качестве молекулярных векторов позволяет, наряду с увеличением стабильности и эффективности действия, достичь значительного снижения стоимости препаратов направленного действия.

Полученные штаммы-продуценты эндостатина человека и разработанные методы очистки и ренатурации этого белка могут быть использованы в области промышленной биотехнологии, а полученный рекомбинантный белок как для научно-исследовательских работ, так и для его применения в области практической медицины.

Обнаружение более высокого терапевтического потенциала in vivo липосомных форм ангиостатина и эндостатина по сравнению с их свободными формами делает возможным развитие этого направления в области создания новых противоопухолевых средств.

Продемонстрированное преимущество комбинированной терапии опухолей с применением двух классов препаратов с различными механизмами противоопухолевого действия, таких как антиангиогенные полипептиды и цитотоксические препараты направленного действия, представляет большой интерес при поиске эффективных схем противоопухолевой терапии. Полученные результаты расширяют понимание вопроса сочетания разных типов антинеопластических средств при выборе схем лечения онкологических заболеваний и показывают важность продолжения исследований антиангиогенных полипептидов и цитотоксических химиопрепаратов на основе пептидных векторов, специфические рецепторы которых гиперэкспонированы на мембранах злокачественно перерождённых клеток.

На основе разработанных технологий получения рекомбинантного эндостатина человека, препаратов направленного действия, включающих цитотоксические агенты и векторные полипептитды, а также липосомных форм антиангиогенных агентов оформлено 6 патентов на изобретение.

Апробация диссертационной работы. Результаты исследований доложены на конференциях: Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM) (1996, 1999, 2000, 2001, 2002, 2004);

5th European Winter Oncology Conference, France, 1997;

the European Cancer Conference ECCO 9, Hamburg, 1997;

International Conferences New Anticancer Agents, Athens, 1997;

VIII конференции «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, 1997;

Meeting of the EACR (1998, 2002, 2004, 2006);

4th European Congress of Pharmaceutical Sciences, Milan, 1998;

Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2000, 2003, 2004, 2005);

17th Meeting of the International Academy of Tumour Marker Oncology, Hong Kong, 2000;

3rd Central European Conference on Human Tumor Markers, Karlovy Vary, 2001;

3rd international symposium on genetic anticancer agents, Amsterdam, 2002;

14th International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, 2003;

37thAnnual Scientific Meeting of European Society for Clinical Investigation (ESCI), Verona, 2003;

9th World Congress on Cancers of the Skin, Sevilla, 2003;

Объединенном иммунологическом форуме, Екатеринбург, 2004;

международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва (2004, 2005);

the World Conference on Dosing of Antiinfectives, Nurnberg, Germany, 2004;

международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2005.

Публикации: основные материалы работы изложены в 35 статьях, 48 материалах научных конференций, 6 оформленных патентах РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 248 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, общие выводы и указатель цитируемой литературы (330 источников). Работа иллюстрирована 67 рисунками и 23 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования Для реализации поставленных задач были использованы методы исследования:

• химические (синтез, выделение и очистка препаратов направленного действия, твердофазный химический синтез);

• физико-химические (флуориметрия, проточная цитофлуориметрия, флуоресцентная микроскопия, центрифугирование, электрофорез, хроматография);

• биологические (исследование биологической активности препаратов на культурах клеток, исследование противоопухолевой активности на моделях экспериментальных опухолей у животных).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Задачей первого этапа исследований являлось определение возможностей реализации подхода, рассматривающего рецепторопосредованный эндоцитоз в качестве универсального механизма, позволяющего доставлять в клетку-мишень различные эффекторы с помощью физиологических лигандов и, таким образом, оказывать целенаправленное влияние на внутриклеточные процессы. Для практического выполнения поставленной задачи в качестве модели нами были использованы опухолевые клетки человека и химиопрепараты, широко исследуемые и применяемые в области практической онкологии. В качестве физиологических лигандов были использованы белки ЭФР и АФП, а также их рецепторсвязывающие фрагменты, наиболее полно отвечающие критериям, предъявляемым к векторным молекулам (стабильность, доступность, высокий уровень рецепторов на клетках мишенях и др.). Выбор области исследования продиктован большим практическим значением химиотерапии злокачественных новообразований и повышения ее эффективности в медицине.

Получение и исследование цитотоксической и противоопухолевой активности препаратов направленного действия на основе АФП и ЭФР in vitro и in vivo Для исследования возможностей повышения противоопухолевой терапевтической активности фталоцианинов алюминия (ФЦ(Al)) и кобальта (ФЦ(Со)), антрациклиновых антибиотиков доксорубицина (ДР) и карминомицина (КМ) и растительных алкалоидов винкристина (ВК) и винбластина (ВБ), доставляемых в опухолевые клетки в результате рецепторопосредованного эндоцитоза, были синтезированы их коньюгаты с векторными белками. Коньюгаты ДР, КМ и ВБ с АФП и ЭФР были получены с помощью водорастворимого карбодиимида, коньюгаты ФЦ(Al), ФЦ(Со) и ВК с АФП и ЭФР путем прямого присоединения цитотоксических препаратов к белку. Молярные соотношения векторный белок : химиопрепарат в коньюгатах АФП и ЭФР составляли 1:4 и 1:1 соответственно. Относительно высокое содержание цитотоксических препаратов в препаратах на основе АФП обусловлено более высокой молекулярной массой белка (~70 кДа) по сравнению с ЭФР (6,045 кДа).

Увеличение содержания химиопрепарата в препаратах на основе ЭФР может привести к уменьшению аффинности векторной молекулы к рецептору и сказаться на эффективности внутриклеточной интернализации.

Цитотоксическая активность препаратов направленного действия на основе АФП и ЭФР Сравнительное исследование цитотоксической активности (ЦТА) свободных противоопухолевых препаратов и их коньюгатов с АФП проводили на клетках Т клеточной лимфомы человека линии QOS, обладающих способностью к эффективному связыванию и внутриклеточному накоплению данного белка [Severin 1995].

Опухолевые клетки рака молочной железы человека линии MCF-7 и меланомы мыши линии В16, несущие на поверхности рецепторы ЭФР, использовали в качестве моделей для оценки ЦТА соответствующих препаратов. Результаты исследования ЦТА свободных и входящих в состав препаратов направленного действия на основе АФП и ЭФР противоопухолевых агентов приведены в табл. 1 и 2, соответственно.

Таблица 1. Цитотоксическая активность химиотерапевтических препаратов и их коньюгатов с АФП в отношении клеток Т-клеточной лимфомы человека линии QOS (приведены средние значения IC50 по трем экспериментам для каждого типа клеток).

Препарат IC50, мкМ ПСД* Фталоцианины ФЦ(Al) 1, 1,09 1, АФПФЦ(Al) 12, ФЦ(Со) 2,4 5, АФПФЦ(Со) Антрациклиновые антибиотики ДР 0, 0,29 2, АФПДР 1, КМ 0,96 1, АФПКМ Растительные алкалоиды ВБ 0, 0,0025 8, АФПВБ * Показатель соотношения доз (ПСД) представляет собой отношение значений IC50 в присутствии свободного цитотоксического препарата и препарата направленного действия.





Таблица 2. Цитотоксическая активность химиотерапевтических препаратов и их коньюгатов с ЭФР в отношении опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линии MCF-7 и меланомы мыши линии В16 (приведены средние значения IC по трем экспериментам для каждого типа клеток).

MCF-7 B Препарат IC50, мкМ ПСД* IC50, мкМ ПСД* Фталоцианины ФЦ(Al) 2,5 6, 0,9 2,78 2,5 2, ЭФРФЦ(Al) 40 16, ФЦ(Со) 0,3 133,33 12,1 1, ЭФРФЦ(Со) Антрациклиновые антибиотики ДР 0,65 0, 0,57 1,14 0,18 2, ЭФРДР 0,029 0, КМ 0,007 4,14 0,027 1, ЭФРКМ Растительные алкалоиды ВБ 0,0071 0, 0,0017 4,18 0,00015 226, ЭФРВБ 0,0084 0, ВК 0,002 4,20 0,0022 5, ЭФРВК * Показатель соотношения доз (ПСД) представляет собой отношение значений IC50 в присутствии свободного цитотоксического препарата и препарата направленного действия.

ЦТА препаратов, включающих фталоцианины Следует отметить, что механизм активации фталоцианинов, используемых для фотодинамической (ФЦ(Al)) и каталитической, или темновой (ФЦ(Со)) терапии может быть различным. Для активации ФЦ(Al) облучали клетки светом соответствующей длины волны [Moan 1990]. ФЦ(Со) активировали добавлением в клеточную среду аскорбиновой кислоты без использования источника света [Moan 1990, Van Hillegersberg 1994]. Мольное соотношение ФЦ(Со):аскорбиновая кислота составляло 1:10. Изучение ЦТА фталоцианинов и включающих их препаратов на основе АФП показало, что активность препаратов направленного действия заметно превышала активность свободных ФЦ, причем наибольшую ЦТА проявлял препарат АФПФЦ(Со). Аналогичные результаты получены для препаратов на основе ЭФР, причем препарат, включающий ФЦ(Со), проявлял чрезвычайно высокую ЦТА в отношении клеток карциномы молочной железы линии MCF-7 (табл. 2). Наибольшая эффективность цитотоксического действия препаратов на основе ЭФР отмечалась также в отношении клеток MCF-7. Представленные данные наглядно иллюстрируют преимущество векторной доставки фталоцианинов в клетку, позволяющей увеличить цитотоксичность исследуемых препаратов.

ЦТА препаратов, включающих антрациклиновые антибиотики Как видно из табл. 1 и 2, ЦТА препарата АФПДР в отношении клеток Т клеточной лимфомы линии QOS превышала активность свободного вещества более чем в 2 раза. ЦТА препарата ЭФРДР и свободного антибиотика в отношении клеток линии MCF-7 характеризовались близкими значениями;

в то же время препарат ЭФРДР в отношении клеток мышиной меланомы линии В16 проявлял ЦТА в 2 раза большую, чем свободный ДР. Из препаратов, включающих КМ, лишь ЭФРКМ проявлял ЦТА, существенно превышающую активность свободного антибиотика, в экспериментах с клетками линии MCF-7 (табл. 1, 2).

Дополнительное сравнительное исследование ЦТА ДР, КМ и препаратов направленного действия проводили на чувствительных к этим антибиотикам клетках карциномы яичника человека линии SKOV3, поскольку оба вектора эффективно доставляют цитотоксические препараты в клетки данной линии [Severin 1995].

Результаты исследования приведены на рис. 1 и 2 и в табл. 3.

Как видно на рис. 1 и 2, АФПДР оказался более эффективным цитотоксическим препаратом (ЦТА препарата АФПДР выше активности ДР в 4, раза), чем АФПКМ (IC50 коньюгата и свободного вещества характеризуются близкими значениями), что может быть обусловлено различиями в чувствительности и механизмах устойчивости клеток к данным антибиотикам. Препарат ЭФРДР, напротив, является менее цитотоксичным, чем ЭФРКМ: IC50 свободного ДР и его коньюгата с ЭФР оказались равными, в то время как активность препарата ЭФРКМ превышала активность свободного КМ в 3,67 раза.

Выживаемость, % Выживаемость, % Др Км Др-АФП Км-АФП Др-ЭФР Км-ЭФР 1 10 100 0,01 0,1 [Км], нМ [Др], мкМ Рис. 1. Выживаемость клеток карциномы Рис. 2. Выживаемость клеток карциномы яичника человека линии SKOV3 при яичника человека линии SKOV3 при инкубации со свободным ДР и инкубации со свободным КМ и препаратами АФПДР и ЭФРДР в препаратами АФПКМ и ЭФРКМ в течение 72 ч. течение 72 ч.

Таблица 3. Цитотоксическая активность доксорубицина и карминомицина и их коньюгатов с АФП и ЭФР в отношении клеток карциномы яичника человека линии SKOV3 (приведены средние значения IC50 по трем экспериментам).

Препарат IC50, нМ ПСД* ДР 290 4, АФПДР 1200 ЭФРДР КМ 99 1, АФПКМ 30 3, ЭФРКМ * Показатель соотношения доз (ПСД) представляет собой отношение значений IC50 в присутствии свободного антибиотика и препарата направленного действия.

Представленные данные свидетельствуют о том, что эффективность цитотоксического действия препаратов направленного действия определяется не только природой цитотоксических агентов и векторных молекул и способом их химической “сшивки”, но и правильным выбором наиболее уязвимых к действию препаратов опухолевых клеток-мишеней.

ЦТА препаратов, включающих растительные алкалоиды ЦТА всех препаратов на основе ВБ и ВК, представленных в табл. 1 и 2, превышала активность свободных алкалоидов в отношении клеток исследуемых линий как минимум в 4 раза. При этом превышение активности препаратов на основе ЭФР в отношении клеток линии MCF-7 над активностью свободных ВБ и ВК находилось примерно на одинаковом уровне (в 4,18 и 4,2 раза соответственно). ЦТА препарата АФПВБ в отношении клеток линии QOS превосходила активность свободного ВБ почти в 9 раз. Наибольшей эффективностью цитотоксического действия отличался препарат ЭФРВБ, ЦТА которого в отношении клеток линии В16 превышала активность свободного ВБ более чем в 266 раз.

Представленные результаты исследования векторных возможностей ЭФР и АФП наглядно демонстрируют, что оба белка могут быть успешно использованы при создании препаратов направленного действия. При применении подобных препаратов, поступающих в клетки в процессе рецепторопосредованного эндоцитоза, их ЦТА в большинстве случаев значительно превышает активность свободных химиопрепаратов, попадающих в клетку в результате диффузии. В зависимости от механизма действия препарата, адресно доставляемого в клетку с помощью векторов, могут быть целенаправленно вызваны эффекты, модулирующие клеточную активность. Таким образом, подход к химиотерапии, предусматривающий использование рецепторопосредованного эндоцитоза для транспорта в клетку-мишень препаратов направленного действия, включающих физиологический лиганд и химиопрепарат, представляется чрезвычайно перспективным.

Исследование противоопухолевой активности фталоцианинов, антрациклиновых антибиотиков, растительных алкалоидов и включающих их препаратов направленного действия in vivo Сравнительное исследование противоопухолевой активности свободных и входящих в состав коньюгатов цитотоксических препаратов проводили на моделях перевиваемых солидных опухолей мышей с использованием клеток мышиного лейкоза линии Р388 (мыши DBA/2) и мышиной меланомы В16 (мыши C57Bl/6). Нами были использованы разные модели опухолей для изучения векторных возможностей исследуемых белков, поскольку ранее было показано, что АФП эффективно доставляет химиопрепараты в клетки линии Р388 [Severin 1996], а ЭФР в клетки линии В [Луценко 1998]. Препараты вводились 1 раз в 4 дня, всего 3 инъекции, начиная со 2 дня после прививки опухоли, в дозах (по химиопрепарату) 0,2 мг/кг в случае ФЦ(Со), ВБ и ВК, и 0,14 мг/кг в случае ДР и КМ. Через 1 ч после каждого введения препаратов ФЦ(Со) животные получали внутримышечно аскорбиновую кислоту в дозе 0,46 мг/кг.

Эффективность противоопухолевого действия исследуемых препаратов оценивали по способности к ингибированию роста опухолей и увеличению средней продолжительности жизни животных, подвергавшихся терапии, по сравнению с контролем. Результаты исследований приведены в табл. 4 и 5.

Таблица 4. Противоопухолевая активность свободных и входящих в состав препаратов направленного действия химиотерапевтических агентов в отношении солидных опухолей мышиного лейкоза линии Р Препарат ОРО*, % СПЖ, дни УСПЖ, % от контроля контроль 100 18,5±0,3 ФЦ(Со) 103 19,1±1,1 3, 70 26,5±0,2 43, АФПФЦ(Со) контроль 100 27,7±0,3 ДР 37,3 32,6±1,5 17, 12,4 42,2±16,3 59, АФПДР контроль 100 20,5±0,3 КМ 81,2 21,7±0,4 5, 53,4 25,7±1,5 25, АФПКМ контроль 100 7,0±1,5 ВБ 32 9,7±1,5 38, 9 13,2±1,6 88, АФПВБ * Данные на день начала гибели животных в контрольной группе.

Противоопухолевая активность препаратов, включающих ФЦ(Со) Несмотря на то, что препараты как ФЦ(Al), так и ФЦ(Со) обладали высокой цитотоксической активностью, для экспериментов in vivo мы избрали ФЦ(Со), поскольку данный препарат, в отличие от ФЦ(Al), может быть активирован при введении в клеточную среду и в органы аскорбиновой кислоты в отсутствии источника света [Novodarova 1996]. Как видно из табл. 4, терапевтическое применение свободного ФЦ(Со) в указанных дозах не приводило к ингибированию роста опухолей, в то время как лечение животных препаратом АФП–ФЦ(Со) приводило к значительному замедлению роста опухолей. При этом величина ингибирования роста опухолей составляла 30% на день начала гибели контроля. При применении ФЦ(Со) и ЭФР– ФЦ(Со) по такой же схеме ингибирование роста опухолей отмечалось только в случае препарата направленного действия и составляло 44% к дню начала гибели контрольных животных, что свидетельствует о высокой противоопухолевой эффективности препарата ЭФР–ФЦ(Со) (табл. 5).

Таблица 5. Противоопухолевая активность свободных и входящих в состав препаратов направленного действия химиотерапевтических агентов в отношении солидных опухолей мышиной меланомы линии В16.

Препарат ОРО*, % СПЖ, дни УСПЖ, % от контроля контроль 100 35,6+1,0 ФЦ(Со) 113 36,2+2,5 1, 56 45,9+2,9 28, ЭФРФЦ(Со) контроль 100 35,9+0,7 ДР 58,5 32,6+1,5 -9, 29,8 42,8+2,1 20, ЭФРДР контроль 100 30,9+4,8 КМ 88,9 32,5+7,1 5, 48,2 39,4+2,1 27, ЭФРКМ контроль 100 36,1+4,0 ВБ 77 35,8+2,6 -0, 48 45,4+3,4 27, ЭФРВБ контроль 100 36,1+4,0 ВК 49,2 36,6+2,3 1, 30,7 47,3+2,9 31, ЭФРВК * - на день начала гибели животных в контрольной группе.

Как видно из табл. 4 и 5, лечение животных как препаратом АФП–ФЦ(Со), так и ЭФР–ФЦ(Со) оказывало также значительный позитивный эффект в отношении УСПЖ животных. Представленные данные свидетельствуют о том, что как АФП, так и ЭФР могут быть успешно использованы для направленного транспорта фталоцианинов к опухолевым клеткам-мишеням.

Противоопухолевая активность препаратов, включающих ДР и КМ Для изучения возможностей повышения терапевтической активности ДР и КМ исследовали влияние свободных препаратов и их коньюгатов с АФП и ЭФР на развитие опухолей in vivo. При лечении животных свободным ДР и препаратом АФП–ДР ингибирование роста опухолей наблюдалось в группах, получавших как свободный антибиотик, так и коньюгат. При этом направленный препарат оказывал более сильное супрессивное действие в отношении опухолей, чем свободный ДР (табл. 4). Так, к дню эксперимента средний размер опухолей в группе, получавшей АФП–ДР, был в раза меньше, чем в группе, получавшей ДР. Наиболее значительное УСПЖ также наблюдалось в группе животных, получавших АФП-ДР (табл. 5). Таким образом, терапевтическая активность препарата АФП–ДР была значительно выше, чем активность свободного ДР. В группах животных, получавших ДР и препарат ЭФР–ДР, наблюдалось заметное ингибирование опухолевого роста. При этом относительный размер опухолей у животных, получавших ЭФР–ДР, к 40 дню после прививки опухоли оказался в 1,7 раза меньше, чем у животных, получавших свободный ДР, и в 3,4 раза меньше, чем в контроле (табл. 5). Кроме того, в отличие от свободного ДР, внутривенное введение препарата направленного действия приводило к 20% УСПЖ по сравнению с контролем (табл. 5).

Исследование влияния КМ и препарата АФПКМ на процесс опухолевого роста показало, что КМ обладал менее выраженным ингибирующим действием по сравнению с направленным препаратом. Так, к 22 дню эксперимента средний размер опухолей у животных, получавших АФП–КМ, оказался меньше примерно в 1,5 раза, чем у животных, получавших свободный КМ, и в 1,9 раза меньше, чем в контрольной группе.

Терапевтическое применение препарата АФП–КМ, в отличие от свободного КМ, также приводило к заметному УСПЖ животных (табл. 4).

Сравнительное исследование противоопухолевой активности КМ и ЭФР–КМ показало, что свободный антибиотик оказывал слабое ингибирующее действие в отношении роста опухолей в сравнении с контролем, тогда как ингибирующее действие ЭФР–КМ оказалось значительным – относительный размер опухолей в группе, получавшей ЭФР–КМ, составил лишь 48,2% (табл. 5). Эффект препарата ЭФР–КМ в отношении УСПЖ животных также оказался существенно выше эффекта свободного КМ.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что терапевтическая активность ДР и КМ может быть значительно повышена за счет их адресной доставки к опухолевым клеткам-мишеням с помощью АФП и ЭФР. Следует также отметить, что используемые в работе дозы ЭФР, вводимого в составе препаратов направленного действия, не индуцируют ускоренного развития опухолей и, таким образом, митогенная активность ЭФР не является препятствием для его использования в качестве вектора для адресной доставки цитотоксических препаратов к опухолевым клеткам-мишеням.

Противоопухолевая активность препаратов, включающих ВБ и ВК Исследование влияния препарата АФП–ВБ на развитие солидных опухолей линии L1210 показало, что как свободное вещество, так и коньюгат в исследуемых дозах оказывали ингибирующее действие на рост опухолей (табл. 4). При этом относительный объем опухолей у животных, получавших АФП–ВБ, к 8 дню эксперимента оказался в 3,6 раза меньше, чем у животных, получавших свободный ВБ, и примерно в 11 раз меньше, чем в контроле. Терапевтическое применение препарата АФП–ВБ приводило к наибольшему УСПЖ животных (88,6%) по сравнению со всеми исследуемыми препаратами на основе АФП и ЭФР (табл. 4).

Исследование влияния ВБ и препарата ЭФРВБ в тех же дозах на рост опухолей линии В16 показало, что ЭФРВБ обладал более выраженным ингибирующим действием, чем свободный алкалоид (табл. 5). Относительный размер опухолей у животных, получавших ЭФРВБ, к 31 дню эксперимента оказался в 1,6 раза меньше, чем у животных, получавших ВБ, и более чем в 2 раза меньше, чем в контроле. При лечении животных препаратом ЭФРВБ УСПЖ животных достигало 27%, тогда как свободный ВБ в используемых дозах практически не оказывал влияния на продолжительность жизни животных (табл. 5). Аналогичным противоопухолевым действием обладал препарат ЭФРВК. При его применении относительный размер опухолей у животных к 31 дню эксперимента оказался в 1,6 раза меньше, чем у животных, получавших свободный ВК в той же дозе, и более чем в 3 раза меньше, чем у контрольных животных (табл. 5). УСПЖ животных при терапии препаратом направленного действия достигало 31%, тогда как применение свободного ВК практически не влияло на продолжительность жизни животных.

Представленные данные позволяют заключить, что АФП и ЭФР могут быть использованы в качестве векторов для адресной доставки противоопухолевых препаратов к клеткам-мишеням. На основе данных белков могут быть созданы противоопухолевые препараты направленного действия с цитотоксическими веществами различных классов. Противоопухолевая активность препаратов направленного действия на основе векторных белков, включающих фталоцианины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды, значительно превышает активность свободных цитотоксических препаратов. По нашему мнению, применение таких систем для лечения резистентных к химиотерапевтическим препаратам опухолей могло бы значительно повысить эффективность терапии за счет преодоления препаратами направленного действия резистентности опухолевых клеток и снижения терапевтических доз препаратов. Кроме того, многих побочных эффектов, вызываемых химиотерапевтическими препаратами, например высокой кардиотоксичности ДР, можно было бы избежать при применении систем направленного действия за счет адресной доставки цитотоксических препаратов к клеткам-мишеням. Для достижения максимальной терапевтической эффективности разработанных нами препаратов необходимо их дальнейшее совершенствование наряду с подбором наиболее уязвимых к терапии опухолей и поиском оптимальных схем лечебного применения препаратов.

Сравнительное исследование ЦТА, динамики накопления и внутриклеточного распределения свободного и входящего в состав препарата направленного действия на основе ЭФР доксорубицина Резистентность, или множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток к действию ДР является основным препятствием на пути успешного его применения для терапии онкологических заболеваний. Коньюгирование ДР с векторным белком может значительно увеличить его цитотоксичность в отношении резистентных клеток, что представляется многообещающим путем преодоления МЛУ.

С точки зрения проявления цитотоксической активности ДР и ее зависимости от резистентности опухолевых клеток важнейшими факторами являются кинетические параметры включения антибиотика в клетку, а также оценка уровня его накопления и внутриклеточной локализации. Интернализация, внутриклеточная транслокация, компартментализация и накопление коньюгата ДР с белком, а также освобождение антибиотика внутри клетки в фармакологически активной форме являются важнейшими параметрами, определяющими ЦТА направленного препарата.

ЦТА доксорубицина и включающего его препарата на основе ЭФР в отношении чувствительной и резистентной к антрациклиновым антибиотикам клеточной линии карциномы молочной железы MCF- Результаты сравнительного исследования ЦТА ДР и препарата ЭФР-ДР в отношении опухолевых клеток, чувствительных (MCF-7/Wt) и резистентных (MCF 7/AdrR) к действию ДР, приведены на рис. 3. Препараты проявляли дозозависимую ЦТА в отношении клеток обеих линий, причем препарат ЭФР-ДР проявлял более высокую активность, чем свободный ДР (в случае клеток линии MCF-7/Wt в 4 раза, а MCF-7/AdrR – примерно в 2,2 раза, что, по-видимому, обусловлено различиями в путях поступления и внутриклеточного распределения препаратов). Наиболее высокая ЦТА препарата ЭФРДР проявлялась в отношении чувствительных клеток линии MCF-7/Wt (IC50=45 нМ) (рис. 3 А). В отношении резистентных клеток линии MCF-7/AdrR активность ЭФРДР была существенно ниже (IC50=1,6 мМ) (рис. 3 Б), что, очевидно, объясняется действием механизмов, определяющих резистентность.

А 100 Б 100 IC50, мкM ДР 3, ЭФР-ДР 1, Выживаемость, % 80 60 40 IC50, нМ ДР 20 ЭФР-ДР 0 1 10 100 1000 1 10 [Др], нM [Др], мкM Рис. 3. Цитотоксическая активность свободного и входящего в состав препарата направленного действия на основе ЭФР ДР в отношении клеток карциномы молочной железы человека линии MCF-7/Wt (А) и MCF-7/AdrR (Б).

Накопление свободного и входящего в состав препарата направленного действия ДР в чувствительных и резистентных опухолевых клетках В связи с тем, что уровень ЦТА препаратов направленного действия, так же, как и свободных химиопрепаратов, во многом определяется скоростью и характером поступления препаратов в клетку (пассивная диффузия и рецептор-опосредованный эндоцитоз), их компартментализацией, а также эффективностью действия механизмов клеточной резистентности, мы провели исследование закономерностей поступления, накопления и внутриклеточного распределения химиопрепаратов на примере ДР путем измерения его собственной флуоресценции в клеточных суспензиях. Отсутствие заметного изменения флуоресценции ДР при его взаимодействии с клеточными органеллами и мембранами и, напротив, гашение флуоресценции при интеркаляции антибиотика в ДНК позволяет производить измерение его накопления в ядре и цитоплазме клеток [Tarasiuk 1989]. Приведенные выше факты легли в основу производимых нами исследований.

Перенос ДР в составе препарата направленного действия и в свободном виде в клетки контролировали, используя флуоресцентные свойства этого антибиотика ( возбуждения 473 нм, эмиссии 556 нм). Следует отметить, что концентрация ДР в клеточных суспензиях при проведении эксперимента не должна превышать 6 мМ, поскольку интенсивность флуоресценции возрастает линейно при увеличении концентрации ДР до достижения данной величины, после чего наблюдается гашение флуоресценции за счет стэкинга молекул антибиотика [Tarasiuk 1989]. Клетки инкубировали с препаратом ЭФРДР или свободным ДР в течение 2 ч в питательной среде, затем собирали центрифугированием, измеряли флуоресценцию супернатанта, быстро промывали PBS с 0,1% BSA, суспендировали в растворе PBS и измеряли флуоресценцию суспензии клеток, соответствующую количеству ДР в цитоплазме и на мембранах клеток. Затем клетки лизировали, добавляя к суспензии 10% раствор ДСН до его конечной концентрации 0,2%, инкубировали 2 мин при 37 0С и измеряли флуоресценцию лизатов, отражающую общее содержание антибиотика в клетках.

Количество антрациклина, интеркалировавшего в ДНК, в ядрах клеток определяли по разности флуоресценции препаратов в присутствии ДСН и без него. Количество распавшегося ДР определяли по разности значений флуоресценции препарата в лизатах в начале инкубации и после ее завершения.

Данные по накоплению ДР в клетках линий MCF-7/Wt и MCF-7/AdrR представлены в табл. 6. Исследование накопления ДР в клетках показало, что после 2 ч инкубации содержание ДР в чувствительных клетках оказалось в 1,95 раза выше, чем в резистентных. Низкое содержание ДР в резистентных клетках обусловлено внутриклеточной деградацией свободного антибиотика, а также действием механизма, обеспечивающего выведение ДР из клетки [Сергеева 1996]. При инкубации клеточной суспензии с ЭФРДР уровень накопления ДР в чувствительных и резистентных клетках существенно не различался. Очевидно, что при рецептор-опосредованном эндоцитозе препарата ЭФРДР эффективность действия механизма, определяющего резистентность клеток к ДР, заметно снижена.

Таблица 6. Содержание ДР в клетках и среде инкубации по отношению к его исходному количеству в среде через 2 ч инкубации клеток MCF-7/Wt и MCF-7/AdrR со свободным и входящим в состав препарата направленного действия антибиотиком.

Содержание ДР, % Клеточная культура Препарат Клетки Среда Распад ДР 29,7 60,1 10, MCF-7/WT 40,1 52,4 7, ЭФРДР ДР 15,2 68,5 16, MCF-7/AdrR 36,6 55,3 8, ЭФРДР Следует отметить, что уровень накопления ДР как чувствительными, так и резистентными клетками при его поступлении в составе препарата ЭФРДР заметно превышает уровень накопления свободного ДР.

Представленные данные свидетельствуют о том, что рецепторопосредованный эндоцитоз, заложенный в основу препаратов направленного действия в качестве механизма транспорта, является более действенным средством доставки ДР в клетки MCF-7, чем диффузия свободного ДР через клеточную мембрану по градиенту концентрации. Высокий уровень накопления химиопрепарата резистентными клетками, обусловленный действием нахождением последнего в составе препарата направленного действия, может служить объяснением заметного снижения клеточной резистентности.

Ранее было показано, что ДР в клетке может подвергаться деградации [Tritton 1991]. Как видно из табл. 6, в процессе инкубации препарата ЭФРДР и свободного ДР с клетками линий MCF-7/Wt и MCF-7/AdrR происходит деградация ДР, регистрируемая по снижению флуоресценции, обусловленному образованием нефлуоресцирующих продуктов распада ДР, но не его интеркаляцией в ДНК. Следует отметить, что ДР, доставляемый в клетку в составе препарата направленного действия на основе ЭФР, подвержен распаду в меньшей степени, чем проникающий в клетку посредством свободной диффузии. Более низкий распад ДР может быть объяснен протективным действием полипептида, заключающемся в снижении воздействия на него цитоплазматических и околомембранных ферментов, например трансглутаминазы [Tritton 1991]. Наиболее высокий уровень деградации ДР наблюдался при инкубации клеток со свободным ДР, причем в резистентных клетках уровень распада был выше (16,3%), чем в чувствительных (10,2%) (табл. 6). В случае препарата направленного действия ЭФРДР существенных различий в уровнях деградации ДР между чувствительными и резистентными клетками не наблюдалось. Низкий уровень внутриклеточной деградации ДР в составе ЭФРДР может рассматриваться как преимущество при использовании препарата направленного действия в качестве цитотоксического агента.

Накопление свободного и входящего в состав препарата направленного действия ДР в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток Результаты экспериментов по изучению динамики накопления ДР в ядрах чувствительных (линия MCF-7/Wt) и резистентных (линия MCF-7/AdrR) клеток при их инкубации с препаратом ЭФРДР и свободным ДР приведены на рис. 4. На рис. 4 А видно, что как в случае препарата направленного действия, так и свободного ДР кривые достигают плато в течение 200 мин. При этом наблюдалось примерно 42% гашение первоначальной флуоресценции ДР. t1/2, т.е. время, необходимое для достижения полумаксимального уровня гашения флуоресценции, составило 38 мин для препарата ЭФРДР и 17 мин для свободного ДР, что отражает значительное различие в скоростях поступления препаратов в ядра клеток (табл. 7). Как видно на рис. 4 Б, кривые гашения флуоресценции при 2-х часовой инкубации резистентных к ДР клеток линии MCF-7/AdrR, в отличие от MCF-7/Wt, не достигали плато. При этом отмечалось 44% и 32%-ное гашение первоначальной флуоресценции при 2-х часовой инкубации клеток с препаратом ЭФРДР и свободным ДР соответственно. t1/2 для препарата ЭФРДР составило 46 мин, а для свободного ДР – 36 мин (табл. 7). Представленные данные свидетельствуют о более низких скоростях накопления препарата ЭФРДР в ядрах чувствительных и резистентных к ДР клеток по сравнению со свободным ДР.

Различия в скоростях накопления свободного и входящего в состав препарата направленного действия антибиотика определяются как путем транслокации этих препаратов в клетку, так и особенностями их внутриклеточной компартментализации.

Свободные антрациклины быстро проникают в клетку в результате пассивной диффузии [Takahashi 1996]. Антрациклины, входящие в состав препаратов направленного действия, попадают в клетку в результате рецепторопосредованного эндоцитоза, протекающего с более низкой скоростью [Willingham 1983].

А Б Тушение флуоресценции, % 10 Др ДР ЭФР-Др ЭФР-ДР 0 50 100 150 0 50 100 150 t, мин t, мин Рис. 4. Тушение флуоресценции ДР при инкубации опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линий MCF-7/Wt (А) и MCF-7/AdrR (Б) со свободным и входящим в состав препарата направленного действия на основе ЭФР доксорубицином.

Примечательно, что процесс накопления ДР в ядрах чувствительных клеток проходит значительно быстрее, чем в резистентных, как при использовании препарата ЭФРДР, так и свободного ДР, что может быть обусловлено проявлением механизмов резистентности, препятствующих проникновению химиопрепаратов в клетку [Сергеева 1996]. Одним из факторов, определяющих уровень ЦТА препарата ЭФРДР в отношении чувствительных (MCF-7/Wt) и резистентных (MCF-7/AdrR) клеток, также может являться скорость поступления препарата в ядра клеток, что справедливо и для свободного ДР.

Таблица 7. Накопление свободного и входящего в состав препарата направленного действия ДР в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток.

Препарат / Линия клеток ДР ЭФРДР MCF-7/Wt 17,1±0,6 38,3±0, t1/2*, мин MCF-7/AdrR 36,0±0,7 46,2±1, MCF-7/Wt 0,538±0,010 0,616±0, C**, мкМ/106 кл MCF-7/AdrR 0,257±0,012 0,543±0, * t1/2 – время полумаксимального накопления ДР в ядрах опухолевых клеток.

** C – концентрация связанного с ядром ДР, определенная в условиях стационарного состояния.

Как видно из табл. 7, уровень накопления ДР, входящего в состав препарата ЭФРДР, в ядрах клеток MCF-7/Wt и MCF-7/AdrR превышает уровень свободного антибиотика. Уровень накопления свободного ДР в ядрах клеток MCF-7/Wt был заметно выше, чем в MCF-7/AdrR, что может служить одним из объяснений резистентности клеток к цитотоксическому действию антибиотика. Уровни накопления ДР, входящего в состав препарата ЭФРДР, в ядрах клеток MCF-7/Wt и MCF-7/AdrR существенно не различались, т.е. не зависели от чувствительности клеток, что может служить объяснением высокой ЦТА антибиотика в отношении резистентных клеток при применении препарата направленного действия.

Для выяснения внутриклеточной локализации ДР, поступающего в клетки путем рецепторопосредованного эндоцитоза и диффузии через клеточную мембрану, мы исследовали его накопление в ядре и цитоплазме опухолевых клеток (табл. 8). После 2 ч инкубации клеток со свободным ДР и препаратом ЭФРДР антибиотик преимущественно локализовался в ядрах обоих типов клеток. При этом распределение свободного ДР между ядром и цитоплазмой клеток MCF-7/Wt и MCF-7/AdrR существенно различается. Так, соотношение содержания ДР в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток MCF-7/Wt и MCF-7/AdrR составило 9,0 и 5, соответственно. Таким образом, по сравнению с клетками MCF-7/Wt, относительный уровень свободного ДР в ядрах клеток MCF-7/AdrR снижается, а в цитоплазме возрастает, что, очевидно, вызвано действием механизма клеточной резистентности [Сергеева 1996], препятствующего поступлению антрациклинов в ядро. В противоположность свободному антибиотику, соотношение содержания ДР, входящего в состав препарата ЭФРДР, в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток MCF 7/Wt и MCF-7/AdrR составило 3,3 и 2,8 соответственно. Таким образом, при поступлении ДР в клетку в составе коньюгата с ЭФР его содержание в ядре (табл. 7), а также уровень его относительного распределения между ядром и цитоплазмой (табл. 8) практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотику, что может свидетельствовать о низкой эффективности действия механизма клеточной резистентности в отношении препарата направленного действия. Одним из объяснений этого может служить недоступность связанного с ЭФР и проходящего путь внутриклеточных компартментов ДР для действия мембранного насоса Р170.

Таблица 8. Распределение ДР между ядром и цитоплазмой клеток MCF-7 через 2 ч инкубации со свободным и входящим в состав препарата направленного действия ДР.

Содержание ДР, % Линия клеток Препарат Ядро Цитоплазма ДР 90 MCF-7/Wt 77 ЭФРДР ДР 85 MCF-7/AdrR 74 ЭФРДР Таким образом, особая привлекательность использования препаратов направленного действия в качестве терапевтических средств связана с возможностью значительного снижения или полного преодоления множественной лекарственной устойчивости, условием которого является дальнейшее их совершенствование.

Создание и исследование противоопухолевого потенциала препаратов направленного действия на основе рецепторсвязывающих пептидных фрагментов АФП, ЭФР и ТФР Продолжением вышеописанных исследований явилась попытка создания и изучения противоопухолевого потенциала препаратов направленного действия на основе рецепторсвязывающих фрагментов АФП и ЭФР. Поскольку трансформирующий фактор роста (ТФР) является физиологическим лигандом рецептора ЭФР, рецепторсвязывающий фрагмент данного белка также использовали в качестве векторного компонента препаратов направленного действия.

Синтез пептидных аналогов рецепторсвязывающих фрагментов ЭФР и ТФР В настоящем исследовании мы изучали возможность использования рецепторсвязывающих фрагментов ЭФР и ТФР в качестве таких векторов. ЭФР и ТФР являются естественными лигандами рецептора ЭФР [Ciardiello 2003], а связывание как ЭФР [Ogiso 2002], так и ТФР [Garrett 2002] с рецептором детально охарактеризовано. Были исследованы два пептида, полученные методом твёрдофазного пептидного синтеза, – модифицированный фрагмент ЭФР человека (рецепторсвязывающий участок ЭФР) (ЭФРМФ) и модифицированный фрагмент ТФР человека (рецепторсвязывающий участок ТФР) (ТФРМФ). ЭФРМФ имел структуру H2NMYIEALDSYACCOOH и отличался от рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР человека (а.о. 21-31: MYIEALDKYAC) заменой Лиз28 на Сер. ТФРМФ имел структуру H2NRFLVQEDSPACOOH и отличался от рецепторсвязывающего фрагмента ТФР человека (а.о. 22-31: RFLVQEDKPA) заменой Лиз29 на Сер. Такие замены позволяют избежать взаимодействия -аминогруппы лизина со сшивающим агентом в ходе коньюгирования пептидов. Экранирование лизина в составе пептидов может препятствовать взаимодействию коньюгатов с рецептором ЭФР и их эффективной интернализации.

Получение рекомбинантного 3-го домена -фетопротеина человека Получение рекомбинантного -фетопротеина связано с существенными трудностями ввиду высокой молекулярной массы белка и наличия в нём многочисленных углеводных компонентов и дисульфидных связей. В значительной мере избежать этих затруднений позволяет использование генно-инженерных конструкций, обеспечивающих продукцию не целого белка, а его биологически активных фрагментов. В нашей работе мы изучали потенциал АФП3Д, полипептида с мол. массой около 27 кДа, как векторной молекулы для адресной доставки цитотоксических средств в малигнизированные ткани. Препарат АФП3Д был любезно предоставлен сотрудниками НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова к.б.н. Гороховец Н.В. и Макаровым В.А. Рекомбинантный АФП3Д выделяли из биомассы штамма-продуцента E. coli BL21(DE3), в которых он накапливался в тельцах включения. АФП3Д получали из биомассы штамма-продуцента посредством ультразвуковой дезинтеграции клеток, изолирования телец включения и ренатурации рекомбинантного белка. Ренатурацию проводили с помощью серии диализов и окисления HS-групп препарата кислородом воздуха после предварительной полной денатурации АФП3Д в присутствии мочевины и гуанидинхлорида. Окончательную очистку белка осуществляли гель-фильтрационной хроматографией на сорбенте Superdex 200 10/30. В результате был получен белок с мол. массой около 27 кДа (данные электрофоретического и масс-спектрального анализа). Выход ренатурированного АФП3Д составил 5 мг/л культуральной среды.

Исследование накопления модифицированных рецепторсвязывающих фрагментов ЭФР и ТФР человека в опухолевых клетках Для исследования способности синтезированных пептидов к избирательному проникновению в клетки злокачественных опухолей применяли метод проточной цитофлуориметрии. В качестве стандарта при исследовании способности синтезированных пептидов к Интенсивность флуоресценции, усл. ед.

140 DU145 связыванию с рецептором ЭФР Фибробласты 120 на поверхности клеток карциномы предстательной железы использовали ФИТЦ меченый ЭФР. Известно, что при 4°С наблюдается связывание мембранных рецепторов с их лигандами на 20 поверхности клеток, но интернализации лиганд ЭФР-ФИТЦ ЭФРМФ-ФИТЦ ТФРМФ-ФИТЦ рецепторных комплексов не происходит. При 37°С, Рис. 5. Интенсивность флуоресценции клеток напротив, после связывания с DU145 после 1 ч инкубации с ЭФРФИТЦ, рецептором происходит ЭФРМФФИТЦ TФРМФФИТЦ и в эффективная интернализация концентрации 4 мкМ при 37°С.

лигандов, поступающих в клетку путем рецепторопосредованного эндоцитоза. В связи с этим для исследования возможных путей поступления пептидов в клетку (рецепторопосредованный эндоцитоз или альтернативное проникновение через плазматическую мембрану) мы провели сравнительное изучение накопления флуоресцентной метки в опухолевых клетках карциномы предстательной железы человека линии DU145 и в клетках первичной культуры фибробластов человека при их инкубации с ФИТЦ-мечеными ЭФР и пептидами в различных температурных режимах.

Для обоих исследованных пептидов было показано, что уровень флуоресценции в клетках, инкубировавшихся с ФИТЦ-мечеными пептидами при 37°С, значительно выше, чем в клетках, инкубировавшихся при 4°С. Так, при концентрации препарата 1 мкМ интенсивность флуоресценции при 37°С для ЭФРМФФИТЦ превышала интенсивность флуоресценции при 4°С на 29,2%, а для ТФРМФФИТЦ – на 62,6%. При концентрации 4 мкМ интенсивность флуоресценции при 37°С для ЭФРМФФИТЦ превышала интенсивность флуоресценции при 4°С на 74,8%, для ТФРМФФИТЦ – на 185,2%, т.е. почти в 3 раза. Интенсивность флуоресценции клеток, обработанных ФИТЦ-мечеными пептидами в максимальной концентрации (4 мкМ), была значительно выше их аутофлуоресценции и сопоставима с уровнем флуоресценции клеток, инкубировавшихся с ЭФРФИТЦ (рис. 5). Этот вывод подтверждается флуоресцентной микроскопией клеток линии DU145, инкубировавшихся с ЭФРФИТЦ, ЭФРМФФИТЦ и ТФРМФФИТЦ (данные не показаны). В то же время интенсивность флуоресценции в фибробластах человека, инкубировавшихся с ФИТЦ-мечеными пептидами в аналогичных концентрациях, была значительно более низкой. Так, после инкубации с ЭФРФИТЦ интенсивность флуоресценции фибробластов была более чем в 5 раз слабее, чем клеток DU145. Интенсивность флуоресценции фибробластов после инкубации с ЭФРМФФИТЦ и ТФРМФФИТЦ была ниже интенсивности флуоресценции опухолевых клеток DU145 в 3,1 и 4,3 раза соответственно (рис. 5).

Полученные результаты свидетельствуют о способности данных пептидов специфически проникать в клетки карциномы предстательной железы человека путём рецепторопосредованного эндоцитоза.

Коньюгирование ДР с векторными пептидами С целью изучения возможности использования синтезированных пептидов в качестве векторов для направленного транспорта нами были синтезированы коньюгаты пептидов АФП3Д, ЭФРМФ и ТФРМФ, а также ЭФР, с противоопухолевым антибиотиком антрациклинового ряда доксорубицином. Коньюгаты были получены с помощью сшивающего реагента PDPH (3-2(пиридилдитио)пропионил гидразид). Мольное соотношение ЭФР:ДР, ЭФРМФ:ДР, ТФРМФ:ДР и АФП3Д:ДР для всех полученных препаратов составляло 1:1.

Определение ЦТА препаратов направленного действия на основе АФП3Д, ЭФР, ЭФРМФ и ТФРМФ Полученные препараты исследовали на наличие специфической ЦТА in vitro на культурах ряда клеток злокачественных опухолей (карцинома предстательной железы человека DU145, эпидермоидная карцинома человека А431, карцинома молочной железы человека MCF-7 и фибросаркома человека HT1080), а также на нераковых клетках, в качестве которых использовали первичную культуру фибробластов человека и линию мышиных эндотелиоцитов SVEC4-10. Препараты проявляли выраженную дозозависимую ЦТА в отношении всех четырех линий опухолевых клеток, фигурировавших в исследовании. При этом уровень ЦТА препаратов ЭФРМФДР и ТФРМФДР был сравним с активностью препарата ЭФРДР. Данные о ЦТА всех препаратов на основе векторных пептидов в отношении исследованных клеточных линий обобщены в табл. 9.

Таблица 9. ЦТА препаратов направленного действия на основе ЭФР, ЭФРМФ, ТФРМФ и АФП3Д и ДР в отношении раковых и нормальных клеток человека и мыши (приведены средние значения IC50 по данным трех независимых экспериментов).

IC50, мкМ Линия клеток ЭФРМФДР ТФРМФДР АФП3Д ДР ДР ЭФРДР 0,065 0,055 0,105 0,090 0, DU 0,027 0,021 0,040 0,023 0, A 0,051 0,057 0,133 0,112 0, MCF- 0,079 0,064 0,258 0,149 0, НТ 0,071 2,29 2,14 2,05 1, Фибробласты 0,0075 0,133 0,495 0,611 0, SVEC4- Наибольшую активность ДР и препараты направленного действия на основе векторных пептидов – лигандов рецептора ЭФР проявляли по отношению к клеточной линии А431. При этом ЦТА препаратов ЭФРДР, ЭФРМФДР и ТФРМФДР была близка к активности свободного ДР (табл. 9). Следует учитывать, что in vivo свободный ДР легко проникает во все типы раковых и нормальных клеток, что является причиной возникновения побочных эффектов. В противоположность этому, препараты на основе пептидов будут главным образом проникать лишь в опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие рецептор ЭФР. Поэтому их цитотоксическое действие на нормальные клетки будет минимальным. Таким образом, несмотря на близкие значения ЦТА препаратов направленного действия и свободного ДР in vitro, преимущества направленных препаратов над ДР при их терапевтическом применении in vivo представляются очевидными.

Исследования ЦТА препаратов в отношении опухолевых клеток линии DU (карцинома предстательной железы человека) показали, что активность ЭФРДР (IC50 0,055 мкМ) превышала как активность препаратов ЭФРМФДР (IC50 0,105 мкМ) и ТФРМФДР (IC50 0,090 мкМ), так и активность свободного ДР (IC50 0,065 мкМ).

Уровень ЦТА препаратов ЭФРМФДР и ТФРМФДР, напротив, был несколько ниже, чем у свободного ДР.

В отношении клеточной линии MCF-7 (карцинома молочной железы человека) ЦТА препарата ЭФРДР (IC50 0,057 мкМ) была близка к активности свободного ДР (IC50 0,051 мкМ). Активность препаратов ЭФРМФДР и ТФРМФДР была более чем в два раза ниже (IC50 0,133 и 0,112 мкМ соответственно).

В отношении клеток фибросаркомы человека линии НТ1080 ЦТА препарата ЭФРДР была близка к активности свободного ДР, в то время как активность ЭФРМФДР и ТФРМФДР была ниже активности свободного антибиотика в 3,2 и 1, раза, соответственно (табл. 9). Возможно, такой результат говорит о специфическом рецепторном портрете клеток линии НТ1080, которые, не являясь клетками эпителиального гистогенеза, могут иметь особенности в экспонировании и функциональной активности рецепторов ЭФР.

Для исследования действия препаратов на нормальные клетки человека в качестве модельных культур использовали первичную культуру фибробластов человека и клетки эндотелия лимфатических сосудов мыши SVEC4-10, имеющие нормальный фенотип, при котором экспонирование рецептора ЭФР на поверхности мембраны минимально [Ciardiello and Tortora 2001].

ЦТА всех исследованных препаратов направленного действия в отношении клеток SVEC4-10 превышала активность в отношении фибробластов. Как видно из табл. 9, при изучении ЦТА синтезированных препаратов на основе пептидов на первичной культуре фибробластов человека IC50 не достигалась даже при концентрации 2 мкМ, хотя для свободного ДР IC50 составляла лишь 0,071 мкМ. Таким образом, ЦТА свободного ДР оказалась значительно более высокой, чем активность каждого из коньюгатов. Клетки эндотелия мыши были выбраны нами в качестве объекта исследования в силу необходимости установить возможное цитотоксическое действие препаратов ЭФРМФДР и ТФРМФДР на стенки сосудов экспериментальных животных, поскольку при исследованиях in vivo такие коньюгированные препараты, как и свободный ДР, будут вводиться внутривенно. ЦТА ДР при исследованиях на клетках эндотелия мыши линии SVEC4-10 была очень высокой (IC50 0,0075 мкМ). ЦТА коньюгированных форм антибиотика была в 6080 раз ниже по сравнению со свободным ДР (IC50 препаратов направленного дейстия составляла 0,495 мкM в случае ЭФРМФДР и 0,611 мкM в случае ТФРМФДР). ЦТА препарата ЭФРДР по отношению к клеточной линии SVEC4-10 была ниже активности свободного ДР в 17 раз. Очевидно, что свободный ДР легко проникал как в фибробласты, так и в клетки SVEC4-10 путём диффузии и накапливался в них, оказывая мощный цитотоксический эффект. ДР, коньюгированный с ЭФР и пептидами, в отличие от свободного антибиотика, может проникать лишь в клетки, несущие соответствующие рецепторы. В связи с этим при действии препаратов направленного действия нормальные клетки, в отличие от опухолевых, практически не поражаются или поражаются в незначительной степени, что является подтверждением избирательности цитотоксического действия таких препаратов.

В целом данные по активности препаратов ЭФРМФДР и ТФРМФДР в отношении раковых клеток различных линий соответствуют общим принципам действия противоопухолевых препаратов направленного действия [Ciardiello and Tortora 2001, Moskaleva 1997]. Несмотря на то, что в большинстве случаев цитотоксическая активность исследуемых препаратов в отношении опухолевых клеток не превышала активнсти свободного антибиотика, преимущества препаратов направленного действия над обычными химиопрепаратами должны проявиться in vivo.

Препарат направленного действия на основе векторного пептида АФП3Д также проявлял выраженную дозозависимую ЦТА в отношении всех исследованных линий раковых клеток. Как видно из табл. 9, наибольшую активность препарат АФП3ДДР проявлял в отношении клеточной линии фибросаркомы человека НТ (IC50 0,094 мкМ). Специфичность действия данного препарата подтверждается тем, что его ЦТА в отношении нормальных клеток была значительно ниже, чем для раковых (IC50 для фибробластов составляла 1,14 мкМ). В то же время ЦТА препарата в отношении эндотелиальных клеток линии SVEC4-10 (IC50 0,234 мкМ) была довольно близка к цитотоксическим концентрациям для клеточных линий злокачественных опухолей. Предположительно такой результат объясняется тем, что эндотелиоциты продуцируют большие количества мембранных АФП-связывающих белков [Mizejewski 2001], благодаря чему препарат АФП3ДДР поступает в клетки линии SVEC4-10 путём рецепторопосредованного эндоцитоза.

Как было ранее показано нами, препарат АФП–ДР проявлял высокую ЦТА в отношении клеток MCF-7 (IC50 0,045 мкМ) и SKOV3 (IC50 0,29 мкМ). Результаты по ЦТА препарата АФП3ДДР в отношении раковых клеток (табл. 9) показывают, что его активность значительно ниже, чем активность АФП–ДР;

однако, учитывая продемонстрированную низкую активность АФП3ДДР в отношении нормальных клеток, сравнительно с активностью на раковых клетках, можно предполагать терапевтические преимущества АФП3ДДР над свободным ДР.

Микроскопическое исследование динамики интернализации и внутриклеточного распределения препарата ТФРМФДР в раковых клетках Нами также была изучена динамика внутриклеточного накопления препаратов направленного действия в опухолевых клетках на примере препарата ТФРМФДР.

Методом флуоресцентной микроскопии было изучено поступление и внутриклеточное распределение препарата ТФРМФДР в клетки линии DU145 при инкубации в течение 1, 4 и 24 ч (рис. 6).

1ч 4ч 24 ч А Доксорубицин Б А ТФРМФДР Б Рис. 6. Микрофотографии клеток карциномы предстательной железы человека линии DU145 после их инкубации с ДР и препаратом TФРМФДР в течение различных промежутков времени. Фазово-контрастная (А) и флуоресцентная (Б) микроскопия.

Свободный ДР быстро проникал в клетки, и уже через 1 ч инкубации флуоресценция детектировалась преимущественно в ядрах (рис. 6). Напротив, ДР в составе препарата ТФРМФДР после 1 ч инкубации был распределён по всему объёму цитоплазмы. Через 4 ч и особенно через 24 ч инкубации различия во внутриклеточной компартментализации свободного и коньюгированного с ТФРМФ ДР практически нивелировались (рис. 6). Очевидно, что в процессе инкубации ДР поступает в клетку, накапливается в ядре, где и проявляет своё цитотоксическое действие. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что коньюгирование ДР с векторным пептидом не препятствует реализации химиотерапевтическим компонентом, в данном случае ДР, своего противоопухолевого цитотоксического действия.

Таким образом, представленные результаты позволяют сделать вывод о том, что пептиды ЭФРМФ, ТФРМФ и АФП3Д обладают высоким векторным потенциалом для доставки цитотоксических химиопрепаратов в клетки злокачественных опухолей человека эпителиального и мезенхимального гистогенеза. Для дальнейшего изучения противоопухолевого потенциала полученных препаратов проводили испытания на мышах с привитыми опухолями.

Исследование противоопухолевой активности препаратов направленного действия на основе векторных пептидов на мышах с привитыми солидными опухолями Сравнительное исследование противоопухолевой активности ДР и препаратов 3500 контроль ДР направленного действия на 3000 ЭФРМФ-ДР основе векторных пептидов Объем опухоли, мм ТФРМФ-ДР ЭФРМФДР, ТФРМФДР и АФП3Д-ДР АФП3ДДР проводили на мышах с модельными солидными опухолями 1000 меланомы В16.

Противоопухолевые препараты вводили животным внутривенно каждые 4 дня, 15 20 25 30 начиная со 2-го дня после Дни после прививки опухоли инъекции опухолевых клеток.

Рис. 7. Динамика роста привитых солидных Всего осуществляли опухолей меланомы В16 у мышей при терапии ДР и инъекции препаратов.

препаратами направленного действия на основе Применение препаратов векторных пептидов.

направленного действия на основе ДР позволяет адресно доставлять противоопухолевый антибиотик в раковые ткани организма и повысить эффективность терапии. В нашем исследовании это подтверждается значительно большим торможением роста опухолей у мышей, получавших препараты ЭФРМФДР, ТФРМФДР и АФП3ДДР по сравнению с мышами, которым вводили раствор свободного ДР (рис. 7, табл. 10). Как видно на рис. 7, все три исследуемых препарата направленного действия проявляли довольно близкую терапевтическую эффективность (торможение роста опухоли по сравнению с контролем во всех трёх группах животных сопоставимо (табл. 10)). Наибольшей терапевтической эффективностью обладал препарат ТФРМФДР. Препараты также увеличивали СПЖ экспериментальных животных. В табл. 10 представлены результаты по УСПЖ при терапии мышей ДР и препаратами ЭФРМФДР, ТФРМФДР и АФП3ДДР.

Как видно из таблицы, наибольшее УСПЖ животных вызывал препарат ТФРМФДР, что согласуется с данными по торможению опухолевого роста у мышей (рис. 7).

Таблица 10. Эффективность противоопухолевого действия препаратов ЭФРМФДР, ТФРМФДР и АФП3ДДР в отношении мышиной меланомы В16 in vivo в сравнении с неконьюгированным ДР.

Препарат ТРО*, % СПЖ, дни УСПЖ, % Контроль 33,4±2,0 – ДР 32,4 38,5±1,1 15, ЭФРМФДР 72,0 43,6±1,2 30, ТФРМФДР 81,1 46,2±1,2 38, Коньюгат АФП3ДДР 75,4 45,4±1,5 35, * Данные на 31 день эксперимента Получение и исследование цитотоксической активности антиангиогенных препаратов Поддержание роста злокачественных новообразований тесно связано с процессом ангиогенеза, заключающегося в образовании кровеносной сети, питающей опухоль. При развитии злокачественного процесса сосуды мигрируют к опухоли, а опухоль, в свою очередь, к сосудам. Ингибирование роста сосудов приводит к остановке роста опухоли или ее регрессии. Ангиостатин и эндостатин являются высокопотентными антиангиогенными препаратами, специфически ингибирующими пролиферацию эндотелия кровеносных сосудов опухоли, препятствуя таким образом ее нормальной оксигенации и питанию. Чрезвычайно важно, что данные препараты действуют на организм без проявления токсических эффектов и развития резистентности. Однако особенности распределения и выведения ангиостатина и эндостатина из организма при их экзогенном введении обусловливают необходимость их применения в высоких терапевтических дозах (от 10 до 100 мг/кг/день). Решением данной проблемы могла бы служить направленная доставка препаратов к опухолевым сосудам с помощью липосом. Известно, что липосомные препараты способны накапливаться также в областях, характеризующихся изолированной васкулатурой, таких как опухоли [Drummond 1999]. Поскольку капилляры, образовавшиеся в результате опухолевого неоангиогенеза, характеризуются наличием в слое эндотелия большого количества пор размером до 800 нм, липосомы, размеры которых традиционно не превышают 500 нм, при циркуляции в кровотоке будут проникать преимущественно в солидные опухоли [Allen and Cullis 2004], обеспечивая направленный транспорт антиангиогенного препарата. В связи с этим другой целью нашего исследования являлось получение липосомных форм ангиостатина и эндостатина и исследование их противопухолевой активности.

Выделение и очистка ангиостатина Ангиостатин имеет сложную пространственную конформацию и содержит дисульфидных связей, что крайне затрудняет получение ренатурированного белка в генно-инженерных продуцентах. Для изучения терапевтического потенциала данного белка мы выделяли нативный ангиостатин из плазмы крови человека. Нами была модифицирована ранее описанная методика [O’Reilly 1996] получения ангиостатина, что позволило получать нативный белок в достаточных для исследований количествах.

Плазминоген выделяли из плазмы крови человека с помощью аффинной хроматографии на колонке с L-лизин-сефарозой. Фракция плазминогена, собранная с колонки, представляла собой концентрированный раствор высокоочищенного белка (рис. 8, дорожка 3). Для частичного протеолиза плазминогена использовали эластазу свиньи;

после 12 ч протеолиза реакционную смесь наносили на колонку с L-лизин 0. A кДа Ангиостатин 0. 94 – 0. 67 – 43 – 0. 30 – 0. 20,1 – 0. 14,4 – 20 30 40 1 2 3 Время элюции, ч Рис. 8. Электрофореграмма Рис. 9. Профиль элюции ангиостатина с плазминогена и ангиостатина колонки с Sephacryl S-300. Стрелками человека. – стандарты обозначены границы сбора фракции молекулярных масс;

2 – плазма ангиостатина.

крови человека;

3 – плазминоген;

4 – ангиостатин.

сефарозой при 4°С. Ангиостатин, посредством присутствующих в его молекуле сайтов связывания с лизином, эффективно сорбировался на колонке. Белок элюировали 0,2 М раствором 6-аминокапроновой кислоты в фосфатно-солевом буфере. Однако чистота препарата на этом этапе была недостаточной, поэтому проводили дополнительную очистку ангиостатина с помощью гель-фильтрационной хроматографии на носителе Sephacryl S-300 (рис. 9).

Как показал электрофоретический анализ конечного продукта (рис. 8, дорожка 4), полученный ангиостатин представляет собой смесь двух изоформ белка с мол. массами 38 и 40 кДа (различия относятся к аминокислотной последовательности С-конца, поскольку при действии эластазы на плазминоген протеолиз возможен более чем в одном сайте [Ji 1998]. С использованием данной методики из 1 л плазмы крови человека удаётся выделить 180190 мг высокоочищенного плазминогена. Это выход, близкий к максимально возможному, поскольку концентрация плазминогена в плазме крови взрослого человека составляет 180200 мкг/мл, или 1,52 мкМ [Castellino 1984].

Количество ангиостатина, получаемого ограниченным протеолизом плазминогена, варьирует в зависимости от ряда условий и составляет (после всех стадий очистки) 23 мг из 10 мг плазминогена. Таким образом, из 1 л плазмы крови человека получали 3555 мг гомогенного препарата ангиостатина.

Получение рекомбинантного эндостатина человека Эндостатин человека содержит две внутримолекулярные дисульфидные связи и имеет относительно простую пространственную конфигурацию. В биологическом материале содержание эндостатина крайне низкое, поэтому разработка препаративных методов получения нативного эндостатина нецелесообразна. В связи с этим получение эндостатина для исследования его противоопухолевого потенциала осуществлялось BamH Hind III Endostatin lac O RBS T нами с помощью генно инженерных методов.

6 His-tag В качестве экспрессионной системы был pBSH-ED15 (6675 п.о.) выбран штамм E. coli lacI pBSH-ED16 (6His) (6705 п.о.) BL21(DE3). В качестве CanR источника гена эндостатина была использована библиотека генов человека. Фрагмент гена m PUC ori коллагена XVIII, соответствующий Рис. 10. Экспрессионный вектор, последовательности, кодирующий биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в штамме-продуценте кодирующей эндостатин, был E. coli BL21(DE3).

выделен методом амплификации. Для осуществления продукции эндостатина человека в этом штамме была сконструирована плазмидная ДНК, содержащая ген эндостатина человека и названная pBSH-ED15 (рис. 10). Кроме того, была сконструирована плазмидная ДНК, аналогичная pBSH-ED15, но дополнительная включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую шесть N-концевых остатков гистидина (6-His-tag) и слитую с ними последовательность -(Асп)3-Лиз- (сайт расщепления энтерокиназой).

Полученный вектор назвали pBSH-ED16 (рис. 10).

На последующем этапе подбирали подходящий штамм-продуцент для экспрессии целевого белка. Уровень экспрессии эндостатина человека определяли в различных штаммах E. coli, содержащих плазмиду pBSH-ED15. В результате проведенного скрининга штаммов был выбран оптимальный продуцент – штамм E. coli BL21(DE3), обеспечивающий высокий и стабильный уровень экспрессии целевого белка. Экспрессию гена эндостатина человека осуществляли в штамме E. coli, трансфицированном рекомбинантной плазмидой pBSH-ED15 или pBSH-ED16, в культуральной среде, сначала в отсутствие индуктора lac-промотора изопропилтио- D-галактопиранозида (ИПТГ). По достижении мутности среды OD600 0,40, добавляли ИПТГ до концентрации 0,10,3 мМ и продолжали экспрессию под контролем индуцированного lac-промотора.

Продукцию белка ожидаемой мол.

кДа массы (20 кДа) контролировали с помощью 94 - электрофореза в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН. Как следует из данных, 67 представленных на рис. 11, в клетках E. coli 43 с плазмидами pBSH-ED15 и pBSH-ED 30 - наблюдается эффективный биосинтез рекомбинантного эндостатина.

20,1 - Разрушение клеточных оболочек, дезинтеграцию клеток, выделение 14,4 - цитоплазматических телец включения, начальные этапы очистки и ренатурацию 1 2 3 4 эндостатина проводили для целевых продуктов экспрессии плазмид pBSH-ED Рис. 11. Электрофореграмма и pBSH-ED16 одинаковым образом.

тотальных лизатов клеток E. coli штаммов BL21(DE3), трансформиро - Окончательная очистка проводилась ванных экспрессионными векторами различными методами, исходя из эндостатина человека. 1 – стандарты особенностей структурной организации молекулярных масс;

2 – штамм, содержащий плазмиду pBSH-ED15;

получаемых белков.

3 – штамм, содержащий плазмиду В клетках штаммов-продуцентов с pBSH-ED16;

4 – штамм, не несущий плазмидами pBSH-ED15 и pBSH-ED плазмид pBSH-ED15 или pBSH-ED16.

рекомбинантный эндостатин экспрессируется в виде нерастворимых А А280 2. Эндостатин 1. 1. 0. 0. 0 10 20 30 40 Время, мин Объём, мл Рис. 13. Профиль элюции Рис. 12. Профиль элюции рекомбинантного эндостатина с рекомбинантного эндостатина человека с колонки с Ni-NTA-агарозой.

колонки Superose 12.

телец включения, в которых белок присутствует в денатурированной неактивной форме. Для выделения телец включения из бактериальных клеток был избран подход, основанный на деструкции клеток ультразвуком.

Для увеличения эффективности разрушения клеток в среду вводили детергент натрия дезоксихолат и фермент лизоцим. Затем тельца включения отделяли от клеточного дезинтеграта центрифугированием, и обрабатывали препарат телец включения, находящихся в растворе детергента, ультразвуком с последующим центрифугированием и отделением нерастворившихся фрагментов клеточных структур и прочих примесей от целевого продукта.

Очистку целевого продукта, полученного экспрессией плазмидной ДНК pBSH ED15, осуществляли методом гель-фильтрационной хроматографии с помощью системы FPLC на сорбенте Superose 12 (рис. 12). Уровень продукции эндостатина человека в штамме E. coli, трансфицированном плазмидой pBSH-ED15, составлял около 70 мг/л культуры.

Очистку целевого продукта, полученного экспрессией плазмидной ДНК pBSH ED16, осуществляли методом катионообменной хроматографии на агарозном носителе (рис. 13). Уровень продукции эндостатина человека в штамме E. coli, трансформированном плазмидой pBSH-ED16, составлял около 80 мг/л культуры.

Ренатурацию рекомбинантного эндостатина проводили с помощью серии диализов. На первых этапах в рекомбинантном белке с помощью дитиотреитола восстанавливали все дисульфидные связи. Затем препарат подвергали медленному окислению под воздействием кислорода воздуха и редокс-пары глутатиона. Количество не окислившихся HS-групп в препаратах очищенного белка определяли, используя реактив Эллмана. Было установлено, что степень ренатурации рекомбинантного эндостатина составляла более 95 % как для продукта экспрессии плазмиды pBSH ED15, так и продукта экспрессии плазмиды pBSH-ED16.

На рис. 14 представлены данные электрофоретического анализа конечного препарата эндостатина в 15 % ПААГ в присутствии 0,1 % ДСН. Как видно из представленных данных, оба препарата представляют собой практически гомогенные белки (чистота более 99 %) с мол. массой ~ 20 кДа, соответствующей массе нативного эндостатина человека. Благодаря наличию в рекомбинантном эндостатине, кодируемом вектором pBSH-ED16, сайта протеолиза энтерокиназой, последовательность 6-His может быть отщеплена от целевого белка после его очистки на Ni-NTA-агарозе, что уменьшит антигенные свойства рекомбинантного препарата.



Pages:   || 2 |
 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.