авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека вирусов

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

РАЗУМОВ ИВАН АЛЕКСЕЕВИЧ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ИЗУЧЕНИИ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИРУСОВ 03.00.03 – молекулярная биология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

КОЛЬЦОВО – 2008

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Локтев Валерий Борисович

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор Малыгин Эрнст Георгиевич ФГУН ГНЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора Доктор биологических наук, профессор Покровский Андрей Георгиевич Новосибирский государственный университет Доктор биологических наук Таранин Александр Владимирович Институт цитологии и генетики СО РАН

Ведущая организация:

ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва)

Защита диссертационной работы состоится «_06» февраля 2009 г. в 09-00 на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: ФГУН ГНЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУН ГНЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: 630559, Кольцово, Новосибирский район, Новосибирской области.

Автореферат разослан « » 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Карпенко Лариса Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Только за последние 3-4 десятилетия было выявлено около 30 новых возбудителей инфекционных болезней, поразивших за этот период сотни миллионов человек и унесших миллионы жизней. К их числу относятся несколько возбудителей острых и хронических диарей, гепатитов С и Е, возбудители венесуэльской (вирус Гуанарито) и бразильской (вирус Сабиа) геморрагических лихорадок, СПИДа, геморрагических лихорадок Эбола (вирус Эбола) и Марбург (вирус Марбург) и других заболеваний. Кроме того, инфекционные заболевания расширяют ареал своего распространения. Ярким примером возникновения и распространения в последнее время новых вариантов вирусов является проникновение вируса Западного Нила в Северную Америку (Нью-Йорк) в 1999 году и его повсеместное распространение по территории континентов Северной и Южной Америки.

Под эгидой ВОЗ совместными усилиями правительств многих стран в 20-м веке удалось ликвидировать только одну вирусную инфекцию - натуральную оспу. Вместе с тем, в настоящее время по ряду причин, включая угрозу биотерроризма и отсутствие современных способов лечения и профилактики, центры по контролю и предотвращению болезней во многих странах снова ставят вирус натуральной оспы на первое место в списке потенциальных агентов массового поражения. Необходимо отметить, что для многих вновь возникающих инфекций нет ни средств специфического лечения, ни эффективных способов профилактики.

Вместе с тем, гибридомная технология, разработанная Kohler & Milstein (1975) для получения клеточных гибридов, гибридом, синтезирующих моноклональные антитела (МКА) предопределенной специфичности и высокого аффинитета, позволила вывести на новый уровень понимание многих структурно-функциональных особенностей биологических объектов, в том числе вирусов. Создание гибридомной технологии и изучение свойств МКА стимулировали проведение исследований на уровне аминокислотной последовательности вирусных белков в отношении многих вирусов патогенных для человека. Использование современных молекулярно биологических методов в сочетании с МКА позволило получить целый комплекс новых фундаментальных данных: о структуре и функции вирусных белков;

о природе взаимодействия антигена и антитела, о структуре вирусных антигенных детерминант и их функциях. Так, изучение взаимодействия МКА с вирусными белками и их рекомбинантными аналогами в системах in vivo и in vitro позволило идентифицировать наиболее важные структурные участки вирусных белков и локализовать их на аминокислотной последовательности, выявить особенности строения вирионов, получить новую информацию о роли вирусных белков в формировании противовирусного иммунитета.

Именно с этими исследованиями из области молекулярной вирусологии и иммунной биотехнологии связывается дальнейший прогресс в изучении структуры и функций вирусных белков и на его основе создания новых более эффективных методов иммунодиагностики вирусных заболеваний, способов профилактики и средств специфического лечения.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является получение с помощью моноклональных антител комплекса новых данных о структурно-функциональных свойствах белков патогенных для человека вирусов.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Освоить комплекс методов по технологии получения гибридом и создать коллекцию гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к структурным белкам вирусов патогенных для человека.

2. Получить и очистить моноклональные антитела, исследовать их иммунобиологические свойства и сформировать представительные панели МКА к структурным белкам вирусов.

3. Провести с помощью панелей моноклональных антител изучение структурных белков вирусов патогенных для человека, в том числе филовирусов, вирус Марбург (ВМ) и вирус Эбола (ВЭ), флавивирусов, вирус Западного Нила (ВЗН), ортопоксвирусов, вирус эктромелии (ВЭм), вирус осповакцины (ВОВ), вирус оспы коров (ВОК), вирус натуральной оспы (ВНО), в следующих направлениях:

- выявление и изучение перекрестно-реактивных антигенных детерминант на белках филовирусов Марбург и Эбола;

- определение иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков NP, VP35 и VP40 вируса Марбург (ВМ);

- исследование роли NP, VP35 и VP40 белков филовирусов в формировании противовирусного иммунитета;

- поиск и изучение перекрестно-реактивных и видоспецифических антигенных детерминант и эпитопов белков ортопоксвирусов;

- исследование антигенной изменчивости штаммов ВЗН, выделенных в России и в ближнем зарубежье;

- сравнительное изучение антигенной схожести вирусных белков и их рекомбинантных аналогов;

- детальное картирование эпитопов белка VP35 вирусов Эбола и Марбург и гликопротеина Е ВЗН;

- проведение сравнительного анализа противовирусной активности гибридомных и рекомбинантных одноцепочечных и гуманизированных антител против белка Е ВЗН.

Научная новизна Cоздание коллекции гибридных клеточных линий, гибридом, продуцентов антител к вирусным антигенам, и формирование представительных панелей МКА стимулировали исследование вирусов на стыке трех наук, вирусологии, иммунологии и молекулярной биологии. С помощью МКА был проведен цикл работ по изучению антигенной структуры и картированию антигенных детерминант структурных белков флавивирусов, ортопоксвирусов, филовирусов и других вирусов, патогенных для человека.

Проведенное исследование позволило получить комплекс новых данных по антигенной структуре изучаемых вирусов и уточнить функции вирусных белков в процессе формирования противовирусного иммунитета.

Так использование моноклональных антител позволило получить приоритетные данные по антигенной структуре нуклеокапсидных, NP и VP35, и матриксного VP40 белков вирусов Марбург и Эбола и ее роли в формировании противовирусного иммунитета.

Впервые обнаружено наличие общей перекрестно-реактивной антигенной детерминанты на нуклеокапсидных белках NP и VP35 вирусов Марбург и Эбола.

С помощью МКА проведено топологическое картирование эпитопов белков NP, VP40 и VP35 вируса Марбург. Установлено, что 7 эпитопов на структурных белках NP, VP35 и VP40 вируса Марбург, взаимно перекрываясь, образуют функциональный домен, индуцирующий синтез МКА. Именно эти МКА проявляли антивирусную активность – в присутствии комплемента они вызывали лизис клеток, инфицированных вирусом Марбург. В ходе уточнения роли антигенных детерминант на белке VP40 ВМ было выявлено 2 эпитопа, которые индуцируют синтез протективных антител В-клетками. Предварительное введение этих МКА в морских свинок защищает их от гибели при заражении ВМ.

В результате исследования закономерностей формирования противовирусного иммунитета на белки филовирусов обнаружено, что иммунный ответ, как на введение вирусного антигена, так и, по-видимому, в процессе начального развития филовирусной инфекции у выживших животных, формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные NP и VP35 белки и VP40 матриксный белок.

Анализ антигенной структуры белков филовирусов (NP, VP40, VP ВМ и VP35 ВЭ) и их рекомбинантных аналогов показал, что не только рекомбинантные белки, но и их фрагменты могут сохранять антигенную конформацию вирусных белков. Используя МКА и фрагменты рекомбинантных аналогов вирусных белков, впервые удалось провести картирование антигенных детерминант и эпитопов на аминокислотной последовательности VP35 белков вирусов Марбург и Эбола.

В результате анализа взаимодействия МКА с ортопоксвирусами была выявлена высокая перекрестная реактивность МКА против ВЭм с патогенными для человека ортопоксвирусами - ВОВ, ВОК и вирусом натуральной оспы. Было обнаружено, что белки слияния ВЭм (ген 129L), ВОВ (ген A27L), ВОК и ВНО (ген A30L) содержат общие перекрестно реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против ВОВ и ВНО;

исследованные рекомбинантные полипептиды pr129L (ВЭм) и prA30L (ВНО) имитируют эти вирусные эпитопы.

С помощью нейтрализующих МКА против штамма Vlg99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, выявлена значительная антигенная вариабельность современных штаммов ВЗН, циркулирующих в Евразии.

Многие штаммы вели себя как типичные антигенные мутанты и были способны избегать нейтрализующего действия МКА, например, штаммы Hp 94 и Tur-2914, у которых выявлены различия в нейтрализации по 7 эпитопам.

Даже штаммы Vlg99-27889 и Vlg00-27924, выделенные в Волгограде с интервалом в один год, показывали вариабельность в реакции нейтрализации по 4 эпитопам.

В результате анализа взаимодействия МКА с рекомбинантными пептидами белка Е ВЗН продемонстрировано наличие двух дискретных районов, вовлеченных в процессы (РН и РТГА) взаимодействия вируса с клеткой. Это район 321-466 ао белка Е ВЗН, несущий эпитопы для МКА, нейтрализующих все исследуемые штаммы ВЗН, и включающий домен III (305-394 ао) белка E ВЗН. Второй район взаимодействия нейтрализующих МКА был локализован между 1-126 ао, которые включают аминокислотные остатки I и II доменов E белка и, в частности, пептид слияния (98-113 ао) белка Е ВЗН, который участвует в проникновении вируса в клетку.

В результате сравнительного изучения иммунобиологических свойств МКА 9Е2 и их рекомбинантных аналогов (одноцепочечных и гуманизированных антител) было обнаружено, что рекомбинантные аналоги сохранили конформацию вариабельного домена исходных гибридомных антител, определяющего способность взаимодействовать с эпитопами гликопротеина Е ВЗН и нейтрализовать in vitro инфекционность вирионов ВЗН. Нейтрализующая активность полученных гуманизированных антител Fc-9E2 в разведении 1/1024000 против ВЗН была сравнима с таковой гибридомных антител.

Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены патентами и авторскими свидетельствами: № 2142507;

№ 2281327;

№2265658;

№ 2144565 и отражены в публикациях в реферируемых отечественных и зарубежных журналах и изданиях.

Практическая ценность работы.

В результате проделанной работы был успешно создан банк гибридом ГНЦ ВБ "Вектор", в котором депонировано более чем 700 гибридом, секретирующих моноклональные антитела (МКА) к различным биологически активным молекулам и к структурным белкам патогенных для человека вирусов: к вирусам Японского энцефалита, Венесуэльского энцефаломиелита лошадей;

восточного энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита, к белку p24 вируса иммунодефицита человека типа 1, к вирусу иммунодефицита человека типа 2, к вирусам полиомиелита тип 2, гепатита В, гепатита A, а также к вирусу Западного Нила, к филовирусам, вирус Марбург и вирус Эбола;

к ортопоксвирусам, включая вирус эктромелии, вирус осповакцины, вирусы оспы коров;

. Полученные гибридомы и в настоящее время могут быть успешно использованы, как штаммы-продуценты для получения МКА.

Сформированная коллекция гибридом и полученные наборы МКА с изученными свойствами, панели МКА, к структурным белкам вирусов могут быть использованы для развития прикладных исследований в области иммунодиагностики вирусных инфекций:

в диагностических целях для создания диагностических препаратов и тест-систем;

в качестве средств контроля в производстве иммунобиологических препаратов;

в качестве лигандов для аффинной хроматографии и с целью очистки биомолекул из сложных биологических смесей.

В то же время, представленные научные результаты по изучению антигенной структуры и функций вирусных белков могут способствовать развитию и созданию не только иммунодиагностических, но и иммубиологических препаратов для профилактики и защиты от патогенных для человека вирусов.

Исследуемые в работе рекомбинантные белки и полипептиды филовирусов (вирусы Марбург и Эбола), ортопоксвирусов (ВНО и ВЭм) и флавивирусов (ВЗН) могут быть использованы в качестве антигена, как для разработки иммунодиагностических тест-систем, так и профилактических препаратов.

Полученные и описанные в работе гуманизированные вируснейтрализующие антитела против ВЗН являются, на наш взгляд, перспективными для разработки препаратов нового поколения для профилактики и терапии лихорадки Западного Нила.

В представляемой диссертационной работе на защиту выносятся следующие положения:

1. Создание оригинальной коллекции гибридом, которые и в настоящее время могут быть успешно использованы как штаммы-продуценты, секретирующие моноклональные антитела к структурным белкам вирусов патогенных для человека, позволяет обеспечивать научные и экспериментально-производственные исследования стабильными, очищенными, гомогенными и высокоаффинными препаратами антител с определенной специфичностью.

2. Наборы очищенных препаратов МКА с изученными свойствами, панели МКА, могут быть успешно использованы для изучения структурных белков вирусов патогенных для человека, включая филовирусы (вирусы Марбург и Эбола), флавивирусы (вирус Западного Нила), ортопоксвирусы (ВЭм, ВОВ, ВОК и ВНО).

3. Нуклеокапсидные, NP и VP35, и матриксные VP40 белки филовирусов играют значительную роль в формировании защитного иммунного ответа организма: так в процессе развития филовирусной инфекции иммунный ответ у переболевших животных формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные, NP и VP35, и VP40 матриксный белки филовирусов, что, возможно, является определяющим фактором выживания.

4. Белки слияния ВЭм (ген 129L), ВОВ (ген A27L), ВОК и ВНО (ген A30L) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против ВОВ и вируса натуральной оспы.

5. Современные штаммы ВЗН, циркулирующие в Евразии, обладают значительными антигенными отличиями: с помощью панели МКА против штамма Vlg99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, на структурных белках ВЗН выделено не менее 13 различных эпитопов (11 из которых расположено на Е гликопротеине). Кроме того, выявлены максимальные антигенные различия в реакции нейтрализации у штаммов Hp-94 (год выделении 1963) и Tur-2914 (год выделении 1973), у которых, по-видимому, изменено по 7 эпитопов на белке Е ВЗН.

6. Получены МКА, которые обладают нейтрализующей активностью против 7 исследованных штаммов ВЗН, являются перспективными для создания иммунодиагностических наборов и, возможно, для разработки препаратов для иммунотерапии тяжелых случаев лихорадки Западного Нила.

Так, на наш взгляд, высоко активные нейтрализующие гуманизированные антитела Fc-9E2 привлекательны для будущего конструирования и создания нового антивирусного препарата для лечения лихорадки Западного Нила.

7. Используемая нами методология, включающая объединенное применение двух инструментов исследования, панели МКА и набора антисывороток, а также рекомбинантных белков и их фрагментов, с изученными свойствами, позволяет расширить наши возможности при картировании и перейти к локализации эпитопов связывания с МКА на аминокислотной последовательности вирусных белков.

Апробация работы Материалы диссертационной работы были представлены на следующих международных или всесоюзных конференциях, симпозиумах, семинарах:

Third Congress of the European Society for Veterinary Virology, Immunobiology of Viral Infection, Interlaken, Switzerland, September 4-7, 1994;

First European Meeting of Virology, Wurzburg, Germany, September 10-13, 1995;

Vth International Сongress on the Impact of Viral Diseases in the Developing World, Johannesburg, South Africa, July9-14, 1995;

Xth International Congress of Virology (Jerusalem, Izrael, 1996);

Russian-German colloquium on filoviruses: the modern state of problem (Koltsovo, Novosibirsk region, Russia, 1997);

VIth Biological Medical Defense Conference (Munich, Germany, 1999);

Inauguration of the Swedish Containment Laboratories (Stockholm, Sweden, 2000);

IX Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии (Крым, Гурзуф, Украина, 2001);

VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций, ИБХ РАН (Москва, Россия, 2001);

3-й Ежегодный семинар, посвященный рассмотрению программы научных исследований в области биозащиты (Санкт-Петербург, Россия, 2003).

Связь выполненной работы с планом научных исследований Работа выполнена в ГНЦ ВБ «Вектор» (1982-2007 гг) в рамках научных тем, выполняемых по Программе Центра по приоритетному направлению «Изучение структурно-функциональной организации и молекулярной эволюции геномов особо опасных вирусов человека и животных» и ряда других научно-исследовательских работ и научно технических программ Центра. Исследования были также поддержаны государственной программой «Новейшие методы биоинженерии», «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники, подраздел: Защита от патогенов», контракт № 43.035.11.1529 (рук. Чепурнов А.А.);

проектами Международного научно-технического центра (МНТЦ) ISTC № 1198 и ISTC № 2087 (рук. Локтев В.Б.), грантами российского фонда фундаментальных исследований № 97-04-49697-а (рук. Разумов И.А.), №98 04-49439-а (рук. Нетесов С.В.), 01-04-49877-а (рук. Качко А.В.), №01-04 48972-а (рук. Разумов И.А.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 35 статей, получено патента на изобретения штаммов гибридных клеток, представлено более тезисов. Все исследования выполнены в ГНЦ ВБ «Вектор».

Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом, под его руководством и в соавторстве с дбн В.Б.

Локтевым (глава 3), кбн Е.В. Агапов (раздел 3.1), кбн А.В. Перебоев (раздел 3.1., 3.8), Е.Е. Коноваловым (раздел 3.1., 3.7), кбн В.А. Святченко (раздел 3. и 3.8), кбн Е.В. Протопопова (раздел 3.1 и 3.7), кбн Е.И. Казачинская (раздел 3.1 – 3.5., 3.7 и 3.8), дбн, чл-корр. РАН С.В. Нетесов (раздел 3.1-3.5), кбн А.А.

Букреев (раздел 3.2, 3.4 и 3.5), кбн А.А. Чепурнов (раздел 3.2-3.5), кбн А.А.

Беланов (раздел 3.2, 3.3 и 3.6), Н.И. Бормотов (раздел 3.2, 3.3 и 3.6), кбн А.В.

Качко (раздел 3.4., 3.5., 3.7 и 3.8), кбн А.В. Сорокин (раздел 3.4., 3.5 и 3.8), А.В. Иванова (раздел 3.4., 3.5 и 3.7), дбн Е.И. Рябчикова (раздел 3.4), кбн В.А.

Терновой (раздел 3.4 и 3.5), Т.Н. Рудзевич (раздел 3.4 и 3.5), дбн С.Н.

Щелкунов (раздел 3.6), кбн И.П. Гилева (раздел 3.6), кбн Г.В. Кочнева (раздел 3.6), М.А. Васильева (раздел 3.6), кбн Т.С. Непомнящих (раздел 3.6), а также с некоторыми другими соавторами, ссылки на которых даны в тексте данной работы при описании конкретных результатов исследований. Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам за сотрудничество.

Искренне признателен за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту д.б.н., проф.

Локтеву Валерию Борисовичу.

Выражаю глубокую благодарность за критические замечания и помощь при оформлении и обсуждении диссертационной работы д.б.н.

Татькову Сергею Ивановичу.

Объем и структура работы Диссертация изложена на 329 cтраницах, включающих 33 рисунка и таблицу и список литературы (316 ссылок). Работа состоит из введения, трех глав (глава 1 – «Обзор данных литературы»;

глава 2 – «Экспериментальная часть»;

глава 3 – «Результаты и обсуждение исследований»), заключения, выводов, списка литературы и приложения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Создание, расширение и изучение коллекции гибридом ГНЦ ВБ «Вектор» за период с 1982 по 2007 годы Основой успешного развития биотехнологических, вирусологических и молекулярно-биологических работ с использованием моноклональных антител (МКА), продуцируемых культивируемыми гибридными клетками, гибридомами, является наличие коллекции этих культур клеток. Создание коллекции гибридом в нашем Центре включало в себя: получение гибридом и хранение в жидком азоте (-1960С) на протяжении длительного времени;

стабилизацию и паспортизацию штаммов клеточных линий в соответствии с общепринятыми требованиями ВОЗ;

формирование панели МКА, то есть наработку, очистку и изучение свойств, продуцируемых гибридомами моноклональных иммуноглобулинов.

Весь период формирования коллекции был довольно условно по времени разбит мной на два этапа, методический (1982-1994 г) и научно исследовательский (1995-2007 г).

Краткое описание коллекции гибридом 1982-1994 г К этому списку относятся гибридомы, полученные лично автором, с его участием или под его руководством, к следующим вирусным антигенам:

32 гибридомы, продуцирующих МКА к вирусу Венесуэльского энцефаломиелита лошадей, в том числе 23 крысиных и 9 мышиных гибридом.

Четыре гибридомы защищены авторскими свидетельствами;

34 гибридомы, продуцирующих МКА к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей, в том числе 17 крысиных и 17 мышиных гибридом. Две гибридомы защищены авторскими свидетельствами;

3 гибридомы, продуцирующих МКА к вирусу клещевого энцефалита, получены в ИБХ СО РАН и депонированы в нашей коллекции;

7 гибридом, продуцирующих МКА к белку p24 вируса иммунодефицита человека 1 типа, в том числе 4 мышиных и 3 крысиных гибридомы. Все эти клеточные линии были депонированы во Всесоюзной коллекции клеточных линий;

6 гибридом, продуцирующих МКА к вирусу полиомиелита, тип 2;

3 крысиных гибридомы, продуцирующих МКА к вирусу гепатита В;

11 мышиных гибридом, продуцирующих МКА к шести различным формам цитохрома Р-450 из печени крыс;

более 150 гибридом к ортопоксвирусам;

32 гибридомы к вирусу гепатита А;

28 гибридом к вирусу гепатита В;

18 гибридом к вирусу полиомиелита, типа 2;

14 гибридом, секретирующих моноклональные антиидиотипические антитела, взаимодействующие с паратопами МКА против вируса ВЭЛ;

21 гибридома, продуцирующая МКА к белкам р105, р160 и р Opistorchis felineus;

более 16 гибридом, секретирующих МКА к иммуноглобулинам человека, а также ряд других гибридных клеточных линий.

Именно, на 1 этапе было получено более 500 гибридом, продуцирующих МКА к вирусным белкам. В частности, в этот период была создана многочисленная коллекция гибридом к ортопоксвирусам, которая, лишь частично, представлена в данной работе.

Проводимое в нашем Центре с 90-х годов изучение структурно функциональной организации геномов вирусов патогенных для человека предполагало детальное выяснение функций фрагментов генома, кодирующих тот или иной ограниченный район вирусного белка. В рамках этого направления работ в Центре была расширена коллекция гибридом, продуцирующих МКА против различных вирусных белков.

Краткое описание коллекции 1995-2007 гг На этом этапе стартовали работы по созданию гибридом, продуцирующих МКА, использование которых в изучении вирусных белков в основном широко представлено в данной работе. В списке представлены гибридомы к следующим вирусам и антигенам:

38 гибридом, продуцирующих МКА к структурным белкам вируса Эбола;

21 гибридома, секретирующая МКА к структурным белкам ВМ;

32 гибридомы, продуцирующие МКА к вирусу Западного Нила. Одна гибридома защищена патентом РФ;

15 гибридом, продуцирующих МКА к вирусу японского энцефалита.

Указанные клеточные линии были получены лично автором или с его участием.

На протяжении всего периода создания коллекции гибридомы, включенные в каталог, использовались для формирования наборов МКА с изученными свойствами, панелей МКА, к различным вирусным антигенам. С целью формирования панелей МКА к вирусам первоначально проводилось культивирование гибридом in vitro и перевивание in vivo, в BALB/c мышах и Lou крысах. В результате проделанной работы, как правило, получали значительные количества МКА в виде асцитической жидкости, из которой были приготовлены очищенные препараты. Панели МКА постоянно использовались и используются в исследованиях лабораторий Центра. В качестве примера Вашему вниманию предоставлена панель МКА к вирусу Марбург. Для характеристики МКА были определены: подклассы иммуноглобулинов;

вирусные белки-мишени, с которыми они взаимодействуют;

титры специфического взаимодействия с вирусным препаратом;

количественный уровень синтеза гибридомных IgG в организме мышей BALB/c;

константы аффинитета МКА (таблица 1).

Таким образом, коллекция гибридом, созданная за период с 1982 по 2007 годы, на наш взгляд, имеет неоценимое значение как хранилище штаммов-продуцентов, секретирующих МКА к различным вирусным антигенам. Проделанная на этом этапе работа явилась началом создания «фундамента», в материальном, методическом и научном плане, который может служить основой для получения в течение неограниченно долгого периода времени препаратов антител, необходимых для обеспечения научных исследований, для организации производства тест-систем (применяемых для диагностики различных инфекционных заболеваний), для производства и выпуска МКА, которые как стандартные иммунобиологические препараты, могут быть использованы для контролирования, стандартизации и совершенствования различных биотехнологических процессов по получению новых профилактических и лекарственных препаратов. Кроме того, дальнейшее развитие работ в направлении получения и изучения МКА может привести к созданию препаратов гибридомных антител и на их основе получения рекомбинантных гуманизированных антител для лечения различных заболеваний человека.

Представленная работа, в частности, отражает или иллюстрирует лишь возможности использования МКА для изучения структурных белков патогенных для человека вирусов.

Таблица Свойства моноклональных антител к белкам вируса Марбург.

(Панель МКА против вируса Марбург) Титры МКА против ВМ в Концент.

Названиие Константа ТИФА (обр.величины) № Класс Белок- очищенных гибридомы аффинности п/п IgG мишень Культуральная Асцитическая IgG Ка, М- и МКА (мг/мл) среда жидкость 6,3х 1 1E2 IgG2a VP35 2700 656100 3, 2 1H5 н.о VP35 900 2700 н.о. н.о.

3,4х 3 3F9 IgG2a VP35 6075 768000 6, 2,9х 4 5H7 IgG1 NP 24300 1248000 7, 5,9х 5 6B7 н.о VP40 2430 729000 1, 2,1х 6 8G3 IgG2a VP35 8100 656100 3, 4,5х 7 7C4 IgG2a VP40 7290 2624400 4, 7,7х 8 7H10 IgG2a VP40 2430 729000 2, 25х 9 9C7 IgG1 NP 6561 6516000 8, 4,5х 10 9D8 IgG1 VP35 7290 729000 4, 1,5х 11 9G6 IgG2a VP40 8100 218700 5, 12 1C7 н.о VP40 900 729000 4,2 н.о.

13х 13 7D8 IgG2a VP40 24300 2624400 5, 14 5F2* н.о н.о. 81 н.о н.о. н.о.

3,2х 15 5G8 IgM VP40 6561 656100 1, 16 1C12 IgG2a VP40 2187 н.о н.о. н.о.

6,3х 17 5F1 IgG1 NP 6561 2624400 3, 18 3A5 IgG1 - 900 218700 4,3 н.о.

19 11H7* н.о VP40 2187 н.о н.о. н.о.

20 10E11 IgG2b VP40 7290 н.о н.о. н.о.

9,9х 21 5G9** IgG2b VP40 24300 2187000 7, Примечание: ‘-‘ – отсутствие взаимодействия;

н. о – не определяли;

*данные гибридомы тестировали по культуральной среде;

**5G9/G11/A3 – полное название гибридомы, продуцирующей представленные МКА.

МКА в изучении структурных белков филовирусов Марбург и Эбола.

Определение перекрестно-реактивных антигенных детерминант филовирусов Мы использовали сформированные панели МКА против вируса Марбург (таблица 1) и вируса Эбола, чтобы изучить антигенную структуру белков филовирусов, которые являются особо-опасными патогенами человека.

Необходимо отметить, что, хотя вирусы Марбург и Эбола являются представителями одного семейства, по антигенной характеристике они имеют, по-видимому, существенные отличия. Имеющиеся литературные данные по перекрестной реактивности филовирусов с антисыворотками носили несколько противоречивый характер. Вместе с тем, в результате сравнения аминокислотной последовательности белков VP35 и NP (нуклеопротеинов) филовирусов были выявлены гомологичные аминокислотные участки, что позволяло предположить наличие перекрестно-реактивной антигенной структуры у этих белков.

В наших экспериментах перекрестное взаимодействие антител, специфичных к филовирусам, было исследовано методами твердофазного ИФА (ТИФА) и иммуноблота. Методом ТИФА (таблица 2) было обнаружено перекрестное взаимодействие поликлональных антител сывороток с гетерогенными вирусными антигенами. Необходимо отметить корреляцию результатов между высоким титром антител к гомологичному вирусу и обнаружением перекрестного взаимодействия антител с гетерологичным вирусным антигеном.

Вместе с тем, при использовании гибридомных антител, ни одно из типа МКА против ВМ не взаимодействовало с вирусом Эбола, а при использовании 13 МКА против ВЭ перекрестное взаимодействие с NP ВМ было обнаружено лишь для двух МКА, 7Е1 и 6G8, специфичных к NP ВЭ.

С помощью метода иммуноблота нам удалось выявить вирусные белки, которые являются мишенью перекрестного реагирования антител. Для вируса Марбург были выявлены два белка - нуклеопротеин и VP35, которые являются мишенью для поликлональных антител к ВЭ. Из двух МКА к нуклеопротеину ВЭ (116 кДа) и перекрестно реагирующих в ТИФА с ВМ, лишь МКА 6G8 взаимодействовали с нуклеопротеином ВМ (96 кД) в иммуноблоте.

Таким образом, проведенные нами исследования позволили получить ряд принципиально новых результатов, касающихся наличия перекрестно реактивной антигенной структуры у филовирусов. Так, с помощью метода ТИФА была показана взаимная перекрестная активность поликлональных и моноклональных антител, специфичных к ВЭ, с антигеном ВМ, а антител поликлональных сывороток, специфичных к ВМ, с антигеном ВЭ. Кроме того, методом иммуноблота с использованием поликлональных и моноклональных антител против вируса Эбола нами были выявлены перекрестно-реактивные белки - NP и VP35 филовирусов.

Таблица Сравнительное изучение перекрестного взаимодействия поликлональных и моноклональных антител с филовирусными антигенами в ТИФА.

Источник антител титры антител (сыворотки животных и Вирус (обратные величины) гибридомные МКА) Антигены ВЭ ВМ мышь* ВЭ 72900 кролик* ВЭ 72900 крыса* ВЭ 72900 морская свинка* ВЭ 900 IgG лошади** ВЭ 218700 морская свинка*** ВЭ 900 МКА 7Е1 к NP ВЭ 24300 МКА 6G8 к NP ВЭ 8100 Мышь N1* ВМ 100 Мышь N2* ВМ 300 кролик* ВМ 100 ЧРС**** ВМ 900 морская свинка *** ВМ 100 нормальные 100 сыворотки***** Примечание: *сыворотки от иммунизированных животных;

** IgG, очищенные из сыворотки лошади, иммунизированной инактивированным и нативным вирусом;

*** сыворотки от инфицированных животных;

**** сыворотка человека, переболевшего лихорадкой Марбург;

***** нормальные сыворотки мыши, кролика, крысы, лошади, морской свинки и человека использовались в качестве отрицательного контроля.

Выявление иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков NP, VP35 и VP40 ВМ Наличие коллекции моноклональных антител (МКА) к белкам вируса Марбург предоставило возможность изучения иммунобиологических свойств структурных вирусных белков и их роли, как в процессе репродукции или размножения данного вируса, так и в формировании защитного иммунитета организма.

Иммунобиологический эффект взаимодействия 6 типов МКА с эпитопами белков NP, VP35 и VP40 вируса Марбург был исследован in vitro, в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Vero, и в антителозависимом комплемент-опосредованном лизисе клеток (АЗКОЛК) инфицированных вирусом, а также in vivo, в реакции пассивной защиты морских свинок при введении антител. Использование данного подхода выявило отсутствие нейтрализующей активности у 6 изученных гибридомных антител, так как инкубация МКА с вирионами не влияла на инфекционность ВМ. Вместе с тем, два типа гибридомных антител, 5G9.G11 и 5G8.H5, специфичных к белку VP40 ВМ, хотя и не проявляли вируснейтрализующей активности при постановке РН на культуре клеток Vero, обладали способностью in vitro опосредовать лизис вирус-инфицированных клеток в присутствии комплемента (таблица 3). Всего из 19 типов МКА протестированных в реакции АЗКОЛК 7 МКА (3 МКА против VP40, по 2 МКА против VP35 и NP белков ВМ) проявляли активность, вызывая лизис инфицированных клеток в присутствии комплемента.

Для определения протективной активности моноклональных антител животным внутрибрюшинно были введены антитела за сутки до инфицирования вирусом Марбург. Как видно из результатов, представленных в таблице 4, из 6 исследованных МКА только МКА 5G9.G11 и 5G8.H5, которые проявляли противовирусную активность in vitro, в реакции АЗКОЛК, были способны предохранять от гибели морских свинок (р0,05) в течение, по меньшей мере, 14 дней (срок наблюдения).

При вскрытии погибших животных наблюдались типичные для ВМ морфологические изменения со стороны внутренних органов [Kiley MP, et al 1988], тогда как у выживших животных каких-либо видимых патологических изменений обнаружено не было. В сыворотке крови переболевших морских свинок методом ИФА была выявлена сероконверсия антител против ВМ, при этом титры противовирусных антител в крови животных колебались в интервале от 1:200 до 1:12800. Не было отмечено корреляции между уровнем специфических антител в крови и типом вводимых гибридомных МКА. По всей видимости, различие в уровне противовирусных антител в крови инфицированных, но выживших морских свинок определяется особенностями индивидуального иммунного ответа животных на вирусную инфекцию [Bowen ET, et al 1977]. Представленная работа является одной из первых попыток оценить роль белков NP, VP35 и VP40 ВМ в формировании защитного иммунитета при филовирусной инфекции, используя полученные противовирусные МКА к этим белкам. Проведенные нами исследования в рамках данной темы позволили получить ряд принципиально новых результатов. Так, впервые было показано, что МКА против Таблица ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ МАРБУРГ.

** МКА *Титры МКА Белок-мишень АЗКОЛК РН в ТИФА (обр. величина) 5G9.G11 218700 VP40 + 7D8 656100 VP40 - 5F1 656100 NP - 3A5 218700 - Н.И.

5G8.H5 729000 VP40 + 7C4 656100 VP40 - 5H7 218700 NP + но 9C7 656100 NP + но 8G3 218700 VP35 + но 1E2 72900 VP35 + но 6B7 656100 VP40 + но Примечание: **Постановку АЗКОЛК проводили с использованием контролей, согласно описанной ранее методике [Babiuk, L. A., et al 1975]. * В качестве источника антител использовали асцитическую жидкость. + лизис более 30% клеток Vero инфицированных вирусом Марбург в присутствии комплемента морских свинок;

_ отсутствие эффекта в данной реакции;

н.и. - белок данным методом не идентифицирован;

но – не определяли.

Таблица Определение протективной активности МКА против ВМ при введении в морских свинок.

Соотношение % Р Фишера* MКА животных выживших выжило/общее животных 0,0368** 5G9.G11 4/4 7D8 2/5 40 1, 5F1 1/5 20 0, 3A5 2/5 40 1, 0,0242** 5G8.H5 5/5 7C4 2./5 40 1, Контроль вируса 2/5 * - Р Фишера - точный критерий Фишера (при малых обьемах выборок) между экспериментальными и контрольной группами животных, инфицированных ВМ [Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962].

** -- значения, являющиеся статистически достоверными с вероятностью 95 %.

нуклеокапсидных, NP и VP35, и матриксного VP40 белков ВМ (3 МКА против VP40, по 2 МКА против VP35 и NP) проявляли противовирусную активность в реакции АЗКОЛК. Вместе с тем, анализ полученных нами данных (по пассивной защите животных, сероконверсии антивирусных антител, а так же морфологии внутренних органов экспериментальных животных) позволяет утверждать, что введение МКА, специфичных к матриксному белку VP40 ВМ и активных в реакции АЗКОЛК, ингибирует развитие инфекционного заболевания на ранних стадиях, предохраняя или защищая организм морских свинок от летального развития патологического процесса. Подобный феномен указывает, по нашему мнению, что белок VP40 ВМ способен индуцировать синтез протективных антител в организме.

Определение иммунодоминантных белков филовирусов В настоящее время в научной литературе недостаточно данных для понимания роли структурных белков филовирусов Марбург и Эбола в формировании иммунного ответа, как в процессе иммунизации, так и в ходе заболевания. Недостаток таких данных, на наш взгляд, препятствует процессу создания эффективных средств профилактики и терапии геморрагических лихорадок, вызываемых этими высокопатогенными вирусами.

Предварительные данные, полученные нами при изучении взаимодействия набора антисывороток с инактивированными препаратами филовирусов указывали, что значительный иммунный ответ формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные белки, NP и VP35, а также матриксный белок VP40, а не на белки оболочки вириона, GP и VP24, как изначально ожидалось.

Вместе с тем, существует мнение, что большая панель МКА, полученных от одного вида животных в действительности может имитировать (представлять) основную композицию антител поликлональной сыворотки против вирусного агента. Проведенный нами анализ полученных данных по специфичности полученной панели МКА к белкам филовирусов (таблица 5), также указывал, что, возможно, именно эти белки, NP, VP40 и VP35 вирусов Марбург и Эбола, являются основными иммуногенами, на которые формируется иммунный ответ при иммунизации животных.

Представленные в научной литературе данные по белок-специфичности наборов МКА против филовирусов, также подтверждали этот вывод.

В связи с вышеизложенными фактами, с целью детального изучения особенностей формирования иммунного ответа животных на структурные белки филовирусов нами проводилось выявление уровня специфических антител (IgG) на структурные белки филовирусов в антисыворотках, а также определение с помощью моноклональных и поликлональных антител вирусных белков, которые являются иммунодоминантной или основной Таблица Сводная таблица определения белок-специфичности панели МКА к структурным белкам филовирусов Марбург и Эбола.

Количество МКА к вирусному белку. Иммуноген Вирусный белок (% от общего «мишень» количества) 16 (42,1%) ВЭ (вирус Эбола) NP 3 (7,9%) ВЭ VP 13 (34,2%) ВЭ VP 6 (15,8%) ВЭ Не определен 3 (14,3%) ВМ (вирус Марбург) NP 5 (23,8%) ВМ VP 11 (52,4%) ВМ VP 2 (9,5%) ВМ Не определен «мишенью» для иммунного ответа организма, то есть индуцируют максимальный синтез антител В-клетками. На этом этапе работы был сформирован и расширен набор поликлональных позитивных сывороток против ВМ и ВЭ. Как представлено в таблице 6, все исследуемые сыворотки, специфичные к ВЭ (от иммунизированных и инфицированных животных), взаимодействовали с инактивированным ВЭ в ТИФА. Титры специфических антител к белкам ВЭ находились в диапазоне разведений от 1/900 до 1/2187000. Максимальный титр антител был обнаружен в препарате иммуноглобулинов, выделенных из сыворотки гипериммунизированных лошадей (производитель ВЦ НИИ микробиологии МО РФ, Сергиев Посад).

Наиболее низкий титр антител был выявлен в сыворотке переболевших морских свинок. Идентификация белков ВЭ, на которые идет формирование иммунного ответа, и с которыми взаимодействуют поликлональные антитела иммунных сывороток, представленных в таблице 6, была также проведена методом иммуноблота. Полученные результаты показали, что поликлональные АТ сывороток к антигену штамма Заир, выявляют белки GP, NP, VP35, VP24, VP40, VP30 и L вируса Эбола. Поликлональные АТ сывороток к вирионам 8МС штамма также выявляют белки GP, NP, VP35, VP24, VP40, VP30 и L вируса Эбола и набор, по-видимому, клеточных или балластных белков, которые не были полностью удалены в процессе очистки вируса. Исходя из величины этих участков, выявляемых в иммуноблоте, основными иммуногенами являются белки NP, VP35, VP40, как штамма Заир, так и 8МС ВЭ. Антивирусные антитела иммунных сывороток против ВЭ штамм Mayinga также выявляли белки NP, VP35 и Таблица Определение специфичной реактивности поликлональных антител с инактивированными препаратами вируса Эбола.

Сыворотки Титр (источник антител в ВЭ-иммуноген Белки-иммуногены, антител) ИФА (обр. выявляемые в иммуноблоте величины) штамм NP*, VP40*, VP35*,VP30, VP мышь Maiynga кролик 72900 штамм Maiynga NP*, VP40*, VP35*,VP30, VP крыса 72900 штамм Maiynga NP* морская штамм Maiynga NP свинка IgG штамм Заир NP*, VP40*, VP35* лошади морская штамм Maiynga GP, NP* свинка мышь5 81000 штамм Заир GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L мышь5 729000 штамм Заир GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L мышь5 2187000 штамм Заир GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L мышь5 9000 штамм 8МС GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L мышь5 243000 штамм 8МС GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L мышь5 72900 штамм 8МС GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L мышь5 72900 штамм 8МС GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L нормальные 100 сыворотки Примечание: – отсутствие взаимодействия в данной реакции;

- сыворотки от иммунизированных животных;

- IgG, очищенные из сыворотки лошади, иммунизированной инактивированным и живым вирусом;

3 - сыворотка от инфицированного животного;

4 - нормальные сыворотки мыши, кролика, лошади, морской свинки использовались в качестве отрицательного контроля в ИФА и иммуноблоте;

5 – пул сывороток от иммунизированных животных;

используемых в гибридизации;

* - мажорные полосы, выявляемые в иммуноблоте и соответствующие вирусным белкам.

VP40 ВЭ, как основные иммуногены. Итак, данные, полученные нами с использованием антител поликлональных антисывороток, указывали, что основными иммуногенами при иммунизации инактивированными препаратами и, возможно, инфицировании вирусом являются белки NP, VP и VP40 вируса Эбола.

Кроме того, мы провели изучение иммунного ответа, который развивается на структурные белки филовирусов при инфицировании морских свинок вирусом Марбург (штамм Popp), и определение вирусных белков мишеней для иммунного ответа. Выявляемые на 14-й день инфицирования титры специфических антител (IgG) к ВМ соответствовали от 1/200 до 1/12800 разведениям сывороток (таблица 7).

Таблица Определение методом иммуноблота белков ВМ, индуцирующих синтез противовирусных иммуноглобулинов, выявляемых в сыворотке инфицированных, но выживших морских свинок.

N Условное Вирусные белки Титры груп обозначение мишени IgG-анти-ВМ пы животных иммунного ответа (обратные организма величины) 1 1.1 NP, VP35, VP40 1.2 NP, VP35 1.3 NP, VP40 1.4 NP, VP40 2 2.1 NP, VP35, VP40 2.2 GP, NP, VP35, VP40 3 3.1 VP40 4 4.1 NP, VP35, VP40 4.2 GP, NP, VP35, VP40 5 5.1 NP, VP35, VP40 5.2 NP, VP35 6 6.1 NP, VP35, VP40 6.2 NP, VP35, VP40 6.3 GP, NP, VP35, VP40 6.4 NP 6.5 NP, VP35, VP40 7 7.1 NP, VP35, VP40 7.2 NP Примечание: для определения протективной активности морским свинкам массой 180-200г вводили внутрибрюшинно МКА в виде 0,8 мл асцитической жидкости.

Через 24 часа животных инфицировали вирусом Марбург в дозе 1-2 ЛД50 (5-10 БОЕ). За животными наблюдали в течение 14 дней.

Данные иммуноблота, представленные в таблице, показывают, на наш взгляд, что синтез противовирусных иммуноглобулинов, выявляемых в сыворотке инфицированных, но выживших морских свинок, происходит, прежде всего, на нуклеокапсидные белки, NP и VP35, а также матриксный белок VP40 вируса Марбург. Необходимо отметить, что рост количества выявляемых сыворотками вирусных белков был пропорционален повышению титров специфических антител.

Итак, с помощью МКА и поликлональных антител позитивных сывороток было обнаружено, что при иммунизации животных инактивированными препаратами филовирусов формируется иммунный ответ, прежде всего на внутренние нуклеокапсидные белки (NP, VP35) и матриксный VP40, нежели на основной белок оболочки. Кроме того, необходимо отметить, что у инфицированных ВМ, но выживших морских свинок, наиболее значительный иммунный ответ также формируется на нуклеокапсидные (NP, VP35) и матриксный VP40 белки.

Изучение белков NP, VP40 и VP35 ВМ и их рекомбинантных аналогов Для исследования роли отдельных филовирусных белков в формировании антигенной структуры филовирусов было решено использовать рекомбинантные белки как инструмент и обьект исследования, то есть было намечено провести сравнительное изучение филовирусных белков и их рекомбинантных аналогов, полученных в результате экспрессии полноразмерных вирусных генов в прокариотической системе.

С этой целью в лаборатории С.В. Нетесова были собраны и экспрессированы полноразмерные копии генов NP, VP35 и VP40 вируса Марбург в плазмиде pQE (QIAGEN). Рекомбинантные белки rGP, rNP, rVP и rVP40 были синтезированы в E. coli JM103 в значительной концентрации и очищены с помощью Ni-хелатной хроматографии (Таблица 8). Сравнительное изучение иммунореактивных свойств белков ВМ проводили с использованием набора сывороток от животных, иммунизированных очищенным препаратом ВМ или рекомбинантными белками, а так же серопозитивной сыворотки рековалесцента, которая содержит противовирусные антитела, отражающие распознавание антигенных детерминант вируса иммунной системой человека в течение инфекции. Результаты тестирования, представленные в таблице демонстрируют, что рекомбинантные аналоги вирусных белков GP, NP, VP и VP40 обладают иммуногенностью, вызывают синтез антител в организме животных и выявляют специфические к вирусу Марбург антитела в сыворотках иммунизированных животных и переболевшего человека, то есть обладают антигенными свойствами.

На рисунке 1 представлен результат специфического взаимодействия антител моноспецифических сывороток против рекомбинантных белков с аналогичными вирусными белками в иммуноблоте.

Детальное изучение антигенной структуры рекомбинантных белков с помощью МКА показало (таблица 10), что 14 из 16-ти типов антител, синтез которых вызывают эпитопы вирусных белков, специфично взаимодействовали с исследуемыми рекомбинантными аналогами.

Проведенные исследования антигенной структуры белков вируса Марбург (штамм Popp) с применением специфичных поликлональных и Таблица Характеристики рекомбинантных белков вируса Марбург.

Синтез Рек. Конценттрация Молекулярный вес Белки очищенных Вектора рек.

( kДа) белков (мг/мл) белков (QIAGEN) (мг/л) ПААГ-ЭФa Теоретич.b rGP 74 PQE31 1-2 0, rNP 98 PQE-32 5-9 O, rVP35 40 PQE-31 50-70 2- rVP40 37-38 PQE-31 90-100 5- a Примечание: рекомбинантные белки были очищены, используя Ni-NTA хроматографию (QIAGEN), разделены в 12% ПААГ-ЭФ и визуализированы окрашиванием с Кумасси синим ;

b определяли путем компьютерного анализа аминокислотной последовательности рекомбинантных белков;

Таблица Взаимодействие рекомбинантных белков с поликлональными сыворотками против вируса Марбург.

Взаимодействие очищенных Титры специфического ПКА рекомбинантных белков с ПКА взаимодействия рекомбинантных (IgG) позитивных сывороток белков с ПКА в ТИФА (Иммуноблот) (обратные величины) rGP rNP rVP35 rVP40 rGP rNP rVP35 rVP - + + + 800 12800 8100 ЧРС - + + + 1600 72900 40500 Л.IgG МАС + + + + 900 24300 8100 ВМ МАС 100 100 + - - - rGP МАС 100 100 - + - - rNP МАС 100 100 - - + - rVP МАС- 100 100 - - - + rVP40 Примечания: ЧРС - сыворотка человека (1/500);

Л. Ig G – лошадиные иммуноглобулины против ВМ ( 1/1500);

МАС-ВМ - мышиная антисыворотка (1/1000);

МАС-rGP - сыворотка против рек.GP (1/1000);

МАС-rNP - сыворотка против рек.NP (1/5000);

МАС-rVP40 - сыворотка против рек.VP (1/10000);

МАС-rVP35 – сыворотка против рек.VP35 (1/5000).

Рисунок 1.

Выявление методом иммуноблота взаимодействия белков NP, VP40 и VP вируса Марбург с моноспецифическими сыворотками против рекомбинантных белков.

1 – антисыворотка мыши к вирусу Марбург в разведении (1/1500);

2 – антисыворотка к рек.

белку NP в разведении (1/1000);

3 – антисыворотка к рек.

белку VP35 в разведении (1/1000);

4 - антисыворотка к рек. белку VP40 в разведении (1/1000).

моноклональных антител, позволяют сделать вывод, что нуклеокапсидные белки, NP и VP35, матриксный VP40 имеют выраженные антигенные участки, которые активно распознаются иммунной системой животных. Причем индукция антител к этим белкам возникает, как в ответ на иммунизацию вирусным антигеном, так и, по-видимому, в процессе развития филовирусной инфекции при инфицировании людей и животных. Противовирусные поликлональные антитела, синтез которых индуцируется у животных в ответ на введение вирусных белков или их рекомбинантных аналогов, и гибридомные МКА против вирусных белков обладают высокой специфичностью по отношению к исследуемым белкам. Данный факт указывает на близкое сходство, если не идентичность антигенной структуры вирусных белков и их рекомбинантных аналогов, что позволило перейти, в дальнейшем, к картированию антигенной структуры на аминокислотной последовательности вирусных белков с помощью делеционных вариантов их рекомбинантных аналогов.

Таблица Определение взаимодействия МКА, специфичных к вирусу Марбург, с эпитопами рекомбинантных белков: rNP, rVP35 и rVP40.

Иммуноблот Титры МКА в ТИФА Белок – Рек.

№ МКА мишень Эпитоп rVP35 rVP40 rNP аналог ВМ 1 VP35 + 1a 67500 100 1E 2 VP35 - н.о. 100 100 1H 3 VP35 + 1c 1822500 100 3F 4 VP35 - 2a 100 100 8G 5 VP35 + 1b 607500 100 9D 6 VP40 + 2d 100 656100 6B 7 VP40 + 2a 100 729000 7C 8 7H10 VP40 + 1b 100 729000 9 VP40 + 2c 100 656100 5G 10 VP40 + 1a 100 72900 5G 11 VP40 + 1c 100 21870 9G 12 VP40 + н.о. 100 72900 1C 13 VP40 + 2b 100 243000 7D 14 NP + 1a 100 100 5F 15 NP + 2a 100 100 5H 16 NP + 2b 100 100 9C Примечание: н.о. - не определен эпитоп;

+ взаимодействие МКА с рек.

белком;

- отсутствие взаимодействия МКА с рек. белком;

Картирование антигенных детерминант и эпитопов белков филовирусов Марбург и Эбола Анализ результатов, проведенного нами топологического картирования методом конкурентного ИФА эпитопов VP35, VP40 и NP белков ВМ позволяет утверждать о наличии не менее 2 двух антигенных сайтов на каждом исследуемом белке. В результате сравнения перекрывания антигенных эпитопов этих белков было обнаружено, что 7 эпитопов ( эпитопа NP, 3 эпитопа VP40 и 2 VP35) взаимно перекрываются, образуя общий функциональный участок, который является специфичным для МКА, участвующих в антитело-зависимом комплемент-опосредованном лизисе инфицированных клеток. В их числе некоторые МКА, которые обладали также антивирусной активностью in vivo [Разумов И.А., и др., 2001].

Следующим подходом, используемым для картирования антигенных детерминант филовирусных белков, явилось объединённое применение двух инструментов исследования, моноклональных антител, а также рекомбинантных белков и их фрагментов, с исследованными антигенными свойствами. С целью идентификации и локализации на аминокислотной последовательности эпитопов связывания моноклональных и поликлональных антител с белком VP35 ВМ были сконструированы и экспрессированы различные фрагменты cDNA гена VP35 ВМ. Одиннадцать фрагментов рекомбинантного белка rVP35, содержащих перекрывающиеся аминокислотные последовательности белка VP35 ВМ были синтезированы в E.coli (рисунок 2).

Рисунок 2. Схема получения фрагментов белка рек.VP35 ВМ.

A. Фрагмент генома ВМ 1027 пн был использован для клонирования рек. VP35.

B. Фрагмент рекомбинантной плазмиды pQ-f35. Отмечены сайты рестрикции плазмиды pQ-f35.

C. Фрагменты белка рек.VP35 ВМ. Названия фрагментов указаны слева.

D. Профиль гидрофобности/гидрофильности (Kyte & Doolittle) белка VP35 ВМ.

С целью определения иммуногенности полученных рекомбинантных белков (фрагментов rVP35) была проведена иммунизация мышей. Сыворотки, полученные при иммунизации животных фрагментами rVP35, исследовались в ИФА на специфичность взаимодействия с рекомбинантными иммуногенами, динамику наработки антител в организме в разные сроки после иммунизации и перекрестную реактивность с VP35 вируса Марбург (таблица 11). Полученные результаты продемонстрировали, что в результате иммунизации животных рекомбинантными белками, у всех животных был получен специфический иммунный ответ на эти иммуногены.

Таблица Некоторые характеристики фрагментов белка rVP35 ВМ.

Концентрация Определение в ИФА титров Рек. Молекулярный вес очищенных (обр.величина) белок в кДа. rVP35 белков в взаимодействия очищенных растворе rVP35 белков с антителами (мкг/мл) сывороток :

Теорет.b МПС-rVP35d МПС-ВМe ПААГ ЭФa rVP35 40 40,913 40 7290 pA1 24 24,004 30 2430 pA2 32 32,698 35 2430 pA3 17-18 19,083 500 24300 pA4 29 28,811 500 72900 pA5 11 11,130 400 16 pA112 14 14,574 170 8100 pA113 36 36,422 50 7290 pA114 22 24,303 600 218700 pA115 11 11,608 30 8 pA116 6-7 7,101 30 8 pA117 33 32,918 50 8 Примечание: a рекомбинантные белки были очищены, используя Ni-NTA хроматографию (QIAGEN), разделены в 12% ПААГ-ЭФ и визуализированы окрашиванием с Кумасси синим;

b определяли путем компьютерного анализа аминокислотной последовательности рекомбинантных белков;

c МПС-ВМe мышиная поликлональная сыворотка против вируса Марбург.

d МПС-rVP35 – мышиная поликлональная сыворотка против rVP35 белка.

Антигенная реактивность фрагментов рек.VP35 была исследована методом ИФА (таблицы 12) и иммуноблота (рисунки 3 и 4), используя поликлональные антитела антивирусных сывороток и пять VP35 специфических моноклональных антител. Все одиннадцать rVP35 фрагментов реагировали специфически с сывороткой против рекомбинантного белка VP35. Но поликлональные антитела антивирусных сывороток распознавали в ИФА только семь VP35 фрагментов (pA1, pA2, pA3, pA4 и pA112, pA113, pA114). По-видимому, это означает, что только эти фрагменты имитируют антигенную структуру и имеют антигенные свойства исходного вирусного белка. Анализ взаимодействия противовирусных сывороток с указанными фрагментами выявил присутствие двух антигенных участков на белке VP ВМ, расположенных между 1 и 174 аминокислотными остатками (aо) и в пределах 174-278 aо около C-конца последовательности.

Изучение взаимодействия 11 фрагментов rVP35 с моноклональными антителами против VP35 ВМ показало, что 2 типа МКА, 1H5 и 8G3, против VP35 ВМ не взаимодействовали с рекомбинантным белком rVP35 и его фрагментами. Три типа МКА (1E2, 3F9, 9D8), взаимодействующие с рекомбинантным белком VP35, активно реагировали только с пятью (pA3, pA4 и pA112, pA113, pA114) из семи rVP35 фрагментов, распознаваемых антивирусными антителами поликлональных сывороток. Результаты изучения взаимодействия анти-VP35 МКА с рекомбинантными белками, фрагментами rVP35, указывают, что эпитопы, распознаваемые МКА (1E2, 3F9, 9D8) на белке VP35 ВМ, расположены между 251 и 278 aо.

Таким образом, исследование иммунохимическими методоми взаимодействия перекрывающихся фрагментов рекомбинантного белка VP35, экспрессированных в E.coli., с антивирусными моноклональными и Tаблица Определение в ИФА взаимодействия фрагментов белка рек.VP35 ВМ с моноклональными антителами против VP35 вируса Марбург.

Фрагменты МКА специфичные к белку VP35 вируса Марбург VP35 ВМ (сайт, эпитоп).

1E2 3F9 9D8 8G3 1H5 Смесь МКА (1а) (1а) (1а) (2а) (?) _ _ _ _ _ _ pA 1-174 ао _ _ _ _ _ _ pA 1-251 ао _ _ pA3 2+ 2+ 2+ +2+ 167-329 ао _ _ pA4 2+ 2+ 2+ +2+ 84-329 ао _ _ _ _ _ _ pA 246-329 ао _ _ pA112 2+ 2+ 2+ 2+ 167-278 ао _ _ pA113 2+ 2+ 2+ 2+ 1-278 ао _ _ pA114 2+ 2+ 2+ 2+ 84-278 ао _ _ _ _ _ _ pA 246-329 ао _ _ _ _ _ _ pA 246-278 ао _ _ _ _ _ _ pA 193-268 ао Рисунок 3. Взаимодействие ПАТ сывороток с фрагментами рек.VP35 ВМ в иммуноблоте. Очищенные фрагменты рек.VP35 после ЭФ были перенесены на мембрану, как описано в материалах и методах. Затем, мембрана была обработана ПАТ мышиной сыворотки в разведении 1:3000 и раствором коньюгата антивидовых АТ с пероксидазой. 1, E. coli–pQE клеточный лизат;

2, pA112 (aо 167–278);

3, pA114 (aо 84–278);

4, pA113 (aо 1–278);

5, pA4 (aо 84 – 329);

6, pA3 (aо 167–329);

7, pA1 (aо1–174).

Рисунок 4. Взаимодействие МКА с фрагментами рек.VP35 ВМ в иммуноблоте.

Мембрана с очищенные полипептидами была обработана раствором очищенных МКА 1E2;

3F9;

9D8 (смесь 1:1:1 объем/ объем) в концентрации 1 мкг/мл. 1, pA4 (aо 84–329);

2, pA3 (aо 167–329);

3, pA1 (aо 1–174);

4, pA113 (aо 1–278);

5, pA112 (aо 167–278);

6, pA2 (aо 1–251);

7, pA114 (aо 84–278).

поликлональными антителами позволило выявить 2 антигенных участка на белке VP35 ВМ. Один антигенный участок, названный нами доминантным антигенным районом (ДАР) был локализован между аминокислотными остатками 251-278 с помощью МКА. Месторасположения другого антигенного участка было выявлено между 1 и 174 аминокислотными остатками с помощью поликлональных антител антивирусных сывороток.

По подобной схеме нами были проведены исследования по картированию антигенных детерминант белка VP35 ВЭ. С этой целью были получены рекомбинантные белки, обозначенные как rVP35 (1-340 ао), Rec310N (1-310 ао), Rec148N (1-148 ао), Rec100N (1-100 ао), Rec86N (1-86 ао), Rec274CN (36-310 ао), которые имели электрофоретическую подвижность, соответствующую 38.5, 31, 17.5, 10.5, 12, 35 кДa, что соответствовало их расчётным молекулярным весам.

С целью картирования проводили оценку взаимодействия фрагментов белка с антителами антивирусных сывороток и МКА против белка VP35 ВЭ.

Как показано в таблице 13, было определено, что антитела кроличьей антисыворотки (КАС) и очищенные лошадиные иммуноглобулины распознавали фрагменты rVP35 так же эффективно, как и полноразмерный белок. Причем важно отметить, что наименьший рекомбинантный фрагмент содержал первые 86 аминокислот с N-конца последовательности VP35. Это позволяет утверждать, что на N-конце белка локализованы эпитопы для Таблица Определение методом ИФА взаимодействия фрагментов rVP35 ВЭ с антивирусными антителами.

Титры антител в ИФА*(обратные величины) rVP35 и М.в.

фрагменты (кДa) МАС- МКА МКА КАС Ig G белка. rVP35 1C7 6F7 лошади rVP35 38,5 1 968 300 218 700 24 300 40 500 8 1-340 ао Rec 310N 35 1 968 300 656 100 218 700 218 700 24 1-310 ао Rec 148N 17,5 1 968 300 1 968 300 218 700 72 900 24 1-148 ао Rec 100N 10,5 656 100 1 968 300 218 700 1 968 300 656 1-100 ао Rec 86N 12 656 100 656 100 218 700 72 900 24 1-86 ао Rec 274CN 31 218 700 100 100 218 700 72 36-310 ао Лизат М15 100 100 100 100 связывания антител и этот район во многом формирует иммунный ответ на VP35 белок. Взаимодействие МКА с рекомбинантными фрагментами белка VP35 ВЭ в ИФА и иммуноблоте было отличным от реагирования с поликлональными антителами. Отсутствие взаимодействия МКА 1С6 и 6F7 с полипептидом Rec274CN (36-310 а.о.), вероятно, свидетельствует о том, что первые 36 N-концевых аминокислотных остатков VP35 ВЭ задействованы в формировании эпитопов для МКА и их удаление приводит к нарушению связывания. Кроме того, тот факт, что полипептид Rec274СN (36-310 ао) не взаимодействовал с МКА, но реагировал с антителами позитивных сывороток, даёт нам основание предположить, что на белке VP35 ВЭ находится не менее двух антигенных детерминант, индуцирующих синтез антител В-клетками в ходе развития иммунного ответа.

Выявление перекрестно-реактивных эпитопов белков ортопоксвирусов, взаимодействующих с нейтрализующими МКА.

К настоящему времени накопились данные, которые указывают, что различные виды ортопоксвирусов значительно отличаются по степени контагиозности и спектру патогенности, но обладают морфологическим подобием и перекрестно-реактивной антигенной структурой [Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. 1998;

Moss B., 2000]. Вирус эктромелии (ВЭм), который также относится к ортопоксвирусам, не патогенен для человека, хотя вызывает заболевания у мелких грызунов, и значительные эпизоотии мышей c летальными исходами были зарегистрированы [Chen N., et al 2003]. Изучение перекрестной реактивности МКА против ВЭм и их ингибирующего действия на репликацию патогенных для человека ортопоксвирусов in vitro, например, в реакции нейтрализации, позволяет надеяться на выявление родоспецифических нейтрализующих МКА и идентификацию новых эпитопов белков ортопоксвирусов, участвующих в формировании защитного иммунитета. Кроме того, лабораторные линии мышей, восприимчивые к вирусу эктромелии, могут быть использованы в качестве пермисcивной животной модели ортопоксвирусной инфекции, то есть для выявления роли нейтрализующих перекрестно-реактивных МКА в подавлении инфекции при введении в организм.

В нашем Центре была создана коллекция из 125 гибридом, крысиного происхождения, продуцирующих МКА к ВЭм. Целью нашего исследования явилось изучение перекрестной реактивности и нейтрализующей активности полученных МКА против патогенных для человека ортопоксвирусов: вирус осповакцины (ВОВ), вирус оспы коров (ВОК) и вирус натуральной оспы.

В результате анализа взаимодействия 125 МКА с ВОВ и ВОК нами было обнаружено, что 112 видов МКА (90%) перекрестно взаимодействовали с ВОВ и ВОК, и лишь 12 МКА (10%) реагировали только с ВЭм. Исходя из представленных в работе данных иммунопрециитации вирусных белков с МКА, можно сделать вывод, что при введении в нечувствительных к вирусу эктромелии крыс Lou очищенных вирионов ВЭм индуцируется иммунный ответ на белки 14 кДа, 35 кДа и 37 кДа. Наиболее иммунодоминантным является белок 14 кДа, который, по-видимому, является продуктом гена 129L ВЭм по аналогии с геном A27L ВОВ. МКА С3 (mAbC3) [Rodriguez J.F., et al 1985] к белку 14 кДа (ген A27L) ВОВ, штамм WR, любезно предоставленные доктором Эстебано, были использованы для идентификации белка 14 кДа ВЭм (ген 129L), с которым взаимодействуют в иммунопреципитации полученные гибридомные МКА. Получив позитивный результат, мы сформировали панель из 22 типов очищенных препаратов МКА, реагирующих с белком 14 кДа (таблица 14). В состав этой панели вошли МКА против ВЭ, 1 против ВОК и 2 против ВОВ. Далее мы провели анализ перекрестного реагирования этих МКА с ВОВ, ВОК, ВЭм и ВНО в ИФА.

Было выявлено, что 9 из 10 перекрестно-реагирующих МКА взаимодействовали с также с ВНО.

Чтобы выяснить, как наличие перекрестно-реактивной структуры соотносится с антивирусной активностью МКА, были исследованы вируснейтрализующие свойства 46 МКА в реакции нейтрализации (РН) ВОВ на культуре клеток Vero. Как показано в таблице 14, из 10 представленных перекрестно-реагирующих МКА пять нейтрализовали ВОВ, из них 2 МКА с максимальной антивирусной активностью были оценены в РН с ВНО, где они также подавляли размножение этого вируса.

Известно, что белок слияния 14 кДа (ген A27L) ВОВ индуцирует синтез вируснейтрализующих антител и активирует клеточный иммунный ответ в инфицированном организме. Развитие ортопоксвирусной инфекции может быть предотвращено при введении в организм нейтрализующих антител против белка 14 кДа (ген A27L). Это позволяет говорить о принципиально важной роли белка слияния в процессе формирования противовирусного иммунитета. Для более полного исследования свойств белков слияния ВЭм и ВНО, гомологов белка слияния ВОВ (ген A27L), в отделе С.Н. Щелкунова были клонированы гены 129L ВЭм и ген A30L ВНО в составе плазмиды pQE32 (Qianogen). Это позволило получить аффинно-очищенные рекомбинантные полипептиды pr129L и prA30L в количествах достаточных для проведения данного исследования. В таблице 15 представлены данные по взаимодействию МКА с аффинно-очищенными pr129L и prA30L полипептидами. Двадцать один тип МКА из 22 гибридомных антител взаимодействовал с очищенным pr129L ВЭм как в ИФА, так и в иммуноблоте.

Исключение составили МКА 112H12, которые эффективно взаимодействовали с белком слияния в составе вирусной частицы ВЭм, и хотя не распознавали его рекомбинантный аналог, pr129L, но реагировали при этом в ИФА с prA30L полипептидом. Девять типов МКА перекрестно взаимодействовали в ИФА и 8 из них в иммуноблоте с prA30L, что указывало на наличие общих антигенных детерминант как у белков слияния Таблица Перекрестное реагирование и нейтрализующая активность МКА при взаимодействии с ортопоксвирусами.

РН** Название Титр МКА (обратные величины) в ИФА МКА с МКА ИФА ВНО* ВЭм ВОВ ВОК ВОВ ВНО 3,65105 1,09106 1, 111А3 – но + 3,65105 100 111C4 – – но 1,09106 3,65105 1, 112H12 80 но + 1,2105 8,1 10 3 8,1 10 113D5 – 200 но 1,09106 3,65105 1, 113F8 200 но + 1,09106 1,09106 3, 115F11 – но + 1,2105 100 117A3 – – но 1,2105 100 122C10 – – но 1,2105 100 122E9 – – но 4,1104 100 122G4 – – но 2,2106 2,2106 2, 122H9 12000 + 1,4104 100 123C3 – – но 3,65105 100 124B6 – – но 3,65105 100 124H9 – – но 3,65105 100 124H2 – – но 1,09106 2,2106 1, 125G9 8000 + 4,1104 100 126C9 – – но 4,1104 100 126C3 – – но 1,2105 100 127F2 – – но 2,4104 1103 2, 1E1 – но + 2,2105 8B11 – но + 6,6106 6,6106 2, 11G7 – но + * - ВНО был обработан, как описано ранее, и полученный лизат использован в качестве антигена в ИФА, где значения оптической плотности при 495 нм обозначены: “–“ 0.2;

“+” 1,0. МКА были использованы в виде асцитической жидкости в разведении 1:500;

** указана обратная величина разведения асцитической жидкости, содержащей МКА, ингибирующих 50% бляшкообразующих единиц (БОЕ) при введении 1000 БОЕ в лунку;

– отсутствие эффекта в нейтрализации;

но - не определяли.

ВЭм и ВНО, так и у их рекомбинантных аналогов.

Итак, полученные нами данные свидетельствуют, о наличии перекрестно-реагирующих или, возможно, родоспецифических эпитопов у белков слияния разных видов ортопоксвирусов, патогенных и непатогенных для человека, и что исследуемые рекомбинантные полипептиды полностью сохраняют или имитируют эту структуру. Пять типов перекрестно реагирующих МКА к белку слияния обладали активностью в реакции нейтрализации против ВОВ, штамм ЛИВП, а дополнительно изученные МКА 122H9 и 122G9 были способны также нейтрализовать ВНО, штамм Инд-3а. Таким образом, впервые удалось показать наличие эпитопов на белке A30L ВНО, которые непосредственно участвуют в нейтрализации вирусной активности Таблица Определение взаимодействия МКА c очищенными рекомбинантными полипептидами, pr129L ВЭм и prA30L ВНО.

Результаты реагирования МКА с № Название Вирус МКА иммуноген рекомбинантными белками pr129L prA30L Титр МКА Иммуноблотb Титр МКА Иммуноблотb в ИФАa в ИФАa 2, 3, ВЭм + 1 111А3 + 1,29105 ВЭм + 2 111C4 4, ВЭм 3 112H12 - 4,05104 ВЭм + 4 113D5 2, 3, ВЭм + + 5 113F 4,05104 4, ВЭм + + 6 115F 4,05104 ВЭм + 7 117A3 1,29105 ВЭм + 8 122C10 3,65105 ВЭм + 9 122E9 3,65105 ВЭм + 10 122G4 3,65105 3, ВЭм + + 11 122H 1,29105 ВЭм + 12 123C3 3,65105 ВЭм + 13 124B6 3,65105 ВЭм + 14 124H9 1,29105 ВЭм + 15 124H2 1,29105 1, ВЭм + + 16 125G 1,29105 ВЭм + 17 126C9 1,29105 ВЭм + 18 126C3 4,05104 ВЭм + 19 127F2 2,43104 2, ВОК + + 20 1Е 2,43104 2, ВОВ + + 21 8B 4,4104 4, ВОВ + + 22 11G Примечание: a в таблице приведены обратные величины титров МКА, определенные в ИФА. Вестерн-блот, где специфическое взаимодействие МКА с рекомбинантными белками отмечено знаком «+», отсутствие взаимодействия «–».

Изучение с помощью нейтрализующих МКА антигенной вариабельности штаммов ВЗН Одновременно со вспышкой лихорадки Западного Нила в Северной Америке в 1999 году была зарегистрирована вспышка лихорадки Западного Нила в южных районах России (в Астрахани и Волгограде). В 2002 году были получены первые свидетельства циркуляции современного генотипа вируса Западного Нила на территории юга Западной Сибири. Вместе с тем данные об антигенной вариабельности штаммов, выделяемых на территории России и ближнего зарубежья, отсутствовали. В связи с этим, мы получили коллекцию гибридом и сформировали панель из 24 МКА, реагирующих в ИФА с ВЗН, штамм Vlg99-27889, который был выделен в 1999 году в Волгограде от больного. Полученная панель МКА была использована для исследования нейтрализующей активности МКА против различных штаммов ВЗН и картирования нейтрализующих эпитопов (Nt-эпитопов) белка Е ВЗН. Из этой панели было выбрано 16 МКА (таблица 16), которые проявляли вируснейтрализующую активность против штамма Vlg99-27889 (генотип 1а).

Далее, нейтрализующая активность МКА из этой панели была определена одновременно по отношению к 7 штаммам ВЗН, которые были получены из Государственной коллекции вирусных штаммов Института вирусологии им.

Д.И. Ивановского РАМН (Москва, Россия).

Нейтрализующие МКА были разделены на 4 группы на основе реактивности в реакции нейтрализации, иммуноблоте, РТГА, перекрестной реактивности с 7 штаммами ВЗН и вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) (таблицы 16 и 17). В группу I вошли МКА с нейтрализующей активностью по отношению ко всем исследованным штаммам ВЗН. Нейтрализующая активность МКА против различных штаммов ВЗН в пределах групп II – IV была различной от штамма к штамму. Обобщение данных по Nt-эпитопам ясно указывает, что эти Nt-эпитопы различны. Это позволило нам заключить, что имеется не менее 13 различных Nt-эпитопов ВЗН, узнаваемых нйтрализующими МКА (Nt-МКА), большинство из которых расположено на гликопротеине Е ВЗН. От одного до семи видов Nt-МКА были отрицательны в РН с использованием штаммов Vlg00-27924, Hp-94, A-1640, A-72, Tur-2914 и Eg101 ВЗН. Мы предположили, что эти штаммы ВЗН не имеют идентичных эпитопов, которые распознают соответствующие Nt-МКА. Для подтверждения этой гипотезы мы исследовали взаимодействие МКА по отношению к этим штаммам в ИФА. Результаты ИФА продемонстрировали, что большинство штаммов ВЗН имеют эпитопы для взаимодействия Nt-МКА. Это позволяет заключить, что некоторые эпитопы белка Е штаммов Vlg00-27924, A-72 и Eg 101 ВЗН сохранены, но не все из них вовлечены в нейтрализацию. Штаммы Tur-2914, A-1640 и Hp-94 не взаимодействовали с несколькими видами Nt МКА групп III и IV в ИФА (таблица 19, черные ячейки). Такая мозаичная нейтрализующая активность и взаимодействие в ИФА указывают, по видимому, на два вида антигенной вариабельности для ВЗН. Первый тип антигенной вариабельности связан с отсутствием нейтрализующей активности МКА после взаимодействия их с эпитопами, а второй тип антигенной вариабельности связан с потерей способности МКА, взаимодействовать с этими эпитопами.

Таблица Панель нейтрализующих МКА к ВЗН.

Титр в ИФАa Субтип Белок МКА Титр в ИФА IgG мишень (обр.величины) РТГА с ВКЭ 9E2 IgG2a Белок E 21.870000 819200 – 7G9 IgG3 Белок E 2.430000 40 – 11G3 IgG3 Белок E 810000 1280 – 7E6 IgG3 Белок E 243000 320 – 5H6 IgG1 – 656100 – – 7B9 IgG2b Белок E 729000 – + 2G12 IgG3 Белок E 24300 – + 5F11 IgG3 67 kDa* 243000 – + 1B7 IgG3 Белок E 243000 – – 3F4 IgG2b Белок E 656100 – – 4F11 IgG3 Белок E 243000 160 – 5F7 IgG1 – 24300 – – 7B2 IgG1 Белок E 24300 – – 1D12 IgG1 67 kDa* 8100 – 4D10 IgG1 – 72900 – – 7F9 IgG1 Белок E 243000 – – n.d. n.d. 2.430000 Гиперим. + сыворотка ** Примечание: (+) – указывает на взаимодействие;

(–) – отсуствие взаимодействия;

(*) – блот с лизатом инфицированных ВЗН клеток, n.d. – не определяли. “a” – титр в ИФА приведен в виде обратных величин разведения превышающих контрольный показатель ОП (сut-off value) не менее, чем в 3 раза.

Картирование антигенных детерминант при помощи рекомбинантных полипептидов позволяет уточнить расположение районов аминокислотной последовательности вирусных белков, вызывающих образование антител.

Такой подход был ранее успешно использован нами для белков вирусов Марбург и Эбола [Рудзевич Т.Н, и др., 2003;

Sorokin A.V., et al 2002]. В настоящей работе, мы попытались использовать этот же подход для картирования антигенных детерминант белка Е ВЗН.

Таблица Определение нейтрализующей активности МКА против размножения штаммов ВЗН в культуре клеток Vero.

Титр МКА (обр. величины) в РН:

МКА Vlg99- Vlg00- Hp-94 A-1640 Tur- А-72 Eg 27889 27924 Гиперимм. 128,000 64,000 400 32,000 100 6,400 128, сыворотка ** Группа Ia (нейтрализующие все штаммы, блот +) 9E2 1.024,000 256,000 64,000 512,000 64,000 512,000 1.024, 7G9 512,000 64,000 200 64,000 400 256,000 512, 11G3 256,000 3,200 3,200 128,000 400 128,000 256, 7E6 16,000 4,000 4,000 8,000 4,000 16,000 8, Группа Ib (нейтрализующие все штаммы, блот –) 5H6 512,000 800 200 64,000 400 128,000 512, Группа II (перекрестно-реагирующие) 7B9 512,000 800 – 16,000 – 64,000 32, 2G12 4,000 – 200 – – 400 5F11 256,000 32,000 4,000 - - 200 64, Группа III (WNVS, блот +) 1B7 128,000 400 – 32,000 – 200 64, 3F4 128,000 – – 64,000 – 400 128, 4F11 64,000 – – 64,000 – 800 64, Группа IV (WNVS, блот –) 5F7 800 – – – 400 – 7B2 6,400 50 – – 50 50 1D12 50 50 – 50 50 50 4D10 16,000 n.d. n.d. 250 n.d. n.d. 7F9 6,400 n.d. 4,000 n.d. – n.d. NS0 асцит – – – – – – – Примечание: Титр в РН был рассчитан как разведение МКА, ингибирующее более чем на 50% развитие ЦПД. Н.о – не определяли. ** - отсутствие активности в реакции.

– - отсутствие нейтрализации МКА – - отсутствие нейтрализации и взаимодействия МКА в ИФА В результате работ по клонированию кДНК фрагментов генома ВЗН (штамм LEIV-Vlg99-27889- human) были клонированы в векторах E.coli фрагменты гена структурного белка Е ВЗН. Сотрудниками нашего отдела были получены короткие рекомбинантные фрагменты белка Е, которые были использованы для картирования эпитопов связывания с МКА [Razumov I.A., et al 2002].

Результаты взаимодействия поликлональных антител и МКА с рекомбинантными фрагментами белка Е ВЗН в ИФА представлены в таблице 18. Семь рекомбинантных фрагментов, представляющих практически всю последовательность белка Е, были использованы для картирования эпитопов Nt-МКА. Результаты исследования взаимодействия Nt-МКА с эти полипептидами (rVPE1-180, rVPE1-277, rVPЕ1-321, rVPE127-193, rVPE 1-86, rVPE 53-126 и rVPЕ260-466) в ИФА указывают, что только пять типов Nt-МКА распознавали эти полипептиды.

Таблица Взаимодействие МКА с рекомбинантными фрагментами белка Е ВЗН в ИФА.

Титр МКА в ИФА:

№ МКА Е 1- Е 1- Е 1- Е 1-86 Е 127- Е 53- Е 260- 180 ао 277ао 321ао ао 193 ао 126 ао ао 1 9E 100 100 100 100 100 2 7G 100 100 100 100 100 3 11G 100 100 100 100 100 4 7E 100 100 100 100 100 5 5H 100 100 100 100 100 4F 100 121500 121500 2700 6 ГПА ВЗН 24300 24300 24300 2700 2700 2700 7 ИПА ВЗН 8100 8100 8100 900 900 900 8 NS0 асцит 100 100 100 100 100 100 Примечание: но – не определяли. Полипептиды сорбировали на пластик в течение ночи в концентрации 100-200 нг/лунку. Лизат бактериальных клеток в разведении 1:100 – 1:200 использовали в качестве отрицательного контроля. ГПА-ВЗН – поликлональные антитела гипериммунной сыворотки против ВЗН;

ИПА-ВЗН поликлональные антитела иммунной сыворотки против ВЗН.

МКА 9E2, 7G9, 11G3 и 7E6 из группы Ia реагировали только с rVPЕ260-466, а МКА 4F11 (группа III) взаимодействовали с rVPE1-180, rVPЕ1-321, rVPE 1-86, и rVPE 53-126. Результаты ИФА были подтверждены в иммуноблоте с Nt-МКА и полипептидами rVPЕ1-321, rVPE 53-126 и rVPЕ260-466. Анализ данных указывает, что район 321-466 ао белка E, в который входит домен III (домен III образован единым фрагментом последовательности 305-394 ао), есть наименьший из полученных рекомбинантный фрагмент, несущий эпитопы для всех Nt- МКА из Ia группы.

Второй район взаимодействия для 4F11 Nt-МКА был локализован между аминокислотными остатками 1-126, которые включают аминокислотные остатки доменов I и II E белка. Внутри этой последовательности расположен пептид слияния белка Е ВЗН, который участвует в процессе взаимодействия вируса с клеткой. Взаимодействие нейтрализующих МКА 4F11 с районом Е белка, в состав которого входит пептид слияния (98-113 ао), вызывает торможение гемагглютинации гусиных эритроцитов вирусом. Отсутствие взаимодействия других Nt-МКА с относительно большими rVPE полипептидами позволяют предположить, что большинство эпитопов для Nt-МКА являются конформационными. Данные результаты, что МКА из Ia группы распознают аминокислотные остатки 321 466 белка Е, позволяют предположить, что взаимодействие этих нейтрализующих МКА с указанным районом, по-видимому, подтверждает ранее опубликованные данные по индукции III доменом белка Е ВЗН вируснейтрализующих антител.

Проведенный нами конкурентный анализ взаимодействия меченных и немеченых МКА с ВЗН в ИФА, показал, что МКА 9E2, 7G9, 11G3 и 7E взаимно конкурируют (ингибирование связывания 75%) между собой за взаимодействие с белком Е ВЗН. Это указывает, по-видимому, на то, что они взаимодействуют с одним и тем же сайтом Е белка. МКА 5H6 не конкурировали с этими МКА за взаимодействие с белком Е ВЗН. МКА 4F11 не конкурировали ни с одним из используемых МКА за взаимодействие с ВЗН и, по-видимому, также реагировали с другим сайтом. Это позволяет считать, что данные по пространственному расположению эпитопов белка Е ВЗН, полученные методом конкурентного ИФА совпадают с результатами эпитопного картирования (таблица 18).

Результаты этой работы позволили обнаружить антигенную вариабельность современных штаммов вируса Западного Нила, циркулирующих в Евразии. Многие штаммы вели себя как типичные антигенные мутанты и были способны избегать нейтрализующего действия моноклональных антител. Обобщая наши данные по иммунобиологической активности Nt-МКА и картированию Nt-эпитопов с использованием рекомбинантных полипептидов, можно говорить о наличие не менее различных Nt-эпитопов у штаммов ВЗН. Такое большое количество Nt эпитопов предполагает, что механизм нейтрализации ВЗН является более сложным, чем считалось ранее, и он нуждается в дальнейшем исследовании.

Вероятно, что полученные нами МКА 9E2, 7G9, 11G3 и 7E6, реагирующие с 321-466 ао белка Е ВЗН, не идентичны описанным ранее МКА 5C5 и 5H [Sanches M.D., et al 2005]. Взаимодействие нейтрализующих МКА 4F11, активных также в РТГА, с полипептидами rVPE1-180, rVPE1-86, rVPE1- указывает, что домены I и II белка Е также вовлечены в рецепторные взаимодействия вируса и клетки.

Анализ нейтрализующей активности МКА 9Е2 и рекомбинантных одноцепочечных scFv 9Е2 и гуманизированных Fc-9Е2 антител В последние десятилетия внимание ученых и фармацевтических производителей привлекают рекомбинантные антитела, которые в принципе можно получить в значительных количествах и использовать как в научных исследованиях, так и в практическом плане. Наибольший интерес при этом, конечно, вызывают гуманизированные антитела, в которых вариабельные участки человеческих антител заменены последовательностями, высокоспецифичными к выбранному объекту, например, последовательностями гибридомных МКА.



Pages:   || 2 |
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.