авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Двухкомпонентная регуляторная система sak188/sak189 и ее влияние на свойства streptococcus agalactiae

На правах рукописи

РОЖДЕСТВЕНСКАЯ Анастасия Сергеевна ДВУХКОМПОНЕНТНАЯ РЕГУЛЯТОРНАЯ СИСТЕМА SAK188/SAK189 И ЕЕ ВЛИЯНИЕ НА СВОЙСТВА STREPTOCOCCUS AGALACTIAE 03.02.03 – Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо Западного отделения РАМН

Научный консультант: доктор биологических наук Дмитриев Александр Валентинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор Поспелов Валерий Анатольевич

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера"

Защита диссертации состоится "" 2011 г. в _ часов на заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 при НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан ""_ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Нежинская Г.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Streptococcus agalactiae – грамположительный микроорганизм, вызывающий широкий спектр заболеваний, таких как пиелонефрит, артрит, абсцессы, эндокардит, септицемия и др. (Sendi P. et al., 2008). S. agalactiae может приводить к патологии беременности (Larsen J. et al., 2008), вызывать тяжелые формы сепсиса, менингита, пневмонии новорожденных, часто приводящие к летальному исходу (Berardi et al., 2007).

Не менее важное значение S. agalactiae имеет в ветеринарии, поскольку может вызывать хронические маститы у крупного рогатого скота, которые наносят большой экономический ущерб (Keefe G., 1997). При этом многие домашние животные, не только коровы, но и кошки, собаки, лошади, свиньи и др., могут быть бессимптомными носителями S. agalactiae, что обуславливает наличие обширных очагов инфекции.

Использование молекулярно-генетических методов исследования позволяет провести сравнительный анализ штаммов S. agalactiae и предположить потенциальную способность отдельных штаммов вызывать инфекционные процессы в организмах различных хозяев. Так, например, наличие у штамма тех или иных генов патогенности является одной из важных характеристик его потенциальной способности к адгезии, инвазии и подавлению иммунного ответа хозяина. Ряд генов патогенности, таких как cylE, hylB, cfb, scaAВ присутствуют во всех штаммах S. agalactiae, выделенных как от человека, так и от животных. В то же время, каждый из генов bca, bac и scpB присутствует не у всех штаммов (Dmitriev A. et al, 2002).

Штаммы S. agalactiae способны быстро адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, используя различные регуляторные механизмы.

Одним из таких механизмов является регуляция транскрипции генов двухкомпонентными регуляторными системами. Двухкомпонентные системы участвуют в регуляции метаболизма бактерий, включая их способность использовать различные питательные вещества (Gao R. et al., 2009), в регуляции устойчивости к стрессовым воздействиям и действию антибиотиков и др. (Jordan S. et al., 2009). Кроме того, двухкомпонентные регуляторные системы часто контролируют экспрессию генов патогенности, что отражается на взаимодействии микроорганизма и организма хозяина, обеспечивает колонизацию органов и тканей и приводит к патологическим процессам.

Одним из генов патогенности S. agalactiae является ген bac, интенсивно изучаемый отделом молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН в последние годы. При этом ген bac присутствует лишь у отдельной субпопуляции штаммов S. agalactiae, которые характеризуются специфическими рестрикционными паттернами ДНК, риботипами и аллелью гена sak (Дмитриев А. В. с соавт., 2007). Ген bac кодирует белок Вас, способный связывать IgA человека и фактор Н комплемента человека. Вас является перспективным кандидатом в состав вакцинного препарата (Леонтьева Г. Ф. с соавт., 2005;

Грабовская К. Б. с соавт., 2007). Недавно было показано, что ген bac локализован в пределах "островка" патогенности размером 8992 п.н., содержащего семь генов, в том числе гены двухкомпонентной системы sak188 и sak189, кодирующие сенсорную гистидинкиназу Sak188 и ДНК-связывающий белок Sak189 (Dmitriev A. et al., 2006). Учитывая близкое расположение этих генов, логично предположить участие двухкомпонентной системы Sak188/Sak в регуляции транскрипции гена bac и синтеза белка Вас, и, как следствие, в формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae.

Таким образом, актуальность изучения S. agalactiae, его факторов патогенности, а также механизмов их регуляции и формирования вирулентного фенотипа не вызывают сомнений. Имеющиеся данные о двухкомпонентной регуляторной системе Sak188/Sak189, потенциально участвующей в формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae, открывают перспективные направления исследований. Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования Изучение роли двухкомпонентной регуляторной системы Sak188/Sak189 в регуляции метаболизма, транскрипции гена bac и синтеза белка Вас и вирулентности S. agalactiae.



Задачи работы 1. Изучить генетическую гетерогенность штаммов S. agalactiae на основе наличия у них генов патогенности и аллели гена sak192;

выявить штаммы, содержащие ген bac и гены двухкомпонентной регуляторной системы Sak188/Sak189.

2. Инактивировать гены sak188 и sak189 у штамма S. agalactiae и провести сравнительный анализ свойств штамма дикого типа и мутантных штаммов с использованием методов биохимии, микробиологии и молекулярной биологии.

3. В штамме S. agalactiae, мутантном по генам sak188 и sak189, восстановить экспрессию: а) обоих генов sak188 и sak189;

б) только гена sak189;

провести сравнительный анализ полученных штаммов.

4. Выявить штаммы, содержащие неактивные аллели генов sak188 и/или sak189;

восстановить в них экспрессию генов sak188 и sak189 и провести последующий анализ свойств штаммов.

Научная новизна - обнаружены штаммы S. agalactiae, выделенные от коров, содержащие ген bac и другие гены "островка" патогенности, в том числе, гены двухкомпонентной регуляторной системы Sak188/Sak189;

- показано, что штаммы S. agalactiae, выделенные от коров и содержащие ген bac, характеризуются аллелью 1.1 гена sak192;

- методом инсерционного мутагенеза создан штамм S. agalactiae, мутантный по гену sak188, и штамм, мутантный по обоим генам двухкомпонентной регуляторной системы sak188 и sak189;

- выявлено, что одновременная инактивация генов sak188 и sak приводит к значительному снижению уровня транскрипции гена bac (в 17 раз) и к ингибированию синтеза белка Вас in vitro, в то время как инактивация одного гена sak188 методом инсерционного мутагенеза не влияет на уровень транскрипции гена bac и экспрессии белка Вас;

- показано, что одновременная инактивация генов sak188 и sak189 приводит к повышению вирулентности мутантного штамма по сравнению со штаммом дикого типа при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей, а инактивация одного гена sak188 методом инсерционного мутагенеза не влияет на вирулентность S. agalactiae;

- показано, что восстановление под контролем природного промотора полноразмерного гена sak189 в штамме S. agalactiae, мутантном по генам sak и sak189, приводит к активации синтеза белка Вас;

- обнаружен штамм S. agalactiae, содержащий ген bac, но не экспрессирующий белок Вас вследствие точечной делеции гуанина в положении 439 в гене sak189;

- выявлено, что восстановление экспрессии полноразмерных генов sak188 и sak189 в штамме S. agalactiae, содержащем природную неактивную аллель гена sak189 приводит к активации экспрессии белка Вас.

Научно-теоретическая и практическая значимость исследования Показано, что гетерогенность структуры и нуклеотидной последовательности гена sak192 может быть использована в качестве одного из генетических и эпидемиологических маркеров штаммов S. agalactiae, выделенных как от человека, так и от коров. Характеристика штаммов по аллели гена sak192 в дополнение к другим методам исследования позволяет эффективно предсказывать их естественную экологическую нишу.

Полученные результаты необходимы для понимания механизма регуляции транскрипции гена патогенности bac S. agalactiae двухкомпонентной регуляторной системой Sak188/Sak189. Эти данные открывают новое направление исследований по разработке методов направленного воздействия на регуляторные механизмы экспрессии факторов патогенности с целью влияния на вирулентные свойства микроорганизмов.

Фрагменты ДНК, секвенированные в настоящем исследовании, были депонированы в базе данных GenBank под следующими номерами: EU484325 EU484332, FJ890928, HQ840774.

Положения, выносимые на защиту 1. В геномах штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, может присутствовать "островок" патогенности, содержащий ген bac и гены двухкомпонентной регуляторной системы Sak188/Sak189;

штаммы S. agalactiae, выделенные от коров и человека, которые содержат ген bac, характеризуются аллелью 1.1 гена sak192;

2. Инактивация генов sak188 и sak189 в штамме S. agalactiae приводит к уменьшению уровня транскрипции гена bac и экспрессии белка Вас, а также увеличению вирулентности при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей;

3. ДНК-связывающий белок Sak189 необходим для активации синтеза белка Вас;

4. Природная делеция гуанина в положении 439 в гене sak189 приводит к потере функциональной активности белка Sak189 и нарушению синтеза белка Вас.

Личный вклад автора включал самостоятельное формулирование задач работы, проведение большинства исследований, адаптацию ряда методов исследования, а также интерпретацию полученных результатов и их статистическую обработку. Методическая помощь была оказана Mikula I. Jr. при постановке и освоении метода SSCP и к.м.н. Грабовской К.Б., к.б.н. Королевой И.В., Зуткис А.А., Ильясовым Ю.Ю. при работе с лабораторными мышами.





Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 9 научных работах (из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 тезисов) и доложены на 5 международных и всероссийских конференциях: XVIIth Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, г. Порто-Хели, Греция, 2008;

19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, г. Хельсинки, Финляндия, 2009;

XIII Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология – наука XXI века", г. Пущино, 2009;

25th Congress of Czechoslovak Society of Microbiologists, г. С. Лесна, Словакия, 2010;

Всероссийской научной конференции молодых ученых "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия", г. Санкт-Петербург, 2010.

Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН в 2007, 2008 и 2011 гг.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 главы обзора литературы, описание материалов и методов, 4 главы результатов собственных исследований, обсуждение полученных результатов и общее заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 9 таблиц и рисунков, указатель литературы содержит 154 источника, в том числе отечественных и 147 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования В работе использовали 35 штаммов S. agalactiae, выделенных от беременных женщин, 114 штаммов S. agalactiae, выделенных из коровьего молока, и по 3 штамма Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Штаммы были получены из коллекций НИИЭМ СЗО РАМН, Пекинского детского госпиталя (г. Пекин, Китай) и Университета ветеринарной медицины (г. Кошице, Словакия). Штаммы были выделены в различных географических регионах в период с 1989 по 2002 гг.

Штаммы E. coli JM109 и DH5 использовали для амплификации плазмидной ДНК.

Культивирование стрептококков и стафилококков осуществляли в жидкой среде Todd-Hewitt (Hi-Media, Индия) и на 1,5% агаризованных средах при температуре 37°С без перемешивания. Для оценки гемолитической активности штаммов в агаризованную среду добавляли эритроцитарную массу до конечной концентрации 5%. Штаммы E. coli культивировали в бульоне BHI (Gibco, США) при температуре 37°С и перемешивании на качалке роторного типа Sky Line (ELMI, Латвия) или на 1,5% агаризованной среде. Питательные среды готовили в соответствии с прилагаемой к ним инструкцией. Концентрации антибиотических препаратов для культивирования штаммов S. agalactiae и E. coli составили:

эритромицин – 2,5 мкг/мл и 200 мкг/мл соответственно;

спектиномицин мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно;

ампициллин 100 мкг/мл (только для E.

coli).

Реакцию коагглютиации осуществляли с использованием набора для экспресс-диагностики стрептококка группы В (АКВАПАСТ, Россия).

Определение чувствительности штаммов S. agalactiae к эритромицину осуществляли с помощью диско-диффузионного метода.

Динамику роста штаммов оценивали по изменению оптической плотности при длине волны 600 нм в бульоне Todd-Hewitt.

Трансформацию микроорганизмов осуществляли методом электропорации с использованием Gene Pulser Xcell (Bio-Rad Laboratories, США).

Выделение хромосомной ДНК осуществляли методом фенол/хлороформенной экстракции. Выделение плазмидной ДНК из рекомбинантных штаммов E. coli осуществляли с помощью коммерческих наборов "AxyPrep Plasmid Miniprep Kit" и "AxyPrep Plasmid Midiprep Kit" (Axygen, США) согласно инструкции производителя.

Выделение ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью коммерческого набора "AxyPrep DNA Gel Extraction Kit" (Axygen) согласно инструкции производителя.

Амплификацию фрагментов ДНК осуществляли методом ПЦР. При проведении мультиплексной ПЦР в одну и ту же реакционную смесь добавляли праймеры на различные гены. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК осуществляли в 1-1,5% агарозном геле в зависимости от их размеров. В качестве маркеров электрофоретической подвижности использовали препараты "100 bp ladder" и "1 kb ladder" (Медиген, Россия).

Гидролиз ДНК рестриктазами EcoRI, BamHI (Fermentas, Литва) осуществляли согласно протоколу производителя.

Секвенирующую ПЦР проводили с использованием набора "GenomeLab Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" (Beckman Coulter Inc., США) согласно протоколу производителя. Секвенирование осуществляли с использованием секвенатора GenomeLab GeXP Genetic Analysis System (Beckman Coulter Inc., США).

Выделение тотальной клеточной РНК осуществляли с помощью набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, США) согласно протоколу производителя.

Концентрацию РНК оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000.

Количественную ПЦР с обратной транскриптазой проводили на оборудовании ABI Prism 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием набора Power SYBR® Green RNA-to-CTTM 1–Step Kit (Applied Biosystems) согласно протоколу производителя. Уровни транскрипции каждого из анализированных генов нормализовали по отношению к уровням транскрипции гена cpn60.

Для идентификации различных аллелей гена sak192 использовали метод анализа SSCP (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК).

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 10% полиакриамидном геле при 200 В в течение 35 часов. Окрашивание геля осуществляли 0,2% раствором AgNO3 в течение 30 минут в темноте в соответствии с опубликованным протоколом (Bassam B., 1991).

Анализ внутриклеточных и поверхностных белков осуществляли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и методом Western-blot. Для приготовления лизатов осадки клеток суспендировали в физиологическом растворе, смешивали с равным объемом буферного раствора, содержащего 10% -меркаптоэтанола, и кипятили в течение 10 минут.

Для анализа белков с помощью двумерного электрофореза бактериальные культуры в объеме 10 мл выращивали при температуре 37°С в течение пяти часов. После этого клетки осаждали центрифугированием, промывали физиологическим раствором и суспендировали в 150 мкл буферного раствора, содержащего 6М мочевину и 2М тиомочевину в деионизованной воде. По истечении 20 минут клеточные суспензии трижды обрабатывали ультразвуковыми импульсами длительностью 15 сек, после чего инкубировали в течение 30 минут. Клеточные обломки отделяли центрифугированием при об/мин в течение 15 минут. Концентрации белка в полученных растворах измеряли по методу Мэрион Брэдфорд (Bradford M., 1976).

Для изоэлектрофокусировки белков при двумерном электрофорезе использовали стрипы Ready StripTM IPG Strips 7 см, диапазон pH 4-7 (Bio-Rad Laboratories), и изоэлектрофокусировку проводили в камере Protean IEF Cell (Bio Rad Laboratories).

Для оценки вирулентности изучаемых штаммов применяли внутрибрюшинное заражение лабораторных мышей (самцы, 10-12 нед., вес 14- г). Исследуемые штаммы выращивали при 37°С в 40 мл бульона Todd-Hewitt в течение ночи, клетки центрифугировали и отмывали физиологическим раствором. Отмытые клетки ресуспендировали в физиологическом растворе, затем вводили мышам внутрибрюшинно по 0,5 мл микробной суспензии с концентрацией возбудителя 108 КОЕ/животное. Животным контрольной группы вводили по 0,5 мл физиологического раствора. Для каждого исследуемого штамма использовали по 15 мышей. Наблюдение вели в течение 10 дней. Для подтверждения гибели животных от стрептококковой инфекции делали счетные высевы из селезенок.

В работе использовали компьютерные программы и базы данных: Chromas 1.45 (Microsoft) – для анализа нуклеотидных последовательностей, полученных в результате секвенирования;

программное обеспечение BLAST и базу данных GenBank – для сравнительного анализа ДНК;

программное обеспечение BankIt – для депонирования аллелей исследованных генов в базу данных GenBank;

программное обеспечение Expasy translate tool – для транслирования нуклеотидных последовательностей генов;

программное обеспечение Protein BLAST – для сравнительного анализа аминокислотных последовательностей;

программное обеспечение SWISS-MODEL – для моделирования трехмерных структур белковых молекул.

Статистическую обработку данных при построении кривых роста осуществляли с использованием критерия распределения Стьюдента и программного обеспечения Excell (Microsoft). Статистическую достоверность различий в вирулентности штаммов при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей определяли с использованием кривых выживаемости Каплана-Мейера, логарифмического рангового критерия и программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Генетическая гетерогенность штаммов S. agalactiae, выделенных от коров В настоящей работе коллекция штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, была проанализирована на наличие генов патогенности bca, bac и scpB, кодирующих -антиген, белок Вас и С5а пептидазу соответственно. Ген bac, ранее обнаруженный лишь у штаммов, выделенных от человека, был выявлен у (4,4%) из 114 штаммов, выделенных от коров. Гены bca и scpB были обнаружены у 12 (10,5%) и 22 (19,3%) из 114 штаммов соответственно (табл. 1). В целом, у исследованных штаммов было обнаружено 6 различных комбинаций этих трех генов патогенности (табл. 1). Две из них, bac–bca–scpB+ и bac–bca+scpB+, ранее были обнаружены у штаммов, выделенных от человека (Dmitriev A. et al., 2002), а четыре (bac–bca–scpB–, bac–bca+scpB–, bac+bca–scpB+ и bac+bca+scpB–) оказались характерными только для штаммов, выделенных от коров. Самой распространенной у проанализированных штаммов была комбинация генов bac– bca–scpB–. Ею характеризовались 82 (71,9%) из 114 штаммов. В то же время, штаммы, одновременно содержащие три анализируемых гена (bca, bac и scpB), выявлены не были. Возможно, роль белка Вас белка, -антигена и С5а пептидазы в развитии инфекционного процесса или бессимптомной колонизации у коров не столь важна, как у человека, и другие факторы патогенности имеют большее значение для патогенеза заболеваний. В пользу данной гипотезы свидетельствует тот факт, что С5а пептидаза способна инактивировать С5а фракцию комплемента человека, но не у животных (Bohnsack J. et al., 1993).

Таблица 1. Распространенность различных комбинаций генов bac, bca и scpB у штаммов S. agalactiae, выделенных от коров Комбинация генов Количество штаммов патогенности bac – bca – scpB – 82 (71,9%) bac – bca – scpB + * 19 (16,6%) bac – bca + scpB – 6 (5,3%) bac – bca + scpB + * 2 (1,8%) bac + bca – scpB + 1 (0,9%) bac + bca + scpB – 4 (3,5%) Всего штаммов: 114 (100%) Символом "*" отмечены комбинации генов патогенности, обнаруженные ранее у штаммов, выделенных от человека (Dmitriev A. et al., 2002).

Кроме наличия генов патогенности у исследуемых штаммов были проанализированы нуклеотидные последовательности гена sak192. Ранее этот ген был использован в качестве маркера для внутривидовой дифференциации штаммов, выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соавт., 2006). В данной работе у штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, структурная организация гена sak192 (рис. 1) в целом оказалась аналогичной таковой у штаммов, выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соавт., 2006). У всех штаммов размер фрагмента гена в области 5'-конца составил 93 п.н. Фрагмент гена в области 3' конца у 108 из 114 штаммов представлял собой идентичную последовательность размером 34 п.н., а у 6 из 114 штаммов – размером 40 п.н. (рис. 1).

Внутренняя область гена оказалась наиболее вариабельной. Ее размер у различных штаммов зависел от количества правильно чередующихся прямых повторов размером 16 п.н. и спейсерных последовательностей размером 44 п.н.

Нуклеотидные последовательности прямых повторов были, в основном, идентичны, тогда как спейсерные участки отличались гетерогенностью и могли содержать от 2 до 6 точечных нуклеотидных замен. В частности, была выявлена неизвестная ранее спейсерная область, условно обозначенная номером 11. В целом, с учетом гетерогенности структуры гена sak192, у 114 штаммов S.

agalactiae, выделенных от коров, было обнаружено 8 различных аллелей гена (рис. 1).

– 93 п.н. фрагменты гена в области 5’-конца, выделенные черным цветом, отличаются одной нуклеотидной заменой от таковых, выделенных серым цветом;

– фрагмент гена в области 3’-конца, отмеченный символом "", содержит делецию одного нуклеотида и изменение рамки считывания;

– незаштрихованными и черными стрелками обозначены прямые повторы;

– незаштрихованными прямоугольниками обозначены спейсерные области;

порядковые номера над ними соответствуют различным спейсерам и присвоены согласно (Дмитриев А. В. с соавт., 2006);

– символом "*" отмечены аллели гена sak192, обнаруженные ранее у штаммов, выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соавт., 2006).

Рисунок 1. Полиморфизм гена sak192 у штаммов S. agalactiae, выделенных от коров Три из восьми аллелей гена sak192 (аллели 1.1, 1.3 и 3.1), обнаруженные у коровьих штаммов, ранее были обнаружены и у штаммов, выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соавт., 2006). В то же время у 44 (38,6%) из штаммов, выделенных от коров, были выявлены аллели 1.5, 1.6, 2.3, 3.3 и 5.2, не обнаруженные у штаммов, выделенных от человека. Таким образом, полиморфизм гена sak192 в ряде случаев может быть использован для установления естественной экологической ниши штамма.

При комплексном анализе аллели гена sak192 и наличия генов патогенности у 114 штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, было обнаружено 16 различных генетических вариантов (табл. 2). Наиболее распространенные генетические варианты S. agalactiae не содержали гены bac, bca, scpB и характеризовались аллелями 3.1, 1.3 и 5.2 гена sak192. К ним принадлежало 28 (24,6%), 20 (17,5%) и 16 (14,0%) из 114 проанализированных штаммов соответственно. Три генетических варианта (№№ 8, 9 и 14) были обнаружены ранее у штаммов, выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соавт., 2006;

Dmitriev A. et al., 2002), но большая часть штаммов, а именно, 100 (87,7%) из 114, проанализированных в рамках настоящего исследования, характеризовалась генетическими вариантами, не выявленными ранее. К их числу относились и штаммы, содержащие ген bac. Все они, как и изученные ранее штаммы, содержащие ген bac, характеризовались аллелью 1.1 гена sak192, однако обладали комбинациями генов патогенности (bac+bca–scpB+ и bac+bca+scpB–), отличными от таковой для bac+ штаммов, выделенных от человека (bac+bca+ scpB+) (Dmitriev A. et al., 2002). Эти данные согласуются с результатами сравнительного анализа штаммов S. agalactiae с использованием других методов (Dmitriev A. et al., 1999;

Dogan B. et al., 2005;

Manning S. et al., 2010;

Martinez G. et al., 2000;

Oliveira I. et al., 2006;

Sukhnanand S. et al., 2005) свидетельствующими о значительных отличиях между штаммами, выделенными от разных хозяев.

Таблица 2. Распространенность генетических вариантов штаммов S. agalactiae, выделенных от коров Наличие генов Генетический Аллель Количество патогенности вариант гена sak192 штаммов bac bca scpB №1 1.3 №2 1.5 №3 1.6 – – – №4 2.3 №5 3.1 №6 3.3 №7 5.2 №8* 1.3 – – + №9* 3.1 № 10 2.3 № 11 1.3 – + – № 12 2.3 № 13 3.1 № 14 * – + + 1.3 № 15 + – + 1.1 № 16 + + – 1.1 Всего штаммов: Символы "–" и "+" обозначают отсутствие или наличие гена соответственно;

символом "*" отмечены генетические варианты, обнаруженные ранее у штаммов, выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соавт., 2006;

Dmitriev A. et al., 2002).

Таким образом, предложенный комплексный анализ штаммов на основе наличия генов патогенности и аллели гена sak192 может быть использован в качестве одного из методов дифференциации штаммов, различающихся по экологической нише, степени филогенетического родства и вирулентности.

Роль двухкомпонентной регуляторной системы Sak188/Sak189 в метаболизме, синтезе белка Вас и проявлении S. agalactiae вирулентных свойств Как было показано ранее, ген bac локализован на "островке" патогенности, который содержит семь генов, в том числе гены сенсорной гистидинкиназы sak188 и ДНК-связывающего белка sak189 (Dmitriev A. et al., 2006). В рамках настоящего исследования для изучения возможной роли двухкомпонентной системы Sak188/Sak189 в регуляции транскрипции генов и проявлении вирулентных свойств гены sak188 и sak189 были инактивированы у штамма S.

agalactiae 168/00 методом инсерционного мутагенеза. С этой целью фрагменты соответствующих генов клонировали с помощью вектора pVA891-2, содержащего ген устойчивости к эритромицину и неспособного к репликации в грамположительных кокках, в результате чего получили две рекомбинантные плазмиды, обозначенные как pHK и pRR. Интеграция каждой из плазмид в геномную ДНК штамма 168/00 приводила к нарушению целостности нуклеотидных последовательностей генов sak188 (плазмида pHK) и sak (плазмида pRR) и изменению первичных структур соответствующих белков (рис.

2).

EmR – ген устойчивости к эритромицину;

P – промотор Рисунок 2. Инактивация гена sak189 методом инсерционного мутагенеза.

Инактивацию гена sak188 осуществляли аналогичным образом Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей гистидинкиназы и ДНК-связывающего белка в штамме 168/00 и соответствующих белков, потенциально экспрессируемых мутантными штаммами, выявил значительные различия в структурах белковых молекул. В частности, в мутантных штаммах произошла замена 95 а.к. на С-конце гистидинкиназы Sak188 на 191 а.к., а 51 а.к. на C-конце ДНК-связывающего белка Sak189 – на 15 а.к. Дальнейший анализ и моделирование трехмерных структур белковых молекул показали, что в штамме, мутантном по гену sak188, были утрачены сайты связывания АТФ и Mg2+ в белке Sak188, а в штамме, мутантном по гену sak189, – домен белка Sak189, ответственный за связывание с ДНК.

Как известно, без участия АТФ и ионов Mg2+ молекула сенсорной гистидинкиназы не способна к фосфорилированию. В то же время, ДНК связывающий белок-регулятор ответа при отсутствии в нем эффекторного домена не обладает возможностью взаимодействовать с промоторными областями ДНК и влиять на уровни транскрипции генов (Bourett R., 2010;

Gao R. et al., 2007, 2010;

Stock A. et al., 2000). Вышеизложенное позволило предположить наличие изменений в функциональных активностях белков Sak188 и Sak189.

Использование метода инсерционного мутагенеза для инактивации гена sak189 привело не только к существенным изменениям в нуклеотидной последовательности этого гена, но и к значительному удалению гена sak188 от промотора (рис. 2). По данным, опубликованным в литературе, интеграция плазмиды между промотором и геном сенсорной гистидинкиназы вызывает нарушение транскрипции этого гена, что используют для получения мутантов, не экспрессирующих гистидинкиназу (Sugareva V. et al., 2010;

Zhuo Ma et al., 2007).

Таким образом, инактивация гена sak189 методом инсерционного мутагенеза приводит к получению двойного мутанта по генам sak188 и sak189.

Сравнительный анализ морфологических и культуральных свойств штамма дикого типа 168/00 и штаммов, мутантных по генам sak188 и sak188/sak189, не выявил существенных различий в форме и размере клеток и колоний.

Помимо морфологических и культуральных свойств штамма 168/00 и штаммов, мутантных по генам sak188 и sak188/sak189, была изучена экспрессия внутриклеточных и поверхностных белков в этих штаммах. Сравнительный анализ клеточных лизатов перечисленных штаммов методами SDS электрофореза, двумерного электрофореза и Western-blot выявил различия в экспрессии белка весом около 150 кДа, который по способности связывать IgA человека был идентифицирован как белок Вас. Соответствующий этому белку бэнд присутствовал в клеточных лизатах штамма 168/00 и штамма, мутантного по гену sak188, но отсутствовал в клеточном лизате штамма, мутантного по обоим генам sak188 и sak189 (рис. 3, 4). Таким образом, инактивация гена sak не оказала влияния на уровень экспрессии белка Вас, а инактивация обоих генов sak188 и sak189 привела к ингибированию его синтеза. Полученные данные позволяют предположить, что ДНК-связывающий белок Sak189 играет ключевую роль в регуляции синтеза белка Вас.

1, 4 –штамм 168/00 после двух и пяти часов роста соответственно;

2, 5 – штамм 168/00 sak188 после двух и пяти часов роста соответственно;

3,6 – штамм 168/00 sak188/sak189 после двух и пяти часов роста соответственно;

7 – маркер молекулярного веса.

Рисунок 3. Сравнительный анализ экспрессии внутриклеточных и поверхностных белков штаммов методами SDS-электрофореза (А) и Western-blot с IgA человека, меченными пероксидазой хрена (Б) Слева расположен маркер молекулярного веса Рисунок 4. Сравнительный анализ экспрессии внутриклеточных и поверхностных белков методом двумерного электрофореза Использование метода количественной ПЦР в режиме реального времени позволило выявить, что уровень транскрипции гена bac в штамме, мутантном по гену sak188, незначительно отличался от такового в штамме 168/00. В то же время, уровень транскрипции гена bac в штамме, мутантном по генам sak188 и sak189, оказался примерно в 17 раз ниже, чем в штамме 168/00. Таким образом, регуляция экспрессии белка Вас осуществляется на уровне транскрипции.

Для дальнейшего анализа роли регуляторной системы Sak188/Sak189 в активации синтеза белка Вас была исследована коллекция из 40 штаммов S.

agalactiae, содержащих ген bac, методами SDS-электрофореза и Western-blot. В основу этого анализа легло предположение, что штаммы, содержащие ген bac, но не экспрессирующие белок Вас, могли обладать неактивными аллелями генов sak188 и/или sak189. В результате исследования среди 40 штаммов был выявлен штамм A49V, не экспрессирующий белок Вас. При этом в гене sak189 была обнаружена делеция одного нуклеотида (соответствующего 439-му нуклеотиду в гене sak189 штамма 168/00), которая привела к изменению открытой рамки считывания и нарушению аминокислотной последовательности белка Sak189.

Так, согласно компьютерному анализу, в результате делеции произошла замена 72 а.к. на С-конце ДНК-связывающего белка Sak189 на 10 а.к., при этом были утрачены все 9 а.к., обеспечивающих связывание ДНК. Сравнительный анализ третичных структур белка Sak189 в штаммах 168/00 и A49V выявил отсутствие ДНК-связывающего домена в белке Sak189 в штамме A49V (рис. 5).

Рисунок 5. Модели третичных структур белков Sak штамма 168/00 (А) и штамма A49V (Б) Для того, чтобы доказать, что ингибирование экспрессии белка Вас в штамме 168/00, мутантном по генам sak188 и sak189, и в штамме дикого типа A49V вызвано нарушением функциональной активности двухкомпонентной регуляторной системы Sak188/Sak189, экспрессия обоих генов sak188 и sak была восстановлена в этих штаммах. Для этого на основе вектора pAT29, содержащего ген устойчивости к спектиномицину и способного к автономной репликации в грамположительных кокках, сконструировали рекомбинантную плазмиду pBgrRS(P), содержащую гены sak188 и sak189 под контролем природного промотора.

Трансформация штамма 168/00, мутантного по генам sak188 и sak189, и штамма A49V рекомбинантной плазмидой pBgrRS(P) привела к восстановлению экспрессии белка Вас в обоих штаммах. Полученный результат убедительно доказывает участие двухкомпонентной регуляторной системы Sak188/Sak189 в активации экспрессии белка Вас.

Для подтверждения ключевой роли ДНК-связывающего белка Sak189 в активации синтеза белка Вас, дополнительно осуществили восстановление экспрессии одного лишь гена sak189 в штамме 168/00, мутантном по генам sak188 и sak189. Для этого использовали сконструированную на основе вектора pAT29 рекомбинантную плазмиду pRfull(P), содержащую полноразмерный ген sak189 под контролем природного промотора. Сравнительный анализ штамма 168/00, штамма, мутантного по генам sak188 и sak189, и штамма, мутантного по генам sak188 и sak189, содержащего рекомбинантную плазмиду pRfull(P), методом SDS-электрофореза показал, что восстановление экспрессии ДНК связывающего белка Sak189 привело к активации синтеза белка Вас (рис. 6).

Таким образом, проведенные эксперименты продемонстрировали, что двухкомпонентная система Sak188/Sak189 участвует в регуляции транскрипции гена bac и синтеза белка Вас, при этом именно экспрессия ДНК-связывающего белка Sak189 при данных условиях является необходимой.

1 2 3 4 1 – маркер молекулярного веса;

2 –штамм 168/00;

3 – штамм 168/00 sak188/sak189;

4 - штамм 168/00 sak188/sak189 с восстановленными генами sak188 и sak189;

5 – штамм 168/00 sak188/sak189 с восстановленным геном sak189.

Рисунок 6. Сравнительный анализ экспрессии внутриклеточных и поверхностных белков методом SDS-электрофореза Сравнительный анализ вирулентных свойств штамма S. agalactiae 168/00 и штаммов, мутантных по генам sak188 и sak188/sak Для того чтобы выяснить, оказывает ли влияние двухкомпонентная система Sak188/Sak189 на вирулентные свойства штамма S. agalactiae 168/00 in vivo, в рамках настоящего исследования было применено моделирование стрептококковой инфекции на лабораторных мышах. Суспензии штамма 168/00 и мутантных штаммов с концентрацией возбудителя 108 КОЕ/животное вводили внутрибрюшинно. Контрольной группе животных осуществляли инъекцию физиологического раствора. Наблюдения вели в течение 10 дней после заражения. Анализ динамики гибели мышей показал, что заражение штаммом, мутантным по генам sak188 и sak189, привело к гибели 87% животных, что существенно больше, чем для штамма 168/00 (47% животных) и штамма, мутантного по гену sak188 (52% животных) (рис. 7). Таким образом, инактивация генов двухкомпонентной системы Sak188/Sak189 привела к повышению вирулентных свойств штамма при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей.

Рисунок 7. Динамика гибели лабораторных мышей при заражении штаммом 168/00 и мутантными штаммами Этот результат, на первый взгляд, противоречит полученным ранее данным о том, что инактивация генов sak188 и sak189 приводит к уменьшению уровня транскрипции гена bac и синтеза белка Вас – признанного фактора патогенности S. agalactiae. Однако известно, что наличие белка Вас коррелирует с возникновением иммунологической толерантности, предоставляющей возможность S. agalactiae длительно персистировать в организме хозяина и не вызывать выраженный иммунный ответ. При этом, внутрибрюшинное заражение мышей позволяет оценить вирулентность штамма при инвазивном пути инфекционного процесса, поскольку перед возбудителем отсутствуют естественные защитные барьеры, такие как кожные покровы или слизистые, нормальная микрофлора и др. Таким образом, вполне логичным представляется, что ингибирование синтеза белка Вас, способствующего бессимптомной колонизации S. agalactiae в организме хозяина, привело к повышению вирулентности при инвазивном пути развития инфекции.

Следует отметить, что S. agalactiae обладает большим количеством факторов патогенности, транскрипцию которых регулируют ДНК-связывающие белки. Существует высокая вероятность того, что двухкомпонентная система Sak188/Sak189 участвует в активации транскрипции и других генов, участвующих в формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae. Полный набор генов, транскрипцию которых регулирует система Sak188/Sak189, может быть выявлен при использовании микрочиповой технологии, что является одним из основных направлений дальнейших исследований.

Таким образом, результаты проведенного исследования убедительно доказывают, что двухкомпонентная регуляторная система Sak188/Sak контролирует экспрессию белка Вас и проявление вирулентных свойств S.

agalactiae in vivo.

Выводы 1. Штаммы S. agalactiae, выделенные от коров, могут содержать ген bac и гены двухкомпонентной регуляторной системы Sak188/Sak189;

аллель 1.1 гена sak192 является генетическим маркером штаммов S. agalactiae с геном bac, выделенных как от человека, так и от коров.

2. ДНК-связывающий белок Sak189 участвует в активации синтеза белка Вас;

регуляция экспрессии белка Вас осуществляется на уровне транскрипции.

3. Двухкомпонентная регуляторная система Sak188/Sak189 контролирует проявление вирулентных свойств S. agalactiae in vivo;

инактивация генов sak188 и sak189 приводит к повышению вирулентности штамма при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей.

4. Природная делеция гуанина в положении 439 в гене sak189 приводит к потере функциональной активности белка Sak189 и ингибированию синтеза белка Вас.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи:

1. Рождественская А.С., M. Bhide, I. Mikula, I. Mikula Jr., А.В. Дмитриев.

Использование полиморфизма гена sak0192 Streptococcus agalactiae в качестве молекулярно-эпидемиологического маркера // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. – №5. – С. 38-43.

2. Дмитриев А.В., Рождественская А.С., Зуткис А.А., Тотолян А.А.

Направленная регуляция патогенных свойств стрептококков // Мед. Акад.

Журнал. – 2009. – №9(4). – С. 50-58.

3. Rozhdestvenskaya A.S., Totolian A.A., Dmitriev A.V. Inactivation of DNA binding response regulator Sak189 abrogates beta-antigen expression and affects virulence of Streptococcus agalactiae // PLoS ONE. – 2010. – №5(4). – e10212.

Тезисы:

1. Rozhdestvenskaya A.S., A.V. Dmitriev, M. Bhide, I. Mikula, I. Mikula Jr.

Structural and sequence polymorphism of sak0192 gene of bovine Streptococcus agalactiae strains as molecular epidemiological marker // Abstracts of XVIIth Lancefield Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Porto-Heli, Greece. – 2008. – Р. 222.

2. Рождественская А.С. Влияние ДНК-связывающего белка Sak189 на транскрипцию генов, метаболизм и вирулентность Streptococcus agalactiae // Аннотации работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга 2008 года для студентов, аспирантов, молодых ученых и молодых кандидатов наук. – 2008. – С.

46.

3. Rozhdestvenskaya A., Yu. Ilyasov, I. Mikula, M. Bhide, A. Totolian, A.

Dmitriev. Inactivation of DNA-binding response regulator Sak189 abrogates beta antigen expression and affects virulence of Streptococcus agalactiae // Abstracts of 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Helsinki, Finland. – 2009. – P. 1843.

4. Рождественская А.С., Дмитриев А.В. Инактивация ДНК-связывающего белка Sak189 Streptococcus agalactiae ингибирует экспрессию белка Вас // Тезисы 13 международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология – наука XXI века", г. Пущино. – 2009. – С. 41-42.

5. Zutkis A., Rozhdestvenskaya A., Srivishnupriya A., Chaussee M., Dmitriev A. Transcriptional regulation in Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae //

Abstract

of 25th Congress of Czechoslovak Society of Micobiologists. –2010. – P. 27.

6. Рождественская А.С. Роль двухкомпонентной регуляторной системы BgrRS в синтезе белка Вас и контроле вирулентных свойств Streptococcus agalactiae // Мед. Акад. Журнал. – 2010. – №10(5). – с. 91.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.