авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 ||

Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений

-- [ Страница 2 ] --

Современная схема семеноводства, принятая в РФ, предусматривает обязательную сертификацию оригинального, элитного и репродукционного семенного картофеля с использованием метода ИФА (Анисимов и др., 2005). Лабораторное тестирование в целях сертификации возложено на испытательные лаборатории, специально созданные для этой работы и аккредитованные в Системе сертификации семян Минсельхоза РФ. Результаты анализа зараженности семенного картофеля вирусами и вироидом оформляются в виде протокола испытаний, на основании которого органы Государственной семенной инспекции принимают решение о включении проанализированной партии семян в тот или иной класс.

Одна из таких испытательных лабораторий по вирусным и вироидным болезням была создана в 2001 году в составе ЗАО «НВО Иммунотех» МГУ имени М.В.Ломоносова (аттестат аккредитации в Системе сертификации семян Минсельхоза РФ № РоссRUS ПС01.6.1.1121). В этой лаборатории в течение 2001 – 2008 годов с помощью созданных нами диагностических тест-систем ИФА было выполнено, в целях сертификации, свыше 7 тысяч анализов зараженности семенного картофеля различных репродукций и пробирочных растений картофеля вирусами Х, S, M, A, Y и скручивания листьев картофеля. Крупнейшими заказчиками являлись такие производители безвирусных семян картофеля, как ООО «Дока Генные технологии» (г. Зеленоград), ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г.Лорха РАСХН (Московская обл.), ООО «Русская снековая компания» (Московская обл.), ОАО «Агросервис» (г. Кашира), Зональный НИИ сельского хозяйства Северо-Востока им. Н.В.Рудницкого РАСХН (г. Киров), Удмуртский государственный НИИ сельского хозяйства (Удмуртская Республика), Уральский НИИ сельского хозяйства РАСХН (г. Екатеринбург), ООО «Агрофирма КРиММ» (г. Тюмень), и другие.

Процесс оздоровления растений от вирусов и вироида и размножение оздоровленных растений предполагает постоянный мониторинг вирусных инфекций с использованием различных методов диагностики. Мониторинг осуществляется производителями семенного картофеля, и для его обеспечения на базе ЗАО «НВО Иммунотех» было развернуто производство наборов для диагностики вирусов. В течение 2001 – 2008 годов в ЗАО «НВО Иммунотех» на основе наших разработок были произведены и реализованы наборы для иммуноферментного определения вирусов картофеля, общим количеством свыше 5 тысяч анализов. Кроме того, для обеспечения нужд Федеральной службы карантина растений налажено производство наборов для иммуноферментного определения ВШС. Основными потребителями наборов являлись ООО «Химмед» (г. Москва), Белорусский НИИ картофелеводства (г. Минск), «Всероссийский центр карантина растений» (Московская обл.).

В течение 1998 – 2000 годов наборы для лабораторной диагностики ХВК, SВК, MВК, YВК, AВК и ВСЛК методом ИФА были использованы для контроля качества семенного картофеля в ООО «ЭТК Меристемные культуры» (Ставропольский край) – ведущем предприятии по производству семенного картофеля на юге России. С помощью этих наборов было проанализировано свыше 10 тыс. растений картофеля с. Волжанин различных репродукций: оздоровленных пробирочных растений, семенных клубней, выращенных в гидропонных теплицах, и семенного картофеля категории супер-суперэлита и суперэлита, выращенного в поле. Результатом систематического мониторинга вирусных инфекций явилось оздоровление сорта от вирусных заболеваний.

Диагностика вирусных инфекций плодовых и ягодных культур для получения безвирусного посадочного материала.

Технология производства безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур в РФ предполагает применение методов лабораторной диагностики вирусных инфекций на всех стадиях технологического процесса (Кашин, 2001).

С этой целью в 1992 – 2002 годах изготовленные нами наборы для лабораторной диагностики ВКПМ, ВМА, ВЧКПТ, ЛВКПЗ и ВТМ методом ИФА регулярно использовали при мониторинге вирусных инфекций в насаждениях плодовых и ягодных культур во Всероссийском НИИ садоводства им. И.В.Мичурина (ВНИИС). С помощью этих наборов было определено фитосанитарное состояние свыше 8 тыс. сортообразцов яблони, вишни, малины, смородины, земляники, крыжовника из коллекционных и опытных насаждений ВНИИС, базовых питомников, сортоиспытательных участков и промышленных насаждений.

В результате этой работы во ВНИИС и в базовых плодопитомниках Тамбовской, Липецкой и Саратовской областей на площади 16,8 га были заложены базисные маточно-черенковые сады для производства посадочного материала высших категорий качества.

Определение фитосанитарного статуса коллекционных насаждений плодовых и ягодных культур имеет первостепенное значение для эффективности всей последующей работы по производству безвирусного посадочного материала. С этой целью в течение 1995 – годов было проведено обследование коллекционных насаждений косточковых культур в европейской части России в отношении их зараженности, в частности, ВКПМ, ВЧКПТ, ЛВКПЗ и ВШС, для диагностики которых применяли разработанные нами тест-системы на основе ИФА. В результате проведенной работы установлена высокая зараженность комплексом вредоносных вирусов основного и перспективного сортимента сливы, вишни и других косточковых культур. Основными источниками распространения вирусов являются селекционные коллекции и сортоиспытательные участки, широко используемые для заготовки черенков для питомников (Приходько и др., 2008).

В течение 2007 – 2008 годов было проведено изучение распространенности ВШС в коллекционных и коммерческих насаждениях косточковых культур в АР Крым, Украина. С помощью наборов для иммуноферментного определения ВШС проведено свыше анализов зараженности этим вирусом насаждений персика, сливы, алычи и абрикоса на территории Никитского ботанического сада, промышленных насаждений косточковых культур в Бахчисарайском, Севастопольском и Джанкойском районе АР Крым, а также дикорастущей флоры. В результате проведенных анализов было впервые доказано наличие ВШС в насаждениях косточковых плодовых культур на Южном берегу, в предгорной и степной зонах Крыма и выяснены некоторые пути интродукции вируса в регион.

Применение тест-системы для диагностики ВШС в карантинных исследованиях.

Поскольку ВШС является карантинным объектом (Приказ Минсельхоза России от декабря 2007 г. № 673 «Об утверждении перечня карантинных объектов»), по инициативе Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ были начаты систематические инспекции зараженности фруктовых садов, питомников и коллекционных насаждений этим вирусом. Целью работы, проводимой Всероссийским центром карантина растений, является изучение распространенности ВШС в основных регионах возделывания косточковых культур на европейской территории России для выявления и ликвидации существующих очагов инфекции и предотвращения дальнейшего распространения ВШС при размножении зараженного материала. В этих исследованиях используют разработанные нами наборы Пиротест-ИФА для иммуноферментного определения ВШС.

В 2007 – 2008 годах был проведен ряд обследований насаждений косточковых культур в Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской, Волгоградской, Липецкой, Тамбовской, Воронежской, Белгородской, Курской и Орловской областях на общей площади 254 га. В 24 коммерческих и экспериментальных садах, 5 коллекциях и 8 питомниках был собран 481 образец листьев с деревьев сливы, алычи, персика, абрикоса, вишни и черешни с симптомами, напоминающими шарку. Каждый образец анализировали методом ИФА с помощью 3 тест-систем: Пиротест-ИФА («НВО Иммунотех»), «Adgen» (Neogen Europe Ltd ADGEN Pytodiagnostics) и DASI-ELISA («Agritest», Италия), основанного на использовании универсальных моноклональных антител, распознающих все известные штаммы ВШС.

В результате анализа ВШС был выявлен в 71 образце. Все три варианта ИФА выявляли одни и те же зараженные деревья. Таким образом, доля зараженных растений составила, в среднем, 14,8%. В южных регионах России эта доля составила 26,1%, в то время как в Центральном и Центрально-Черноземном регионе около 6,5%. При этом следует отметить, что в центральной России было проанализировано вчетверо больше деревьев на единицу площади, чем на юге. Значительно более высокий уровень инфекции в южных регионах обусловлен, по всей вероятности, интродукцией вируса с зараженным посадочным материалом, импортированным на рубеже 80-х – 90-х годов из бывшей Югославии, а также быстрым распространением вируса тлей из-за большой плотности насаждений. Этот вывод указывает на необходимость усиления карантинного контроля посадочного материала. В центральной России, где для закладки насаждений используют зимостойкие сорта местной селекции, основным источником вируса являлся зараженный коллекционный материал.

В этой работе нами была впервые предпринята попытка идентифицировать штаммы ВШС, присутствующие в России. Для их идентификации использовали наборы DASI-ELISA («Agritest», Италия), основанные на использовании моноклональных антител, специфичных к штаммам D, M, C и EA. Обнаружено, что почти 60% положительных образцов заражены штаммом D. Наиболее вредоносный штамм М, который эффективно распространяется тлей и рассматривается как эпидемическая форма вируса, выявлен в 24% образцов, в основном на юге России. В ряде образцов, однозначно положительных по результатам всех трех вариантов ИФА, штамм вируса идентифицировать не удалось.

Диагностика вирусных инфекций цветочно-декоративных культур для получения безвирусного посадочного материала.

АБВ-тест был использован для массовой диагностики ВКГ в меристемной лаборатории агрофирмы «Колхоз им. С.М.Кирова» (Московская обл.) при промышленном получении и размножении оздоровленного посадочного материала ремонтантной гвоздики. С помощью АБВ-теста было проанализировано свыше 10 тысяч растений гвоздики различных репродукций. Это позволило отказаться от менее производительного и несравнимо более затратного биотеста на растениях-индикаторах для выявления ВКГ в меристемных растениях гвоздики и осуществлять диагностику ВКГ в осеннее-зимний период, когда концентрация вируса в растениях существенно снижалась по сравнению с весенне-летним периодом.

В 2000 – 2001 году в ООО «ЭТК Меристемные культуры» с помощью наборов для диагностики ВКГ методом ИФА было проанализировано свыше 2 тысяч меристемных растений гвоздики. Результатом этой работы явилось оздоровление маточника нескольких сортов гвоздики от вируса крапчатости.

Таким образом, разработанные тест-системы для диагностики вирусных инфекций растений с помощью ИФА и АБВ-теста были широко использованы государственной службой сертификации семян РФ, производителями безвирусного посадочного материала в России, Белоруссии и на Украине для контроля качества и производства безвирусного посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур и государственной службой карантина растений РФ для диагностики карантинного вируса шарки сливы.

IV. Индукция у растений устойчивости к заражению вирусами.

Возделывание устойчивых к вирусам растений существенно снижает потери от вирусных заболеваний. Один из подходов к созданию устойчивости основан на стимуляции защитных механизмов растения с помощью элиситоров. Биогенные элиситоры олигосахаридной природы (-1,3-глюканы, фрагменты хитина и хитозана, галактурониды, ксилоглюканы) – важнейшие сигнальные молекулы у растений. Возникая in vivo при деструкции клеточных стенок, они индуцируют экспрессию защитных генов и запускают каскад местных и системных реакций, препятствующих дальнейшему размножению фитопатогена (Ryan, 1988;

Shibuya & Minami, 2001).

Одним из самых известных элиситоров является хитозан (-1,4-поли-D-глюкозамин), который обычно получают деацетилированием хитина ракообразных в щелочных условиях (рис. 21).

.

Рис. 21. Структура полностью деацетилированного хитозана.

Поскольку реакция N-деацетилирования сопровождается одновременным разрывом гликозидных связей полимера, хитозан, полученный химическим путем, представляет собой полидисперсный по молекулярной массе гетерополимер N-ацетилглюкозамина и глюкозамина, содержащий обычно 5 – 15% 2-ацетамидных групп.

В нашей лаборатории было впервые обнаружено, что обработка листьев фасоли раствором хитозана приводит к уменьшению количества местных некрозов, развивающихся после механического заражения листьев ВМЛ. Этот факт свидетельствовал об ингибировании хитозаном вирусной инфекции, поэтому было проведено детальное исследование данного явления с использованием различных видов растений, вирусов и молекулярных форм хитозана. В этой работе были использованы разработанные нами тест-системы для диагностики вирусов методом ИФА.

В большинстве экспериментов использовали высокомолекулярный хитозан с мол.

массой 120 кДа и степенью ацетилирования 30%, полученный из панциря криля (Sea Fishering Institute, Гдыня, Польша). Хитозан растворяли в 0,05% уксусной кислоте на магнитной мешалке и доводили рН раствора до 6,0 с помощью 0,1 М КOH. Листья опрыскивали раствором хитозана до или после инокуляции один или несколько раз в зависимости от цели эксперимента. Для заражения растений использовали очищенный вирусный препарат или экстракт из зараженных растений. Дозу инокулюма подбирали заранее таким образом, чтобы на листьях контрольных растений получать 50 – 75 местных некрозов на половине листа, или использовали инокулюм с концентрацией вируса 30 – мкг/мл, определенной ИФА. На половину листа наносили 20 - 30 мкл инокулюма.

Характеристика противовирусной устойчивости, индуцированной хитозаном.

Результаты проведенных исследований подытожены в таблице 4 и сводятся к следующему: (1) Хитозан ингибирует образование местных некрозов при заражении некротического хозяина данного вируса;

(2) Хитозан ингибирует системную инфекцию.

Подавление размножения вируса в инокулированном листе (обработанном хитозаном) приводит к замедлению или отсутствию системного распространения вируса;

(3) Протективный эффект хитозана неспецифичен в отношении вида вируса. Хитозан индуцирует устойчивость у ряда экспериментальных растений к заражению различными РНК- и ДНК-содержащими вирусами и ВВКК;

(4) Противовирусная активность хитозана опосредована его влиянием на растение, поэтому степень подавления инфекции зависит от вида растения. Из исследованных нами растений максимальной восприимчивостью к хитозану обладали бобовые растения. У представителя семейства крестоцветных Brassica campestris (с. Just Right) устойчивость к заражению каулимовирусом мозаики цветной капусты, потивирусу мозаики турнепса и комовирусу мозаики редиса индуцировать не удалось: системная инфекция в обработанных хитозаном растениях развивалась так же, как и в необработанных;

(5) Протективный эффект хитозана зависит от его концентрации. Как правило, использовали раствор хитозана в концентрации 1 мг/мл или более низкие концентрации.

Таблица 4.

Противовирусная активность хитозана в растениях Вирус1) Растение Тип Cтепень инфекции 2) ингибирования 3) Фасоль Phaseolus vulgaris ВМЛ с/мн ++++ ВЗМФ с ++++ ВКА с ++++ ВММФ с ++++ ВТМ мн ++++ ВНТ мн ++++ Горох Pisum sativum ВМЛ с ++++ ВКА с ++++ Табак Nicotiana tabacum Самсун NN ВТМ мн +++ ВМЛ мн ++ Табак Nicotiana tabacum Самсун nn ВТМ с ++ Табак Nicotiana tabacum Ксанти nc ВТМ мн ++ Табак Nicotiana glutinosa ВТМ мн ++ Табак Nicotiana paniculatа ВКА мн ++ Томаты Lycopersicon esculentum ВТМ с +++ ХВК с +++ ВВКК с +++ Картофель Solanum tuberosum ХВК с +++ YВК с +++ Лебеда Chenopodium quinoa ВНТ мн ++ ВОМ мн +++ Лебеда Сhenopodium amaranticolor ВТМ мн +++ ВМЛ мн +++ Дурман Datura stramonium ВМН с +++ ВТМ мн +++ 1) сокращения в тексте;

2) «с» - системная инфекция;

«мн» - местные некрозы;

3) при обработке хитозаном (1мг/мл) за сутки до инокуляции: «++» - 25 – 50%;

«+++» - 50 – 75%;

«++++» - 75 – 100%;

Изоляты альфамовируса мозаики люцерны (ВМЛ), комовируса карликовости арахиса (ВКА) и ВВКК предоставлены H.Pospieszny;

геминивирус золотистой мозаики фасоли (ВЗМФ) - F. Morales (Morales & Niessen, 1988);

Рекомбинантная плазмида, содержащая полногеномную копию ДНК каулимовируса мозаики норичниковых (ВМН, figwort mosaic virus) была предоставлена R.J.Shepherd (Shepherd et al., 1987). Инфекционную ДНК вируса, полученную рестрикцией плазмиды по сайту SacI, использовали для механической инокуляции растений дурмана Datura stramonium.

Роль структуры в противовирусной активности хитозана.

Хитозан представляет собой сополимер глюкозамина и N-ацетилглюкозамина и в кислой среде обладает свойствами поликатиона за счет протонирования аминогрупп.

Следовало выяснить, какую роль играют величина молекулярной массы (степень полимеризации), количество ацетамидных групп (степень ацетилирования) и поликатионные свойства молекулы в его противовирусной активности.

Для решения первого вопроса в Центре «Биоинженерия» РАН методом фильтрации через мембраны с уменьшающимся размером пор были получены препараты хитозана, однородные по мол. массе (Мw). Их активность изучали на растениях фасоли, заражаемой ВММФ, концентрацию которого определяли с помощью ИФА. Данные, приведенные в табл. 5, показывают, что наибольшей активностью обладали препараты низкомолекулярного хитозана.

Таблица 5.

Накопление ВММФ в растениях фасоли, обработанных хитозаном (% от контроля) Концентрация хитозана, мкг/мл Образцы хитозанов 10 100 10 8 сутки 14 сутки В инокулированных листьях Мw 40, 5 - 0,8 (до фракционирования) Мw 10,1 6 0 19 Мw 2,2 0 0 0,5 Мw 1,2 0,6 0 0,3 В системных листьях Мw 40, 0 0 39 0, (до фракционирования) Мw 30,3 0 0 33 4, Мw 10,1 0 0 35 0, Мw 2,2 0 0 0 Мw 1,2 0 0 0 «-» - не определяли.

Исследование активности 6-О-сульфата хитозана и 6-О-сульфат-N-сукцината хитозана, предоставленных А.И.Гамзазаде (Институт элементоорганических соединений им.

А.Н.Несмеянова РАН), показало, что анионные производные хитозана обладают в 10 – раз меньшей противовирусной активностью, чем поликатионные молекулы хитозана с такой же мол. массой, при ингибировании образования местных некрозов на листьях фасоли после инокуляции ВМЛ. Таким образом, поликатионные свойства хитозана, по-видимому, важны для проявления его противовирусной активности.

Изучение механизма противовирусной активности хитозана.

Обнаружено, что при обработке хитозаном нижней поверхности листа фасоли устойчивость к заражению ВМЛ развивалась и на его верхней поверхности, при обработке одной половины листа устойчивость развивалась и в другой, необработанной хитозаном половине, при обработке нижних листьев устойчивость наблюдали также и в верхних.

Аналогичные данные были получены при заражении растений фасоли ВТМ, а также при обработке корней растений фасоли перед их заражением ВМЛ. Эти результаты показывают, что хитозан индуцирует в растениях системную устойчивость.

В растениях с индуцированной системной устойчивостью мишенью для защитных реакций может являться любая стадия инфекционного процесса (Gilliland et al., 2006;

Palukaitis & Carr, 2008). При изучении динамики устойчивости, развивающейся в растениях картофеля в результате обработки хитозаном, была обнаружена положительная корреляция между содержанием каллозы и уровнем рибонуклеазной активности, с одной стороны, и степенью устойчивости к вирусной инфекции, с другой. Это позволяет предположить, что индукция хитозаном отложений каллозы и рибонуклеазной активности может быть слагаемым механизма противовирусной устойчивости.

Установлено также, что хитозан ингибирует репликацию ВТМ и ХВК в культуре протопластов табака N.tabacum cортов Самсун NN, Самсун nn и Ксанти nc, зараженных вирусом или вирусной РНК методом электропорации. Электрофоретический анализ лизатов протопластов табака показал, что хитозан стимулирует продукцию нескольких клеточных белков, в особенности белка с мол. массой около 130 кДа (р130) (рис. 22).

1 2 34 5 Рис. 22. Электрофоретический анализ лизатов протопластов, зараженных ВТМ. 1, 2, 3 – концентрация хитозана, соответственно, 25, 50 и 100 мкг/мл;

4 – с хитозаном (100 мкг/мл) без инкубации;

5 – без хитозана;

6 – белки-маркеры.

Сверху вниз: 94, 67, 43, 30, 20,1 и 14,4 кДа.

Уровни экспрессии этого белка и накопления вируса были связаны обратной зависимостью. В то же время, хитозан не ингибировал накопления ВТМ и ХВК в изолированных протопластах ячменя и не индуцировал образования в них белка с близкой молекулярной массой.

Таким образом, р130 может играть роль в ингибировании вирусной инфекции. Принимая во внимание мол. массу этого белка и то обстоятельство, что в лизатах протопластов обнаружена индукция хитозаном РНК-полимеразной активности, можно предположить, что р130 является клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразой, а противовирусная устойчивость, индуцируемая хитозаном, частично опосредована механизмом РНК-интерференции.

Выводы 1. Разработаны тест-системы на основе планшетного сэндвич-варианта ИФА для лабораторной диагностики основных вирусов картофеля (ХВК, SВК, МВК, YВК, АВК, ВСЛК), неповирусов (ВКПМ, ВМА, ВЧКПТ), а также ЛВКПЗ, ВШС, ВНТ, ВТМ, ВММФ и ВКГ. Аналитические характеристики тест-систем позволяют определять перечисленные вирусы в концентрации до 1 нг/мл в очищенном препарате и в экстракте из зараженных растений и с высокой специфичностью выявлять зараженные растения картофеля, овощных, ягодных, плодовых и цветочных культур.

2. Для экспресс-диагностики фитовирусов во внелабораторных условиях разработаны метод виробактериальной агглютинации (АБВ-тест), основанный на коагглютинации вирусных частиц и клеток Staphylococcus aureus, покрытых антителами к вирусу, и метод иммунохроматографии на тест-полосках, основанный на применении поликлональных антител и наночастиц коллоидного золота в качестве маркера. Методы позволяют выявлять вирусы с чувствительностью до 80 нг/мл за 2 – 10 мин и проводить анализ без вспомогательного оборудования как специалистами, так и лицами без профессиональной подготовки.

3. На основе модифицированного варианта иммуноферментного анализа с использованием неорганической пирофосфатазы E.coli в качестве ферментной метки разработаны наборы реагентов для определения основных вирусов картофеля, а также вируса шарки сливы, содержащие все необходимое для выполнения анализа.

4. Разработан способ экстракции РНК из вирусных частиц и из тканей зараженного растения, основанный на выделении нуклеиновых кислот с помощью нового хаотропного агента трихлорацетата аммония и очистке РНК с помощью целлюлозного сорбента на основе хлопковой ваты. Способ не требует применения токсичных соединений и позволяет получать РНК и высокого качества при комнатной температуре. Процедура получения очищенного препарата РНК из одного образца занимает 30 мин.

5. Разработан метод определения вирусов растений с помощью дот-гибридизации c кДНК зондами, меченными хлордиэтилентриаминоплатиной [(диен)Pt], и последующем выявлении образующихся гетеродуплексов в непрямом ИФА с помощью антител, специфичных к (диен)Pt. Метод позволяет выявлять до 10 пг вирусной РНК в образце объемом 1 мкл и, в силу его высокой чувствительности, специфичности и производительности, пригоден для массовой диагностики вирусных заболеваний растений.

6. Разработан метод диагностики вируса шарки сливы, основанный на применении полимеразной цепной реакции. При наличии в образце вируса амплифицированный фрагмент гена NIb (репликазы) идентифицируется в агарозном геле как зона размером 560 пар нуклеотидов. Метод позволяет достоверно выявлять вирус в пробирочных растениях косточковых культур.

7. Для одновременной диагностики вирусов и вироида картофеля разработан прототип ДНК чипа – ДНК-микроплата, в ячейках которой фиксированы рекомбинантные ДНК, комплементарные РНК определяемого патогена. ДНК-микроплата позволяет выявлять до РНК вируса или вироида в концентрации до 10 пг/мкл. Применение ДНК-микроплаты дает возможность одновременной диагностики вирусов и вироида в анализируемом образце и позволяет обеспечить, значительно ускорить и существенно удешевить процедуру сертификации семенного картофеля.

8. Разработанные тест-системы для диагностики вирусных инфекций растений с помощью ИФА и АБВ-теста были широко использованы государственной службой сертификации семян РФ, производителями безвирусного посадочного материала в России, Белоруссии и на Украине для контроля качества и производства безвирусного посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур и государственной службой карантина растений РФ для диагностики карантинного вируса шарки сливы.

9. Установлено таксономическое положение вируса мягкой мозаики фасоли (ВММФ).

Изучение структуры вирусной частицы и вирусного генома, а также состава белковых продуктов, образующихся при трансляции вирионной РНК in vitro, позволили отнести ВММФ к представителям рода Carmovirus.

10. Показана возможность индукции противовирусной устойчивости у различных видов растений хитозаном. Протективный эффект опосредован влиянием хитозана на растение и зависит от вида растения, концентрации и молекулярной формы хитозана.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

Патенты 1. Чирков С.Н., Оловников А.М., Сургучева Н.А., Оловникова Н.И., Пирузян Л.А., Атабеков И.Г. (1981). Способ определения зараженности растений. Авторское свидетельство СССР № 924099.

2. Дрыгин Ю.Ф., Атабеков И.Г., Кондакова О.А., Чирков С.Н., Гаврюшина Е.С. (2008).

Применение трихлорацетата аммония в качестве средства для диссоциации природных комплексов нуклеиновых кислот и способ выделения РНК. Международная заявка № PCT/RU2007/000310. Номер международной публикации WO 2008/150187 A1.

3. Дрыгин Ю.Ф., Кондакова О.А., Чирков С.Н., Зиновкин Р.А., Киселева В.И., Атабеков И.Г.

(2008). Способ одновременного обнаружения множества РНК-последовательностей в биологическом образце. Международная заявка № PCT/RU2008/000198.

Статьи в научных журналах:

4. Чирков С.Н., Оловников А.М., Сургучева Н.А., Оловникова Н.И., Пирузян Л.А., Кулинич А.В., Атабеков И.Г. (1981). Виробактериальная агглютинация (АБВ-тест) – новый метод иммунодиагностики вирусов сельскохозяйственных растений. Докл. ВАСХНИЛ № 7, 9-11.

5. Чирков С.Н., Оловников А.М., Варицев Ю.А., Атабеков И.Г. (1982). Диагностика Х, S, M и Y вирусов картофеля методом виробактериальной агглютинации. Сельскохоз. биол. № 2, 272 277.

6. Чирков С.Н., Варицев Ю.А., Герасимова К.Ф., Атабеков И.Г. (1982). Сравнение трех серологических методов диагностики X, S, M и Y-вирусов картофеля на разных стадиях развития растений. Докл. ВАСХНИЛ № 3, 14-16.

7. Бобкова А.Ф., Чирков С.Н. (1983). Применение иммуноферментного анализа для диагностики вирусных заболеваний растений. Сельскохоз. биол. № 5, 32-36.

8. Одинец А.Г., Кулинич А.В., Чирков С.Н., Козицкий Ю.Н., Атабеков И.Г. (1983).

Сравнительное испытание иммунологических методов для массовой диагностики вируса крапчатости гвоздики. Сельскохоз.биол. № 5, 37-41.

9. Чирков С.Н. (1983). АБВ-тест: экспресс-метод иммунодиагностики фитовирусов.

Сельскохоз. биол. № 5, 42- 46.

10. Chirkov S.N., Olovnikov A.M., Surguchova N.A., Atabekov J.G. (1984). Immunodiagnosis of plant viruses by a virobacterial test. Ann. appl. Biol. 104, 477-483.

11. Бойков С.В., Чирков С.Н., Сургучева Н.А., Атабеков И.Г. (1984). Сравнение флокулляционных методов иммунодиагностики вирусов растений. Биохимия № 2, 272-274.

12. Бобкова А.Ф., Нацвлишвили Н.М., Чирков С.Н., Сургучева Н.А., Варицев Ю.А., Атабеков И.Г. (1987). Характеристика отечественных коммерческих антисывороток к вирусам картофеля в АБВ-тесте и иммуноферментном анализе. Изв. АН СССР, Сер. биол. № 1, 28 34.

13. Karasev A.V., Chirkov S.N., Kaftanova A.S., Miroshnichenko N.A., Surgucheva N.A., Fedotina V.L. (1989). Characterization of bean mild mosaic virus: particle morphology, composition and RNA cell-free translation. Intervirology 30, 285-293.

14. Федотина В.Л., Сургучева Н.А., Чирков С.Н., Кочкина З.М. (1990). Очистка и иммуноферментный анализ вируса кольцевой пятнистости малины. Сельскохоз. биол. № 5, 74-181.

15. Сургучева Н.А., Федотина В.Л., Чирков С.Н., Кочкина З.М. (1990). Очистка и иммуноферментный анализ вируса некроза табака. Вестн. сельскохоз. науки № 8, 144-148.

16. Чирков С.Н., Сургучева Н.А., Федотина В.Л., Кочкина З.М. (1991). Очистка и иммуноферментный анализ вируса черной кольцевой пятнистости томатов и латентного вируса кольцевой пятнистости земляники. Биол. науки № 4, 22-29.

17. Pospieszny H., Chirkov S., Atabekov J. (1991). Induction of antiviral resistance in plants by chitosan. Plant Sci. 79, 63-68.

18. Chirkov S.N., Surguchova N., Atabekov J.G. (1994). Chitosan inhibits systemic infections caused by DNA-containing plant viruses. Arch. Phytopath. Plant Protection 29, 21-24.

19. Чирков С.Н., Сургучева Н.А., Атабеков И.Г. (1995). Стимуляция синтеза клеточных белков и ингибирование вирусной инфекции хитозаном в изолированных протопластах табака.

Доклады РАН № 6, 836-838.

20. Чирков С.Н., Сургучева Н.А., Гамзазаде А.И., Абдулабеков И.М., Поспешны Г. (1998).

Сравнительная эффективность производных хитозана при подавлении вирусной инфекции растений. Доклады РАН № 2, 271-273.

21. Surguchova N., Chirkov S., Atabekov J. (1998). ELISA-test bei Nepoviren mit einem neuen Enzym - einer anorganischen Pyrophosphatase aus Escherichia coli. Arch.Phytopath.Pflanz. 31, 535-541.

22. Surguchova N.A., Yu.A.Varitsev, Chirkov S.N. (2000). The inhibition of systemic viral infections in potato and tomato plants by chitosan treatment. J.Russ.Phytopath.Soc.,1, 59-62.

23. Чирков С.Н., Новиков В.К., Бобкова А.Ф., Атабеков И.Г. (2000). Пиротест – усовершенствованный вариант иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Защита и карантин растений № 12, 15-16.

24. Добржанская Е.О., Приходько Ю.Н., Чирков С.Н. (2001). Диагностика вируса шарки сливы методом полимеразной цепной реакции. Докл. РАСХН № 2, 11-12.

25. Чирков С.Н., Ильина А.В., Сургучева Н.А., Летунова Е.В., Варицев Ю.А., Татаринова Н.Ю., Варламов В.П. (2001). Влияние хитозана на системную вирусную инфекцию и некоторые защитные реакции в растениях картофеля. Физиол. растений № 6, 890-896.

26. Чирков С.Н., Осипов А.П., Атабеков И.Г. (2002). Наборы «Пиротест» для лабораторной диагностики вирусов картофеля. Картофель и овощи № 1, 29.

27. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана. (2002). Прикл. биохим. микробиол. № 1, 5 – 13.

28. Бобкова А.Ф., Блинцов А.Н, Чирков С.Н. (2003). Пиротест – метод иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Аграрная Россия № 3, 23 – 27.

29. Nemtsev S.V., Il’ina A., Varlamov V.P., Ozeretskovskaya O.L., Vasyukova N.I., Chirkov S.N., Skryabin K.G. (2003). Stimulation of plant growth and induction of potato resistance to diseases by low molecular weight chitosan. Bull. Polish Acad. Sci. Biol. Sci. 51, 243 – 249.

30. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина А.В., Лопатин С.А., Варламов В.П. (2006). Влияние молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях. Прикл.

биохим. микробиол. № 2, 224 – 228.

31. Чирков С.Н., Варицев Ю.А., Русецкий Н.В. (2007). Усовершенствованный способ очистки вируса А картофеля и разработка тест-системы для его диагностики методом иммуноферментного анализа. Сельскохоз. биол. № 5, 114 – 118.

32. Приходько Ю.Н., Чирков С.Н., Метлицкая К.В., Цубера Л.В. (2008). Распространенность вирусных болезней косточковых культур в европейской части России. Сельскохоз. биол. № 1, 26 – 32.

33. Бызова Н.А., Сафенкова И.В., Чирков С.Н., Жердев А.В., Блинцов А.Н., Дзантиев Б.Б., Атабеков И.Г. (2009). Разработка иммунохроматографических тест-систем для экспрессной детекции вирусов растений. Прикл. биохим. микробиол. № 2, 225 – 231.

Статьи в книгах и сборниках 34. Pospieszny H., Struszczyk H., Chirkov S.N., Atabekov J.G. (1995). New applications of chitosan in agriculture. «Chitin World». Karnicki Z.S., Brzeski M.M., Bykovski P.J., Wojtasz Pajak A., Eds. Gdynya: Wirtschaftsverlag NW, 246-254.

35. Чирков С.Н., Поспешны Г. (1999). Индукция противовирусной устойчивости у растений хитозаном. Материалы Пятой конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». Москва – Щелково, 25 – 27 мая, с. 111 – 114.

36. Чирков С.Н. (2002). Противовирусные свойства хитозана. «Хитин и Хитозан. Получение, свойства и применение». М.: Наука, 327 – 338.

37. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина А.В., Лопатин С.А., Шумилина Д.В., Джавахия В.Г.

(2006). Использование хитозана для защиты растений от вирусных болезней. Материалы Восьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». Казань, 13 – 17 июня, с. 330 – 332.

38. Drygin, Yu.F., Chirkov S.N., Kondakova, O.A., Zinovkin, R.A., Ivanov, P.A., Blintsov, A.N., Gavryushina, E.S., Zherdev, A.V., Byzova, N.A., Dzantiev, B.B., Atabekov J.G. (2007). High sensitive technologies for molecular diagnostics of potato virus and viroid infections. «Potato Production and Innovative Technologies». A.J. Haverkort, B.V. Anisimov, Eds. Wageningen:

Acad.Publishers, 274-285.

39. Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Чирков С.Н., Смыков А.В., Вожегова Р.А.

(2008). Биотехнологические системы оздоровления косточковых плодовых культур и получения безвирусного посадочного материала. «Фактори експериментальної еволюції організмів». Киев: Логос, 410-415.

Избранные тезисы 40. Н.А.Сургучева, С.Н.Чирков, И.Г.Атабеков. (1982). Электронно-микроскопическое исследование виробактериальных комплексов в АБВ-тесте. Cборник тезисов XII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии. Сумы, октябрь, с. 256-257.

41. Чирков С.Н., Сургучева Н.А., Федотина В.Л., Кочкина З.М. (1990). Разработка тест-систем иммунодиагностики фитовирусов. Сборник тезисов Всесоюзной конференции «Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства». Алма-Ата, октябрь, с.110.

42. Сhirkov S.N., Pospieszny H., Surguchova N.A. (1994). Chitosan protects plants against virus diseases. Abstracts of the International Conference on Fundamental and Applied Problems in Phytovirology». Yalta, 22 – 26 May, p.17.

43. Pospieszny H., Struszczyk H., Chirkov S.N., Atabekov J.G. (1994). New application of chitosan in agriculture. Abstracts of the 6th International Conference on Chitin and Chitosan. Gdynya, 16 – 19 August, p. 26.

44. Chirkov S., Dmitrieva T., Atabekov J.G. 1994. Chitosan inhibits virus replication in tobacco protoplasts. Abstracts of the International Conference on Plant Virology. Town of Trojan, 19 – September, p. 29.

45. Chirkov S.N. (1994). Features of chitosan-induced antiviral resistance in plants. Abstracts of the Symposium on molecular responses of plants to biotic and abiotic stresses. Helsinki, 8 – December, p. 7-8.

46. Чирков С.Н., Новиков В.К., Бобкова А.Ф., Атабеков И.Г. (2000). Пиротест – усовершенствованный вариант иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Сборник тезисов семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2000». Пущино, 26 – 28 сентября, c. 26 – 27.

47. Кондакова О.А., Чирков С.Н., Козловский С.В., Дрыгин Ю.Ф., Атабеков И.Г. (2003).

Высокочувствительная и доступная технология молекулярной диагностики вироидных и вирусных заболеваний растений. Материалы II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 10 – 14 ноября, с. 170 – 171.

48. Kulikov S.N., Chirkov S.N., Il’ina A.V., Lopatin S.A., Varlamov V.P. (2006). Antiviral activity of chitosan. Abstracts of the 6th International Conference of the European Chitin Society. Poznan, August 31 – September 3, p. 53.

49. Сафенкова И.В., Жердев А.В., Блинцов А.Н., Чирков С.Н. (2007). Изучение взаимодействия антител с вирусами растений различной структуры. Сборник тезисов Первой Всероссийской школы-семинара «Современные достижения бионаноскопии». Москва, 11–17 июня, 50 – 51.

50. Киселев В.Н., Майсурян А.Н., Серенко Е.К., Чирков С.Н., Кондакова О.А., Дрыгин Ю.Ф., Зиновкин Р.А., Гаврюшина Е.С., Атабеков И.Г. (2007). Создание высокочувствительных технологий молекулярной диагностики вирусных и вироидных заболеваний растений для развития безвирусного растениеводства. Сборник тезисов Итоговой конференции «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно технологического комплекса России на 2007 – 2012 годы». Москва, 6–7 декабря, 100 – 101.

51. Сафенкова И.В., Жердев А.В., Бызова Н.А., Чирков С.Н., Блинцов А.Н., Дрыгин Ю.Ф., Дзантиев Б.Б., Атабеков И.Г. (2008). Изучение взаимодействия вирусов растений с антителами и их конъюгатами с коллоидными наночастицами. Сборник тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11–15 мая, 374.

52. Митрофанова О.В., Чирков С.Н., Лесникова-Седошенко Н.П. (2008). Вирусные болезни косточковых плодовых культур и биотехнологические системы оздоровления растений.

Сборник тезисов IX международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Звенигород, 8 - 12 сентября, с. 254.

Методические рекомендации 53. Атабеков И.Г., Чирков С.Н. (1985). Методические рекомендации по применению реакции виробактериальной агглютинации (АБВ-теста) для диагностики вирусов растений. М.:

ВАСХНИЛ. – 22 с.



Pages:     | 1 ||
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.