авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 ||

Бесприборная иммунодиагностика инфекционных заболеваний на основе высокодисперсных корпускулярных маркеров

-- [ Страница 2 ] --

Отработка способов подготовки поверхности подложки. Поверхность пластмассы обычно несет на себе остатки компонентов, используемых при производстве материала, и банальные загрязнения. Кроме того, поверхностный слой пластика может содержать участки с дефектами химического состава и полимеризации. Эти загрязнения и дефекты поверхности могут с одной стороны, снижать эффективность иммобилизации антигенов, а с другой – вызывать неспецифическое связывание биокомпонентов и спонтанное проявление. В конечном итоге они влияют на уровни специфических и неспецифических сигналов, а также на воспроизводимость результатов анализа.

Для удаления банальных загрязнений обычно применяют отмывку растворами детергентов или щелочи, для удаления стойких жировых загрязнений – обработку растворителями, а для удаления дефектов поверхностного слоя – травление крепкими растворами кислот. Влияние таких видов обработки на специфический и фоновый сигналы мы и исследовали в настоящей работе.

Картина результатов многопрофильного анализа, выполненного на различно обработанных подложках из синтетической бумаги, приведена на рисунке 19.

Исследования показали, что наиболее технологичным и достаточно эффективным способом подготовки синтетической бумаги для иммобилизации антигенов может служить обработка ее поверхности 1 %-ым раствором детергента SDS с последующей, тщательной промывкой дистиллированной водой.

6 1 2 а б г в Рис. 19. Результаты оценки эффективности сорбции антигенов на подложках из синтетической бумаги «Polylith» марки «GС-3», подвергнутых некоторым видам обработки: 1 - без обработки;

2 - отмывка 1 %-ым раствором SDS;

3 - обработка тампоном с фреоном 113;

4 - отмывка 10 %-ым раствором Triton X-100;

5 - отмывка с мылом;

6 - обработка тампоном с 96 %-ым этанолом;

7 - обработка тампоном с хлороформом. Слева приведена схема нанесения антигенов на подложку: (а) р41 T.

рallidum, (б) р150 ЦМВ, (в) р17 T. рallidum (г) лизат T. gondii.

Подбор антигенов для изготовления матрицы. Для конструирования белковой матрицы были выбраны антигены самых распространённых возбудителей, представляющих наибольшую опасность для здоровья матери и плода. Всего исследовано более 80 партий белков. Оценку каждого антигена осуществляли в ИФА на планшетах и дот-анализе на синтетической бумаге.

При оценке учитывали адекватность взаимодействия антигена с образцами рабочей панели, а также уровень оптических сигналов, полученных при оптимальном разведении антигена. Чистоту и молекулярную массу антигенов оценивали методом SDS-электрофореза в 10 %-ом полиакриламиидном геле.

Перечень исследованных в данной работе антигенов приведен в таблице 3.

Таблица Исследованные антигены возбудителей инфекций Возбудитель Антигены Рекомбинантные белки: MOMP, Hsp Chlamydia trachomatis Рекомбинантные белки: В 10 и Sag 1, лизат возбудителя Toxoplasma gondii Смесь рекомбинантных белков Е 1, Е 2 и С Rubella virus Рекомбинантные белки: p 150, p 56, p 65, лизат возбудителя Cytomegalovirus Herpes simplex virus - 1 Рекомбинантный белок D 1, лизат возбудителя Рекомбинантные белки: p 17-в-галактозидаза, p 17-GST, Treponema pallidum p 41-в-галактозидаза, p 41-GST Рекомбинантный белок р120, лизат возбудителя Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum Рекомбинантные белки Ure D, МБА 1, лизат возбудителя Gardnerella vaginalis лизат возбудителя Рекомбинантный белок Adgesin p 65, лизат возбудителя Trichomonas vaginalis Рекомбинантный белок мембраны, лизат возбудителя Neisseria gonorhoeae лизат возбудителя Candida albicans лизат возбудителя Chlamydia pneumoniae Рекомбинантный белок Adgesin p 65, лизат возбудителя Trichomonas vaginalis Рекомбинантный белок g 1, лизат возбудителя Virus herpes simplex В результате проведенных исследований для изготовления белковой матрицы отобраны шесть рекомбинантных антигенов: Sag1 - T. gondii;

MOMP C. trachomatis;

E1, E2, C - Rubella virus;

p17 и р41 - T. pallidum;

p150 Cytomegalovirus;

D1 - Herpes simplex virus-1 и два натуральных: Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum (в табл. 3 эти антигены выделены жирным шрифтом). В некоторых экспериментах на матрицы дополнительно наносили лизатный антиген Gardnerella vaginalis.

Выбор способа и условий иммобилизации антигенов на подложке.

Изучение условий иммобилизации антигенов на подложках из синтетической бумаги проводили с использованием трех различных по структуре, составу и молекулярной массе антигенов (p17 T. pallidum, р150 ЦМВ и лизате клеток T.

gondii). Исследовали концентрации антигенов в сорбционной смеси, состав и рН буферных растворов, а также условия инкубации сорбционной смеси на подложках. Сравнивали два режима инкубации: сушка капель (2,5 мкл) сорбционной смеси на воздухе при комнатной температуре и инкубация подложек с сорбционной смесью во влажной камере при 4оС в течение 12 ч.

Эффективность иммобилизации оценивали по уровню оптического сигнала после выполнения дот-иммуноанализа. Установлено, что связывание антигенов на синтетической бумаге наиболее эффективно при значениях рН, близких к нейтральным, рН 7,3-8,0. Причём, в таких условиях иммобилизация одинаково хорошо происходила как при длительной инкубации во влажной камере, так и при быстрой сушке. Последнее обстоятельство имеет существенное значение, так как может значительно упростить технологию производства белковых матриц. Оптимальные концентрации антигенов подбирали путем нанесения на подложку серии двукратных разведений антигенов. После сорбции, блокировки и выполнения дот-анализа сравнивали интенсивность визуальных сигналов и за рабочее принимали наибольшее разведение антигена, обеспечивающее максимальную оптическую плотность. Оптимальный диапазон рабочих разведений для разных антигенов варьирует в области от 5 до 20 мкг/мл. Вне этого диапазона снижение содержания антигенов в сорбционной смеси уменьшает сигнал, а повышение - вызывает появление ореола вокруг места иммобилизации за счет диффузии излишка антигена на окружающие участки подложки.

Отработка автоматизированного способа нанесения антигенов.

Основной задачей автоматического устройства для распечатывания антигенов является раздельное, строго локализованное нанесение на подложку матрицы различных белковых растворов в форме пятен (символов) размером 2-3 мм с четко ограниченными контурами. Эту задачу нам удалось выполнить с использованием перьевого планшетного плоттера MP 4200 (Graphitec, Япония).

Пробные распечатывания проводили на лицевой стороне листов формата А синтетической бумаги “Polylith” марки «GC-3», отмытых раствором SDS и дистиллированной водой. Формирование дизайна матриц, задание опций печати и распечатывание на плоттере проводили в программе «Splan 50R» (Abacom, Германия). После пробной печати проводили дот-иммуноанализ, по результатам которого оценивали: эффективность распечатки антигенов (интенсивность и равномерность оптического сигнала в месте нанесения антигена), возможность перекрестного загрязнения антигенов в процессе печати и возможность загрязнения антигенами свободных участков матрицы. Подобраны режимы печати и тип штриховки пятна, при которых модифицированным пером с толщиной 0,5 мм удается наносить примерно 1 мкл белковой смеси на пятно диаметром около 2,5 мм, что удовлетворяет поставленной задаче.

Концентрацию антигенов подбирали эмпирически, для рекомбинантных антигенов она составляла 10-20 мкг/мл, а расход каждого антигена на 1 матрицу – 10-20 нг. С использованием такого подхода нам удавалось стандартно распечатывать до 2500 точек в час. Кроме нанесения антигенов плоттер позволял производить необходимую разметку и маркировку матриц с помощью фломастеров с водостойкими чернилами.

Выбор системы детекции. В настоящей части исследований проводилась сравнительная оценка эффективности применения в многопрофильном анализе трех хромогенных маркеров (пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и коллоидного золота) и систем их проявления с целью подбора наиболее подходящей (чувствительной, быстрой и простой в применении) системы детекции. Для сравнения взяты коммерческие проявляющие системы: для пероксидазы - «Peroxidase substrate kit DAB», «Peroxidase substrate kit DAB-Ni» (Vector Lab. Inc., Burlingame, США);

субстрат на основе хлорнафтола из тест системы «Immuno-blot kit» (Sigma, США) и биотинилтирамидная система амплификации пероксидазного сигнала «Super Card» (Bhattacharya R. et al., 1999);

для щелочной фосфатазы - NBT/BCIP-субстрат из тест-системы «Immunocomb Chlamydia-IgG» (Orgenics, Израиль);

для коллоидного золота «Silver enhancer kit» (Sigma, США) и самостоятельно приготовленные физические проявители на основе гидрохинона и метола. В дот-анализе с использованием разных конъюгатов и проявляющих систем оценивали следующие параметры: интенсивность оптических сигналов в местах нанесения антигенов и положительного контроля, чувствительность и полноту выявления спектра антител, специфичность выявления спектра антител, а также возможность неспецифического связывания конъюгатов с подложкой или спонтанного проявления свободными участками матрицы.

Результаты исследования показали, что системы с использованием пероксидазных конъюгатов не обеспечивают необходимой чувствительности.

Применение биотинилтирамидной амплификации (Super Card) существенно увеличивает чувствительность, но требует применения нестандартных, более дорогих, короткоживущих компонентов и увеличивает время анализа примерно на 20 мин. Система с применением щелочной фосфатазы была более чувствительна, чем пероксидазная, однако формируемый в ней сигнал отличался невысокой контрастностью, что затрудняло визуальную оценку низкотитражных антител. Детекция с использованием коллоидного золота и физического проявителя позволяла выявлять весь спектр антител в образце и обеспечивала более яркий и контрастный сигнал, чем система со щелочной фосфатазой. Применение коммерческого набора «Silver enhancer kit» не позволяло достигать высокой интенсивности окраски, а проявители на основе метола и гидрохинона обеспечивали в течение 7-8 мин появление насыщенных оптических сигналов. При этом состав с метолом давал более яркую картину результатов анализа c относительно чистым фоном и, по нашему мнению, является лучшей проявляющей системой для визуализации результатов многопрофильного иммуноанализа.

Оптимизация состава и условий применения физического проявителя.

Физический проявитель на основе метола нестабилен и готовится непосредственно перед применением путем смешивания трех растворов. Такая процедура неудобна для использования во внелабораторных условиях. Задачей настоящей части исследований являлась отработка способа применения проявителя, пригодного для использования в автономных тест-наборах.

В состав физического проявителя входят три компонента: метол 0,2 %, лимонная кислота 0,5 % и нитрат серебра 0,2 %. В лабораторной практике они готовятся в виде отдельных растворов и смешиваются при необходимости.

Раствор нитрата серебра стабилен и может храниться в склянке из темного стекла более года. Раствор метола может эффективно использоваться только в течение 1-2 суток. Мы экспериментально установили, что в виде сухой смеси с лимонной кислотой метол может более 2 лет (срок наблюдения) храниться при комнатной температуре без потери активности. Проблема комплектации в этом случае заключалась в малой дозировке порций этих компонентов. Доза на 1 мл проявителя составляет для метола – 2 мг, а для лимонной кислоты 5 мг. Весовая или объемная дозировка таких порций сопряжена с высокой погрешностью, вероятно, способной негативно сказаться на результатах анализа. При экспериментальной проверке было показано, что даже двукратное превышение или снижение концентрации метола и лимонной кислоты не приводят к значительным изменениям активности проявителя, но заметно снижают его стабильность. На практике это выглядело как быстрое потемнение раствора за счет диффузного восстановления серебра в его объеме. Особенно дестабилизация раствора была заметна при повышении рН, поэтому мы сочли целесообразным использование в проявителе не лимонной кислоты, а цитратной буферной системы, способной обеспечить стабильный показатель рН 2,5. Подобрано весовое соотношение компонентов сухой смеси: метол – 2, лимонная кислота – 9, цитрат натрия (5,5 водный) – 1. Компоненты измельчали и перемешивали в шаровой мельнице, а затем изготавливали тритурационные таблетки путем формования увлажненной спиртом смеси во фторопластовой матрице с последующей сушкой. Эта технология проста, не требует специального оборудования и подходит для решения поставленной задачи.

Путем подбора матрицы мы получили таблетки из метолово-цитратной смеси массой 12 мг. Таким же способом удавалось изготавливать таблетки массой мг, содержащие 2 мг метола и 5 мг лимонной кислоты. Оба варианта таблеток были пригодны для приготовления 1 мл проявителя. Погрешность дозирования при таком подходе не превышала 8-10 % и не сказывалась на результатах проявления. Способ применения вышеуказанных компонентов включал растворение (2-3 мин) таблетки сухой смеси в 0,5 мл дистиллированной воды и добавление равного объема 0,4 %-го раствора нитрата серебра. Такая схема позволяет использовать физический проявитель в автономных тест-системах.

В ряде случаев при высыхании проявленной матрицы изначально черно серые сигналы приобретали буро-рыжую окраску и теряли контрастность. Для того чтобы стабилизировать результаты и одновременно повысить интенсивность сигналов мы погружали отмытые после проявления матрицы на мин в щелочной раствор тиомочевины (1 % тиомочевины и 1 % гидроокиси натрия в дистиллированной воде). При этом образовывался черный сульфид серебра, обладающий высокой устойчивостью к внешним воздействиям.

Матрицы перед такой обработкой отмывали от остатков проявителя, иначе на ней появлялась вуаль.

Оптимизация условий выполнения анализа. Многопрофильный анализ антител включает несколько стадий (рис. 20).

Время выполнения операций (мин) Общее время 20 2х2 20 3х2 7 1 1 1 анализа 60 мин Отмывка Отмывка Отмывка Отмывка Этап 2 Этап 4 Этап Этап 1 Этап Инкубация с Инкубация с Стабилизация Учет Усиление иммунозолем образцом окраски результатов сигнала Au-SpA сыворотки Y Y Y Y Аг- Аг- Ag Ag2S Au Y Ат- Щелочной Иммунозоль Физический раствор проявитель Au-SpA тиомочевины Рис. 20. Общая схема многопрофильного дот-иммуноанализа антител с применением иммунозоля золота, усилением сигнала физическим проявлением и стабилизацией окраски щелочным раствором мочевины.

На первом и втором этапах анализа мы оптимизировали составы рабочих растворов, кратность рабочих разведений образца и конъюгата, режимы инкубации и отмывок. Сравнивали два варианта базовых буферных растворов (фосфатного и трис-HCl), в которые для приготовления растворов для разведения сывороток и конъюгата, а также растворов для отмывок вводили одинаковые дополнительные компоненты. Оценка показала, что обе буферные системы могут быть использованы при проведении анализа, но растворы на основе трис-HCl обеспечивают немного более заметную разницу между положительными и отрицательными образцами. Для снижения возможности появления ложноположительных результатов мы применяли щелочные (рН 9,5 9,8) растворы для разведения сывороток и вводили в их состав детергенты и мочевину, препятствующие связыванию низкоаффинных компонентов, и/или так называемый «концентрат блокирующего раствора», представляющий собой лизат клеток E. coli. Для предотвращения неспецифического связывания с подложкой и блокирующим белком в состав растворов вводили небольшие (0,05 %) количества казеина и неионного детергента твин-20. В качестве консерванта использовали азид натрия. Оптимальные концентрации иммунозоля золота подбирали опытным путем.

В ИФА инкубацию, как с образцами, так и с конъюгатом, осуществляют при 37оС в течение 30 мин. Этот режим подходит и для многопрофильного иммуноанализа. Однако, в целях создания оперативного и автономного теста, нами были предприняты попытки сокращения время инкубации с образцами и конъюгатом и выполнения анализа в условиях комнатной температуры.

Результаты экспериментов позволили сделать вывод о том, что при постановке многопрофильного анализа в условиях комнатной температуры, достаточно 20-минутного взаимодействия матрицы, как с образцами, так и с конъюгатом, а также ее двукратной отмывки по 2 мин после каждой из этих операций. Для промывки матрицы перед проявлением и стабилизацией сигналов достаточно погрузить ее на 1 мин в дистиллированную воду. Таким образом, отработанная процедура многопрофильного анализа антител включает 11 последовательных операций и может быть выполнена в течение 60 мин при комнатной температуре.

Испытания лабораторного образца теста для многопрофильного анализа антител. В результате проведенной работы был создан лабораторный образец, который может быть использован в качестве прототипа при организации производства многопрофильного теста для определения антител к возбудителям перинатальных инфекций. Этот образец включал белковые матрицы с положительным контролем (IgG-Hum), шестью рекомбинантными (T. gondii;

C. trachomatis;

Rubella virus;

T. pallidum;

ЦМВ;

ВПГ-1) и двумя натуральными (M. hominis, U. urealytica) антигенами, а также рабочие растворы. При лабораторных испытаниях прототипа теста анализ сывороток выполняли в индивидуальных полипропиленовых пробирках объемом 3 мл (LKB, Швеция). Учет результатов осуществляли визуально.

Оценку чувствительности и специфичности многопрофильного теста при определении антител к ЦМВ, ВПГ-1, C. trachomatis и T. pallidum проводили с использованием соответствующих панелей сывороток, производства ЗАО «Медико-биологический союз» (Бердск). Результаты исследований приведены в таблице 4. Оценка чувствительности и специфичности теста при определении антител к вирусу краснухи и T. gondii осуществлялась на произвольных выборках из образцов рабочей панели сывороток с использованием референс тестов. Результаты представлены в таблице 5.

При выявлении антител к токсоплазмам данные, полученные с использованием референс-тестов и многопрофильного анализа, полностью совпадают, а при выявлении антител к вирусу краснухи многопрофильный тест позволяет определять меньше позитивных сывороток, чем тест-системы фирм «Medac» и «Вектор-Бест». Возможно, это связано с особенностями антигенов, используемых в разных тестах, поскольку результаты многопрофильного теста и тест-системы «ИмДи-спектр», изготовленных с использованием одинаковых антигенов, совпадают.

Таблица Оценка чувствительности и специфичности многопрофильного теста с использованием панелей сывороток, производства ЗАО «МБС» (Бердск) Инфекция ЦМВ Герпес Хламидиоз Сифилис Панель ОСО-42-28-360 ОСО-42-28-373 ОСО-42-28- Панель серия 001 серия 001 серия 003 серия Чувствительность 95 % 95 % 94 % 100 % Специфичность 94 % 86 % 95 % 100 % Таблица 5.

Результаты оценки показателей многопрофильного теста при выявлении IgG к возбудителям токсоплазмоза и краснухи относительно референс тест-систем.

Относительные диагностические Инфекция Референс тест-система показатели, % Чувствительность Специфичность Toxoplasma gondii IgG 100 «Sentinel CH», Италия Токсоплазмоз Токсоплазмоз IgG-антитела 100 «ИмДи-спектр», Новосибирск Rubella IgG – ELISA 96 f. Medac, Германия ВектоРубелла-IgG-стрип Краснуха 92 «Вектор-Бест» Новосибирск Краснуха IgG-антитела 100 «ИмДи-спектр» Новосибирск Результаты сравнительного анализа образцов рабочей панели сывороток, с использованием многопрофильного теста и моноспецифических тест-систем, производства ООО «ИмДи-спектр», изготовленных с применением идентичных антигенов, представлены в таблице 6. Данные, полученные с использованием одинаковых рекомбинантных антигенов в ИФА и многопрофильном анализе, совпадали на 97-100 %. На антигенах, представленных лизатами натуральных возбудителей (M. hominis и U. urealyticum), многопрофильный анализ выявлял больше позитивных сывороток, чем ИФА. Анализ с использованием лизатных антигенов сопровождался относительно высоким уровнем фона. При проведении ИФА антител к M. hominis и U. urealyticum фоновые сигналы определялись в диапазоне 0,150-0,300 ОЕ. В варианте многопрофильного анализа такие сигналы визуализируются в виде слабо окрашенных, но отчетливо различимых пятен и могут интерпретироваться как положительный результат.

Таблица Результаты сравнительного анализа рабочей панели сывороток (150 образцов) с использованием многопрофильного теста и ИФА тест-систем ООО «ИмДи-спектр» Совпадений результатов Патоген Число % 150 Chlamydia trachomatis 147 Toxoplasma gondii 149 Rubella virus 145 Cytomegalovirus 149 Herpes simplex virus- 149 Treponema pallidum 133 Mycoplasma hominis 138 Ureaplasma urealyticum Сходная картина наблюдалась и при сравнительной оценке аналитической чувствительности этих тестов. Титры специфических антител параллельно определяли в многопрофильном дот-иммуноанализе и на соответствующих моноспецифических тест-системах для ИФА (ООО "ИмДи спектр"). Белковые матрицы и тест-системы были изготовлены с применением идентичных антигенов. Данные, полученные с использованием рекомбинантных антигенов, в ИФА и многопрофильном анализе совпадали, тогда как на антигенах, представленных лизатами натуральных возбудителей матрицы выявляли антитела в большем разведении, чем ИФА.

Таким образом, чувствительность и специфичность анализа антител на белковых матрицах определяются в основном качеством применяемых в них антигенов. Все использованные нами рекомбинантные антигены обеспечивают достаточно высокие показатели чувствительности и специфичности анализа.

Антигены на основе лизатов натуральных возбудителей провоцируют высокий уровень фоновых сигналов, что затрудняет правильную интерпретацию результатов. Поэтому необходим поиск более качественных аналогов белков этих возбудителей.

Для проверки воспроизводимости результатов многопрофильного анализа матрицы распечатывали на нескольких листах синтетической бумаги (по стрипов на листе). Из разных мест каждого листа вырезали по 6 матриц и параллельно проводили на них анализ одного и того же образца сыворотки.

Результаты учитывались визуально. Отмечены незначительные различия в интенсивности визуальных сигналов на отдельных матрицах, однако все они идентично выявляли спектр антител в образце. Для проверки стабильности белковые матрицы, упакованные в полиэтиленовые пакеты, хранили при температурах 4оС и 40оС и периодически исследовали их работоспособность и чувствительность. Полученные данные показали, что при температуре 40оС матрицы сохраняют исходную активность в течение 30 дней (срок наблюдения), а при 4оС они адекватно выявляют весь спектр контролируемых антител и не теряют чувствительности как минимум 12 месяцев.

Разработка средств инструментального учета результатов теста. Для того чтобы избежать трудностей при субъективной оценке сигналов, нами разработана компьютерная программа, которая позволяет анализировать изображение матрицы, полученное с помощью сканера, цифрового аппарата или WEB-камеры. Эта программа способна распознавать области нанесения антигенов и определять их оптическую плотность. По каждой из этих областей она позволяет задавать и вычитать отсекаемые значения фоновых сигналов, интерпретировать результаты как положительные или отрицательные, сохранять результаты в банке данных и выдавать на распечатку протокол анализа.

Разработка прототипа набора реагентов для многопрофильного анализа. Проведенные исследования позволили сформулировать общее представление о том, что должен представлять собой набор реагентов для многопрофильного анализа антител и его потенциальных преимуществах перед существующими средствами серодиагностики. Наиболее перспективным нам представляется набор, включающий в свой состав: комплект белковых матриц, многоячеечную аналитическую ванну, компоненты физического проявителя и диск с программой учета. Общий вид прототипа набора реагентов для много профильного анализа (20 тестов на 8 инфекций) представлен на рисунке 21.

Рис. 21. Общий вид прототипа набора для многопрофильного анализа антител.

Матрицы могут быть выполнены в виде плоского гребня, каждый зубец которого является аналитическим устройством. Матрицы могут использоваться как по одной (для индивидуальных анализов), так и в виде целого гребня (для массовых обследований). Аналитическая ванна изготавливается из химически инертной пластмассы и предназначена для последовательных инкубаций белковых матриц в рабочих растворах. Она заполняется готовыми растворами и герметизируется. При выполнении анализа в первый ряд ячеек ванны вносят исследуемые образцы и, затем, всю гребенку или отдельные матрицы последовательно инкубируют в ячейках каждого ряда.

Проявитель готовят непосредственно перед использованием. После выемки матрицы из последней ячейки визуально учитывают результаты. При необходимости с диска устанавливают компьютерную программу и выполняют инструментальный учет.

Описанный выше набор по внешним признакам сходен с моноспецифическими тест-системамами «ImmunoComb» франко-израильской фирмы «Orgenics», но значительно отличается от них по используемым материалам и техническому исполнению. Кроме того, в отличие от них, предлагаемый набор позволяет проводить одновременное комплексное обследование на 8 инфекций, а также содержит вместо системы детекции со щелочной фосфатазой, золотосеребряную систему детекции, позволяющую повысить чувствительность анализа и существенно снизить себестоимость теста.

Сравнительные расчеты материальных затрат на производство ИФА наборов, а также многопрофильных тестов, использующих системы детекции со щелочной фосфатазой и коллоидным золотом, показали, что затраты на материалы для изготовления многопрофильных тестов с коллоидным золотом примерно в 4 раза ниже, чем для тестов со щелочной фосфатазой, а стоимость одного такого анализа на 8 инфекций только в 1,5 раза превышает стоимость одного ИФА в планшете. При выполнении комплексного обследования за счет снижения затрат клинической лаборатории анализ на белковой матрице с антигенами обойдется пациенту примерно в 7-8 раз дешевле, чем эквивалентное число тестов в ИФА. Кроме того, предлагаемый набор полностью укомплектован, автономен, не требует особой квалификации оператора и позволяет оперативно выполнять многопрофильные исследования во внелабораторных условиях. Производство наборов для многопрофильного анализа не требует дорогого оборудования и может быть развернуто на небольших производственных площадях. Один из возможных вариантов организации производства таких наборов приведен в приложении к диссертации.

Таким образом, проведенные исследования по применению в иммуноанализе высокодисперсных корпускулярных маркеров позволили решить поставленную задачу – разработать технологические подходы к созданию комплекса чувствительных, простых, быстрых и недорогих твердофазных иммунохимических тестов, способных обеспечить иммунодиагностику инфекционных заболеваний и специфическую индикацию патогенов в слабооснащенных медицинских учреждениях или во внелабораторных условиях. Отработанные в наших экспериментах методы иммуноанализа сочетают высокую чувствительность, надежность, простоту выполнения и скорость получения результатов. В то же время они значительно дешевле существующих аналогов и могут выполняться повсеместно, что делает их более доступными для пациентов. Кроме того, применение таких тестов позволяет оперативно осуществлять эпидемиологический мониторинг и санитарно-эпидемиологический контроль, а также проводить быструю оценку ситуации и принимать необходимые меры при возникновении биологических угроз. Описанные выше технологические подходы не требуют дорогого оборудования, универсальны и могут быть использованы при производстве диагностических наборов любой специфичности. Такие подходы могут найти применение не только в диагностике инфекционных заболеваний, но и в других отраслях медицины, а также в ветеринарии, экологических исследованиях и научных экспериментах.

ВЫВОДЫ Выполнены исследования по разработке высокодисперсных корпускулярных маркеров для создания комплекса методов твердофазного иммунохимического анализа с визуальным учетом результатов, пригодных для проведения исследований в слабооснащенных лабораториях и в полевых условиях в результате чего:

1. Впервые экспериментально обосновано применение в планшетном варианте иммуноанализа неорганических катализаторов на основе соединений железа, серебра и кобальта как маркеров, альтернативных пероксидазе хрена, а также принципа каталиметрии для их выявления.

2. Установлено, что применение в планшетном варианте иммуноанализа каталитических маркеров на основе кобальтсодержащих золей и субстратов с ализарином S при сходной с пероксидазными конъюгатами чувствительности и специфичности анализа обеспечивает отчетливое различие положительных и отрицательных образцов и позволяет визуально проводить надежный учет результатов теста.

3. Показано, что гидрозоли серебра могут служить альтернативой маркерам на основе коллоидного золота, а дот-иммуноанализ с использованием золей серебра и визуализацией результатов физическим проявлением позволяет выявлять антигены возбудителя чумы в концентрации 5 нг/мл.

4. Отработана технология получения и применения в дот-иммуноанализе высокодисперсного активированного угля. Применение угольных маркеров позволяет создавать простые и быстрые тесты для массового скрининга и исследования индивидуальных серологических образцов, лишь в 2-4 раза уступающие по чувствительности ИФА.

5. Впервые установлено, что импрегнация высокодисперсного активированного угля серебром позволяет повысить чувствительность дот иммуноанализа с его использованием до уровня чувствительности планшетного варианта иммуноферментного теста.

6. Разработаны основы технологии изготовления и применения белковых матриц для одновременного выявления ряда антигенов или антител в многопрофильном дот-иммуноанализе. Показано, что многопрофильный анализ при сходной чувствительности имеет преимущества перед планшетными иммуноферментными тестами по информативности, оперативности, трудоемкости и удельной стоимости. Этот метод допускает как визуальный учет результатов, так и компьютерную обработку оцифрованных данных с помощью специальной программы.

7. Создан прототип набора реагентов для многопрофильного анализа на белковых матрицах, позволяющий одновременно определять до 8 различных аналитов в каждом образце. Набор полностью укомплектован, а его применение не требует энергообеспечения и высокой квалификации оператора.

Список работ, опубликованных то теме диссертации 1. Полтавченко А.Г., Сенькин Ю.И., Караваев В.С. Использование каталитических свойств железосодержащих золей в иммуноанализе // Вопр.

вирусол. – 1997. - № 2. - С. 82-85.

2. Полтавченко А.Г., Лавриненко И.А., Костровский В.Г.,Тузиков Ф.В., Караваев В.С. Применение серебряных иммунозолей для выявления ВИЧ антител в микротитровальных планшетах // Вопр. вирусол. – 1997. - № 3. С. 120-123.

3. Полтавченко А.Г., Караваев В.С., Тузиков Ф.В. Использование золей серебра как маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах // ЖМЭИ. – 1998. - № 2. - С. 108-111.

4. Полтавченко А.Г., Агафонов А.П., Ничеухина С.П. и др. Использование иммуносуспензий на основе углеродных маркеров для определения антител к вирусу паротита методом поверхностного дот-иммуноанализа // Биотехнология. – 1999. - № 3. - С. 110-113.

5. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Перспективы использования коллоидного серебра как маркера в иммуноанализе // Сибирь-Восток. – 2002. - № 3. – С. 10-12.

6. Полтавченко А.Г., Тузиков Ф.В., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю.

Получение серебряных золей - маркеров для иммуноанализа // Сибирь Восток. – 2002. - № 4. - С. 18-20.

7. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Стабилизация коллоидного серебра // Сибирь-Восток. – 2002. - № 6. - С. 17-18.

8. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Проявление золей серебра в микротитровальных планшетах // Сибирь-Восток. – 2002. - № 9. С. 7-9.

9. Загоскина Т.Ю., Полтавченко А.Г., Докорина А.А., Меринов С.П., Марков Е.Ю., Голубинский Е.П. Обнаружение противобруцеллезных антител в сыворотках крови экспериментальных животных в дот-иммуноанализе с антигенной фракцией бруцелл, маркированной частицами активированного угля // Сибирь-Восток. – 2002. - № 8. - С. 7-9.

10. Полтавченко А.Г., Лавриненко И. А., Костровский В.Г., Полтавченко Д. А., Загоскина Т.Ю. Получение и оценка чувствительности серебряных иммунозолей при постановке иммуноанализа в микротитровальных планшетах // Сибирь-Восток. – 2002. - № 12. - С. 14-17.

11. Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Nikolaev V.B., Balakhonov S.V., Andreevskaya N.M., Poltavchenko A.G., Dokorina A.A., Golubinsky E.P. The use of silver immunosols for detection of Yersinia pestis antigens in dot immunoassay // The Center for infectious diseases with natural foci. Scientific journal (Mongolia). – 2002. - № 10. - Р. 53-55.

12. Poltavchenko A.G., Poltavchenko D.A., Zagoskina T.Yu. Colloid silver as perspective marker of immunoassay // The Center for infectious diseases with natural foci. Scientific journal (Mongolia). – 2002. - № 10. - Р.84-87.

13. Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П., Меринов С.П., Полтавченко А.Г.

Марков Е.Ю. Современные подходы к конструированию диагностических тест-систем с использованием неорганических корпускулярных меток (обзор) // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2004. - № 1. - т. 2.- С. 175-179.

14. Полтавченко А.Г., Рыбаков А.Н., Надточий О.Н. Изучение гуморального иммунного ответа на белки р17 и p41 Treponema pallidum на ранних стадиях сифилиса // ЖМЭИ. – 2004. - № 3. - С. 52-57.

15. Полтавченко А. Г., Филатов П. В., Яковченко А.М., Рыбаков А. Н. Изучение динамики гуморального иммунного ответа на белки р17, p41 и р Treponema pallidum на ранних стадиях сифилиса // Иммунология. – 2005. № 5. - С. 101-107.

16. Полтавченко А.Г., Филатов П.В., Зайцев Б.Н. Применение золей на основе соединений Co(II) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 1. Получение и проявление кобальтсодержащих иммунозолей // Биотехнология. – 2005. - № 3. - С. 79 89.

17. Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Co(II) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 2. Оптимизация условий проведения иммунокаталитичесого анализа // Биотехнология. – 2005. - № 4. - С. 70-77.

18. Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Co(II) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 3. Применение кобальтсодержащих золей в иммунокаталитическом анализе // Биотехнология. - 2005. - № 5. - С. 72-77.

19. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А. Многопрофильная иммунохимическая индикация возбудителей инфекционных заболеваний // Клиническая лабораторная диагностика. – 2006. - № 5. - С. 39-42.

20. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Зайцев Б.Н.

Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 1. Выбор формата белковых чипов и материала для изготовления подложки // Биотехнология. – 2006. - № 5. - С. 77-87.

21. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 2. Иммобилизация антигенов на подложке белкового чипа // Биотехнология. - 2007.- № 1. - С. 86-94.

22. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Карпышев Н.Н.

Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний.

3. Визуализация результатов анализа // Биотехнология. – 2007. - № 2. – С. 63-71.

23. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 4. Лабораторные испытания многопрофильного теста // Биотехнология. – 2007. - № 3. – С. 88-94.

24. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н.

Разработка панели с нормированным содержанием IgG к Treponema pallidum // Вестн. дерматологии и венерологии. – 2007. - № 3. – С. 5-13.

25. Чепурнов А.А., Федосова Н.И., Егоричева И.Н., Полтавченко А.Г., Элх Ф.

Разработка метода экспресс-выявления антител и антигена вируса Эбола // Вопр. вирусол. – 2007. - № 3. – С. 41-43.

26. Дроздов И.Г., Сергеев А.Н., Нетесов С.В. … Полтавченко А.Г. и др.

Практическое руководство. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. / Под редакцией Г.Г. Онищенко. – М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - 288 с.

Публикации в материалах конференций 27. Полтавченко А.Г., Зайцев Б.А., Полтавченко Д.А. Перспективы использования каталитически активных неорганических гидрозолей в качестве маркеров иммуноанализа. - В сб. мат. Межрегион. научно-практ.

конф. с международн. участием «Новые химические системы и процессы в медицине» (Новосибирск, 21-22 декабря, 2001 г.). - Новосибирск: СибУПК, 2002. - С. 232-236.

28. А. Г. Полтавченко, А. В. Голубятникова, П.А. Белавин, А. Н. Рыбаков, М.А. Лунев: Изучение динамики гуморального иммунного ответа на белки р17, p41 и р47 Treponema pallidum на ранних стадиях сифилиса. - В сб. тр.

международн. мультидисциплинарного семинара «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии – интегративная медицина» (Hurgada, Egypt, February 14-24, 2004.). - М.: МАКС Пресс, 2004. – С. 107.

29. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Серпинский О.И.

Иммуночипы для диагностики TORCH-инфекций. - В сб. тр. международн.

мультидисциплинарного семинара «Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» и международн. конф. «Актуальные вирусные инфекции – теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2- ноября 2004 года). - М.: МАКС Пресс, 2004. – С. 134-135.

30. Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н., Филатов П.В., Яковченко А.М. Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Treponema pallidum. - В сб. тр.

международн. мультидисциплинарного семинара «Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» и международн. конф. «Актуальные вирусные инфекции – теоретические и практические аспекты» (Санкт Петербург, 2-5 ноября 2004 года). - М.: МАКС Пресс, 2004. – С. 135-136.

31. Яковченко А.М., Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Серпинский О.И.

Использование серебра в многопрофильной иммунодиагностике инфекционных заболеваний. – В сб. материалов научно-практической конф.

с международным участием: «Серебро и висмут в медицине». – Новосибирск: СибУПК, 2005. - С. 68- 32. Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Со(II) как маркеров иммуноанализа с визуальным учетом результатов. - В сб. мат. международн. конф. «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21- июня 2006 г.). – Ульяновск: ГСХА, 2006. - С. 123-126.

33. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М. Многопрофильная иммунодиагностика инфекционных заболеваний. - В сб. мат. международн. конф.

«Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21-23 июня 2006 г.). - Ульяновск:

ГСХА, 2006. - С. 126-128.

34. Яковченко А.М., Полтавченко А.Г. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. - В сб. мат. III Российской научн. конф. с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск 27- сентября 2006 г.). - Новосибирск: ЦЭРИС, 2006. - С. 305-306.

35. Полтавченко А.Г. Применение кобальтсодержащих золей как маркеров иммуноанализа с визуальным учетом результатов. – В сб. мат. научно практ. конф. с международным участием «Нанотехнологии и наноматериалы для биологии и медицины» (Новосибирск, 11-12 октября 2007 г.) /В 2-х томах/. – Новосибирск: СибУПК, 2007. – Том 1. – С. 234-237.

Патенты 1. Полтавченко А.Г., Сенькин Ю.И., Караваев В.С. «Иммунодиагностикум и способ твердофазного иммуноанализа на его основе». - Патент РФ № 2092853, приоритет от 12.10.1992, опул. 10.10.97, Бюл. № 28.

2. Полтавченко А.Г., Серпинский О.И. «Маркер для иммунохимического и гибридизационного анализа». - Патент РФ № 2133469, приоритет от 02.04.1997, опубл. 20.07.99, Бюл. № 20.

3. Полтавченко А.Г., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Полтавченко Д.А.

«Иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа на пористых стрипах».

- Патент РФ № 2187121, приоритет от 08.02.1999, опубл. 10.08.2002, Бюл.

№ 22.

4. Полтавченко А.Г., Серпинский О.И., Карпышев Н.Н. «Изделие и способ для многопрофильного иммуноанализа сывороток». - Патент РФ № 2242762, приоритет от 31.10.02, опубл. 20.12.2004, Бюл. № 35.

5. Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н., Филатов П.В., Яковченко А.М. «Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Treponema pallidum и способ ее получения». - Патент РФ № 2275635, приоритет от 03.06.2004, опубл.

27.04.2006, Бюл. № 12.

6. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Серпинский О.И., Лунев М.А. «Набор для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител к возбудителям TORCH-инфекций методом дот-иммуноанализа». – Патент РФ № 2298795, приоритет от 29.03.04, опубл. 10.05.2007, Бюл. № 13.

7. Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Серпинский О.И., Тюнников Г.И.

«Способ многопрофильного иммунохимического выявления антигенов в жидких образцах». - Патент РФ № 2296995, приоритет от 20.06.03, опубл.

10.04.2007, Бюл. № 10.

Список использованных сокращений БАУ – березовый активированный уголь БАУ-Ag – березовый активированный уголь, импрегнированный серебром БСА – бычий сывороточный альбумин ВПГ – вирус простого герпеса ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВККГЛ – вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки ВОВ – вирус осповакцины ВВЭЛ – вирус Венесуэльского энцефаломиелита лошадей ВЭ – вирус Эбола ДАБ (DAB) - диаминобензидин ЗФЦ – золь ферри-фероцианида ЗГЖ – золь гидроокиси железа ЗФГА – золь ферриглицерата аммония ИКА – иммунокаталитический анализ ИКР – индикаторная каталиметрическая реакция ИФА - иммуноферментный анализ К+ - положительный контроль К- - отрицательный контроль м.к. – микробные клетки ОП - оптическая плотность ОПкрит - критическое значение оптической плотности ОСО - отраслевой стандартный образец ПЭГ - полиэтиленгликоль РНГА - реакция непрямой гемагглютинации СКк - золь сульфида кобальта, полученный при избытке катионов СКа - золь сульфида кобальта, полученный при избытке анионов ТББ – тетраборатный буферный раствор ФБ – фосфатный буферный раствор ФКк - золь ферроцианида кобальта, полученный при избытке катионов ФКа - золь ферроцианида кобальта, полученный при избытке анионов ЦМВ – цитомегаловирус a/IgG-Hum – антитела против иммуноглобулинов класса G человека BCIP/NBT - bromo-chloro-indolyl phosphate/ nitro blue tetrasollium GST – глутатион-S-трансфераза IgG – иммуноглобулины класса G SDS – додецилсульфат натрия SpA – белок А Staphylococcus aureus

Pages:     | 1 ||
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.