авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных а- и в-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином

На правах рукописи

Грачева Мария Андреевна РАЗРАБОТКА КОМПОНЕНТНОЙ БАЗЫ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ А- И В-СУБЪЕДИНИЦ РИЦИНА ДЛЯ СОЗДАНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМ, АНТИДОТОВ И ВАКЦИН ПРОТИВ ОТРАВЛЕНИЙ РИЦИНОМ 03.00.23. – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2008

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в лаборатории биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН.

академик РАМН,

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Виталий Иванович Швец доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Сергей Викторович Костров доктор биологических наук Илья Александрович Шилов

Ведущая организация: НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «16» июня 2008 года в 15 часов на заседании диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.

Автореферат разослан «15» мая 2008 года. ……………………………

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

* Актуальность работы. Рицин, токсин растительного происхождения из семян клещевины обыкновенной (Ricinus communis), является одним из наиболее сильнодействующих токсинов. Минимальная летальная доза рицина для человека может составлять 5 мкг/кг [Bradberry S.M., 2003]. Семена клещевины (касторовые бобы) используют для выделения касторового масла, которое применяется в промышленности, медицине и косметологии. Шрот клещевины, богатый питательными белками, входит в состав комбикормов для сельскохозяйственных животных. Присутствие рицина в семенах клещевины осложняет производство данной продукции. Согласно ГОСТ 18102–95 (Масло касторовое медицинское.

Технические условия) и ГОСТ 17290–71 (Шрот клещевинный кормовой. Технические условия), реакция на рицин в ней должна отсутствовать.

Технология выделения рицина из семян клещевины является простой и доступной, поэтому рицин представляет собой серьезную опасность с точки зрения возможности его использования в качестве химического оружия, в частности, в террористических целях для отравления воздуха в закрытых вентиляционных системах, питьевой воды и запасов продовольствия. Этому веществу, как поражающему агенту, был присвоен шифр "W" [Антонов Н.С., 1994].

Рицин – гликопротеин (62 кДа), белковая часть молекулы которого построена из двух субъединиц – каталитической А-субъединицы (RТA, Ricinus Toxin А-chain) и лектиновой В-субъединицы (RTB, Ricinus Toxin B-chain), соединенных одной дисульфидной связью. RТA (30,6 кДа) представляет собой высоко активную N гликозидазу, отщепляющую консервативный остаток аденина в 28S рРНК эукариот. В результате отщепления остатка аденина, рибосомы утрачивают способность связывать факторы элонгации, что ведёт к блокированию синтеза новых белков, и, как следствие, к апоптозу и гибели эукариотических клеток. RTB (31,4 кДа) – лектин, выполняющий транспортные функции. Связываясь с остатками D-галактозы и N ацетилгалактозамина углеводных цепей рецепторных гликопротеинов и гликолипидов поверхности эукариотических клеток, RTB обуславливает эндоцитоз и * В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, к.б.н. В.Г. Лунин.

дальнейший внутриклеточный транспорт токсина [Endo Y. et al., 1987]. Благодаря своей потенциальной токсичности, RTA нашла применение в создании иммунотоксинов – конъюгатов, состоящих из токсина и антитела и обладающих направленным токсическим действием, например, в противоопухолевой терапии [Olsnes S. et al., 2001] и терапии ВИЧ [Pincus S.H., 1996].

На сегодняшний день не существует препаратов для профилактики и лечения отравлений рицином, в связи с чем, чрезвычайный интерес представляет создание антидотов и вакцин, а также разработка тест-систем для экспресс-индикации рицина в окружающей среде и в организме. Наиболее перспективными представляются антидоты, полученные на основе протективных антител к рицину и тест-системы, основанные на иммунохимических методах. Производство подобных антидотов, тест систем, а также вакцин требует получения антигенов рицина.

Работа с нативным рицином для получения его антигенов крайне сложна ввиду его высокой токсичности. Показано, что RTA, изолированная от RTB, находясь вне клетки, не токсична из-за неспособности проникать в клетку в отсутствии RTB [O’Hare et. al., 1987]. Также показано, что рекомбинантные RTA и RTB сохраняют многие эпитопы нативного рицина, в том числе и протективные [Carra J.H. et al., 2007;

McGuinness C.R. et al., 2006;

Maddaloni M. et al., 2004]. Поэтому перспективным подходом к получению антигенов рицина является создание рекомбинантных RTA и RTB. Для разработки иммунотоксинов также возможно использование рекомбинантных RTA, но для этой цели необходимо сохранение потенциальной токсичности рекомбинантых RTA и снижение их иммуногенности.



Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение рекомбинантных антигенов RTA и RTB и исследование их иммуногенных и антигенных свойств.

Работа выполнялась в рамках комплексного проекта Федерального агентства по науке и инновациям при Министерстве образования и науки РФ по теме: «Разработка технологий, методов и средств обеспечения системы биологической безопасности и противодействия терроризму» (шифр «БТ-00.2/001») по договору №8-Л/05 от 04.05.2005 (ГК 02.467.11.6002 от 12.04.2005).

В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи:

1. Клонирование и экспрессия в E. coli нуклеотидных последовательностей, кодирующих как аутентичные RTA и RTB, так и их гибриды с белками носителями;

2. Создание эффективных штаммов-продуцентов E. coli рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB;

3. Разработка технологии выделения и очистки рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB;

4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств полученных белков.

Научная новизна. На основе идеологии создания многокомпонентных белков, развиваемой в исследовательском коллективе лаборатории биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН под руководством В.Г. Лунина, были впервые спланированы и сконструированы рекомбинантные гибридные плазмидные ДНК E. coli, позволяющие эффективно осуществлять в клетках E. coli штамма M индуцированный биосинтез химерных белков RTA-DHFR, RTB-DHFR и RTAspCBD, RTBspCBD, содержащих А- и В-субъединицы рицина и белки-носители (дигидрофолат редуктазу – DHFR и целлюлозосвязывающий домен – CBD). Впервые получены штаммы-продуценты данных белков. Разработана высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантных белков RTAspCBD, RTBspCBD на целлюлозном сорбенте, основанная на аффинных свойствах целлюлозосвязывающего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 95%. Впервые получены в препаративных количествах высокоочищенные рекомбинантные белки RTA-DHFR, RTB-DHFR и RTAspCBD, RTBspCBD, способные индуцировать у кроликов выработку высокого титра специфичных к нативному рицину антител.

Практическое значение работы. Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков RTAspCBD, RTBspCBD и разработанный метод выделения, очистки и иммобилизации этих белков на целлюлозе, могут найти применение в области промышленной биотехнологии при создании вакцинных препаратов для предотвращения отравлений рицином, тест-систем индикации рицина на основе иммунохимических методов, а также для получения антидотов к рицину на основе протективных антител. Целлюлозосвязывающий домен позволяет получать иммобилизованные препараты RTAspCBD, RTBspCBD на целлюлозе. Белки, иммобилизованные на целлюлозном носителе, обладают большей стабильностью и существенно большей иммуногенностью по сравнению с раствором нативного белка [Волков И.Ю. и др., 2004]. Данные белки могут быть использованы для разработки нового поколения иммунологических диагностикумов, в том числе белковых биочипов, основанных на присоединении к подложке из целлюлозы данных рекомбинантных белков, а также для получения сорбентов на основе целлюлозы, для очистки противорициновых антител. В случае сохранения токсичности, связанной с каталитической активностью RTA выщеплять аденин из 28S рРНК эукариот, белок RTAspCBD может найти применение в качестве компонента иммунотоксинов для борьбы со злокачественными опухолями и ВИЧ. Белок RTBspCBD может быть использован в качестве адъюванта субъединичных генно-инженерных вакцин.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения–2007», Саратов, 26–30 ноября 2007;

на VIII Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2 апреля 2008;

на Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология», Курск, 29-30 апреля 2008 г;

на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, отражающих основное содержание работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 152 страницах печатного текста;

содержит 32 рисунка и 3 таблицы;

состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 271 наименование.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение рекомбинантных аутентичных А- и В-субъединиц рицина Первым этапом работы было клонирование и исследование экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих аутентичные RTA и RTB. Для этого на основе экспрессионного вектора pQE6 (Apr) (QIAGEN, CША), содержащего высокоэффективные регуляторные элементы – промотор фага Т5, находящийся под контролем Lac-репрессора, и терминатор транскрипции, получали генно-инженерные конструкции (плазмиды) pRTA и pRTB (рис. 1).





Все олигонуклеотиды для получения последовательностей RTA и RTB планировались на основе известной последовательности гена предшественника рицина из Ricinus communis аннотированного в базе данных GenBank (Accession No. X03179). Синтез олигонуклеотидов проводился ЗАО «Синтол» (Москва). В качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали хромосомную ДНК Ricinus communis, выделенную из ее листьев. Ген предшественника рицина не содержит интронов.

pRTA NcoI BamHI XbaI Pис. 1. Схемы генно-инженерных конструкций pRTA, pRTB: Promoter T5 – промотор бактериофага T5;

SD – Promoter T5 SD RTA Terminator последовательность Шайна-Дальгарно;

RТA – нуклеотидная последовательность, pRTB кодирующая A-субъединицу рицина;

RТB – EcoRI NcoI AflII BamHI Kpn2I нуклеотидная последовательность, кодирующая B-субъединицу рицина;

Terminator – терминатор транксрипции.

Promoter T5 SD RTB Terminator Нуклеотидную последовательность, кодирующую RTA, получали при помощи ПЦР. Для ее амплификации была подобрана пара олигонуклеотидных праймеров, в которых были запланированы сайты рестрикции NcoI, XbaI, BamHI для удобства последующего клонирования, а также инициирующий и терминирующий кодоны:

Start RTA-F: 5’–TTAGAGGCCATGGGCATATTCCCCAAACAATACCCAATTATAAAC-3’, NcoI RTA-R: 5’–CACTGGTCTAGATTAGGATCCAAACTGTGACGATGGTGGAGGTGCG-3’.

XbaI Stop BamHI Плазмиду pRTA получали встраиванием ПЦР-фрагментов последовательности RTA в экспрессионный плазмидный вектор pQE6 при помощи эндонуклеаз рестрикции NcoI и XbaI.

Нуклеотидную последовательность, кодирующую RTB, конструировали по частям из двух фрагментов (N- и С-концевого) для того чтобы убрать неудобные для дальнейшего клонирования сайты рестрикции NcoI и BamHI, присутствующие в нативной ДНК. Для этого получали плазмиды pNRTB и pCRTB (рис. 2).

pNRTB EcoRI NcoI AflII BamHI XbaI Pис. 2. Схемы генно-инженерных конструкций pNRTB, pCRTB и pRTB:

Promoter T5 SD NRTB Terminator Promoter T5 – промотор бактериофага T5;

SD – последовательность Шайна pCRTB Дальгарно;

NRТB – нуклеотидная EcoRI AflII BamHI Kpn2I последовательность, кодирующая N концевую часть RTB (1219-1982 п.н., GenBank, Accession No. X03179);

CRТB – Promoter T5 SD CRTB Terminator нуклеотидная последовательность, кодирующая С-концевую часть RTB (1956 pRTB 2018 п.н., GenBank, Accession No. X03179);

EcoRI NcoI AflII BamHI Kpn2I Terminator – терминатор транксрипции.

Terminator Promoter T5 SD RTB Нуклеотидную последовательность, кодирующую N-концевую часть RTB, получали методом ПЦР. Для ее амплификации была подобрана пара праймеров, в которых были запланированы сайты рестрикции NcoI, XbaI, BamHI, AflII, а также инициирующий кодон:

Start N-RTB-F: 5'-TACCAAССATGGGTGCTGATGTTTGTATGGACCCTGAGCCC-3' NcoI N-RTB-R:5'-GAGAGGTCTAGATTAGGATCCCTTAAGGCTCGGGTCCGATGCCCTCACAT-3' XbaI BamHI AflII ПЦР-фрагменты, кодирующие N-концевую последовательность RTB, встраивали в вектор pQE6 при помощи эндонуклеаз рестрикции NcoI и XbaI и получали плазмиду pNRTB (рис. 2). Последовательность, кодирующую С-концевую часть RTB с оптимизированными для синтеза в E. coli кодонами, получали химико ферментативным синтезом из олигонуклеотидов, в которых были запланированы сайты рестрикции EcoRI, BamHI, Kpn2I и AflII, а также терминирующий кодон:

EcoRI (полусайт) C-RTB-F1: 5'-AATTCTTAAGCAGATTATCCTGTACCCGCTGCA-3' AflII BamHI Stop C-RTB-F2: 5'-TGGCGATCCGAATCAGATCTGGCTGCCGCTGTTTGGATCCTAAT-3' Kpn2I (полусайт) Stop BamHI C-RTB-R1: 5'-CCGGATTAGGATCCAAACAGCGGCAGCCAGATCTGAT-3' AflII C-RTB-R2: 5'-TCGGATCGCCATGCAGCGGGTACAGGATAATCTGCTTAAG-3' Полученные фрагменты, кодирующие С-концевую часть RTB, встраивали в вектор pQE6 с использованием эндонуклеаз рестрикции EcoRI и Kpn2I и получали плазмиду pCRTB (рис. 2). Плазмиду pRTB, несущую последовательность, кодирующую полноразмерную RTB, получали из двух плазмид pNRTB и pCRTB при помощи эндонуклеаз рестрикции EcoRI и AflII (рис. 2). Последовательности всех рекомбинантных генов были подтверждены секвенированием по Сэнгеру.

Плазмидные ДНК pRTA и pRTB трансформировали электропорацией в клетки E. coli M15 [pREP4] (QIAGEN, CША). Выбранные по результатам секвенирования и рестрикционного анализа штаммы M15 [pREP4, pRTA] и M15 [pREP4, pRTB], выращивали на среде, содержащей ампициллин и канамицин;

экспрессию рекомбинантных генов индуцировали добавлением изопропил--D тиогалактопиранозида (ИПТГ). В дальнейших исследованиях трансформацию, селекцию клонов и индукцию экспрессии проводили аналогичным образом.

Индукция экспрессии рекомбинантных генов RTA и RTB в E. coli при помощи ИПТГ не привела к накоплению белковых продуктов ожидаемой молекулярной массы (~30 кДа), что было выявлено при помощи электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) c окраской по Кумасси. Отсутствие видимого накопления целевых белков, вероятно, может быть связано с их протеолизом, так как они являются гетерологичными для клеток E. coli.

2. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в цитоплазме E. coli Для увеличения уровня продукции, стабилизации и устойчивости к протеолизу гетерологичных рекомбинантных белков в клетках E. coli в генно-инженерной практике часто используют технологию создания слитных (химерных) белков [Terpe K., 2003], основанную на соединении в одной рамке трансляции нескольких генов, например, гена белка-носителя и гена исследуемого продукта. Белок-носитель при этом может способствовать накоплению целевого белка в клетках и его эффективной очистке на аффинном сорбенте, способствовать его фолдингу и растворимости в цитоплазме клетки. В качестве белка-носителя нами был выбран целлюлозосвязывающий домен (CBD) фермента эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilum, который, с одной стороны, может способствовать защите целевого белка от протеолиза, а с другой, обеспечивать возможность высокоэффективной одностадийной очистки, концентрации и иммобилизации целевого белка на дешевом и доступном целлюлозном сорбенте. В результате получения гибридных конструкций, содержащих в одной рамке трансляции нуклеотидные последовательности CBD и целевого белка, удавалось получить продукцию белка, составляющую вплоть до 30% от тотального белка E. coli [Васекина А.В. и др., 2005;

Лящук A.M. и др., 2006].

На основе вектора pQE6 нами были созданы генно-инженерные конструкции pRTAspCBD и pRTВspCBD, содержащие в своем составе нуклеотидные последовательности, кодирующие аутентичные RTA и RTB, соответственно, слитые с (Gly-Ser)5-спейсером (sp) и CBD (рис. 3).

pspCBD Pис. 3. Схемы генно-инженерных конструкций pspCBD, NcoI BamHI HindIII pRTAspCBD, pRTBspCBD:

Promoter T5 – промотор бактериофага T5;

SD – Promoter T5 SD sp CBD Terminator последовательность Шайна Дальгарно;

RТA – нуклеотидная pRTAspCBD последовательность, кодирующая NcoI BamHI HindIII A-субъединицу рицина;

RТB – нуклеотидная последовательность, кодирующая B-субъединицу Promoter T5 SD RTA sp CBD Terminator рицина;

sp – нуклеотидная последовательность кодирующая pRTBspCBD спейсер, состоящий из 5 повторов NcoI BamHI HindIII Gly-Ser;

CBD – нуклеотидная последовательность, кодирующая целлюлозосвязывающий домен;

Promoter T5 SD RTB sp CBD Terminator Terminator – терминатор транксрипции.

Для этого нуклеотидные последовательности RTA и RTB из плазмид pRTA и pRTB при помощи эндонуклеаз рестрикции NcoI и BamHI были встроены в плазмиду pspCBD, предварительно полученную в два этапа. На первом этапе химико ферментативным синтезом получали нуклеотидную последовательность (Gly-Ser)5 спейсерa из олигонуклеотидов, в которых были запланированы сайты рестрикции BamHI, BglII и HindIII:

BamHI (полусайт) BglII SP-F: 5'-GATCCCCGGGTTCTGGCTCCGGCTCTGGTTCCGGTTCTGGCGCCAGATCTA-3', HindIII (полусайт) SP-R:5'-AGCTTAGAACTGGCGCCAGAACCGGAACCAGAGCCGGAGCCAGAACCCGGG-3'.

Полученные фрагменты встраивали в плазмиду pQE6 при помощи эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII и получали плазмиду pQE6sp. На втором этапе получали нуклеотидную последовательность CBD из гена CelD. Для этого специфический участок хромосомной ДНК A. thermophilum амплифицировали при помощи специфических праймеров, спланированных на основе последовательности гена СelD A. thermophilum, аннотированной в банке данных GenBank (Accession No. Z77855). В праймерах были запланированы сайты рестрикции BamHI, BglII и HindIII, а также терминирующий кодон:

BamHI CBD-F: 5'-AAAGAAGGATCCAATGCACCTTTAGGCG-3', HindIII Stop BglII CBD-R: 5'-TCAAAAAGAAGCTTTTAAGATCTAACATTATCTATATAC-3'.

Полученный ПЦР-фрагмент гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII и встраивали в плазмиду pQE6sp, гидролизованную эндонуклеазами рестрикции BglII и HindIII, получая плазмиду pspCBD (рис. 3). Последовательности всех полученных генов были подтверждены секвенированием по Сэнгеру.

Индукция экспрессии рекомбинантных генов в E. coli при помощи ИПТГ не привела к накоплению белков продуктов RTAspCBD и RTВspCBD ожидаемой молекулярной массы (~52 кДа), что было выявлено при помощи электрофореза в 10% ДСН-ПААГ с окраской по Кумасси. Отсутствие видимой продукции, возможно, может быть связано с протеолизом в цитоплазме E. coli гетерологичных рекомбинантных белков RTAspCBD и RTВspCBD.

Ранее было показано, что белок spCBD продуцируется в E. coli в водорастворимой форме, и его использование в качестве белка-носителя в составе химерных конструкций чаще всего способствует образованию водорастворимых продуктов. Известно, что водорастворимые продукты подвержены протеолизу в цитоплазме клеток E. coli в большей степени, чем гидрофобные продукты, образующие тельца включения. В связи с этим следующим этапом работы стало создание химерных белков, образующих тельца включения в E. coli.

3. Получение химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR и исследование их иммуногенных и антигенных свойств 3.1. Клонирование и экспрессия гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR Одним из известных подходов к получению рекомбинантных белков с низким уровнем экспрессии, а также белков, подверженных протеолизу в цитоплазме E. coli, является подход, направленный на получение этих белков в форме телец включения, представляющих собой водонерастворимые обособленные компартменты, препятствующие действию протеолитических ферментов. В качестве белка-носителя для RTA и RTB, способствующего образованию телец включения в цитоплазме клеток, мы использовали мышиную дигидрофолат редуктазу (DHFR).

Pис. 4. Схемы генно-инженерных конструкций pQE16, pRTA pQE DHFR, pRTB-DHFR: Promoter T EcoRI BamHI – промотор бактериофага T5;

SD – последовательность Шайна Дальгарно;

RТA – нуклеотидная Promoter T5 SD DHFR 6His Terminator последовательность, кодирующая A-субъединицу рицина;

RТB – pRTA-DHFR нуклеотидная EcoRI BamHI последовательность, кодирующая B-субъединицу рицина;

DHFR – нуклеотидная Promoter T5 SD RTA DHFR 6His Terminator последовательность, кодирующая мышиную дигидрофолат pRTB-DHFR редуктазу;

6His – нуклеотидная EcoRI BamHI последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, состоящую Promoter T5 SD RTB DHFR 6His Terminator из шести остатков гистидина;

Terminator – терминатор транксрипции.

Для получения плазмидных генно-инженерных конструкций pRTA-DHFR и pRTВ-DHFR (рис. 4), несущих гибридные гены химерных белков RTA-DHFR и RTB DHFR, последовательности, кодирующие RTA и RTB из плазмид pRTA и pRTB, встраивали в экспрессионный плазмидный вектор pQE16 (Apr) (QIAGEN, США) при помощи эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI. Вектор pQE16, в свою очередь, содержит последовательность, кодирующую в одной рамке считывания DHFR и пептид из шести аминокислотных остатков гистидина (6His) на С-конце DHFR, позволяющий производить очистку рекомбинантных белков на Ni-NTA-содержащих сорбентах. Полученные гены были подтверждены секвенированием по Сэнгеру.

Наблюдали замедление роста клеток, трансформированных плазмидой pRTA DHFR по сравнению с ростом клеток, трансформированных плазмидами pRTB-DHFR и pQE16 (рис. 5). Кроме того, происходило снижение выхода на 18% биомассы, обладающей замедленным ростом, по сравнению с выходом остальных вариантов биомассы. Это может свидетельствовать о токсичности для клеток E. coli, продуцируемого штаммом M15 [pREP4, pRTA-DHFR], накапливающегося в цитоплазме, целевого белка RTA-DHFR, причем токсичность в этот химерный белок привносится именно доменом RTA, а не DHFR. Возможно, что в случае экспрессии аутентичной RTA, целевой белок просто не успевал проявить своего токсического действия на клетки в следствие протеолиза, поэтому в том случае не отмечали как замедления роста клеток, так и появления самого продукта.

Оптич. плотность при 550 нм 4, б 4, в 3, Рис. 5. Динамика роста клеток E. coli штаммов:

3, а) M15 [pREP4, pRTA-DHFR], б) M15 [pREP4, pRTB а 2, DHFR] и в) M15 [pREP4, pQE16];

инкубация при 2, 37С, 240 об/мин, в 500-мл колбах, в 100 мл среды 1, LB.

1, 0, 0, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Время, часы Механизм токсического действия RTA-DHFR может быть связан с N гликозидазной активностью RTA, которая, возможно, проявляется не только в цитоплазме эукариот, где ее субстратом является 28S рРНК, но и в цитоплазме прокариот, где ее субстратом может являться 23S РНК [Endo Y. et. al., 1988], а также другие нуклеиновые кислоты, в том числе плазмидные ДНК [Wang S.T. et. al., 2005].

После индукции экспрессии рекомбинантных генов в штаммах E. coli M15 [pREP4, pRTA-DHFR], E. coli M15 [pREP4, pRTB-DHFR] обнаруживалось накопление белковых продуктов ожидаемой молекулярной массы (~52 кДа). Уровень продукции целевых белков составил приблизительно 5–7% от общего клеточного белка при экспрессии после индукции ИПТГ в течении 3 ч при 37С (рис. 6).

Увеличение времени экспрессии свыше 3 ч не способствовало увеличению уровня продукции целевых белков.

1 2 3 4 5 6M Рис. 6. Электрофореграмма белков в 10% ДСН ПААГ с окрашиванием по Кумасси. Лизаты 52 кДа клеток E. coli M15 [pREP4]: 1 –– до индукции;

2 – 66 кДа – после индукции. Лизаты клеток E. coli M [pREP4, pRTA-DHFR]: 3 –– до индукции;

4 – 45 кДа после индукции. Лизаты клеток E. coli M [pREP4, pRTB-DHFR]: 5 –– до индукции;

6 –– после индукции. М – маркеры молекулярной массы: бычий сывороточный альбумин – 66 кДа, овальбумин – 45 кДа.

В результате анализа распределения целевых белков RTA-DHFR и RTB-DHFR в клетках E. coli было показано, что целевые белки накапливаются в них примерно в равной степени, как в виде телец включения, так и в растворимой форме (рис. 7).

Рис. 7. Электрофореграмма белков в 10% ДСН ПААГ с окраской по Кумасси. Анализ 1 2 3 4 5 6M распределения белка RTA-DHFR в клетках E. coli штамма M15 [pREP4, pRTA-DHFR]: 1 – 66 кДа лизат клеток после индукции;

2 – растворимая 52 кДа фракция лизата;

3 – нерастворимая фракция 45 кДа лизата;

белка RTB-DHFR в клетках E. coli штамма M15 [pREP4, pRTB-DHFR]: 4 – лизат клеток после индукции;

5 – растворимая фракция лизата;

6 – нерастворимая фракция лизата. M – маркеры молекулярный массы: бычий сывороточный альбумин – 66 кДа, овальбумин – 45 кДа.

3.2. Выделение и очистка химерных белков RTA-DHFR и RTВ-DHFR Выделение и очистку белков RTA-DHFR и RTB-DHFR проводили как из водорастворимой фракции клеточного лизата, так и из водонерастворимой (из телец включения) на колонке с Ni-NTA-агарозой (QIAGEN, США). Тельца включения предварительно растворяли в 6 M гуанидин хлориде. Были получены препараты очищенных белков с концентрацией 1 мг/мл. Чистота белков RTA-DHFR и RTB DHFR составляла не менее 95% (рис. 8). Выход белков составил приблизительно 8 мг из 1 л культуры для RTA-DHFR и приблизительно 10 мг из 1 л культуры для RTB DHFR Рис. 8. Электрофореграмма белков в 10% ДСН-ПААГ с окраской по Кумасси. Очистка белков RTA-DHFR и 1 23 4 5 67 8М RTB-DHFR на колонке с Ni-NTA-агарозой: 1 – M 66 кДа [pREP4, pRTA-DHFR] – растворимая фракция лизата;

2 – очищенный белок RTA-DHFR из растворимой фракции;

3 – M15 [pREP4, pRTA-DHFR] – 52 кДа нерастворимая фракция лизата;

4 – очищенный белок 45 кДа RTA-DHFR из нерастворимой фракции;

5 – M [pREP4, pRTB-DHFR] – растворимая фракция лизата;

6 – очищенный белок RTB-DHFR из растворимой фракции;

7 – M15 [pREP4, pRTB-DHFR] – нерастворимая фракция лизата;

8 – очищенный белок RTB-DHFR из нерастворимой фракции. M – маркеры молекулярной массы: бычий сывороточный альбумин – 66 кДа, овальбумин – 45 кДа.

3.3. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTA-DHFR и RTВ-DHFR Очищенными антигенами RTA-DHFR и RTB-DHFR проводили иммунизацию кроликов. Животные остались живыми на протяжении всего курса иммунизации.

Можно предположить, что данные белковые препараты не обладают летальной токсичностью в дозировке необходимой для иммунизации. Активность и специфичность антител в кроличьих гипериммунных сыворотках определяли при помощи непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), где в качестве сенсибилизирующих антигенов были применены химерные белки RTA DHFR, RTB-DHFR и нативный рицин.

aA 14000 aB Титр антител aA aB aA aB Ns Ns Ns Рицин RTA-DHFR RTB-DHFR Рис. 9. Определение титра и специфичности антител в гипериммунных сыворотках крови кролика методом непрямого ИФА: RTA-DHFR, RTB-DHFR, рицин – антигены, сорбированные на плашке;

Ns – предиммунная сыворотка;

аА – гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTA-DHFR;

аВ – гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTB-DHFR. Титром антител считали обратную величину последнего разведения, в котором оптическое поглощение при длине волны нм (ОП450) исследуемого образца сыворотки в 2 раза превышает ОП450 в отрицательном контроле.

Гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTA-DHFR, проявляла активность в разведении 1:12800 как по отношению к исследуемому антигену RТA DHFR, так и в разведении 1:6400 по отношению к нативному рицину. Гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTB-DHFR, проявляла активность в разведении 1:12800 как по отношению к исследуемому антигену RТB-DHFR, так и в разведении 1:6400 по отношению к нативному рицину. Наблюдали незначительную перекрестную специфичность в сыворотках (активность в разведении 1:1600), обусловленную присутствием в составе рекомбинантов общей структуры DHFR (рис.

9). Полученные результаты показали, что химерные белки RTA-DHFR и RTB-DHFR сохранили антигенные детерминанты нативного рицина.

Технология очистки полученных антигенов на Ni-NTA содержащем сорбенте рациональна лишь для их получения в лаборатории в научно-исследовательских целях, но не в производственной практике, из-за высокой стоимости Ni-NTA содержащего сорбента. Целлюлоза, в свою очередь, является в десятки раз более дешевым сорбентом и значительно более доступным. Поэтому далее было решено добиться накопления в E. coli антигенов рицина с CBD путем их секреции в периплазму.

4. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в периплазме E. coli и исследование их иммуногенных и антигенных свойств 4.1. Клонирование и экспрессия гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTВspCBD Накопление гетерологичных белков в растворимой форме в цитоплазме E. coli часто приводит к их протеолизу. Известно, что в периплазме E. coli рекомбинантные белки не подвержены протеолизу, а присутствующие в ней ферменты способствуют более правильному сворачиванию белка [Blight M.A., et. al., 1994]. Поэтому следующим этапом нашей работы стало создание штаммов-продуцентов белков RTAspCBD и RTВspCBD, обеспечивающих секрецию этих белков в периплазму. Для того чтобы секретировать рекомбинантный белок в периплазму, в генно-инженерной практике в его состав вводят N-концевой сигнальный пептид, который направляет белок в периплазму и при этом отщепляется клеточной сигнальной пептидазой во время транслокации белка через периплазматическую мембрану. В качестве сигнального пептида нами был выбран сигнальный пептид L-аспарагиназы II E. coli (Sig), являющийся гомологичным для клеток E. coli, что должно обеспечивать эффективную секрецию рекомбинантных белков в периплазму и отщепление сигнального пептида.

pSigRTAspCBD MunI NcoI BamHI HindIII Promoter T5 SD Sig RTA sp CBD Terminator pSigRTBspCBD MunI NcoI BamHI HindIII Promoter T5 SD Sig RTB sp CBD Terminator Pис. 10. Схемы генно-инженерных конструкций pSigRTAspCBD, pSigRTBspCBD: Promoter T5 – промотор бактериофага T5;

SD – последовательность Шайна-Дальгарно;

Sig – нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид L-аспарагиназы II E. coli;

RТA – нуклеотидная последовательность, кодирующая A-субъединицу рицина;

RТB – нуклеотидная последовательность, кодирующая B-субъединицу рицина;

sp – нуклеотидная последовательность кодирующая спейсер, состоящий из 5 повторов Gly-Ser;

CBD – нуклеотидная последовательность, кодирующая целлюлозосвязывающий домен;

Terminator – терминатор транскрипции.

Для получения таких штаммов-продуцентов нами были получены плазмиды pSigRTAspCBD и pSigRTВspCBD (рис. 10). Данные плазмиды несут гибридные гены химерных белков, состоящих из А- и В-субъединиц рицина, (Gly-Ser)5-cпейсера, целлюлозосвязывающего домена и сигнального пептида. Для их получения, в плазмидные конструкции pRTAspCBD и pRTВspCBD встраивали последовательность, кодирующую сигнальный пептид (Sig) при помощи эндонуклеаз рестрикции MunI и NcoI. Данную последовательность получали химико ферментативным способом из олигонуклеотидов, в которых были запланированы сайты рестрикции MunI и NcoI, а также инициирующий кодон:

MunI (полусайт) Start SIG-F1: 5’-AATTGATTAAAGAGGAGAAATTAACTCTATGGAGTTTTTTAAAAAGACG-3’ SIG-F2:

5’-GCACTTGCCGCACTGGTTATGGGTTTTAGTGGTGCAGCATTGGCATTACCCAATATCAC-3’ SIG-R1:

5’-GTGCGGCAAGTGCCGTCTTTTTAAAAAACTCCATAGAGTTAATTTCTCCTCTTTAATC-3’ NcoI (полусайт) SIG-R2: 5’-CATGGTGATATTGGGTAATGCCAATGCTGCACCACTAAAACCCATAACCA-3’ Нуклеотидные последовательности полученных рекомбинантных генов были подтверждены секвенированием по Сэнгеру.

Индукция экспрессии полученных генов в штаммах E. coli M15 [pREP4, pSigRTAspCBD], M15 [pREP4, pSigRTBspCBD] привела к накоплению белковых продуктов ожидаемой молекулярной массы (~52 кДа). Уровень продукции целевых белков в клетках E. coli, полученных при экспрессии после индукции с помощью ИПТГ в течении 18–20 ч при 25С, составил приблизительно 5– 10% от общего клеточного белка. Увеличение температуры до 37С и уменьшение времени экспрессии отрицательно сказывалось на уровне продукции целевых белков.

Анализ распределения целевых белков в клетках E. coli показал, что целевые белки накапливаются в периплазме, причем исключительно в растворимой форме (рис. 11).

Можно предположить, что происходит накопление именно процессированных белков – RTAspCBD и RTBspCBD, не содержащих на N-конце сигнального пептида.

1 2 3 4 56 7 8М Рис. 11. Электрофореграмма белков в 10% ДСН ПААГ с окрашиванием по Кумасси. Лизаты клеток 52 кДа E. coli M15 штамма-продуцента RTAspCBD: 1 – до 66 кДа индукции;

2 – после индукции;

3 – растворимая фракция;

4 – тельца включения. Лизаты клеток 45 кДа E. coli M15 штамма-продуцента RTBspCBD: 5 – до индукции;

6 – после индукции;

7 – растворимая фракция;

8 – тельца включения. M – маркеры молекулярной массы: бычий сывороточный альбумин – 66 кДа, овальбумин – 45 кДа.

4.2. Выделение и очистка химерных белков RTAspCBD и RTВspCBD Выделение и очистка целевых белков RTAspCBD и RTВspCBD были основаны на аффинных свойствах CBD фермента эндоглюканазы CelD из A. thermophilum, характеризующегося высокой константой связывания с целлюлозой в широком диапазоне ионной силы (0,01–4 М NaCl), pH (4–11) и температуры (0–75С).

Существенной особенностью CBD является сохранение его аффинных свойств при соединении с другими белками [Levy I. et. al., 2002].

Нами была разработана методика очистки белков RTAspCBD и RTВspCBD из растворимой фракции лизата биомассы E. сoli штаммов [pREP4, pSigRTAspCBD] и M15 [pREP4, pSigRTВspCBD], соответственно, с помощью целлюлозного сорбента. В соответствии с методикой: 1) проводили лизис штамма-продуцента;

2) центрифугировали полученный лизат;

3) супернатант смешивали с целлюлозным сорбентом и выдерживали 1 ч при комнатной температуре, далее переносили суспензию в хроматографическую колонку;

4) колонку промывали фосфатным буферным раствором (pH 7,4) c 1% тритоном X-100 от неспецифических примесей;

5) элюировали связавшиеся белки 8 М мочевиной;

6) ренатурировали белки при помощи ступенчатого диализа в фосфатный буферный раствор (pH 7,4). Данная технология очистки позволила эффективно выделить и очистить белки RTAspCBD и RTBspCBD от примесей штамма-продуцента. Их чистота составила не менее 95% (рис. 12).

1 2 3 4 М 52 кДа 66 кДа Рис. 12. Электрофореграмма белков в 10 % ДСН-ПААГ с окрашиванием по Кумасси. Очистка химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD на целлюлозе: 1, 3 –– лизаты клеток штаммов-продуцентов RТAspCBD и RTBspCBD 45 кДа после индукции ИПТГ;

2, 4 – препараты очищенных на целлюлозе белков RТAspCBD и RТВspCBD, соответственно. M – маркеры молекулярной массы: бычий сывороточный альбумин – 66 кДа, овальбумин – 45 кДа.

Были получены препараты очищенных белков с концентрацией 1 мг/мл. Выход белков составил приблизительно 5–10 мг из 1 л культуры. Наличие только одной полосы на ДСН-ПААГ, соответствующей приблизительно 52 кДа, может свидетельствовать о том, что белки полностью процессированы и не содержат примесей непроцессированных белков c N- концевым сигнальным пептидом (рис. 12).

Отсутствие сигнальной последовательности было подтверждено путем анализа трипсинового гидролизата продуктов с использованием MALDI-TOF-масс спектрометрии.

4.3. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RТAspCBD и RТBspCBD Очищенными белками RТAspCBD и RТBspCBD проводили иммунизацию кроликов. Животные остались живыми на протяжении всего курса иммунизации.

Можно предположить, что данные белковые препараты не обладают летальной токсичностью в дозировке необходимой для иммунизации. Анализ активности и специфичности антител в кроличьих гипериммунных сыворотках проводили при помощи непрямого твердофазного ИФА, где в качестве сенсибилизирующих антигенов были применены химерные белки RТAspCBD, RТBspCBD и нативный рицин. Гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTAspCBD, проявляла активность как в разведении 1:12800 по отношению к RТAspCBD, так и в разведении 1:6400 по отношению к нативному рицину при отсутствии активности предиммунной сыворотки к этим же антигенам (рис. 13). Аналогичную картину наблюдали в случае сыворотки, полученной в ответ на RTBspCBD, где она проявляла активность как в разведении 1:12800 по отношению к RТBspCBD, так и в разведении 1:6400 по отношению к нативному рицину. Наблюдали незначительную перекрестную специфичность (активность в разведении 1:3200) в сыворотках, обусловленную присутствием в составе рекомбинантов общей структуры spCBD. Полученные результаты показали, что химерные белки RTAspCBD и RTBspCBD сохранили антигенные свойства нативного рицина.

aA aB Титр антител aA aB aB aA Ns Ns Ns Рицин RTAspCBD RTBspCBD Рис. 13. Определение титра и специфичности антител в гипериммунных сыворотках крови кролика методом непрямого ИФА: RTAspCBD, RTBspCBD, рицин – антигены, сорбированные на плашке;

Ns – предиммунная сыворотка;

аА – гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTAspCBD;

аВ – гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTBspCBD. Титром антител считали обратную величину последнего разведения, в котором ОП450 исследуемого образца сыворотки в раза превышает ОП450 в отрицательном контроле.

Таким образом, проведенные нами экспериментальные исследования позволили создать эффективные штаммы-продуценты антигенов рицина – RTA и RTB, в составе химерных белков с CBD (RТAspCBD, RТBspCBD). Введение в состав данных белков N-концевого сигнального пептида, отщепляющегося после транслокации белка в периплазму, сыграло ключевую роль для накопления данных белков в клетках E. coli. Разработанная методика получения препаратов белков RTAspCBD и RTВspCBD представляет собой простой и технологичный процесс.

Преимуществом дальнейшего использования белков RTAspCBD и RTВspCBD перед использованием белков RTA-DHFR и RTВ-DHFR является то, что они синтезируются в E. coli в полностью водорастворимой форме и не требуют дополнительной солюбилизации, а также значительно более низкая стоимость целлюлозного сорбента по сравнению с Ni-NTA содержащими сорбентами. Наличие CBD позволяет получать препараты иммобилизованных на целлюлозе антигенов для решения различных биотехнологических задач, таких как: создание вакцин, антидотов и тест-систем.

Поэтому получение препаратов белков RTAspCBD и RTВspCBD является более экономически и технологически целесообразным, чем получение белков RTA-DHFR и RTB-DHFR.

ВЫВОДЫ 1. Сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гибридные гены химерных белков, состоящих из А- и В-субъединиц рицина и дигидрофолат редуктазы, обеспечивающие эффективную продукцию целевых белков как в водорастворимой форме, так и в форме телец включения в цитоплазме клеток E. coli.

2. Cконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гибридные гены химерных белков, состоящих из А- и В-субъединиц рицина, целлюлозосвязывающего домена и N-концевой сигнальной последовательности, обеспечивающие эффективную продукцию целевых белков в водорастворимой форме в периплазме клеток E. coli.

3. Разработана технологичная и высокоэффективная методика выделения, очистки и иммобилизации белков, состоящих из субъединиц рицина и целлюлозосвязывающего домена на целлюлозном сорбенте.

4. Изучены иммуногенные и антигенные свойства полученных белков. Показано, что они индуцируют выработку высокого титра специфических к нативному рицину антител.

5. Предложено использование белков с целлюлозосвязывающим доменом, как наиболее технологически и экономически выгодных, для создания тест-систем, вакцин и антидотов.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Грачева М.А., Евстифеев В.В., Галушкина З.М., Полетаева Н.Н., Лунин В.Г.,. Швец В.И. Клонирование и экспрессия в Escheriсhia coli А- и В-субъединиц рицина в составе химерных белков с дигидрофолат редуктазой. // Вестник МИТХТ. – 2007. – T. 2. – № 6. – С. 39-46.

2. Грачева М.А., Попадьин П.В., Евстифеев В.В., Галушкина З.М., Полетаева Н.Н., Верховская Л.В., Лунин В.Г., Швец В.И.. Экспрессия в Escheriсhia coli А- и В субъединиц рицина в составе химерных белков с целлюлозосвязывающим доменом и их одностадийная аффинная очистка на целлюлозе. // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. – 2008. – № 3. – С. 50-56.

3. Грачева М.А., Лунин В.Г., Швец В.И. Разработка технологии получения белковых компонентов для создания тест-систем экспресс-индикации рицина и кандидатной субъединичной противорициновой вакцины. // Матер. конф., посвященной 120-й годовщине со дня рождения академика Николая Ивановича Вавилова «Вавиловские чтения–2007», Саратов, 26–30 ноября 2007. – Т. 1. – С. 300.

4. Грачева М.А., Лунин В.Г., Швец В.И. Получение рекомбинантных А- и В субъединиц рицина для создания тест-систем, вакцин и антидотов против рицина.

// Тез. докл. VIII Молодежной науч. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2 апреля 2008. – С. 13-14.

5. Грачева М.А., Лунин В.Г., Швец В.И. Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином. // Сб. трудов Всероссийской научно практической конференции посвященной 10-летию биотехнологического факультета Курского государственного медицинского университета «Биомедицинская инженерия и биотехнология», Курск, 29-30 апреля 2008, С. 84 86.

6. Грачева М.А., Лунин В.Г., Швец В.И. Получение рекомбинантных субъединиц рицина для создания тест-систем, вакцин и антидотов против рицина. // Сб. трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008. – С. 426.

Подписано в печать 13.05.2008 г.

Усл.печ.л. 1 Тираж 100 экз. Заказ № Отпечатано в типографии «АллА Принт» Тел. (495) 621-86-07, факс (495) 621-70- www.allaprint.ru

 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.