авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Выделение и культивирование вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов

На правах рукописи

ГАВРИЛОВА Вера Львовна ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ 03.00.06 «Вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир-2007

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор Байбиков Тауфик Закарьевич

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Русалеев Владимир Сергеевич, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир;

доктор биологических наук, профессор Еремец Владимир Иванович, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ «ВНИТИБП»), г. Щелково Московской области

Ведущая организация: ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»), г. Москва

Защита диссертации состоится «20» ноября 2007г. в 10 часов на заседании дис сертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Автореферат разослан «18» октября 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М. Семенова 1.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - контагиозное заболевание, наносящее ощутимый экономический ущерб сви новодству. Оно характеризуется поздними абортами, преждевременными опоросами или прохолостами у супоросных свиноматок, рождением мертвых или нежизнеспо собных поросят, гибелью новорожденных поросят, поражением органов дыхания у поросят разных возрастных групп [В.А. Мищенко,1995;

Т.З. Байбиков,2000].

РРСС был впервые зарегистрирован в свиноводческих хозяйствах США и Ка нады в 1986-1987гг., а возбудитель заболевания был выделен с помощью первичной культуры альвеолярных макрофагов свиней (АМС) в 1991 году. В последующее деся тилетие это заболевание было установлено в большинстве стран мира с развитым свиноводством [W.T. Christianson and H.S. Joo,1994;

K.D. Rossow,1998].

Возбудителем РРСС является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейст ву Arteriviridae, роду Arterivirus [S. Dea et al.,2000;

D. Therrien et al.,2000]. Для вируса РРСС характерна генетическая и антигенная вариабельность [Т.В. Гребенникова и др.,2004;

R. Forsberg et al.,2002;

S. Indic,2005]. Ежегодно в различных странах мира выделяют новые изоляты вируса РРСС, только в Испании их насчитывают свыше [S. Pesch et al.,2005]. На основании генетических и антигенных отличий изоляты раз деляют на две генетические группы: американскую и европейскую [X.J. Meng et al., 1995;

C.J. Nelsen et al.,1999;

S.K. Kleiboeker et al.,2005]. По данным GenBank (банк ге нетических последовательностей) и литературы, в Юго-Восточной Азии, в том числе и в Китае, в последнее время циркулирует вирус РРСС американского генотипа, вы зывающий болезнь свиней, сходную по течению и клиническому проявлению с клас сической чумой свиней (быстрое распространение, заболеваемость до 100%, смерт ность - 25-50%) [K. Tian et al.,2007]. Во многих лабораториях разработаны и совер шенствуются различные серологические и молекулярно-биологические методы диаг ностики РРСС [В.В. Куриннов,1995;

А.В. Каньшина,2004].

РРСС изучается с 1991 г. во многих странах мира, а в России и других странах СНГ он известен только с 1993 г. [В.А. Мищенко,1995;

А.А. Коломыцев,1996]. Не смотря на это, до сих пор существуют трудности при выделении вируса и его адапта ции в течение длительного культивирования к первичным и перевиваемым культурам клеток [О.В. Суханова,1997;

Н.С. Дудникова и др.,2002].

Вирус РРСС очень изменчив - генетические различия между российскими изо лятами составляют до 17% [В.Г. Андреев и др.,1999;

А.В. Щербаков и др.,2003]. В связи с этим, выделение новых изолятов вируса РРСС, циркулирующих в свиновод ческих хозяйствах России, изучение и использование их для оптимизации средств ди агностики и специфической профилактики являются актуальными задачами.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось выде ление и изучение культуральных свойств изолятов вируса РРСС и оценка возможно сти их использования для приготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить изоляты вируса РРСС, циркулирующие в свиноводческих хозяйст вах России;

- изучить особенности репродукции вируса РРСС в различных системах куль тивирования с использованием референтных штаммов;

- изучить культуральные и антигенные свойства выделенных изолятов по срав нению с известными штаммами вируса РРСС;

- оптимизировать и модифицировать методы лабораторной диагностики РРСС с использованием реакции нейтрализации (РН), непрямой реакции иммунофлюорес ценции (НРИФ), непрямой реакции гемагглютинации (РНГА) и непрямого варианта ИФА;

- оценить возможность применения оптимизированных и модифицированных серологических реакций для оценки антигенной активности вакцин;

- исследовать сыворотки крови свиней на наличие антител к вирусу РРСС от экспериментально зараженных и вакцинированных против РРСС животных;

- провести серомониторинг по РРСС в России.

Научная новизна исследований. Новизна исследования состоит в том, что:

- выделен и адаптирован к перевиваемой культуре клеток MARC-145 изолят вируса РРСС «Кемеровский-96»;

- изучены иммунобиологические свойства изолята «Кемеровский-96», который был депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорга низмов (ФГУ «ВГНКИ»), используемых в ветеринарии и животноводстве, под наиме нованием штамм «КПР-96»-ДЕП и предложен для использования в качестве произ водственного;

- на основе штамма «КПР-96» созданы моно- и ассоциированная вакцины про тив РРСС;

- для оценки антигенной активности вакцин против РРСС рекомендованы мо дифицированные серологические реакции: РН, НРИФ, РНГА и ИФА.

Научная новизна исследования подтверждена тремя патентами Российской Фе дерации:

- Патент на изобретение №2295567 «Штамм «КПР-96» вируса репродуктивно респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и/или вакцин ных препаратов» (2007г.);

- Патент на изобретение №2236253 «Вакцина эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (2004г.);

- Патент на изобретение №2269361 «Вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (2006г.).

Практическая значимость исследований. Результаты исследований вошли в нормативную документацию:

- Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (ТУ 9384-026-00008064-99), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.06.1999г. (изменения внесены 01.04.2005г.);

- Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (ТУ 9384-153-00495527 2005), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.06.2006г.

Кроме того, результаты исследований использованы при подготовке следую щих методик и методических указаний, которые одобрены ученым советом и утвер ждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:

1. «Методика постановки реакции нейтрализации для ретроспективной диагно стики репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС)» (1995г.) 2. «Методические указания по выявлению и титрованию специфических анти тел в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) с помощью непрямой реакции иммунофлюоресценции (НРИФ)» (1999г.) 3. «Методические указания по применению набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в реакции непрямой гемагглютинации» (1999г.) 4. «Методика определения антител в сыворотке крови свиней к вирусу репро дуктивно-респираторного синдрома свиней методом непрямого иммуноферментнго анализа» (2000г).

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано научных работ, в том числе две работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены, обсуждены и опубли кованы в материалах научных конференций «Современные аспекты ветеринарной па тологии животных» (Владимир, 1998г.), «Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных» (Воронеж, 1999г.), «Научные основы производства ветеринар ных биологических препаратов» (Щелково, 2000г.), «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных» (Воронеж, 2005г.), «Актуаль ные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса» (Иваново, 2005г.), «Проблемы инфекционной патологии свиней» (XIV Московский Междуна родный ветеринарный конгресс, Москва, 2006г.), а также на заседаниях ученого сове та ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 1994-2006гг.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие доктор ветеринарных наук Ш.К. Куляшбекова (раздел 2.2.1.1), кандидат ветеринарных наук С.А. Кукушкин (раз делы 2.2.1.4, 2.2.3.1), кандидат ветеринарных наук И.А. Тетерин (раздел 2.2.4.4), кан дидат ветеринарных наук А.И. Егорова (раздел 2.2.5.3), кандидат ветеринарных наук И.Я. Курман (раздел 2.2.5.4), за что автор приносит им сердечную благодарность.

Основные положения, выносимые на защиту - результаты выделения из патологических материалов вируса РРСС и его адаптации к различным культурам клеток;

- оптимизация и модификация лабораторных диагностических реакций с ис пользованием РН, НРИФ, РНГА и ИФА для серодиагностики РРСС;

- результаты обнаружения вируса РРСС при помощи НРИФ в патологических материалах, полученных от экспериментально инфицированных или переболевших свиней;

- оценка антигенной активности вакцин против РРСС с помощью РН, НРИФ, РНГА и ИФА;

- результаты исследований на наличие антител к вирусу РРСС в сыворотках крови, полученных от свиней из хозяйств и от экспериментально зараженных живот ных, в РН, НРИФ, РНГА и ИФА.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 168 страницах и со держит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и прило жения. Список используемой литературы включает 256 источников, из которых на иностранных языках. Работа иллюстрирована 3 рисунками и 35 таблицами.

Исследования по диссертационной работе являются частью комплексных тем НИР «Проведение исследований по разработке и освоению в условиях производства средств и методов борьбы с особо опасными и карантинными болезнями и инфек циями сельскохозяйственных животных» (государственный контракт №808/26) и «Совершенствование методов диагностики и профилактики инфекционных заболе ваний свиней» (шифр «Ветеринарное благополучие» 3-02), которые выполнялись в 1994-2006гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (до 2003г. – ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир).

2. Собственные исследования Материалы и методы Вирусы. В работе использовали следующие штаммы вируса РРСС:

- европейский прототипный штамм Lelystad (Нидерланды), полученный из Центральной ветеринарной лаборатории (Великобритания, Weybridge), с 1 по 8 пас сажи в перевиваемой культуре клеток MARC-145 и с 1 по 5 пассажи в АМС;

- американский штамм NVSL (США), полученный из США (National Animal Disease Center UIDA, Agricultural Research Service, Ames, Iowa, 50010, USA), с 1 по пассажи в перевиваемой культуре клеток MARC-145 и с 1 по 5 пассажи в АМС;

- вакцинный штамм «БД» (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья живот ных»), полученный в лаборатории болезней свиней ФГУ «ВНИИЗЖ», с 1 по 20 пас сажи в перевиваемой культуре клеток MARC-145;

- производственный штамм «КПР-96» (ФГУ «Федеральный центр охраны здо ровья животных»), полученный в лаборатории болезней свиней ФГУ «ВНИИЗЖ», с по 70 пассажи в перевиваемой культуре клеток MARC-145.

В экспериментальной работе использовались также изоляты вируса РРСС, вы деленные из патологических материалов от свиней.

Культуры клеток. Для культивирования вируса РРСС применяли следующие культуры клеток: альвеолярные макрофаги свиней, которые отбирали от клинически здоровых поросят в возрасте 4-6 недель;

перевиваемую культуру клеток почки эм бриона макаки - резус МА-104 и ее клон MARC-145;

перевиваемую культуру клеток почки зеленой африканской мартышки Vero, полученные в 1994г. из США (National Animal Disease Center UIDA, Agricultural Research Service, Ames, Iowa, 50010, USA), с 1 по 20 пассажи, и другие.

Сыворотки и питательные среды. Для культивирования перевиваемых куль тур клеток использовали ростовые среды на основе минимальной среды Игла (Sigma, США), питательные среды полусинтетическую (ПСП) и синтетическую (ПСС). При определении стерильности вирусного материала и полученного препарата согласно ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Методы биологического контроля сте рильности» применяли бактериальные среды: мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, среду Китта-Тароцци и агар Сабуро.

Подопытные животные. В лабораторных опытах использовали свиней пород крупная белая и ландрас:

- поросят-сосунов разного возраста с массой тела 1.5-8.0 кг - 23 шт.;

- подсвинков 2-4 мес. возраста с массой тела 15-30 кг - 146 шт.;

- супоросных свиноматок с массой тела 100-120 кг - 2 шт.

Для изучения безвредности и иммуногенной активности вакцин кроме свиней использовали лабораторных животных:

- кроликов пород советская шиншилла и серебристый с массой тела 2.0-2.5кг 175 шт.;

- морских свинок двухцветных с массой тела 250-300 г - 40 шт.;

- белых мышей беспородных с массой тела 18-21г - 230 шт.

Вакцины. В лабораторных исследованиях по оценке антигенной активности вакцин использовали эмульсионные инактивированные вакцины на основе минераль ного масла фирмы «ESSO» Marcol-52 и масляного адъюванта фирмы «Seppic» Mon tanide ISA-70: моновалентную против РРСС и ассоциированную против РРСС и пар вовирусной инфекции свиней (ПВИС) вакцины.

Серологические методы исследования. Для проверки активности и специфич ности сывороток крови животных, специфичности антигенов вируса РРСС применяли РН, НРИФ, РНГА и ИФА (по методикам ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных») и коммерческий набор ИФА, фирмы «IDEXX» (США).

Получение специфических сывороток крови. Для получения специфических к вирусу РРСС сывороток крови животных проводили их иммунизацию препаратами, содержащими антигены вируса штаммов Lelystad, NVSL, «БД» и «КПР-96», культи вируемого в первичной культуре клеток АМС или перевиваемой культуре клеток MARC-145. Активность сывороток определяли в РН, НРИФ, РНГА и ИФА.

Обработка полученных результатов. Для вычисления среднего арифметиче ского и среднего квадратического значений, или стандартного отклонения, использо вали компьютерные программы Microsoft Excel 2003 и Origin 0.5.

2.2. Результаты собственных исследований Культивирование вируса РРСС в перевиваемой культуре клеток MARC-145 и альвеолярных макрофагах свиней Перевиваемая культура клеток MARC-145, клон культуры клеток почки эм бриона макаки-резус - MA-104, была получена из научно-исследовательского центра здоровья животных, штат Айова (США) в 1994 году и до настоящего времени успеш но поддерживается в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

После получения перевиваемой культуры клеток MARC-145 перед нами встала задача по изучению ее ростовых свойств и условий культивирования. В процессе вы ращивания и пересева перевиваемой культуры клеток MARC-145 мы адаптировали ее к нашим условиям культивирования (питательным средам, сывороткам, глютамину, промывочным и диспергирующим растворам, подготовленной по принятой у нас тех нологии обработки посуде и др.). Выращивание культуры клеток MARC-145 прово дили в стеклянных матрасах объемом 50 и 1500 см3 при заполнении их клеточной суспензией на 1/5 и на 1/7 от их объема, соответственно.

В процессе адаптирования перевиваемой культуры клеток MARC-145 были по добраны подходящие для ее культивирования питательные среды, количество глюта мина и сыворотки крови КРС (или фетальной сыворотки), посевная концентрация клеток и установлен оптимальный уровень рН (7.2-7.4) питательной cреды. Суспен зию клеток MARC-145 с различной концентрацией вносили по 200 см3 в четыре клинских матраса, затем через 10 часов - еще в четыре клинских матраса (чтобы мож но было наблюдать за формированием монослоя через 2, 14, 16, 18, 20 и 22 часа после посева). Наблюдение за культурой клеток проводили каждые 2 часа в течение дня.

Результаты исследований по выявлению оптимальной посевной концентрации клеток MARC-145 представлены в таблице 1.

Таблица Результаты изучения влияния посевной концентрации клеток MARC-145 на скорость формирования и качество монослоя n= Концентрация клеток, Время формирования Оценка монослоя клеток тыс. кл/см3 монослоя клеток, часы неудовлетворительный 75±5 108± удовлетворительный 95±5 84± хороший 130±20 60± удовлетворительный 225±25 36± неудовлетворительный 350±50 24± Данные таблицы 1 показывают, что качественный монослой культуры клеток MARC-145 получали через 60±5 часов при посевной концентрации 130±20 тыс.

кл/см3. При использовании более низкой посевной концентрации клеток монослой формировался позднее и не был сплошным. Применение высокой посевной концен трации приводило к формированию плотного монослоя через сутки после посева и вытеснению клеток на поверхность монослоя.

При испытании влияния ростовых питательных сред (RS-3M, Игла, 199, ПСП и смеси питательных сред в равных пропорциях ПСП+ПСС) на скорость и качество формирования монослоя клеток MARC-145 в данные среды добавляли 10% сыворот ки крови КРС (или фетальной сыворотки), 0.3-1.0 мг/см3 глютамина и вносили сус пензию клеток MARC-145.

При использовании питательной среды 199 монослой был плотный и ровный (через 2 дня после посева). Питательные cреды RS-3M и Игла также обеспечивали формирование хорошего сплошного монослоя, но на 1-2 суток позже, чем при ис пользовании питательной среды 199. Применение питательных сред ПСП и ПСП+ПСС приводило к образованию изолированных зон роста клеток, которые не всегда смыкались в сплошной монослой через 4 дня после посева клеток.

Особенности репродукции вируса РРСС в альвеолярных макрофагах свиней и в перевиваемой культуре клеток MARC- Известно, что вирус РРСС подразделяется на две геногруппы: европейскую и американскую, между которыми имеется определенная генетическая и антигенная связь и существенные отличия. Прототипным представителем европейского генотипа вируса РРСС является штамм Lelystad, одним из типичных американских штаммов NVSL [А.В. Щербаков, 2003;

X.J. Meng et al., 1995;

C.J. Nelsen et al.,1999].

На первом этапе исследования изучали особенности репродукции данных штаммов в первичной культуре АМС и перевиваемой культуре клеток MARC-145.

В перевиваемой культуре клеток MARC-145 первые признаки ЦПД вируса штамма Lelystad в виде сферических образований клеток (конгломератов), приподни мающихся над поверхностью монослоя, отмечали через 1-2 дня после инокуляции вируса. Уплотнение оболочек клеток, образование цитоплазматических выростов на поверхности клеток, потерю клетками части цитоплазматического вещества, и, вслед ствие этого, их сморщивание (пикноз клеток), слияние от двух до пяти клеток (обра зование симпластов) наблюдали спустя 2-3 дня. Разрушение межклеточных связей и дезагрегацию клеток отмечали через 3-4 дня после инфицирования. Отслоение клеток от субстрата регистрировали через 4-5 дней и объединение симпластов в сетчатую структуру (псевдосинцитий) - через 4-7 дней после внесения вируса. Титры вируса от второго к восьмому серийному последовательному пассажу возрастали от 2.75±0. до 5.28±0.32 lg ТЦД50/см3.

Максимальное накопление вируса на уровне 4.88±0.12 - 5.25±0.25 lg ТЦД50/см отмечали через 48-72 часа после инокуляции, когда появлялись в клеточном монослое пикнотические клетки с цитоплазматическими выростами и формировались симпла сты из слившихся 2-5 клеток. Через 24 часа, как и после 96 часов, титры вируса были низкими - в пределах от 1.87±0.13 до 2.75±0.25 lg ТЦД50/см3.

При проведении культивирования вируса РРСС, штамма Lelystad, в монослое культуры клеток MARC-145, выращенном в роллерах, титры вируса составляли 5.78±0.22 lg ТЦД50/см3, что превышало накопление вируса РРСС по сравнению с мо нослойным стационарным методом культивирования на 0.5-1.0 lg ТЦД50/см3.

Перевиваемую культуру клеток MARC-145 инфицировали вирусом РРСС, штамма NVSL, также, как и вирусом штамма Lelystad: при получении первого пасса жа на выращенный монослой клеток наносили 1 см3 вируссодержащей суспензии, при проведении следующих серийных последовательных пассажей в клинские матрасы с клеточным монослоем вносили по 10 см3 культурального вируса РРСС. ЦПД вируса РРСС, штамма NVSL, в культуре клеток MARC-145 отличалось от ЦПД вируса штамма Lelystad. В данном случае не наблюдали образования симпластов и их объе динения в псевдосинцитий, а отмечали только формирование сферических скоплений клеток, приподнимающихся над монослоем, затем округление, пикноз клеток и от слоение их от поверхности матраса. Наибольшее накопление (5.25±0.25 lg ТЦД50/см3) вируса РРСС, штамма NVSL, было установлено через 120 часов после инокуляции, когда ЦПД вируса проявлялось примерно на половине поверхности монослоя.

На следующем этапе изучали особенности репродукции вируса РРСС, штаммов Lelystad и NVSL, в культуре АМС.

АМС получали от клинически здоровых поросят-отъемышей в возрасте от 6 до 8 недель вымыванием их из отпрепарированных легких раствором ФБР (рН 7.2) с до бавлением рабочей концентрации антибиотиков (гентамицина в дозе 0.8 мг/см3).

Цитопатическое действие вируса РРСС, штамма Lelystad, в культуре АМС про являлось в виде уплотнения макрофагов, склеивания их между собой в конгломераты, образования симпластов из слившихся 2-3 клеток, отсоединения макрофагов от суб страта и их лизиса в течение 1-4 дней (количество клеток в поле зрения ежедневно резко сокращалось). Титры вируса РРСС, штамма Lelystad, на протяжении пяти пас сажей существенно не менялись и составляли 5.5-6.5 lg ТЦД50/см3.

Первые признаки ЦПД вируса РРСС, штамма NVSL, наблюдали в АМС в виде формирования конгломератов из клеток в течение от 32±4 до 56±6 часов после ино куляции. Затем отмечали слияние 2-3 клеток в симпласты - от 40±4 до 70±5 часов, от слоение клеток от субстрата - от 72±5 до 96±4 часов после инокуляции. Лизис клеток происходил через 92±4-120±6 часов после инокуляции вируса. Титры вируса РРСС, штамма NVSL, на протяжении 5 пассажей также изменялись незначительно и были в пределах от 5.75±0.25 до 6.50±0.50 lg ТЦД50/см3.

Таким образом, вирус РРСС, штаммов Lelystad и NVSL, хорошо репродуциро вался в культуре клеток АМС. Пассажирование вируса этих штаммов в культуре АМС на протяжении 5 пассажей не приводило к существенному повышению титра и сокращению сроков проявления ЦПД вируса.

Оптимизация непрямой реакции иммунофлюоресценции для выявления антигена вируса РРСС Непрямую реакцию иммунофлюоресценции (НРИФ) оптимизировали с исполь зованием вируса РРСС, штамма Lelystad, и перевиваемой культуры клеток MARC 145. Серопозитивные к вирусу РРСС сыворотки крови отбирали от подсвинков, зара женных вирусом штамма Lelystad интратрахеально.

В результате исследования при помощи НРИФ перевиваемых культур клеток MA-104, MARC-145 и Vero, инфицированных вирусом РРСС различных штаммов, не выявили существенных отличий в интенсивности свечения инфицированных клеток.

Различия между штаммами Lelystad (европейского генотипа) и NVSL (американского генотипа) обнаружили только в проявлении ЦПД вируса РРСС в данных перевивае мых культурах клеток. ЦПД вируса РРСС в перевиваемых культурах клеток обоих штаммов на первой стадии развития было сходным: формирование сферических ско плений инфицированных вирусом РРСС клеток (конгломератов), приподнимающихся над поверхностью монослоя (рис.1). Вторая стадия развития ЦПД вируса в культурах клеток была характерна только для вируса РРСС, штамма Lelystad: клетки, инфици рованные вирусом, сливались в симпласты, которые затем объединялись в псевдо синцитий. Третья стадия развития ЦПД вируса в данных культурах клеток была об щей для обоих штаммов: монослой клеток разрушался, клетки округлялись, станови лись пикнотичными и отслаивались от поверхностей культуральных сосудов (рис.2).

В ходе оптимизации НРИФ [T.H. Weller and A.H. Coons,1954] были подобраны режи мы и условия постановки реакции применительно к нашим задачам. В результате бы ла оптимизирована НРИФ, позволяющая выявлять антиген вируса РРСС в пробах, приготовленных из различных органов и тканей инфицированных животных с ис пользованием перевиваемой культуры клеток MARC-145 или АМС. На первых этапах оптимизации данной реакции использовали в качестве испытуемого материала пробы органов и тканей, полученные от инфицированных вирусом штамма Lelystad и неза раженных подсвинков. Параллельно реакцию ставили с использованием культураль ного вируса штамма Lelystad. Положительный результат (цитоплазматическое свече ние) получали только в препаратах, приготовленных из инфицированных вирусом штамма Lelystad клеток или клеток, в которые вносили вируссодержащую органную суспензию. Максимальное количество клеток с цитоплазматическим флюоресци рующим свечением получали при культивировании вируса в клетках MARC-145 или АМС в течение 18-22 часов. В неинфицированных (нормальных) клетках флюоресци рующего цитоплазматического свечения не наблюдали, что являлось отрицательным результатом. Не было свечения при окрашивании инфицированных вирусом РРСС клеток одним только конъюгатом (кроличьей антисвиной флюоресцирующей сыво роткой), или только одной серопозитивной сывороткой крови. Не наблюдали свече ния как инфицированных вирусом РРСС, так и неинфицированных клеток без нане сения на них стандартных сывороток крови и конъюгата. Для контрастирования пре паратов использовали водный раствор Эванса голубой в разведении 1:106.

Специфическое свечение комплекса антиген+антитело+антиантитело, меченное ФИТЦ, в цитоплазме клеток, инфицированных вирусом РРСС, выявленное при помощи НРИФ (окуляр х10;

объектив х40) Рис. 1. Сферические скопления клеток MARC-145, инфицированных вирусом РРСС, штамма Lelystad Рис. 2. Одиночные клетки MARC-145, инфицированные вирусом РРСС, штамма NVSL Таким образом, оптимизация НРИФ заключалась в подборе оптимальных сро ков культивирования вируса РРСС в АМС и перевиваемой культуре клеток MARC 145, в проведении различных этапов реакции при комнатной температуре, установ лении оптимальных сроков инкубирования на препаратах сывороток крови, конъюга та и контрастирующего раствора.

Затем определяли уровень накопления вируса РРСС в различных органах под свинка, экспериментально инфицированного вирусом штамма Lelystad. Вирус был адаптирован к культуре клеток MARC-145. Для этих целей серонегативного поросен ка интратрахеально заражали вирусом в объеме 5 см3 с титром 4.75 lg ТЦД50/см3. Че рез 72-96 часов после заражения у него отмечали повышение температуры тела до 40.9оС. На четвертые сутки животное убили и от него отобрали пробы различных ор ганов и тканей для вирусовыделения в культуре клеток MARC-145 и исследования на наличие вируса в непрямой реакции иммунофлюоресценции. Результаты этих иссле дований представлены в таблице 2.

Таблица Результаты обнаружения вируса в органах подсвинка, экспериментально инфицированного культуральным вирусом РРСС, штамма Lelystad Исследуемый материал Титр вируса Результаты (lg ТЦД 50/см 3) исследований в НРИФ Сгусток крови, сыворотка крови, 3.00±0.25 макрофаги, легкие, миндалины и + 3.75±0. щитовидная железа Тестикулы, заглоточные и подчелюстные 2.00±0.25 л/у, головной мозг и продолговатый мозг, + 2.75±0. печень, сердце и селезенка Слизистые оболочки носа, глотки и языка, 1.25±0.25 почки, слюнные и поджелудочная железы + 1.50±0. Скелетные мышцы вирус не выделен вирус не обнаружен Примечание: л/у - лимфоузлы;

«+» наличие признака Из результатов, приведенных в таблице 2, видно, что вирус РРСС удалось об наружить во всех исследованных органах и тканях, за исключением скелетной муску латуры. Вирус в наиболее высоких титрах (от 3.0 до 3.75 lg ТЦД 50/см3) накапливался в крови, макрофагах, легких, миндалинах и щитовидной железе. В низких титрах ви рус был обнаружен в слизистых оболочках носа, глотки и языка, почках, слюнных и поджелудочной железах, в которых его титр не превышал 1.5 lg ТЦД50/см3. Кроме то го, наличие вируса РРСС в данных органах и тканях подтвердили и с помощью НРИФ.

Выделение и изучение иммунобиологических свойств полевых изолятов вируса РРСС, циркулирующих среди свинопоголовья на территории России С использованием альвеолярных макрофагов свиней исследовали 8 проб пат материала, полученного из различных регионов страны, и 2 пробы из Белоруссии.

Было проведено 13 пассажей вируса, затем образцы каждого пассажа исследовали в НРИФ и ПЦР. С использованием этого метода было выделено пять полевых изолятов вируса РРСС в культуре АМС: «Кемеровский-96», «Пермский-99», «БР-01», «БР-03» и «Ботово-02». Следует отметить, что выделение вируса РРСС наиболее успешно бы ло при использовании системы: биопроба – АМС донора - культура АМС.

Затем проводили выделение и адаптацию вируса РРСС к перевиваемой культу ре клеток MARC-145. С этой целью исследовали 85 проб патологического материала, поступивших из 63 хозяйств 31 региона России, и 4 пробы из Белоруссии, а также пробы от поросят, экспериментально зараженных некоторыми изолятами вируса РРСС, и изоляты, выделенные в АМС. Для вирусологического исследования отбирали от инфицированных поросят АМС, кровь, легкие, лимфоузлы, миндалины, слюнные железы, селезенку, почки, печень, сердце и головной мозг.

Все пробы культивировали в культуре клеток MARC-145 до 25 пассажа. Полу ченные пробы идентифицировали на наличие вируса РРСС в НРИФ с использованием референтных серопозитивных к вирусу штамма Lelystad сывороток крови свиней, а также в ПЦР. Результаты выделения некоторых изолятов вируса РРСС в перевивае мой культуре клеток MARC-145 представлены в таблице 3.

Из результатов, приведенных в таблице 3, видно, что с 1 по 11 пассажи наблю дали проявление ЦПД вируса РРСС в перевиваемой культуре клеток MARC-145, ин фицированной 3 изолятами («Белгородский-96», «Смоленский-96» и «Воронежский 96»). Цитопатические изменения в культуре клеток MARC-145, инфицированной изо лятами «Нижегородский-95» и «Нижегородский-96», отмечали с 1 по 12-13 пассажи.

На протяжении 20-25 пассажей наблюдали ЦПД вируса РРСС в перевиваемой куль туре клеток MARC-145, инфицированной изолятами «Новосибирский-96» и «Кеме ровский-96». После проведения ряда пассажей изолятов вируса РРСС в культуре кле ток MARC-145 наличие вируса РРСС было подтверждено в НРИФ и при помощи ПЦР в пробах, полученных из шести областей России: Белгородской, Кемеровской, Нижегородской, Новосибирской, Смоленской и Воронежской. Шесть изолятов («Бел городский-96», «Воронежский-96», «Нижегородский-95», «Нижегородский-96», «Но восибирский-96» и «Смоленский-96») 1-10 пассажей и один изолят («Кемеровский 96») 25 пассажа были выявлены в НРИФ и ПЦР.

Таблица Результаты адаптации некоторых изолятов вируса РРСС к перевиваемой культуре клеток MARC- Название изолята № пассажа Проявление ЦПД Результаты в культуре клеток исследования в НРИФ ПЦР «Белгородский-96» 1 +++ + + 4 +++ + + 11 ++ + «Кемеровский-96» 5 +++ + + 25 ++++ + + «Нижегородский-95» 3 +++ + + 12 ++ + «Нижегородский-96» 2 +++ + + 13 ++ + «Новосибирский-96» 10 +++ + + 20 ++ + «Смоленский-96» 2 +++ + + 11 ++ + «Воронежский-96» 2 +++ + + 4 +++ + + 11 ++ + Примечание: степень поражения монослоя клеток MARC-145 вирусом РРСС: «+»- 10%;

«++»- 25%;

«+++»- 40%;

«++++»- 55%;

«+» положительный результат;

«-» отрицательный результат;

ПЦР ставили совместно с к.б.н. В.Г. Андреевым В результате проведения 25 пассажей только изолят «Кемеровский-96» вируса РРСС был адаптирован к перевиваемой культуре клеток MARC-145. Результаты ис следования свидетельствуют, что к перевиваемой культуре клеток MARC-145 в тече ние длительного культивирования можно адаптировать лишь единичные отечествен ные изоляты вируса РРСС.

В результате проведенных исследований было изучено влияние различных ус ловий и способов культивирования вируса изолята «Кемеровский-96» на его накопле ние в перевиваемой культуре клеток MARC-145 (табл. 4).

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что максимальные титры вируса РРСС (5.28±0.22 lg ТЦД 50/см3) регистрировали при заражении трехсуточного клеточ ного монослоя MARC-145 и культивировании вируса в течение 96 часов после ино куляции.

Вирус изолята «Кемеровский-96» имел высокие титры в перевиваемой культу ре клеток MARC-145 в 25 пассаже - 5.63±0.13 lg ТЦД50/см3, поэтому его подвергли дальнейшему изучению. В результате проведенного исследования при помощи мето да ПЦР-секвенирования установили, что вирус изолята «Кемеровский-96» относится к европейской генетической группе. Отсутствие контаминации вируса изолята «Ке меровский-96» другими вирусами, микоплазмами, грибами и бактериями было под тверждено при помощи электронной микроскопии (доктором биологических наук А.П. Пономаревым) и в ПЦР (кандидатом биологических наук А.В. Щербаковым).

Таблица Результаты накопление вируса РРСС в зависимости от возраста монослоя клеток MARC-145 и срока культивирования вируса n= Титр вируса РРСС (lg ТЦД 50/см3) Штамм Возраст вируса РРСС монослоя в различные сроки после инокуляции (часы) клеток, 36 48 72 сутки 3 2.77±0.23 3.63±0.37 5.11±0.14 5.28±0. «Кемеровский- 4 1.83±0.17 3.37±0.13 4.56±0.24 4.16±0. 96» 5 1.25±0.25 2.67±0.33 3.21±0.29 3.37±0. При использовании роллерного способа культивирования вируса изолята «Ке меровский-96» в перевиваемой культуре клеток MARC-145 титры вируса были на уровне 6.29±0.21 lg ТЦД 50/см 3.

Изучение иммунобиологических свойств вируса РРСС, изолята «Кемеровский 96», на подсвинках показало, что он является слабовирулентным для подсвинков, так как у животных наблюдали лишь незначительное повышение температуры тела (до 40.7оС) на 2-4 сутки после инфицирования. Других каких-либо клинических призна ков у экспериментальных поросят не отмечали.

Проведенные исследования показали, что вирус изолята «Кемеровский-96» может быть использован для изготовления вакцинных препаратов, так как он хорошо репродуцируется в клетках MARC-145, является слабовирулентным, свободным от контаминации возбудителями других инфекций и обладает более высокой антигенной активностью по сравнению с вирусом РРСС других штаммов.

Результатами всестороннего изучения вируса изолята «Кемеровский-96» яви лись составление на него соответствующего паспорта, присвоение ему статуса штам ма и названия «КПР-96» (Кемерово-Победа-РРСС);

депонирование в коллекции мик роорганизмов ФГУ «ВГНКИ»;

внесение изменений в действующую нормативную документацию, позволяющих использовать вирус штамма «КПР-96» для производст ва инактивированных вакцин против РРСС.

Оптимизация и модификация методов оценки антигенной активности вакцин против РРСС Для ретроспективной диагностики РРСС нами были оптимизированы и моди фицированы реакция нейтрализации (РН), непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) и непрямой вариант иммуно ферментного анализа (ИФА). При постановке данных реакций мы оптимизировали температурный режим и сроки инкубирования компонентов системы антиген антитело. Модификация касалась использования в этих реакциях вместо вируса рефе рентного штамма Lelystad оригинальных отечественных штаммов «БД» и «КПР-96».

Реакцию нейтрализации, на первых этапах исследования, ставили с использо ванием вируса РРСС референтного штамма Lelystad, генетически и антигенно сход ного с вирусом штамма «КПР-96». За основу брали известную модификацию этой ре акции, когда используют постоянную дозу сыворотки при различных разведениях ви руса [Р.Н. Лукина, 1965;

Р.В. Эпштейн-Литвак и др.,1995].

Для постановки реакции использовали перевиваемую культуру клеток MARC 145 и вирус штамма Lelystad, адаптированный к этой культуре клеток, с инфекцион ным титром не ниже 4.5±0.5 lg ТЦД50/см3. Для каждой испытуемой сыворотки вычис ляли индекс нейтрализации (ИН), который определяли по разности логарифмических показателей титра вируса в присутствии нормальной и испытуемой сывороток. Ин декс нейтрализации до 1.0 логарифма считали отрицательным, от 1.1 до 1.6 - сомни тельным, 1.7 и выше - положительным.

В пробах сывороток крови, полученных от подсвинков через 14 дней после им мунизации, антител к вирусу РРСС не выявили (индекс нейтрализации 1.0 lg). К дню после иммунизации уровень антител повысился и индекс вируснейтрализующих антител в сыворотках крови подсвинков был в пределах от 2.38±0.12 до 3.17±0.33 lg, а в сыворотках крови иммунизированных кроликов – на уровне 2.36±0.14 - 2.50±0.50 lg.

Затем испытывали методику постановки реакции нейтрализации (РН) с посто янной дозой вируса (100-360 доз). Реакцию нейтрализации ставили классическим способом [Р.Н. Лукина,1965;

I.J. Yoon,1994]. Испытуемые сыворотки разводили от 1: до 1:1024 и в каждую разведенную пробу добавляли в равном объеме 100-360 доз ви руса и помещали на 1 час в термостат при 37оС.

В сыворотках крови животных, полученных до иммунизации и через 14 дней после прививки, антитела к вирусу РРСС не были выявлены (2.0 log2). В пробах, полученных от животных через 36 дней после иммунизации и более, титры антител колебались в пределах от 3.22±0.28 до 5.28±0.17 log2 у поросят и от 3.25±0.25 до 3.75±0.17 log2 у кроликов.

Таким образом, проведенные исследования показали возможность выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней и кроликов с использованием ре акции нейтрализации, и в дальнейшем она была модифицирована и применена для оценки антигенной активности вакцин и ретроспективной диагностики РРСС.

Непрямую реакцию иммунофлюоресценции [T.H. Weller and A.H. Coons,1954] ставили на перевиваемой культуре клеток MARC-145, которую инфицировали в на чале работы вирусом штаммов Lelystad и NVSL, а затем оригинальных отечественных штаммов «БД» и «КПР-96».

Наличие изумрудного или салатово-зеленого вирусспецифического цитоплаз матического флюоресцирующего свечения инфицированных вирусом РРСС клеток MARC-145 в разведениях сывороток крови 1:80 и выше принимали за положитель ный результат, при условии отсутствия свечения в препаратах с нормальной (незара женной) культурой клеток.

В сыворотках крови животных, отобранных до иммунизации, антитела к виру су РРСС не были выявлены (1:80). Через 21 день после прививки в пробах сыворо ток крови, полученных от подсвинков, выявляли антитела на уровне от 1:133±27 до 1:267±53, а от кроликов – от 1:80 до 1:107±53. Через 30 дней уровень антител в сыво ротках крови подсвинков определяли в пределах от 1:427±107 до 1:533±107, в сыво ротках крови кроликов – в пределах от 1:267±53 до 1:427±107.

Затем оптимизированную и модифицированную НРИФ использовали для оцен ки антигенной активности вакцин и ретроспективной диагностики РРСС.

При постановке реакции непрямой гемагглютинации [А.Т. Кравченко и М.И.

Соколов,1945;

Р.В. Эпштейн-Литвак и др.,1995] в качестве эритроцитарного антигена использовали формалинизированные и танизированные эритроциты барана, сенсиби лизированные инактивированным вирусом РРСС. Для данных целей сначала исполь зовали вирус РРСС, штаммов Lelystad и NVSL, а затем оригинальных отечественных штаммов «БД» и «КПР-96».

Сыворотки крови считали серопозитивными к вирусу РРСС, если наблюдали агглютинацию эритроцитов в разведении сывороток крови 1:80 и выше, сомнитель ными - в разведении 1:40, серонегативными - в разведении 1:20.

В сыворотках крови животных, отобранных до иммунизации, антитела к виру су РРСС не были выявлены (1:40). В пробах сывороток крови, полученных через день после иммунизации от подсвинков, выявляли антитела к вирусу РРСС в преде лах значений от 1:267±53 до 1:427±107, от кроликов – на уровне 1:107±53-1:133±27.

Через 30 дней после иммунизации уровень антител в сыворотках крови подсвинков определяли в пределах значений от 1:533±107 до 1:640, а в сыворотках крови кроли ков – на уровне 1:427±107. После этого РНГА была использована для ретроспектив ной диагностики РРСС.

Непрямой метод иммуноферментного анализа [H. Friemel,1980] оптимизирова ли и модифицировали для оценки антигенной активности вакцин и ретроспективной диагностики РРСС.

Учет реакции проводили визуально, оценивая интенсивность окрашивания со держимого лунок микропланшета, или спектрофотометрически при длине волны нм. Титром сыворотки крови считали ее максимальное разведение, величина оптиче ской плотности которого двукратно превосходила оптическую плотность в лунках с серонегативной к вирусу РРСС (отрицательный контроль) сывороткой крови. Серопо зитивными к вирусу РРСС считали сыворотки крови с титром 1:100 и выше.

В сыворотках крови животных, полученных до заражения (иммунизации) и че рез 14 дней после иммунизации, антитела к вирусу РРСС не выявляли (1:50). В про бах сывороток крови, полученных через 21 день после иммунизации подсвинков и далее, антитела к вирусу РРСС выявляли в сыворотках крови в пределах от 1:100 и до 1:1600. Обработка результатов, полученных при исследовании сывороток крови сви ней, показала, что относительные чувствительность и специфичность разработанного метода к базовой реакции ИФА (сыворотки параллельно проверяли в коммерческом наборе ИФА фирмы «IDEXX») составляли 95.1% и 95.6%, соответственно.

В дальнейшем непрямой вариант ИФА был использован для оценки антигенной активности вакцин и ретроспективной диагностики РРСС.

Оптимизированные и модифицированные тест-системы были использованы для контроля антигенной активности вакцин против РРСС (табл. 5).

Таблица Оценка антигенной активности вакцин против РРСС производства ФГУ «ВНИИЗЖ» с использованием различных серологических реакций Реакция Исследовано Вид Уровень антител в сыворотках крови вакцин, животных животных количество до через 28-36 нормы серий вакцинации суток после ТУ иммунизации РН кролики 2.0 log2 3.27-3.75 log 5 3.0 log подсвинки 2.0 log2 3.22-4.75 log РН (ИН) 5 кролики 1.7 lg 2.36-2.50 lg 2.0 lg подсвинки 1.7 lg 2.38-3.17 lg НРИФ кролики 1:80 1:267-1: 26 1: подсвинки 1:80 1:427-1: РНГА кролики 1:20 1:320-1: 46 1: подсвинки 1:20 1:533-1: ИФА 6 подсвинки 1:50 1:200-1:800 1: Примечание: ИН – индекс нейтрализации Как видно из таблицы 5, с использованием оптимизированных тест-систем бы ло проконтролировано свыше 80 серий вакцин на серонегативных подсвинках и кро ликах. Исследование в разработанных реакциях сывороток крови кроликов и под свинков, иммунизированных серийными вакцинами производства ФГУ «Федераль ный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»), выявило, что все они об ладали достаточной антигенной активностью. Уровень антител в сыворотках крови животных, отобранных через 28-36 суток после иммунизации, превышал нормы ТУ на вакцины.

Разработанные серологические реакции применяли не только для оценки анти генной активности вакцин, но и для проведения серомониторинга РРСС в свиновод ческих хозяйствах России (табл. 6).

В период с 1994 по 2003 годы на наличие антител к вирусу РРСС при помощи серологичесих реакций РН, НРИФ, РНГА и ИФА было исследовано 22254 проб сыво роток крови свиней, полученных из 127 неблагополучных по РРСС свиноводческих хозяйств, расположенных на территории 35 регионов России. В результате проведен ного исследования серопозитивными к вирусу РРСС были признаны 11411 проб сы вороток крови свиней, что составляло 51.3% от общего количества проб и свидетель ствовало о широком распространении РРСС.

Таблица Результаты исследования на РРСС в различных реакциях поступивших из хозяйств сывороток крови свиней Реакция Годы Исследовано сывороток крови регионов хозяйств всего из них положительных проб кол-во % РН 1994-1996 2 - 16 2 - 41 2288 618 27. НРИФ 1995-1999 15-31 30 - 99 9382 4156 44. РНГА 1998-2003 26 - 35 51 - 127 10035 6529 64. ИФА 2003 7 11 549 108 19. Всего: 1994-2003 2 - 35 2 - 127 22254 11411 51. 3. ВЫВОДЫ 1. Установлено, что оптимальным условием культивирования альвеолярных мак рофагов свиней и перевиваемой культуры клеток MARC-145, необходимых для ре продукции вируса РРСС, является использование питательных сред Игла, 199 или RS 3М, содержащих 9-10% сыворотки крови КРС (или фетальной сыворотки) и 0.3-1. мг/см3 глютамина.

2. Показано, что максимальное накопление вируса РРСС, штаммов Lelystad и NVSL, в титрах 5.25-6.5 lg ТЦД50/см3 происходило в альвеолярных макрофагах свиней и монослойной культуре клеток MARC-145 после инкубирования в течение 36-72 ча сов при +37оС. При использовании роллерного метода культивирования в культуре клеток MARC-145 титры вируса были выше на 0.5-1.0 lg ТЦД50/см3 по сравнению с монослойным стационарным методом культивирования.

3. При вирусологических и иммунофлюоресцентных исследованиях на 4 сутки после инфицирования культуральным вирусом РРСС, штамма Lelystad, у поросят об наружено наличие вируса в различных органах и тканях, за исключением мышечной ткани. Наибольшее накопление вируса отмечено в легких, лимфатических узлах, миндалинах, в крови и щитовидной железе.

4. Изучены иммунобиологические свойства ряда изолятов вируса РРСС, циркули рующих в свиноводческих хозяйствах России. Изолят «Кемеровский-96» был адапти рован к культуре клеток MARC-145, он вызывал четко выраженное ЦПД и накапли вался в титрах 5.25-5.5 lg ТЦД50/см3.

5. Установлено, что выделенный изолят «Кемеровский-96» вируса РРСС относит ся к европейскому генотипу вируса РРСС, является специфичным, слабовирулентным и обладает более высокой антигенной активностью по сравнению с другими изучен ными штаммами вируса РРСС. После изучения и паспортизации под наименованием «штамм «КПР-96»-ДЕП» он был депонирован в качестве производственного для из готовления иммунобиологических препаратов.

6. Штамм «КПР-96»-ДЕП используется в ФГУ «Федеральный центр охраны здо ровья животных» для изготовления эмульсионных инактивированных вакцин против РРСС и широко применяется для диагностических целей.

7. Установлено, что через 28-36 суток после однократной иммунизации в сыво ротках крови подсвинков были выявлены антитела к вирусу РРСС на уровне 1:427 1:533 в НРИФ, 1:533-1:640 в РНГА, 1:200-1:800 в ИФА и 1:10-1:28 в РН, что свиде тельствует о достаточно высокой антигенной активности разработанных вакцин.

8. С использованием референтных штаммов Lelystad и NVSL оптимизированы, а затем на основе отечественных штаммов «БД» и «КПР-96»-ДЕП вируса РРСС моди фицированы серологические реакции РН, НРИФ, РНГА и ИФА, которые используют ся для оценки антигенной активности вакцин и в серомониторинге РРСС. Из исследованных полевых проб сывороток крови свиней серопозитивными к вирусу РРСС были признаны 11411 (51.3%), что указывает на широкое распространение РРСС в свиноводческих хозяйствах России.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Результаты экспериментальной работы вошли в 4 методические рекомендации, одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 2 НД (СТО), утвержденные МСХ РФ, и в 3 полученные патента на изобретения:

1. «Методика постановки реакции нейтрализации для ретроспективной ди агностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС)» (1995г.) 2. «Методические указания по выявлению и титрованию специфических ан тител в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдро ма свиней (РРСС) с помощью непрямой реакции иммунофлюоресценции (НРИФ)» (1999 г.) 3. «Методические указания по применению набора препаратов для выявле ния специфических антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в реакции непрямой гемагглютинации» (1999г.) 4. «Методика определения антител в сыворотке крови свиней к вирусу ре продуктивно-респираторного синдрома свиней методом непрямого иммунофер ментнго анализа» (2000г.) 5. Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции сви ней» (ТУ 9384-026-00008064-99), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.06.1999г. (изменения внесены 01.04.2005г.) 6. Нормативные документы на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (ТУ 9384-153-00495527 2005), утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 30.06.2006г.

7. Патент на изобретение №2236253 «Вакцина эмульсионная инактивиро ванная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (2004г.) 8. Патент на изобретение №2269361 «Вакцина ассоциированная эмульсион ная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома и парво вирусной инфекции свиней» (2006г.) 9. Патент на изобретение №2295567 «Штамм «КПР-96» вируса репродук тивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов» (2007г.).

5. Список опубликованных работ по материалам диссертации 1. Особенности репродукции вируса РРСС в культуре клеток «MARC-145» / А.А.

Гусев, Т.З. Байбиков, Ш.К. Куляшбекова, Л.Г. Жучкова, В.Л. Гаврилова, С.Г.

Алехина // Вирусные болезни с.-х. жив-х: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. Владимир, 1995.-С.95.

2. Экспериментальное заражение свиней вирусом РРСС / Т.З. Байбиков, А.А. Гу сев, Л.Г. Жучкова, Н.П. Квашнин, А.М. Рахманов, В.Л. Гаврилова, Е.К. Долгано ва // Вирусные болезни с.-х. жив-х: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. Владимир, 1995.-С.185.

3. Выявление антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в сыворотках крови в реакции нейтрализации / В.Л. Гаврилова, Т.З. Байбиков, А.А.

Гусев, Н.С. Дудникова // Пробл. инфекц. патологии жив-х: Тез. докл. конф., по священ. 100-летию открытия вируса ящура.-Владимир, 1997.-С.116-117.

4. Гаврилова, В.Л. Выделение вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней из патологических материалов экспериментально инфицированных под свинков / В.Л. Гаврилова, Т.З. Байбиков, Н.С. Дудникова // Пробл. инфекц. пато логии жив-х: Тез. докл. конф., посвящен. 100-летию открытия вируса ящура. Владимир, 1997.-С.116.

5. Изучение респираторно-репродуктивного синдрома у экспериментально инфи цированных подсвинков / Т.З. Байбиков, С.А. Дудников, Н.С. Дудникова, Е.К.

Долганова, В.Л. Гаврилова // Пробл. инфекц. патологии жив-х: Тез. докл. конф., посвящен. 100-летию открытия вируса ящура.-Владимир, 1997.-С.105-106.

6. Особенности накопления вируса РРСС на культуре альвеолярных макрофагов / Н.С. Дудникова, Т.З. Байбиков, В.Л. Гаврилова, С.А. Дудников // Пробл. инфекц.

патологии жив-х: Тез. докл. конф., посвящен. 100-летию открытия вируса ящура. Владимир, 1997.-С.112-113.

7. Гаврилова В.Л., Иммунофлюоресцентная диагностика репродуктивно - респи раторного синдрома свиней / В.Л. Гаврилова // Акт. пробл. с.-х. биотехнол.: Ма тер. конф. - пгт. Гвардейский, 1998. - С. 116.

8. Изучение чувствительности первичных, перевиваемых культур клеток и кури ных эмбрионов к вирусу РРСС / В.Л. Гаврилова, С.А. Кукушкин, И.Я. Курман, Т.З. Байбиков //Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику: Матер.

конф. молодых ученых.-Владимир, 2000.-С.23-25.

9. Репродуктивно-респираторный синдром свиней / Т.З. Байбиков, А.А. Гусев, Н.А. Яременко, Н.С. Дудникова, В.Л. Гаврилова, С.А. Кукушкин, И.Я. Курман, В.Ф. Ковалишин, А.М. Рахманов // Ветеринария.-2001, №.3.-С.18-24.

10. Иммунобиологические свойства штамма «КПР-96» вируса репродуктивно респираторного синдрома свиней / Т.З. Байбиков, И.А. Тетерин, С.А. Кукушкин, Е.П. Баборенко, В.Л. Гаврилова // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Матер. Междунар. науч.-практ. конф., посвящен. 35 летию ВНИТИБП.-Щелково, 2005.-С.179-183.

11.Разработка и испытание эмульсионной инактивированной вакцины против ре продуктивно-респираторного синдрома свиней из штамма «Кемеровский-96» / И.А. Тетерин, С.А. Кукушкин, Е.П. Баборенко, Т.З. Байбиков, В.Л. Гаврилова, А.В. Каньшина // Тр. Федерального центра охраны здоровья жив-х.-Владимир, 2005.-Т.3.-С.241-254.

12. Гаврилова, В.Л. Сравнительное изучение иммунобиологических свойств штаммов вируса РРСС / В.Л. Гаврилова, И.А. Тетерин, С.А. Кукушкин // Ветери нарная патология.-2006, №4.-С.86-90.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Тираж 90 экземпляров, октябрь 2007 г.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.