авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Применение каталитических маркеров на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов

На правах рукописи

Филатов Павел Владимирович Применение каталитических маркеров на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов 03.01.06 – биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово – 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России Научный доктор биологических наук, руководитель Полтавченко Александр Георгиевич Официальные доктор химических наук, профессор оппоненты: Малыгин Эрнст Георгиевич доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович Ведущая ГУ НИИ биохимии СО РАМН (г. Новосибирск) организация

Защита состоится « 29 » октября 2010 г. в _9 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан «28_»сентября2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н. Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время разработано большое количество различных иммунохимических тестов (Herzog D.P., 2006, Stewart B.J. et al., 2006). Из всего многообразия современных иммунодиагностических методов в практическом здравоохранении наибольшей популярностью пользуется иммунопероксидазный тест (Aurameas S., 1971, Jeanson A. et al., 1988) в постановке на планшетах для иммунологических реакций (Engvall E. 1971). Этот метод хорошо зарекомендовал себя в клинических и лабораторных исследованиях, однако для количественного спектрофотометрического учёта результатов требуется специальная дорогостоящая аппаратура и высокая квалификация персонала. В условиях слабого финансирования здравоохранения, приобрести специальный спектрофотометр могут позволить себе только крупные диагностические центры.

В то же время потребность в серологическом контроле на местах велика. Это и контроль крови на наличие инфекционных заболеваний при оперативных вмешательствах и экстренных трансфузиях, и контроль инфекций, возбудители которых вызывают тератогенный эффект, а также выявление и дифференциация паразитарных и хронических инфекционных заболеваний. Большая часть лечебных учреждений не имеет возможности самостоятельно осуществлять иммунодиагностику и вынуждена пересылать образцы или направлять больных на обследование в диагностические центры. При значительном отдалении таких центров, особенно в восточной части России, получение результатов анализа затягивается на недели, что негативно отражается как на качестве иммунодиагностики, так и на здоровье пациентов.

Таким образом, создание чувствительных, но простых и недорогих тест систем, позволяющих выполнять иммунологический анализ в условиях слабооснащенных медицинских учреждений или во внелабораторных условиях, весьма актуально и позволит сделать иммунологическое обследование населения более доступным, своевременным и эффективным.

Цель исследования: разработка планшетного метода иммуноанализа с надежным визуальным учетом результатов для повышения доступности и эффективности лабораторной диагностики инфекционных заболеваний.

Задачи исследования:

подбор условий получения иммунозолей на основе соединений двухвалентного кобальта и изучение их свойств;

отработка способов проявления кобальтсодержащих иммунозолей;

оптимизация условий применения кобальтсодержащих маркеров в планшетном варианте иммуноанализа;

оценка стабильности иммунозолей при хранении;

оценка эффективности применения кобальтсодержащих маркеров в иммуноанализе.

Научная новизна. В работе показано, что золи на основе соединений двухвалентного кобальта:

могут быть использованы в качестве маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах;

по чувствительности и специфичности не уступают иммуннопероксидазным конъюгатам и, при этом, имеют перед ними преимущества по относительной простоте получения иммунозоля, а также по использованию стабильного и безвредного проявляющего раствора;

позволяют создавать системы для иммунохимического тестирования с надежным бесприборным учетом результатов.

Практическая значимость работы:

разработаны методы получения и применения в иммуноанализе иммунозолей на основе соединений двухвалентного кобальта;

показано, что применение кобальтсодержащих иммунозолей позволяет создавать диагностические тест-системы с надежным визуальным учетом результатов по принципу «да/нет» для обеспечения иммунодиагностики в слабо оснащенных лабораториях городских и районных сельских больниц;

описанная в настоящей работе система визуализации результатов иммунохимического анализа пригодна для производства диагностических наборов любой специфичности и может найти применение не только в диагностике инфекционных заболеваний, но и в других отраслях медицины, а также в ветеринарии, экологических исследованиях и научных экспериментах подана заявка на получение Патента РФ «Хромогенная система для визуализации результатов иммунохимического анализа в микротитровальных планшетах» (Рег. № 2010136265 от 27.08.2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

Теоретически и экспериментально обоснована возможность применения иммунозолей на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе.

Разработана методология проведения иммунокаталитического анализа с применением кобальтсодержащих маркеров.

Получено экспериментальное подтверждение эффективности иммунокаталитического анализа в сравнении с иммуноферментным анализом по чувствительности и специфичности.

Конкретное участие автора в получении результатов Вклад автора в представленные результаты заключается в личном участии во всех теоретических и экспериментальных исследованиях, обработке результатов и формулировании выводов. Все работы выполнены под руководством и в соавторстве с А.Г. Полтавченко. Часть исследований выполнена в соавторстве с Б.Н. Зайцевым, Н.А. Кривенчуком, А.Н. Рыбаковым и А.М. Яковченко. Всем, принимавшим участие в данной работе, автор выражает искреннюю признательность.

Апробация работы Материалы диссертации представлены на следующих конференциях:

междисциплинарном семинаре: «Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» и международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции – теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2004 г.);

международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006 г.).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 113 страницах, содержит 13 таблиц и 11 рисунков.

Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов и списка литературы. Список литературы включает в себя 193 источника, из них иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы В экспериментах использовали: азид натрия, ализарин (1,2 диоксиантрахинон), ализарин S (3,4-диоксиантрахинон-2-сульфокислота, натриевая соль), бычий сывороточный альбумин (БСА), поливинилпирролидон (ПВП) с молекулярной массой 10, 40 и 200 кДа, тайрон (4,5-дигидрокси-1,3 бензодисульфокислота), твин-20, трис-основание (Sigma, США);

овальбумин, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6 и 20 кДа (Serva, Германия);

белок А Staphylococcus aureus (SpA) (ВНИИ ОЧБ, С.-Петербург), БСА (НПО «Аллерген», Ставрополь), планшеты для иммунологических реакций с плоским дном (ПО «Енисей», Красноярск) или (ВНИИ «Биополимер», Москва), отечественные реактивы с квалификацией не ниже «чда». Концентрат блокирующего раствора (КБР), представляющего собой лизат клеток E. coli, предоставлен И.Н. Бабкиной (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»). Во всех экспериментах использовали дважды дистиллированную воду.

Использовались следующие антигены: рекомбинантные аналоги антигенов Treponema pallidum с молекулярной массой 17 и 41 кДа, полученые в E. сoli в виде химер с -галактозидазой E. coli или глутатион-S-трансферазой Shistosoma japonicum (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») предоставлены П.А. Белавиным (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»), рекомбинантный аналог антигена CagA Helicobacter pylori (ЗАО «Медико биологический союз», Бердск).

В работе использованы антитела: антитела кроличьи против Fc-фрагмента IgG человека (ICN, США), антитела козьи против всей молекулы IgG человека (Sigma, США), иммуноглобулины из нормальной сыворотки человека (НИИ ЭМ им. Г.Н.

Габричевского, Москва).

В экспериментах использовались конъюгаты: коньюгат пероксидазы хрена с моноклональными антителами против всех субклассов IgG человека (ПХ-a/Hum-IgG (фирма «Капель», Москва), конъюгат пероксидазы хрена с белком А Staphylococcus aureus (ПХ-SpA) (Sigma, США).

Для выявления пероксидазы в планшетном варианте ИФА использовали субстраты на основе о-фенилендиамина (0,5 мг/мл ОФД и 0,02 М перeкиси водорода на 0,05 М цитратно-фосфатном буферном растворе, рН 5,5) или субстрат на основе 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) из тест-систем ЗАО «ИмДи».

Чувствительность и специфичность тест-систем оценивали с применением панелей сывороток производства ЗАО «Медико-биологический Союз», Бердск:

стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВИЧ – ОСО 42 28-212-93, серия 009, экспериментальная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к T. Pallidum «Э-СИФ-01», панель сывороток с нормированным содержанием IgG к белкам р17 и р41 T. pallidum, серия 001, рабочие панели сывороток, предоставленные ЗАО «ИмДи», и собранные самостоятельно в рамках научно-исследовательского проекта «Изучение динамики гуморального иммунитета при сифилитической инфекции и отработка новых методов иммуноанализа», утвержденного Этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» 19.09.2002 г.

В сравнительных экспериментах использовались диагностические наборы:

«ИФА-Анти-трепонема», «Токсоплазмоз IgG-антитела» (ЗАО «ИмДи-спектр», Новосибирск), «СИФ-IgG-ДС-стрип (ФСП 42-0155-5191-04)» (ЗАО «Медико биологический союз, Бердск), «РекомбиБест антипаллидум IgG стрип», «СИФ-IgG ДС», «Анти-HCV» (ЛТД «Авиценна», С-Петербург), «ВИЧ-1, ВИЧ-2 ИФА-Авиценна» (ЛТД «Авиценна», Москва), «РекомбиБест анти-ВИЧ-1+2», «РекомбиБест анти-ВГС» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).

Методы Исследование структурно-дисперсных характеристик маркеров проводили методом электронной микроскопии на микроскопе JEM-100S фирмы «JEOL» (Япония).

Определение концентрации частиц маркера проводили методом фильтрации и взвешивания. 10 мл золя маркера фильтровали под вакуумом через предварительно взвешенный фильтр из нитрата целлюлозы с порами 0,22 мкм и промывали собранный на фильтре маркер небольшим количеством дистиллированной воды для удаления растворимых солей. Высушивали фильтр с маркером в течение суток при температуре 50-60 °С. Просушенные фильтры взвешивали на аналитических весах и, вычитая массу чистого фильтра, определяли массу маркера. Разделив полученное значение на профильтрованный объем (10 мл), получали весовую концентрацию маркера в 1 мл суспензии. Это значение использовали в расчетах соотношения маркер/иммунореагент при получении иммунозолей.

Адсорбционное связывание частиц маркера с иммунореагентами проводили методом «дробной нагрузки», внося при умеренном перемешивании в три приема с интервалом 10-15 мин равные порции маркера в раствор иммунореагента. После минутной инкубации в золь добавляли 10 %-ый водный раствор БСА (1/10 объема золя). Спустя еще 15 минут, в золь добавляли в соотношении 1:1 по объему стабилизирующий раствор.

Иммуноферментный анализ (ИФА) выполняли в объемах 100 мкл.

Использовали разведения сывороток 1/10, или двукратно раститровывали сыворотки в РБР-С-Ф. Инкубации с сыворотками и с рабочим разведением пероксидазного конъюгата на РБР-К-Ф проводили по 30 мин при 37 °С. Отмывки выполняли пятикратно ФСБ-Т. Проявление в субстрате, содержащем 0,5 мг/мл о фенилендиамина и 0,02 М перекиси водорода в цитратно-фосфатном буфере, рН 5,5, осуществляли в течение 15 мин при температуре 37 °С. Иммуноферментный анализ на коммерческих диагностических наборах выполняли в соответствие с инструкциями производителя.

Иммунокаталитический анализ (ИКА) выполняли по схеме, аналогичной ИФА, но, в зависимости от задач эксперимента, разведение сывороток и иммунозолей, а также отмывки и проявление выполняли с использованием различных растворов. Все отмывки в ИКА проводили пятикратно ТСБ-Т. Для разведения золей использовали раствор ТСБ-Т с добавкой 0,05 % (в/о) БСА (НПО «Аллерген», Ставрополь). Проявление иммунозолей проводили в индикаторном растворе, содержащем: концентрации (1-10 мМ) ализарина S и 20 мМ перекиси водорода в ФБ или ББ. Перед внесением индикаторного раствора ячейки планшета дополнительно ополаскивали дистиллированной водой.

Оптическую плотность образцов в планшетах для иммунологических реакций учитывали на сканирующем спектрофотометре «Multiskan-310C» (Flow Lab., Финляндия) при l=492 нм (для ОФД) или при l=450 нм (для ТМБ).

Корректировку водородного показателя растворов осуществляли 0,1 М растворами NaOH и HCl. Контроль рН проводили с помощью рН-метра типа рН-673М с погрешностью ± 0,1 ед. рН.

Концентрацию белков определяли с использованием реактива Coomassie G 250 и спектрофотометра «Spekol» (Германия).

Взвешивание осуществляли на аналитических весах марки МА ВЛА - 200-М с погрешностью ± 0,001 г. Дозирование жидких препаратов осуществляли автоматическими пипетками переменного объема фирмы «Gilson» (Франция) с относительной погрешностью ± 5 %.

Статистическую обработку количественных показателей для вероятности 95 % проводили с использованием квантилей распределения Стьюдента.

Медоды приготовления кобальтсодержащих маркеров описаны ниже.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ИФА в микротитровальных планшетах является одним из наиболее чувствительных и удобных методов иммунодиагностики, но требует сложной и дорогой аппаратуры для учета результатов, поскольку образцы с малым содержанием анализируемого вещества сложно отличить от фона отрицательных проб. Таким образом, если сделать разницу окраски таких образцов более наглядной (при сохранении общей схемы постановки теста) – это поможет расширить круг медицинских учреждений, способных выполнять такой анализ. В основу разработки положена идея использования в иммуноанализе неорганических каталитических маркеров – гидрозолей на основе соединений двухвалентного кобальта, способных в малых концентрациях вызывать показательные изменения цвета индикаторных растворов. В экспериментах использованы известные методы определения следовых количеств кобальта в сложных смесях (Крейнголд С.У., 1983;

Мюллер Х. и др., 1983).

Однако эти методы были разработаны для гомогенных каталитических реакций и не могли дать представления ни об эффективности выявления золей, ни о влиянии биокомпонентов на такое выявление. До настоящего времени кобальтсодержащие золи в иммунохимических тестах не применялись.

В работе использовали золи сульфида и ферроцианида двухвалентного кобальта, приготовленные в условиях избытка катионов или анионов. Образующиеся в таких условиях химческие соединения имеют различный состав, а способ получения золя (при избытке катиона или аниона) может влиять как на процесс связывания белков поверхностью частиц, так и на чувствительность их выявления в индикаторной реакции. Сульфидные золи получали, смешивая 0,02 М растворы нитрата кобальта и сульфида натрия, а ферроцианидные золи – смешивая 0,02 М растворы нитрата кобальта и гексациано-(II)феррата калия (желтой кровяной соли).

При получении золя с избытком катионов использовали объемное соотношение растворов - 3:1, а при получении золя с избытком анионов – 1:3, соответственно.

Оценку формы и размеров частиц золей проводили методом электронной микроскопии. Под электронным микроскопом такие золи выглядели как крупные скопления полигональных слегка вытянутых кристаллов (рис. 1).

Частицы золей имели средние размеры:

сульфид кобальта, полученный при избытке катиона (СКк) – 20х50 нм, сульфид кобальта, полученный при избытке аниона (СКа) – 20х30 нм, ферроцианид кобальта, полученный при избытке катиона (ФКк) – 20х30 нм, ферроцианид кобальта, полученный при избытке аниона (ФКа) – 15х20 нм.

После стабилизации белками крупные конгломераты в значительной степени диссоциировали, однако, во всех препаратах можно было наблюдать агрегаты, содержащие до нескольких десятков частиц.

Определение концентрации частиц маркера выполняли методом фильтрации и взвешивания. Полученные значения использовали в расчетах соотношения по массе маркер/иммунореагент при получении иммунозолей.

СКк СКа СКк-IgG ФКк ФКа ФКк-IgG Рис. 1. Изображения кобальтсодержащих золей под электронным микроскопом.

Ориентировочный масштаб для всех снимков, приведен на изображении ФК.

Связывание иммунореагентов (антивидовых иммуноглобулинов или SpA фракции IgG из иммунных сывороток) с частицами золей проводили методом адсорбции, за несколько приёмов добавляя золь в раствор иммунореагента из расчета - 1000:1 по массе, соответственно. При таком подходе получался неравномерно нагруженный золь, но это не мешало поведению анализа и позволяло избежать длительной и дорогой процедуры очистки конечного продукта от избытка реагентов.

Дополнительную блокировку поверхности золя выполняли БСА. В дистиллированной воде (рН=5,8) золи с избытком катиона имели положительный, а с избытком аниона – отрицательный заряд.

Результаты экспериментальной оценки предела обнаружения золей в индикаторных системах разного состава приведены в таблице 1 и на рисунке 2.

Таблица Условия, использованные в экспериментах по выявлению кобальтсодержащих золей, и достигнутый при этом предел обнаружения Восстановитель Н2О2 рН БР* Достигнутый предел обнаружения, нг/мл ** ([С], мМ) ФКк ФКа СКк СКа Со2+ ФКк- CКк [С], М IgG IgG Ализарин S (9,0) 0,02 11,5 ФБ 13,0 20,0 6,0 10,0 80,0 60, (1,8) 0,02 11,5 ФБ 6,0 10,0 3,0 5,0 1,0 20,0 15, (0,9) 0,02 11,5 ФБ 1,0 2,0 1,0 2,0 0,5 15,0 10, (0,4) 0,02 11,5 ФБ 0,7 2,0 0,5 1,0 0,24 2,0 2, (0,2) 0,02 11,5 ФБ 0, - - - - - (9,0) 0,02 11,5 ББ 10,0 50,0 2,0 25,0 25,0 40, (1,8) 0,02 11,5 ББ 2,0 30,0 1,0 15,0 1,0 5,0 4, (0,9) 0,02 11,5 ББ 1,0 12,0 0,8 5,0 0,5 2,0 2, (0,4) 0,02 11,5 ББ 0,7 2,0 0,7 1,0 0,24 2,0 1, (0,2) 0,02 11,5 ББ 0, - - - - - Ализарин (2,0) 0,15 12,2 ББ 40,0 6,0 1,0 10, - - (0,4) 0,15 11,4 ББ 10,0 4,0 1,0 5, - - Тайрон (5,0) 0,10 10,5 ФБ 300 600 20,0 60,0 10,0 30, ДФК (5,0) 0,12 11,0 ББ 6,0 1,0 2,0 0,7 10,0 2, Тайрон (20,0) ДФК (1,5) 0,12 11,0 ББ 0,7 0,5 0,5 0,25 2,0 1, Тайрон (20,0) ДФК (0,7) 0,12 11,0 ББ 1,0 0,2 0,2 0,2 2,0 0, Тайрон (10,0) Пирокатехин 0,05 11,5 ББ 3,0 15,0 2,5 10,0 0,7 2,0 2, (10,0) Пирокатехин 0,02 10,5 ББ 3,0 3,0 2,0 10,0 0,7 2,0 2, (10,0) * БР – буферный раствор: ФБ – 0,1 М Na-фосфатный и ББ – 0,1 М Na-боратный.

** По общей массе золя без учета связанной воды, за 30 мин проявления при комнатной температуре, по визуально учитываемому переходу окраски индикатора.

ДФК дифенилкарбазон.

Точный химический состав золей и количество связанной с их частицами воды неизвестны, поэтому приведённые в таблице 1 данные имеют ориентировочный характер.

Использованные в наших экспериментах индикаторные растворы значительно различались по пределу обнаружения золей кобальта и цветовой гамме проявления.

При использовании растворов тайрона появляется яркая оранжево-желтая окраска, которая в течение нескольких минут сменяется на бледно-желтую.

Скорость переходов окраски зависит от концентрации кобальта. Такая быстрая смена окраски неудобна, поскольку требует большого внимания оператора при учете результатов. При каталитическом окислении пирокатехина вначале развивается интенсивная оранжево-красная окраска, которая быстро меняется на желто-бурую.

При увеличении концентрации пирокатехина можно повысить наглядность проявления, но предел обнаружения при этом резко снижается. Кроме того, для пирокатехина характерна слабая устойчивость при хранении и токсичность.

Рис. 2. Эффективность выявления золя сульфида кобальта, полученного при избытке катионов, в разных индикаторных системах (n=4, p=0,95).

Индикаторная реакция с дифенилкарбазоном, активированная тайроном, является одной из самых чувствительных и избирательных для определения кобальта (Долманова И.Ф. и др., 1973). В ходе проявления цвет этого индикаторного раствора сначала изменяется с фиолетового на оранжевый, а затем на светло-желтый. С применением этого индикаторного раствора, удается обнаружить золи кобальта в концентрации менее 1 нг/мл, однако наглядность цветового перехода была невысокой, а индикатор в ходе реакции дважды менял окраску.

Ализарин в щелочной среде приобретает насыщенную бордовую окраску.

Продукты его окисления слабо поглощают в видимой части спектра, что обеспечивают наглядный цветовой переход. Однако ализарин обеспечивает относительно низкий предел обнаружения золей, что делает его неперспективным для использования в качестве индикатора.

Ализарин S является сульфопроизводным ализарина и обычно используется в индикаторных растворах на основе боратного или фосфатного щелочного буферного раствора. Боратно-щелочные растворы ализарина S имеют темно-бордовую окраску, а фосфатно-щелочные - насыщенный фиолетовый цвет. И в той и в другой проявляющих системах для золей ферроцианида и сульфида кобальта, полученных при избытке катионов, достигается более низкий предел обнаружения, чем для их анионных аналогов. Следовательно, они более перспективны для использования в качестве маркеров иммуноанализа. Относительно небольшая разница в пределах обнаружения таких золей и растворов нитрата кобальта позволяет сделать вывод о том, что золи в процессе проявления частично растворяются и индикаторная реакция происходит в гомогенной фазе. Ускорению растворимости золей способствует щелочная среда и ионы буферной системы. В частности известно, что фосфаты эффективно растворяют ферроцианиды кобальта, образуя комплексные ионы (Перельман Ф.М., Заворыкин А.Н., 1975). Более короткий индукционный период и более высокую скорость проявления золей в фосфатных проявителях на основе ализарина S по сравнению с аналогичными боратными растворами, вероятно, можно объяснить более энергичным растворением золей в фосфатном буферном растворе.

Связывание поверхности маркера с белками увеличивает индукционный период. Эти явления связаны, возможно, с блокированием поверхностного слоя катализатора и наличием предварительного этапа десорбции белков. Вне индукционного периода скорость проявления чистых и связанных с белками золей примерно одинакова и после 30 минут проявления при комнатной температуре они достигают сходных пределов обнаружения. Инкубацией при 37 оС процесс можно ускорить в 2-3 раза.

Наиболее подходящими для визуального учета результатов (т.е.

обеспечивающими приемлемое сочетание чувствительности, наглядности и скорости проявления) являются индикаторные растворы, содержащие 20 мМ Н2О2 и 1–2 мМ ализарина S в фосфатном (рН 11,0-11,2) или боратном (рН 11,4-11,5) щелочных буферных растворах. Каждый из этих проявителей имеет определенные преимущества и недостатки. Боратно-щелочной индикаторный раствор позволяет достигать немного более низкого предела обнаружения, чем фосфатный, однако проявленные им образцы имеют более насыщенный желтый цвет и переход окраски выглядит менее наглядным. Фосфатный индикаторный раствор обладает более высокой скоростью проявления, и позволяет достигать большей контрастности между отрицательными (фиолетовыми) и положительными (светло-желтыми) образцами.

Скорость проявления ФКк-IgG и в том и другом индикаторных растворах заметно выше, чем у СКк-IgG (рис. 3).

Растворы ализарина S стабильны и могут сохраняться без перекиси водорода более полугода. Индикаторные системы на основе ализарина S удобны в применении, нечувствительны к свету и нетоксичны. Подобранные составы индикаторных растворов обеспечивают выявление золей при комнатной температуре в течение 20- мин, а полученная картина проявления сохраняется в течение нескольких часов (в ряде случаев до 2 суток).

Рис. 3. Динамика проявления золей СКк–IgG (пунктир) и ФКк–IgG (сплошная линия) с концентрацией 50 нг/мл в боратном (ББ) и фосфатном (ФБ) буферных растворах, pH 11,5, содержащих 2 мМ ализарина S (n=4, p=0,95).

В белоксодержащей среде время проявления золей увеличивается. Причиной тому могут служить органические компоненты как связанные с поверхностью золя, так и присутствующие в дисперсионной среде. Чтобы проверить влияние наиболее широко использующихся в иммуноанализе компонентов на скорость проявления золей, в ячейках планшета готовили серии их десятикратных разведений (от 1 до 0,001 %) и вносили в них золи.

Спустя 30 мин добавляли индикаторный раствор и фиксировали результаты каталиметрической реакции через определенные промежутки времени. Определяли скорость индикаторной реакции (n=DОП/Dt) в начальном периоде с выраженной динамикой проявления и строили график зависимости скорости реакции от концентрации компонента. В ходе экспериментов установлено, что тормозящий эффект добавок менее выражен в фосфатном, чем в боратном проявителе.

Органические компоненты меньше влияют на проявление золей ферроцианида, чем золей сульфида кобальта. Полиэтиленгликоли и твин-20 в использованных концентрациях практически не влияют на скорость реакции. Из сывороточных белков в меньшей степени замедляют проявление иммуноглобулины. Альбумины из сыворотки человека, крупного рогатого скота и лактальбумин в концентрации 0,1% примерно вдвое тормозят проявление золей в фосфатном проявителе. При проявлении сульфида кобальта в боратном проявителе они ингибируют проявление даже в концентрации 0,01 % более чем на 70 %.

Можно предположить две основных причины замедления проявления. Первая – блокирование белками поверхности маркера от контакта с индикаторным раствором. Вторая – закисление индикаторного раствора, поскольку наиболее выраженным тормозящим действием обладают компоненты, характеризующиеся значительной буферной емкостью и кислыми свойствами (глицин, казеин, желатин, лактальбумин), а при рН11,0 скорость индикаторной реакции резко снижается.

Вероятно, в отмеченные эффекты воздействия органических компонентов вносят свой вклад оба фактора.

При сравнительной экспериментальной оценке рабочих растворов, приготовленных с использованием буферных систем на основе фосфатов, глицина и трис, установлено, что для выполнения иммуноанализа с применением золей кобальта наиболее пригодны растворы для отмывок и разведения золей на основе трис, а добавки в них твин-20 позволяют эффективно снижать неспецифические взаимодействия как органических, так и неорганических компонентов. В условиях наших экспериментов диапазон рабочих концентраций для того и другого золя составлял от 20 до 300 мкг/мл (оптимум – 50-100 мкг/мл). Применение таких концентраций иммунозолей позволяло достигать предела обнаружения иммуноглобулинов класса G человека около 3 нг/мл, сходного с показателями ИФА (рис. 4).

Рис. 4. Выявление IgG человека (сплошная линия) и кролика (пунктир) с использованием иммунопероксидазного конъюгата и иммунозолей сульфида (СКк) и ферроцианида (ФКк) кобальта на основе иммуноглобулинов против IgG человека (n=4, p=0,95).

Оценку эффективности применения кобальтсодержащих маркеров в иммуноанализе проводили на ряде коммерческих тест-систем: с применением стандартных и рабочих панелей сывороток и золя ферроцианида кобальта, связанного с антителами против IgG человека или белком А Staphylococcus aureus. При этом сначала выполняли ИФА в соответствии с инструкцией производителя, а затем заменяли пероксидазный конъюгат на иммунозоль, отмывочный раствор на ТСБ-Т, субстрат на индикаторный раствор, содержащий 1,5 мМ ализарина S в фосфатном буферном растворе (pH 11,2) и выполняли ИКА по схеме, аналогичной ИФА.

На рисунке 5 в графическом виде приведены результаты определения титров антител к T. gondii с использованием набора «Токсо-IgG-антитела, стрип» (ЗАО «ИмДи-спектр», Новосибирск) и иммунозоля ФКк-а/IgG-Hum. Сравнительные данные по определению антител с применением пероксидазного конъюгата и иммунозоля приведены в таблице в верхней части рисунка.

Видно, что кобальтсодержащий маркер обеспечивает чувствительность определения антител не ниже, чем пероксидазный конъюгат.

№ образцов 8-13 7 6 5 4 3 2 панели Титр в ИФА отр 1:100 1:100 1:200 1:400 1:800 1:800 1: Титр в ИКА отр 1:100 1:100 1:200 1:400 1:800 1:800 1: Рис. 5. Определение титров антител к Toxoplasma gondii в ИКА с использованием иммунозоля ФКк-a/IgG-Hum и индикаторной системы с 1,5 мМ ализарина S (n=4, p=0,95). Цифрами обозначены номера образцов по таблице, где приведены сравнительные данные по определению титров антител в ИФА и ИКА.

Сравнение указанных методов при выявлении IgG к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) проводили на коммерческих тест-системах: «ВИЧ-1, ВИЧ-2 ИФА Авиценна» (ЛТД «Авиценна», Москва) и «РекомбиБест анти-ВИЧ-1+2» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). В тест-системе «Авиценна» использовался коньюгат SpA-ПХ, а в тест-системе «Вектор-Бест» - конъюгат a/IgG-Hum-ПХ. ИКА на этих наборах проводили, соответственно, с иммунозолями ФКк-SpA и ФКк-a/IgG-Hum.

Сравнение проводили на стандартной панели сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) ОСО 42 28-212-93 серия 009, дополненной пятью образцами донорской сыворотки, не содержащими антитела к ВИЧ. Результаты приведены в таблице 2.

И в той и в другой тест-системе результаты ИФА и ИКА полностью совпадают. При этом в ИКА все негативные сыворотки имеют темно-фиолетовый, а все позитивные – светло-желтый цвет, что облегчает надежный визуальный учет результатов.

Таблица Сравнение иммунозолей и пероксидазных конъюгатов в серийно выпускаемых тест-системах для определения антител к ВИЧ «ВИЧ-1,ВИЧ-2 ИФА Авиценна» «Рекомби-Бест анти-ВИЧ-1+2» а ИФА ИКА ИФА ИКА (SpA-ПХ) ОП492 (SpA-ФКк) (IgGa/Hum-ПХ) (IgGa/Hum-ФКк) ОП492 ОП492 ОП 1,698 + 0,222 + 1,796 + 0,263 + 1,437 + 0,226 + 1,475 + 0,282 + 1,094 + 0,253 + 0,916 + 0,255 + 1,386 + 0,240 + 1,048 + 0,252 + 1,011 + 0,265 + 0,863 + 0,242 + 1,765 + 0,227 + 0,956 + 0,296 + 1,482 + 0,247 + 1,915 + 0,231 + 1,164 + 0,234 + 1,878 + 0,277 + 0,987 + 0,263 + 1,234 + 0,283 + 0,848 + 0,254 + 0,965 + 0,306 + 1,097 + 0,265 + 0,994 + 0,246 + 0,964 + 0,342 + 0,817 + 0,272 + 0,946 + 0,278 + 0,936 + 0,266 + 0,769 + 0,296 + 0,649 + 0,285 + 0,815 + 0,312 + 0,873 + 0,282 + 0,734 + 0,336 + 0,915 + 0,268 + 0,169 - 1,017 - 0,112 - 1,268 0,183 - 0,953 - 0,153 - 1,285 0,111 - 1,275 - 0,085 - 1,344 0,138 - 1,114 - 0,096 - 1,259 0,162 - 1,236 - 0,124 - 1,246 т 0,258 0, 1,412 1, зон перехода* 0,350-0,400 0,350-0, * при ОП менее 0,350 - цвет проявителя светло желтый, выше 0,400 - фиолетовый.

КИР – контроль стабильности индикаторного раствора.

Регистрация ОП при = 492 нм, условия эксперимента в тексте.

Сравнение указанных методов при выявлении IgG к вирусу гепатита С (ВГС) проводили на наборах: «Анти-HCV» (ЛТД «Авиценна» С-Петербург) и «РекомбиБест анти-ВГС» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). В тест-системе «Авиценна» использовался коньюгат пероксидазы со стафилококковым белком А (SpA-ПХ), а в тест-системе «Вектор-Бест» - конъюгат пероксидазы с антивидовыми иммуноглобулинами (a/IgG-Hum-ПХ). ИКА на этих наборах проводили, соответственно, с иммунозолями ФК-SpA и ФК-a/IgG-Hum, а проявление выполняли в фосфатном индикаторном растворе с 2 мМ ализарина S. Сравнение проводили на рабочей панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВГС, предоставленном ЗАО «ИмДи». Результаты анализа представлены в таблице 3.

Таблица Сравнение иммунозолей и пероксидазных конъюгатов в серийно выпускаемых тест-системах для определения антител к ВГС Анти-HCV«Авиценна» Рекомби-Бест а/ВГС разца SpA-ПХ ФК-SpA а/IgG-ПХ ФК-a/IgG ОП450 ОП450 ОП450 ОП 0,220 1,414 0,246 1, 0,324 0,326 0,457 0, 2,654 0,253 3,012 0, 2,411 0,240 2,980 0, 1,113 0,214 2,744 0, 2,127 0,240 2,286 0, 0,087 1,628 0,070 1, 0,089 1,552 0,130 1, 0,087 1,635 0,106 1, 0,086 1,619 0,132 1, 0,089 1,614 0,150 0, 1,440 0,274 2,996 0, 1,923 0,264 3,115 0, 0,645 0,261 1,575 0, 0,412 0,262 0,948 0, 0,269 0,338 0,912 0, 0,183 1,181 0,122 1, 0,144 1,466 0,160 1, 0,113 1,447 0,124 1, 0,177 1,558 0,112 1, 0,090 1,645 0,081 1, крит 0, 250 0, Р 1,865 1, апазон перехода 0,350-0,400 0,350-0, ета индикатора* *- при ОП менее 0,350 - светло желтый, при ОП выше 0,400 малиновый.

КК – контроль конъюгата.

КИР – контроль стабильности индикаторного раствора.

Регистрация ОП при =450 нм.

Жирным шрифтом в таблице выделены положительные результаты.

Сравнение указанных методов при выявлении IgG к возбудителю сифилиса на тест-системах «РекомбиБест антипалидум стрип» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) и «СИФ-IgG-ДС» (ЗАО «Медико-биологический союз», Бердск) также показало полное совпадение результатов ИФА и ИКА. При этом в ИКА все негативные сыворотки имели темно-фиолетовый, а все позитивные и слабоположительные образцы – светло-желтый цвет, что обеспечивало надежный визуальный учет результатов.

На рисунке 6 показан вид планшета после выявления антител к Helicobacter pylori в одной панели сывороток с использованием иммунопероксидазного конъюгата (ПХ-a/IgG-Hum) и иммунозоля ферроцианида кобальта (ФКк-a/IgG-Hum).

Рис. 6. Вид планшета после параллельного выявления в образцах панели сывороток антител к H.

pylori с использованием пероксидазного конъюгата (ПХ-a/IgG) и иммунозоля ферроцианида кобальта (ФКк-a/IgG). Положительные сыворотки в первом блоке выделены пунктиром.

И пероксидазный конъюгат, и иммунозоль одинаково определяли наличие специфических антител в сыворотках, однако результаты, полученные с применением иммунозоля, были существенно нагляднее и позволяли без труда визуально регистрировать сигналы низкотитражных сывороток.

Оценка устойчивости иммунозолей в условиях длительного хранения в стабилизирующем растворе при 2-8°С показала, что иммунозоли на основе ферроцианида кобальта при хранении до 1 года (срок наблюдения) не изменяют заметно своих исходных характеристик. Проявление золей сульфида кобальта после месяцев хранения немного замедляется.

Таким образом, кобальтсодержащие иммунозоли в сочетании с индикаторными растворами на основе ализарина S при сходной с пероксидазными конъюгатами чувствительности и специфичности анализа обеспечивают отчетливое различие оптических сигналов положительных и отрицательных образцов. Это позволяет создавать диагностические тест-наборы с надежным визуальным учетом результатов по принципу «да/нет» для обеспечения иммунодиагностики в лабораториях, не имеющих регистрирующего оборудования. Из других достоинств разработанного теста можно отметить безвредность, стабильность и низкую стоимость используемых компонентов, а также устойчивость картины проявления (при комнатной температуре она сохраняется в течение нескольких часов).

Описанная в настоящей работе система визуализации результатов иммунохимического анализа может быть использована при производстве диагностических наборов любой специфичности и может найти применение не только в диагностике инфекционных заболеваний, но и в других отраслях медицины, а также в ветеринарии, экологических исследованиях и научных экспериментах.

ВЫВОДЫ Установлена возможность использования золей на основе двухвалентного кобальта в качестве маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах. Показано, что золи, полученные при избытке катионов кобальта, обеспечивают более высокую чувствительность проявления по сравнению со своими аналогами, полученными при избытке анионов. При одинаковой чувствительности золь ферроцианида кобальта имеет преимущество по скорости, а золь сульфида кобальта – по наглядности проявления.

Предложено использование для иммуноанализа с визуальным учетом результатов индикаторных растворов на основе ализарина S, обладающих большой разницей в скоростях каталитической и некаталитической реакций, а также наличием определенной концентрации золя, способной инициировать проявление. При этом боратно-щелочные индикаторные растворы обеспечивают более высокую чувствительность выявления золей, а фосфатно щелочные – большую скорость проявления и наглядность результатов анализа.

Выявлено, что для выполнения иммунокаталитического анализа с использованием золей кобальта наиболее пригодны растворы для отмывок и разведения золей на основе трис, а добавки твин-20 в рабочие растворы позволяют при выполнении иммуноанализа эффективно снижать неспецифические взаимодействия как органических, так и неорганических компонентов.

Установлено, что иммунозоли обладают стабильностью при хранении в стабилизирующем буферном растворе при температуре 2-8 °С, при этом иммунозоль ферроцианида кобальта не изменяет своих характеристик в течение 1 года (срок наблюдения), а иммунозоль сульфида кобальта спустя месяцев немного замедляет скорость проявления.

Показано, что в одинаковых условиях кобальтсодержащие иммунозоли имеют сходную с пероксидазным конъюгатом чувствительность и специфичность анализа но, в отличие от последнего, обеспечивают наглядное различие положительных и отрицательных образцов, что позволяет создавать диагностические тест-системы с надежным визуальным учетом результатов по принципу «да/нет» для обеспечения иммунодиагностики в недостаточно оснащенных лабораториях городских и сельских больниц.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ТО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Полтавченко А. Г., Филатов П. В., Яковченко А.М., Рыбаков А. Н. Изучение динамики гуморального иммунного ответа на белки р17, p41 и р47 Treponema pallidum на ранних стадиях сифилиса // Иммунология. – 2005. - № 5. - С. 101 107.

Полтавченко А.Г., Филатов П.В., Зайцев Б.Н. Применение золей на основе соединений Co(II) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 1. Получение и проявление кобальтсодержащих иммунозолей // Биотехнология. – 2005. - № 3. С. 79-89.

Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Co(II) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 2. Оптимизация условий проведения иммунокаталитичесого анализа // Биотехнология. – 2005. - № 4. - С. 70-77.

Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Co(II) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 3. Применение кобальтсодержащих золей в иммунокаталитическом анализе // Биотехнология. - 2005. - № 5. - С. 72-77.

Публикации в материалах конференций Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н., Филатов П.В., Яковченко А.М.

Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Treponema pallidum. - В сб. тр. международн.

мультидисциплинарного семинара «Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» и международн. конф. «Актуальные вирусные инфекции – теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2- ноября 2004 года). - М.: МАКС Пресс, 2004. – С. 135-136.

Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Со(II) как маркеров иммуноанализа с визуальным учетом результатов. - В сб. мат.

международн. конф. «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21-23 июня 2006 г.). – Ульяновск: ГСХА, 2006. - С. 123-126.

Патенты Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н., Филатов П.В., Яковченко А.М.

«Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Treponema pallidum и способ ее получения». - Патент РФ № 2275635, приоритет от 03.06.2004, опубл. 27.04.2006, Бюл. № 12.

Полтавченко А.Г., Филатов П.В. «Хромогенная система для визуализации результатов иммунохимического анализа в микротитровальных планшетах». – Заявка на получение Патента РФ (Рег. №2010136265 от 27.08.2010).

Список использованных сокращений:

ББ – боратный буферный раствор БСА – бычий сывороточный альбумин ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВГС – вирус гепатита С ДФК – дифенилкарбазон ИКА – иммунокаталитический анализ ИКР – индикаторная каталиметрическая реакция ИФА – иммуноферментный анализ К+ – положительный контроль К- – отрицательный контроль КБР – концентрат блокирующего раствора ОП – оптическая плотность ОПкрит – критическое значение оптической плотности ОСО – отраслевой стандартный образец ОФД – ортофенилдиамин ПЭГ – полиэтиленгликоль ПВП – поливинилпирролидон ПХ – пероксидаза хрена РБР-К-Ф – разводящий буферный раствор для конъюгата на основе фосфатов РБР-С-Ф – разводящий буферный раствор для сывороток на основе фосфатов СКк – золь сульфида кобальта, полученный при избытке катионов СКа – золь сульфида кобальта, полученный при избытке анионов ТМБ – тетраметилбензидин ТСБ-Т – трис-солевой буферный раствор с твин- ФБ – фосфатный буферный раствор ФКк – золь ферроцианида кобальта, полученный при избытке катионов ФКа – золь ферроцианида кобальта, полученный при избытке анионов ФСБ-Т – фосфатно-солевой буферный раствор с твин- ФСП – фармакопейная статья предприятия ЧДА – чистый для анализа a/IgG-Hum – антитела против иммуноглобулинов класса G человека IgG – иммуноглобулины класса G SpA – белок А Staphylococcus aureus

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.