авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Манучарова Наталия Александровна ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ПРОКАРИОТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НАЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный консультант: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук Чернов Иван Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Терехова Лариса Петровна доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна доктор биологических наук, профессор Лихачев Александр Николаевич

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет МСХА имени К.А.Тимирязева

Защита диссертации состоится 13 марта 2012г. в 15 часов 30 мин.

в аудитории М-2 на заседании Диссертационного совета Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу:

119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д.1, строен. 12, МГУ имени М.В.

Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 2012г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направлять по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д.1, строен. 12, МГУ имени М.В.Ломоносова, факультет почвоведения, Учный совет.

Учный секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г Г.М. Зенова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Вертикальная дифференциация наземных биогеоценозов обусловлена формированием вертикальных ярусов, существенно различающихся по составу и структуре микробных сообществ. Надземный, наземный (подстилка), и почвенный ярусы связаны единым потоком органического вещества и представляют собой разделенные в пространстве стадии сукцессии по разложению органических веществ (Звягинцев и др., 1999). Разложение органических остатков связано, прежде всего, с деятельностью микроорганизмов, образующих ферменты гидролазы, разрушающие сложные органические соединения. Совокупность этих микроорганизмов формирует гидролитический микробный комплекс, структура которого во многом влияет на особенности круговорота веществ и превращения энергии в биогеоценозе.

Масштабы развития микробных гидролитических комплексов и микробной деструкции биополимеров (на примере полисахаридов) различны в биогеоценозах разных климатических зон, однако в научной литературе информация о разнообразии и устойчивости микробных гидролитических комплексов под воздействием экологических факторов практически отсутствует. Долгое время считалось, что основную группу организмов, обладающих гидролитическим комплексом ферментов, составляют, главным образом, грибы. За последнее десятилетие появляется все больше информации о наличии полного комплекса гидролитических ферментов у представителей прокариот (De Boer, 2001;

Schrempf, 2001;

Bhattacharya, 2007). Не все прокариоты обладают полным комплектом гидролитических ферментов, в результате чего степень разложения полимеров разными микроорганизмами неодинакова. Интенсивность их деятельности очень сильно зависит от многих экологических факторов, в том числе температуры, влажности, окислительно-восстановительных условий, реакции среды и осмотического давления почвенных растворов (Gohel et al., 2005).

Поступающие в природную систему полисахариды (биополимеры моносахаридов, соединенные гликозидными связями в линейные или разветвленные комплексы) чрезвычайно широко распространены в природе и являются важным источником органических веществ. Такие полисахариды, как хитин, пектин, целлюлоза, входят в состав матрикса клеточных стенок организмов и, постоянно присутствуя в наземной системе, представляют собой пул органического углерода и азота (De Boer, 2004, Parcham, Deng, 2000). Содержание полисахаридов в почве в зависимости от типа почвы и метода экстракции колеблется в пределах от 0,06% до 3,0% от массы почвы и от 1% до 14% от массы органического вещества почв. В почвы с растительными остатками ежегодно поступает от 2 до 14 т/га углеводов, значительная часть которых минерализуется или участвует, в качестве структурных элементов, в формировании гуминовых кислот (Gomez Ramirez, 2004). Для включения элементов питания в биологический круговорот необходима деструкция полисахаридов, которую осуществляют специфические комплексы микроорганизмов. В России данная область исследований практически не затронута. Опубликованные в мировой научной литературе материалы по предлагаемой проблеме, как правило, содержат результаты исследований комплексов ферментов (хитиназ, целлюлаз, лигниназ и др.), выделенных не из естественных систем, а из культур микроорганизмов, инкубируемых на искусственных питательных средах.

В последнее время препараты, полученные на основе этих ферментов, вызывают все больший интерес, как перспективные экологически безопасные средства биологического контроля за фитопатогенными грибами и широко используются в качестве средств защиты растений от инфекций (Eltarabily, 2000;

Deboer, 1998;

Downing, Thomson, 2000;

Kobayashi et al., 2002). Кроме того, они могут быть использованы в качестве биосорбентов, способствующих биоремедиации и детоксикации почв. Однако, в естественных почвах проблема деструкции полисахаридов этими ферментами, несмотря на свою высокую актуальность, до настоящего времени почти не изучалась. Публикации, в основном, посвящены анализу отдельных частных аспектов этой проблемы.





Изучение различий в структуре гидролитических комплексов микроорганизмов вертикальных ярусов поможет составить более полное представление о ступенчатом разрушении органических веществ в наземных биогеоценозах и оценить роль различных групп микроорганизмов на разных стадиях этого процесса.

Цель и задачи исследования Цель работы - установить специфику почвенных гидролитических прокариотных комплексов, осуществляющих деструкцию полисахаридов (хитина и пектина), выявить закономерности их распространения в наземных экосистемах и зависимость метаболической активности от основных экологических факторов (влажности, температуры, присутствия органических субстратов).

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Оценить разнообразие и определить численность отдельных филогенетических групп прокариотных метаболически активных микроорганизмов – гидролитиков в наземных экосистемах, различающихся параметрами основных экологических факторов.

2. Разработать молекулярные подходы для определения таксономического разнообразия прокариот – гидролитиков (хитина и пектина) и их метаболической активности при различных параметрах основных экологических факторов в наземных экосистемах.

3. Проанализировать динамику функциональных и структурных показателей (дыхание, численность, биомасса) физиологически активных микроорганизмов – гидролитиков в микробных комплексах наземных экосистем.

4. Выявить наиболее активные группы прокариот, участвующие в разложении биополимеров (хитина и пектина) в наземных экосистемах. Выделить и определить видовое разнообразие доминантов гидролитичеких сообществ методами полифазной таксономии, включая использование как фенотипических, так и молекулярно-генетических критериев.

5. Определить в различных условиях лабораторного микрокосма скорости деструкции полисахаридов в почвенных образцах. Установить с помощью математического планирования эксперимента относительную значимость исследуемых экологических факторов и величину отклика микробных гидролитических комплексов на изменение их параметров в структурных и функциональных показателях.

Научная новизна Впервые выявлены закономерности распространения гидролитических прокариотных комплексов в зависимости от влажности, температуры, окислительно-восстановительного потенциала, определена таксономическая структура комплексов и проведена оценка потенциальной гидролитической активности микробных комплексов наземных экосистем, развивающихся в широкой вариабельности экологических факторов. На основе экофизиологических критериев определена функциональная активность гидролитических прокариотных микробных комплексов в наземных экосистемах, выявлена степень толерантности исследуемых микробных комплексов к экстремальным параметрам экологических факторов.

Разработана модификация флюоресцентномикроскопического метода анализа гибридизации клеток in situ (FISH) для исследования физиологического и филогенетического положения гидролитических прокариотных группировок вертикальных ярусов наземных экосистем – почвенного, наземного (подстилка) и надземного (филлосфера).

Впервые с использованием метода FISH оценена численность и выявлен филогенетический состав метаболически активных бактериальных гидролитических (хитинолитических и пектинолитических) комплексов наземных экосистем в зависимости от уровня увлажненности, температурного и окислительно-восстановительного режимов. Численность, выявляемая с использованием метода физиологически активных гидролитических FISH, прокариотных комплексов составляет третью часть от численности всех прокариотных организмов надземного (филлосфера) наземного (подстилка) и почвенного ярусов экосистем. Установлено, что деструкция полисахаридов осуществляется преимущественно представителями филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. Выявлены различия в филогенетической структуре метаболически активных гидролитических прокариотных комплексов пространственно-сукцессионного ряда. Деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, группой протеобактерий (альфа и бета). В почвенном гидролитическом комплексе уменьшается доля протеобактерий и увеличиваются доли фирмикут и актинобактерий.

Установлено, что в почвенном ярусе уровень увлажненности в заданном диапазоне для некоторых структурных показателей оказывается наиболее значимым фактором среди таких существенных для микробного сообщества параметров, как внесение органических веществ и время. Влажность более значима для деятельности хитинолитического комплекса, чем для пектинолитического.

Впервые показано, что наиболее благоприятные условия для микробного разложения хитина складываются при влажности почв, близкой к полной влагоемкости. В глинистых и суглинистых почвах интервал значений влажности, необходимый для интенсивной микробной трансформации хитина шире, чем в песчаных. При увеличении влажности почв увеличивается деятельность мицелиальных бактерий (актиномицетов) в хитинолитическом комплексе. Вместе с тем впервые показано, что развитие гидролитического комплекса происходило и при низкой влажности почвы, близкой к влажности завядания растений. Активный рост гидролитиков и, соответственно, разложение полисахаридов осуществлялось даже на водных пленках толщиной 3 нанометра.

Установлена высокая активность (оцениваемая по структурным и функциональным показателям) минорных по биомассе компонентов – мицелиальных и одноклеточных прокариот при гидролизе полисахаридов микробным сообществом вне зависимости от температуры. При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.

Дыхание почвенного микробного сообщества в широком спектре условий (влажность, температура, поступление органического вещества, сукцессионное время) может существенно контролироваться минорными по биомассе компонентами – мицелиальными и одноклеточными прокариотами, роль которых, очевидно, реализуется их вкладом в регуляцию функционирования микробного сообщества. В процессе деструкции полисахаридов в почве при увеличении как влажности, так и температуры в микробном гидролитическом комплексе заметно возрастает роль прокариотных микроорганизмов, особенно актиномицетов.

С помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры, влажности и сукцессионного времени) для функционального показателя микробного гидролитического комплекса (дыхания).

Практическая значимость Разработана модификация флюоресцентномикроскопического метода анализа гибридизации клеток in situ (FISH) для определения показателей численности, физиологического состояния и филогенетической принадлежности гидролитических прокариотных комплексов ярусов наземных экосистем – почвенного, наземного (подстилка) и надземного (филлосфера).

Выявлен филогенетический состав метаболически активных гидролитических прокариотных комплексов вертикальных ярусов наземных экосистем в зависимости от экологических факторов.

Проведенная оценка потенциальной гидролитической активности микробных сообществ наземных экосистем, развивающихся в широком диапазоне действия экологических факторов, и анализ их компонентного состава могут быть полезны в разработке и применении хитинсодержащих компостов и биодеградабельного упаковочного материала (биопластика), а также для решения проблемы утилизации хитин- и пектинсодержащих отходов. Полученные данные могут быть использованы в биотехнологии для подбора оптимальных условий при поиске и выделении активных организмов хитино- и пектинолитиков, а также создании биопрепаратов для борьбы с фитопатогенами.

Полученные культуры гидролитиков могут быть использованы с целью утилизации отходов микробиологической, медицинской и пищевой промышленности, а также в качестве средства защиты растений от возбудителей болезней. Познание закономерностей микробного разложения биополимеров даст возможность управлять микробными популяциями, в частности откроет новые перспективы повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Результаты проведенных исследований включены в учебные пособия «Образование и поглощение парниковых газов в почвенных агрегатах» (2006);

«Идентификация метаболически активных клеток прокариот в почвах с применением молекулярно-биологического флюоресцентно-микроскопического метода анализа fluorescence in situ hybridisation (FISH)» (2008);

«Молекулярно биологические аспекты исследований в экологии и микробиологии» (2010) и использованы в лекционных курсах по биологии почв, почвенной бактериологии, молекулярной биологии, экологии почвенных микроорганизмов, читаемых на факультете Почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Проведение исследований было поддержано грантами РФФИ (проекты 11 04-00931а;

11-04-92202-Монг_а;

00-04-49162а;

02-04-49061а;

05-04-49252а;

08-04 01233а;

06-04-48165а;

03-04-06911(мас);

грантами президента РФ для молодых ученых (МК-4000.2005.4 );

грантами президента РФ для поддержки Ведущих научных школ (НШ-1518.2003.4, НШ-8797.2006.4, НШ-2227.2008.4), ФЦНТП «Биологическое разнообразие».

Основные защищаемые положения диссертации 1. Применение молекулярно-биологических методов (FISH) в экологических исследованиях обеспечивает получение более полной информации о таксономическом разнообразии и потенциальной гидролитической активности микробных комплексов наземных экосистем, существующих в широком диапазоне экологических факторов (влажности, температуры, окислительно восстановительного потенциала, поступления органического вещества). Сочетание двух молекулярно-биологических методов (FISH и суммарного DGGE амплификата фрагментов гена 16S обеспечивает возможность rRNA) информативной оценки различий в структуре доминантных и минорных компонентов гидролитических комплексов, формирующихся в различных ярусах наземных экосистем.

2. Функциональная деятельность гидролитических микробных комплексов наземных экосистем определяется активностью как доминантного, так и минорного компонента, которые также обладают высокой валовой ферментативной активностью. Деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, представителями филогенетической группы Proteobacteria (классы альфа и бета). В минеральных горизонтах почвы усиливается роль гидролитических представителей групп Firmicutes и Actinobacteria.

Среди параметров, определяющих функциональную активность 3.

гидролитического (хитинолитического) комплекса почвенного яруса (влажность, питательный ресурс, время) наиболее значительным является влажность. Уровень влажности, обусловливающий максимальную активность гидролитического комплекса зависит от типа почвы. Развитие гидролитического микробного комплекса происходит при крайне широком диапазоне влажности - от близкой к полной влагоемкости до близкой к влаге завядания, а также в нанометровых водных пленках.

4. Функциональная роль мицелиальных актинобактерий в метаболизме хитина заключается, с одной стороны, в активном разложении этого биополимера, а с другой – в регуляции функционирования микробного комплекса посредством продукции биологически активных регуляторных метаболитов, что реализуется в широком диапазоне экологических параметров (влажность, температура, поступление органического вещества, сукцессионное время).

Оценка потенциальной гидролитической активности и анализ 5.

компонентного состава микробных сообществ наземных экосистем в широком диапазоне действия экологических факторов могут быть полезны: 1) для разработки и применения хитинсодержащих компостов и биодеградабельного упаковочного материала (биопластика);

2) для решения проблемы утилизации хитин- и пектинсодержащих отходов;

3) для подбора оптимальных условий выделения изолятов хитино- и пектинолитиков и 4) для содания биопрепаратов для борьбы с фитопатогенами.

Апробация работы.

Материалы, вошедшие в диссертацию, были доложены и обсуждены на международных конференциях и симпозиумах: II (Санкт-Петербург, 1996), III (Суздаль, 2000), IV (Новосибирск, 2004), V (Ростов-на-Дону, 2008) съездах Докучаевского общества почвоведов;

Национальной конференции с международным участием «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии» (Пущино, 2000);

Научной конференции Растение и почва (Москва, 2001);

Iinternational symposium "Functions of soils in the geosphere-biosphere systems" (Moscow, 2001);

Международной научной конференции "Экология и биогеохимическая деятельность микроорганизмов" (Одесса, 2001);

Международной научной конференции «Ecosystems of Mongolia and frontier areas of adjacent countries: Natural resources, biodiversity and ecological prospects» (Ulan-Bator, 2005);

Международной научной конференции Проблемы сохранения, восстановление и обогащение биоразнообразия в условиях антропогенно измененной среды, (Кривой Рог, 2005);

18th World Congress of Soil Science (Philadelphia, 2006);

10th International Conference on Chitin & Chitosan (Montpellier, 2006);

14th International Symposium on the Biology of Actinomycetes (Sunday, 2007);

X European Workshop on Astrobiology (EANA’2010) (Pushchino, 2010);

Доклад на научной конференции «Ломоносовские чтения» (Москва, 2009);

Научной конференции «Чтения памяти академика В.Е.

Соколова» (Москва,2009);

на заседании кафедры в Институте почвоведения и оценки земель университета Хохенхайм (Штутгарт, 2010), на заседаниях кафедры биологии почв факультета Почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Публикации. Материалы диссертации содержатся в 90 печатных работах: коллективные монографии, 35 экспериментальных статей (в том числе обзоры), опубликованных в реферируемых журналах, входящих в список ВАК, 6 учебных пособий и тезисов докладов на Международных и Всероссийских симпозиумах и конференциях.

Объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение, заключение, выводы и список литературы.

Материалы диссертации изложены на 300 страницах, содержат 109 рисунков, таблиц. Список литературы включает 306 источников, из них 237 зарубежные.

Место проведения работы. Основная часть работы проводилась на кафедре биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова с 2000 по 2011г. В работе использованы материалы, полученные в соавторстве с аспирантами и студентами, выполнявшими свои исследования под руководством автора.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность всем коллегам – соавторам публикаций, принимавшим участие в представленной работе на различных этапах ее выполнения. Особую благодарность автор выражает своим учителям и наставникам - д.б.н., проф. Д.Г.Звягинцеву, д.б.н, чл.-корр. РАН И.Ю.Чернову, д.б.н. П.А.Кожевину, д.б.н., проф. А.Л.Степанову, д.б.н., проф.

М.М.Умарову, д.б.н., проф. Г.М.Зеновой, д.б.н., проф. И.И.Судницыну, д.б.н., проф. А.В.Смагину, к.б.н., вед. научн. сотр. Т.Г.Добровольской, д.б.н. Л.В.Лысак, д.б.н. Л.М.Полянской, д.б.н. О.Е.Марфениной, к.б.н. И.К.Кравченко.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования Полевые исследования и сбор материалов проводились в наземных экосистемах различных биоклиматических зон с учетом вертикальной ярусности.

Объектами исследования явились образцы, отобранные из разных ярусов вертикальной структуры наземных экосистем, представляющие собой: 1) верхние гумусовые горизонты чернозема обыкновенного (Воронежская обл., Таловский р н), каштановой (Волгоградская область, Иловлинский р-н), серой лесной (Тульская обл., Щекинский р-н), дерново-подзолистой (Московская обл., Солнечногорский р н), глее-слабоподзолистой (Тюменская обл., г. Надым) почв и текстурного уплотненного горизонта бурой пустынно-степной почвы Монголии (Южный Гоби, Булган сомон) - почвенный ярус;

2) наземные образцы подстилок соответствующих почв - наземный ярус (смешанный образец, включающий все три слоя – L, F и H) и 3) растительные субстраты - надземный ярус (зеленая хвоя ели (Picea abies), листья липы (Tilia cordata), березы (Betula sp.)). Образцы субстратов отбирались с повторностью, достаточной для учета пространственных и временных вариаций структуры гидролитических микробных сообществ.

Методы исследования Особое внимание в исследованиях уделено анализу динамики структурных и функциональных показателей в ходе сукцессий гидролитических (хитинолитического и пектинолитического) микробных сообществ наземных биогеоценозов. При определении структуры гидролитического микробного комплекса в исследуемых образцах наземных экосистем использовали метод микрокосмов с инициацией микробной сукцессии увлажнением и внесением очищенных полисахаридов (хитина («ICN Biomedicals», Германия), пектина («Sigma», Германия) или целлюлозы («Sigma», Германия)). Масса вносимых субстратов во всех вариантах не превышала десятых долей процента от массы образца. Инкубация почвенных микрокосмов проводилась при широком диапазоне матричного давления почвенной влаги (P) (от 0 до -808 кПа) (Смагин, окислительно-восстановительного потенциала и при различных 2005), температурах (5, 27 и 50оС).

Определение численности и таксономической принадлежности доминирующих групп микроорганизмов проводили на генетическом уровне методами FISH (fluorescence in situ hibridisation) и DGGE (denaturing gradient gel Определение численности бактерий, длины мицелия electrophoresis).

актиномицетов и грибов проводили с использованием метода люминесцентной микроскопии препаратов, окрашенных набором различных флюорохромов. С использованием метода флюоресцентной гибридизации in situ (метод FISH) (Amann, 2000) с модификацией метода для работы с почвой (Манучарова, 2008) выявляли специфику прокариотного, метаболически активного сообщества, разрушающего полисахариды. Применен спектр зондов, специфичных для представителей доменов Archaea и Bacteria, а также отдельных филогенетических групп Bacteria. Использование метода FISH позволило учесть живые, метаболически активные клетки в исследуемых образцах с внесением полисахаридов и без их внесения. Учет численности проводили с использованием люминесцентного микроскопа «Axioskop2+». Подробная методика приведена в тексте диссертации. Общую биомассу и долю метаболически активных микроорганизмов определяли расчетным методом.

Таксономическую принадлежность доминирующих групп гидролитических прокариотных комплексов наземных экосистем выявляли с использованием метода денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ), основанного на анализе ПЦР-фрагментов. Разделение фрагментов генов 16S rRNA и хитиназного гена группы «А» проводили на оборудовании DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, США) в Институте микробиологии РАН имени С.Н.Виноградского согласно протоколу (Кравченко и др., 2010) с использованием денатурирующего градиента (формамид, мочевина) 50-65% под напряжением 40 V в течение 16 ч для 16S rRNA (и 35-60% при 200V в течение ч для chiA) при постоянной температуре 60о С. Результаты электрофореза регистрировали с помощью системы гель-документирования BioDoc Analyzer II (Biometra, Германия) после окрашивания этидий бромидом. Характерные видимые полосы были элюированы, полученные растворы очищены и использованы для определения нуклеотидных последовательностей.

Выделение ДНК. Для экстрагирования тотальной ДНК из образцов наземных экосистем (листьев, подстилки и почвы) применяли стандартные методики PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO, США), руководствуясь инструкциями производителя;

из чистых культур микроорганизмов ДНК извлекали с помощью Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США).

Выбор олигонуклеотидных праймеров и амплификация ДНК. Для амплификации путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) филогенетических фрагментов генов, кодирующих 16S и 23S rRNA в большинстве экспериментов были использованы универсальные праймерные системы (11F-1492Re и 341F+GC-907R (Muyzer et al., 1993);

в случае амплификации гена 23S rRNA ITS1F-NL4Re) и соответствующие условия реакции. В процессе работы были специально модифицированы праймерные системы и соответствующие условия реакции для амплификации функциональных генов хитинолитиков – гена, кодирующего хитиназу группы «А» - chiA.

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи как горизонтального электрофореза в 1,2-2% геле агарозы при напряженности электрического поля V/см, так и вертикального электрофореза (ДГГЭ).

Секвенирование ДНК. Реакции секвенирования проводили с использованием прямых и обратных праймеров с использованием автоматического капиллярного секвенатора (Silver Sequence d/ddNTP Mixes, Promega, США).

Филогенетический анализ. Для предварительного анализа полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S rRNA и chiA использовали программное обеспечение баз данных GenBank и (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) Ribosomal Database Project (RDP) (http://rdp.cme.msu.edu). Редактирование последовательностей осуществляли с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), а их множественное выравнивание - с использованием программы CLUSTAL W 1.75. Построение дендрограмм осуществляли с помощью алгоритма ближайшего связывания neighbor-joining (NJ) в программе MEGA 4 (Tamura, 2007).

Статистическую достоверность филогенетических реконструкций оценивали методом «Bootstrap» путем построения 1000 альтернативных деревьев. Все вновь полученные последовательности различных генов были депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей (GenBank) с присвоением им индивидуальных номеров доступа.

Наличие гидролитических ферментов и хитиназного гена группы «А» (chiA), вырабатываемых разными группами микроорганизмов в системах микрокосмов определяли молекулярно-биологическими и спектрофотометрическим методами. Интенсивность образования фермента хитиназы в исследуемых образцах in situ, а также чистыми культурами микроорганизмов осуществляли спектрофотометрически с использованием в качестве субстрата хитиназура – коммерческого препарата окрашенного хитина (Gomes Ramizes et al., 2004), также с применением 4-метилумбеллиферон меченого N-ацетил-D-глюкозоаминида дигидрата (Pritsch et al., 2004). Наличие хитиназного гена группы «А» chiA в образцах исследуемых микрокосмов наземных экосистем обнаруживали с помощью «вложенного» ПЦР („nested“ PCR) согласно протоколу (Williamson et al., 2000).

Эмиссию парниковых газов (диоксида углерода, закиси азота и метана) из образцов наземного (подстилка) и почвенного ярусов при внесении полисахаридов и без них оценивали газохроматографическим методом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Для более детальной оценки активности гидролитических микробных комплексов проводили статистическую обработку данных методами многомерной математической статистики с использованием программ STATISTICA-6 и Statgraphics Plus.

Результаты и обсуждение 1. Филогенетическое разнообразие гидролитических прокариотных комплексов в пространственно-сукцессионном ряду наземных лесных экосистем Поскольку молекулярно-экологический подход не ограничен обязательным принципом «чистой культуры», полученные с его применением результаты могут существенно дополнить и расширить представления о микробном разнообразии. Для того чтобы подчеркнуть, что молекулярная экология изучает природные сообщества не на уровне целых организмов, а на уровне отдельных элементов их геномов, предложен термин филотип (Турова, 2009). Таким образом, применение молекулярных методов в экологических исследованиях позволяет получить филогенетическую информацию об отдельных членах сообщества, даже если они не были ранее известны микробиологам. С целью характеристики исследуемых сообществ были использованы молекулярно-экологические методы флюоресцентного анализа гибридизации клеток in situ (FISH) и сиквенс-анализ, проведенного по результатам метода DGGE филогенетических (фрагментов гена 16S rRNA) и функциональных (chiA) генов. Оценивая метаболически активные гидролитические природные комплексы в пространственно-сукцессионном ряду, следует обратить внимание на то, что во всех исследуемых ярусах надземном (филлосфера), наземном (подстилка) и почвенном, доля метаболически активных клеток составляла приблизительно третью часть (35%) от комплексов всех прокариотных организмов. Филогенетическая структура метаболически активного гидролитического комплекса при переходе от филлосферы к подстилке и почве значимо изменялась. В надземном и наземном ярусах значительную часть гидролитического комплекса составляли протеобактерии.

От надземного яруса к наземному и особенно почвенному ярусам доля активных представителей протеобактерий сокращалась от 50% до 25% от всех выявляемых клеток бактерий, соответственно. В почвенном ярусе отмечено возрастание численности фирмикут и актинобактерий, доля которых составила 49% от всех активных прокариот (рис.1).

Надземный слой Наземный слой Почвенный слой 10% 5% 9% 15% 10% 11% 5% 3% 10% 10% 14% 15% 4% 18% 8% 4% 5% 23% 6% 21% 20% 19% 29% 18% 5% 3% Cytofaga + Actinobact Verruco Planctomy Flavobacte Acidobacte eria Firmicutes microbia cetes ria ria P roteobacteria Рис.1 Соотношение отдельных филогенетических групп домена Bacteria (метод FISH) в вертикально-ярусном ряду (серая лесная почва (почвенный слой), подстилка (наземный слой), листья надземный слой (филлосфера)) Современный молекулярно-биологический метод денатурирущего градиентного гель-электрофореза (DGGE) суммарного амплификата фрагментов гена 16S rRNA домена Bacteria (Novinscak et al., 2007) был использован с целью оценки сложности и выявления различий в структурах доминантных составляющих микробных гидролитических сообществ надземного, наземного и почвенного ярусов.

На полученных профилях ДГГЭ интенсивность и количество дискретных полос в образцах с добавлением полисахаридов были выше по сравнению с контрольными вариантами. Сиквенс-анализ характерных ДГГЭ полос выявил в образцах микрокосмов спектр сиквенсных типов, сходных с группами, получаемыми флюоресцентным методом гибридизации клеток in situ (FISH).

Для образцов филлосферы обнаружено присутствие филотипов, наиболее близких к бактериям семейства Oxalobacteraceae класса Betaproteobacteria и семейству Acidobacteriaceae филума Acidobacteria (рис.2а). Представители ацидобактерий нового рода Granulicella выделены из мхов сфагновых болот отечественными исследователями (Дедыш, 2009) и характеризуются как гидролитики, обладающие пектинолитическим комплексом ферментов.

Выделение этого рода таксонов стало возможным только в результате применения молекулярно-биологических методов. Бактериальный компонент в наземном ярусе (для образцов подстилки с полисахаридом) был представлен четырьмя филотипами, составляющими два филогенетических кластера. Один из них наиболее близок к семейству Enterobacteriaceae класса Gammaproteobacteria, второй - к семейству Clostridiaceae грамположительных бактерий.

В почвенном ярусе гидролитический бактериальный компонент оказался наиболее разнообразным, составляя 8 филотипов, принадлежащих к трем основным линиям эволюции бактерий (семейства Chitinophagaceae филума Bacteroidetes, семейства Bacillaceae грамм-положительных бактерий и филума Actinobacteria актиномицетами рода Streptomyces) (рис. 2б). На дендрограмме представлены профили ДГГЭ для образцов листьев и почвы с полисахаридом и без него.

Таким образом, комбинирование двух молекулярно-биологических методов (FISH и DGGE) дало возможность информативно оценить различия в структурах доминантных составляющих гидролитических сообществ наземных экосистем, формирующихся в различных ярусах.

Оценена численность физиологически активного гидролитического прокариотного комплекса в надземном (филлосфера), наземном (подстилка) и почвенном ярусах, установлено, что она составляет третью часть от комплекса всех прокариотных организмов.

Выявлены различия в филогенетической структуре гидролитического прокариотного комплекса пространственно-сукцессионного ряда наземных экосистем. Деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, группой протеобактерий (альфа и бета). В почвенном гидролитическом комплексе увеличивается доля фирмикут и актинобактерий.

Результаты подтверждают имеющиеся данные, полученные ранее сотрудниками кафедры биологии почв МГУ о вертикально-ярусной структуре микробного комплекса (Звягинцев и др., 1999), пополняя их оценкой доли физиологически активных гидролитиков представителей прокариот в филлосфере, подстилке и почве.

Massilia sp. gi|323362903|emb|FM99801...

а) Oxalobacteraceae Naxibacter alkalitolerans gi|31965878...

(Betaproteobacteria) Massilia sp. gi|323362893|emb|FM99800...

Massilia aerolata gi|312179362|gb|HQ4...

Uncultured Massilia sp. gi|209421525|...

99 Uncultured Massilia sp. gi|209421848|...

Uncultured Massilia sp. gi|209421513|...

Хитин Granulicella paludicola partial gi|15...

Acidobacteriaceae Granulicella paludicola gi|310772167|...

Granulicella pectinivorans gi|1581481...

Uncultured proteobacterium clone gi|1...

Хитин 20 Uncultured proteobacterium clone gi|1(2) Bacillus sp. LChit9 partial 16S rRNA...

Pseudomonas sp. LChit68 partial 16S r...

Pseudomonas sp. LChit57 partial 16S r...

0. Конт роль Streptomyces sp. 5GP1-1 partial 16S r...

б) Streptomyces globosus EF371433. (Actinobacteria) Streptomyces griseus NBRC 13350 18243...

Streptomyces griseus strain E989 GU38...

20 Streptomyces microflavus strain B-10...

Streptomyces griseus HQ 43 Chitinophaga pinensis DSM 2588 256419...

Chitinophaga pinensis DSM 2588 256419(2) Chitinophagaceae Chitinophaga pinensis DSM 2588 (Bacteroidetes) Unc. Bacteroidetes bacterium AS9 DQ00...

84 Unc. Bacteroides sp.4 225 GU 44 Unc. Cytophaga sp.1 272 GU Хит ин Bacillus cereus Rock3-28 contig01536...

Конт роль Хит ин 85 Geobacillus sp. Y412MC52 Bacillaceae Конт роль (Firmicutes) Bacillus cereus NVH 391-98 36 Geobacillus sp. WCH70 50 Geobacillus sp. WCH70 239825584(2) Хит ин Конт роль 100 Bacillus coagulans 36D1 0. Рис 2. Филогенетический анализ бактериального компонента микробного гидролитического сообщества а) - надземного яруса (зеленые листья березы);

б) - почвенного сообщества (гумусовый горизонт серой лесной почвы), основанная на результатах DGGE анализа амплифицированных фрагментов гена 16S rRNA. Опытные варианты обозначены кружками. Дерево построено с помощью алгоритма neighbour-joing, масштаб представляет собой эволюционные расстояния и соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap» - анализа 1000 альтернативных деревьев.

2. Физиология и филогения почвенных гидролитических микробных комплексов При сравнении интенсивности деструкции хитина микроорганизмами, определяемой по величине коэффициента трансформации хитина (КТХ, рассчитанного по соотношению эмиссии СО2 из опытного варианта к кон трольному), в опытах с микрокосмами почв разных типов показано, что в микрокосмах чернозема и серой лесной почвы разложение полисахарида протекало почти в 2 раза интенсивнее по сравнению с микрокосмами почв других типов (рис.3).

ктх 5, 4, 3, се 2,0 ра ял че ес рн на 1,0 оз я ем ка шт ан 0,0 со ов ло ая 1 5 7 14 20 28 36 не ц сутки Рис.3 Динамика разложения биополимеров в почвах разных типов (КТХ= мкг С-СО опыт /мкг С-СО2 контроль) По результатам оценки дыхания почв с внесением полисахарида с помощью кластерного анализа (STATISTICA-6) образцы объединяются в следующие группы: каштановая и солонец, бурозем и дерново-глеевая, серая лесная почва и чернозем. Последняя группа почв по отклику на внесение полисахарида выделяется среди других (рис.4). По результатам оценки общей биомассы микроорганизмов методом кластерного анализа выделяются две группы почв: каштановая и солонец, серая лесная и чернозем, где прирост биомассы после внесения полисахарида происходит активнее, чем в других почвах.

Следует отметить, что именно в этих почвах при внесении хитина происходит особенно заметное возрастание биомассы гидролитического про кариотного комплекса, главным образом, актиномицетного компонента.

Метод одиночной связи Евклидово расстояние мкгС-СО 2 опыт /мкгС-СО контроль П6СО2 П5СО2 П4СО2 П3СО2 П2СО2 П1СО П6 П5 П4 П3 П2 П Рис.4 Дендрограмма кластерного анализа по отклику эмиссии СО2 в разных почвах при внесении полисахарида (хитина). П1-чернозем, П2-каштановая, П3-солонец, П4-серая лесная, П5-бурозем, П6-дерново-подзолисто-глеевая.

В исследуемых образцах почвенных микрокосмов было in situ зарегистрировано образование фермента хитиназы и определена динамика его концентрации (рис.5).

а) грибы бактерии актиномицеты сутки б) мкмоль/г час сутки 1 4 8 14 сутки 1 3 8 15 Рис. 5. Динамика (а) биомассы микроорганизмов и (б) динамика активности хитиназы в черноземе.

При этом интересно отметить, что максимальная активность хитиназы в увлажненном черноземе измеренная использованием 4 in situ, c метилумбеллиферон-меченого дигидрата, N-ацетил-B-D-глюкозоаминид приходится на 7-е сутки опыта и достигает 600 мкмоль/г почвы. Данная зависимость коррелирует с полученными результатами эмиссии диоксида углерода и биомассы микроорганизмов в микрокосмах.

3. Детекция и сиквенс-анализ хитиназного гена chiA в почвенных системах Для изучения функциональных особенностей природных микробных сообществ широкое распространение получил подход на основе анализа функциональных генов. С помощью метода «вложенного» ПЦР-анализа (nested с использованием специфических праймеров и последующим PCR) разделением полученных продуктов ПЦР с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза проведено исследование хитиназного гена группы А (chiA) 18 семейства гликозилгидролаз в почвенном микробном сообществе in situ и чистых культурах микроорганизмов, выделенных из исследуемых почв. Среди известных хитиназ эта группа обладает высоко консервативными участками, обеспечивающими их специфическую детекцию среди широкого филогенетического разнообразия микроорганизмов и обнаруживается у 70-80% микробов-хитинолитиков (Williamson et al., 2000).

ДГГЭ анализ амплифицированных фрагментов хитиназного гена показал возрастающую сложность микробных сообществ в почве с добавлением хитина по сравнению с сообществами в почве без хитина. Результаты секвенирования выдавали отношение полученных последовательностей к хитиназному гену некультивируемых организмов и таких филогенетических групп, как Actinobacteria и Firmicutes. Среди близкородственных организмов, у которых методом ДГГЭ выявлен хитиназный ген, не всегда обнаруживались доминанты, выделенные нами методом посева на плотные среды с хитином. Наблюдается корреляция между результатами, полученными исследованием филогении функционального хитиназного гена, и результатами филогении 16S rRNA.

Следует отметить, что используемые методы пополняют результаты друг друга разнообразием представителей-гидролитиков. Эти данные позволяют предполагать наличие горизонтального переноса хитиназных генов, как большинства генов биодеградации, сосредоточенных в плазмидной ДНК, внутри микробного сообщества.

Таким образом, установлено, что наиболее активное разложение полисахаридов наблюдается в образцах чернозема и серой лесной почвы, что определяется структурой гидролитического микробного комплекса этих почв. В почвах с наиболее активным разложением полисахаридов, основными гидролитиками являются прокариоты. Показано наличие in situ фермента хитиназы и хитиназного гена группы А, принадлежащего представителям групп Actinobacteria и Firmicutes.

4. Воздействие экологических факторов на структуру и функциональную деятельность почвенных гидролитических микробных комплексов Знание масштабов распространения гидролитических микробных комплексов, устойчивых к экстремальным значениям экологических факторов, важно не только с теоретических позиций, но и в практическом аспекте в связи с такими проблемами, как получение гидролитических ферментов, устойчивых к экстремальным значениям влажности, температуры, рН;

применение микробов гидролитиков для биоконтроля и биоремидиации, борьбы с фитопатогенными грибами.

4.1. Динамика эмиссии диоксида углерода и метана из почв с внесением полисахаридов при различных параметрах давления почвенной влаги и температуры Изучение влияния увлажненности почвы на эмиссию диоксида углерода из почв при внесении разных полисахаридов показало, что давление почвенной влаги влияет на динамику и интенсивность эмиссии диоксида углерода в большей степени при внесении хитина, по сравнению с другими исследованными субстратами (пектином, глюкозой и целлюлозой). Масса вносимых субстратов во всех образцах содержала равное количество молей углерода. С возрастанием давления почвенной влаги от -800 кПа до -0,5 кПа интенсивность эмиссии СО2 при внесении хитина в микрокосмы с образцами чернозема увеличивалась больше, чем в два раза от 4 до 18 мкг С-СО2/г почвы за час, что не отмечается в случае внесения в почву других исследуемых субстратов (рис. 6). Подобные закономерности наблюдались в случае микрокосмов всех исследованных почв.

мкг С-СО2/г. час хит ин пект ин целлюлолза глюкоза -800 -3,2 -0, конт роль Давление почвенной влаги, кПА Рис. 6. Зависимость эмиссии диоксида углерода из образцов чернозема при разложении полисахаридов и глюкозы от давления почвенной влаги.

В связи с тем, что полисахариды присутствуют в почвах как в аэробных, так и в анаэробных микрозонах, рассмотрена их трансформация в микроаэробных условиях. В качестве показателя интенсивности трансформации была выбрана эмиссия метана из образцов почвы с внесением хитина и без него. При влажности близкой к полной влагоемкости, интенсивная эмиссия метана наблюдалась из образцов всех исследуемых почв, что свидетельствует о наличии строго анаэробных микрозон во всех этих почвах. Разница в величинах эмиссии метана из почвы с внесением хитина и без него (контролем) заметна уже на начальных этапах инкубирования почвы, что свидетельствует о использовании микроорганизмами внесенного хитина уже в первые сутки опыта. Наиболее высокие показатели эмиссии метана и различия в величинах эмиссии между опытными и контрольным вариантами были зафиксирована между 20-30-ми сутками опыта, что, очевидно, связано с развитием метаногенов на продуктах метаболизма хитинолитиков.

Следует отметить, что эмиссия метана из почв наблюдалась при всех исследуемых уровнях матричного давления почвенной влаги: от -800 до -0,5 кПа.

Установлено, что анаэробная трансформация хитина протекает с разной интенсивностью в почвах при исследуемых уровнях влажности и матричного потенциала. Интервал значений влажности для анаэробной трансформации хитина в разных почвах имеет свою величину. Так, в глее-слабоподзолистой песчаной почве наиболее активная работа анаэробов хитинолитиков зафиксирована в достаточно узком интервале влажности от 15% от массы почвы (матричное давление -1,16 кПа) до 25% от массы почвы (полная влагоемкость, 0 кПа), в то время как в черноземе этот интервал значений влажности увеличивался от 36% от массы почвы (матричное давление -32,6 кПа) до 64% от массы почвы (полная влагомкость, 0 кПа). В почвах с большим содержанием илистых фракций (серая лесная, ЭПЧ 1мкм — 28%) коэффициент трансформации хитина возрастал в области больших значений влажности, а для песчаных почв в области меньших (глее-слабоподзолистая ЭПЧ 1мкм — 5%). Существует зависимость между интенсивностью трансформации хитина в анаэробных условиях и радиусом пор, занятых водой. Результаты исследований показали, что при радиусе пор (занятых водой) менее 6 мкм работа анаэробного хитинолитического микробного комплекса (определяемая по величинам коэффициентов трансформации хитина) минимальна, что свидетельствует о затрудненном развитии микроорганизмов-анаэробов вследствие малого диаметра пор. Таким образом, верхний предел изучаемого процесса определялся полной влагоемкостью почв, а нижний - размером пор, в которых еще возможно развитие бактерий.

Исследование активности дыхания в почвенных микрокосмах с внесением хитина и пектина при различных температурах показало, что эмиссия СО 2 в этих вариантах превышала эмиссию в контроле в среднем в 2-6 раз во всех исследованных вариантах опыта. Скорость продукции СО2 в опытных вариантах с внесением полисахаридов различалась в зависимости от температуры инкубации. При минимальной температуре (5оС) пик активности наблюдался к концу 3-й недели эксперимента, при 27оС – к концу первой недели, а при 50оС – уже на первые сутки опыта. В контрольных вариантах подобной закономерности не наблюдалось, что свидетельствует о высокой активности микробных сообществ, использующих полисахариды.

Эмиссия диоксида углерода использована в качестве функционального показателя микробного хитинолитического сообщества в эксперименте на основе математического планирования определения условий, обеспечивающих оптимальные значения факторов для микробного разложение хитина в почвах.

Эксперимент спланирован по схеме центрального композиционного плана «2 +звезда». В результате получена поверхность отклика функционального показателя (эмиссии диоксида углерода) в зависимости от температуры с течением времени с четко выявляемой вершиной (рис.7).

Б.

А.

Рис. 7. Поверхность отклика функционального показателя (эмиссии диоксида углерода) на трехмерном графике в экспериментах с внесением хитина в А – пустынно-степную почву и Б – чернозем типичный.

Установлено, что оптимальные значения факторов различались для почв исследуемых типов. На контурных графиках (рис. 8) видно, что для чернозема максимальное дыхание обнаруживается примерно на 20-е сутки при температуре 25оС, для пустынно-степной почвы – на 10-е сутки при температуре 30оС.

А. Б.

Рис. 8. Оптимальные значения факторов (температуры и сукцессионного времени) на контурном графике в экспериментах с внесением хитина в А – бурую пустынно степную почву и Б – чернозем типичный.

Таким образом, с помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессионного времени) для функционального показателя (дыхания) микробного гидролитического сообщества, развивающегося в почвах разных типов.

Динамика биомассы хитинолитического и пектинолитического 4.2.

микробных комплексов почв, развивающихся при различных параметрах температуры и давления почвенной влаги При рассмотрении численности и биомассы гидролитического микробного комплекса отмечено возрастание всех групп микроорганизмов в вариантах с полисахаридами по сравнению с контрольными вариантами. Эксперименты по определению динамики численности и биомассы разных групп микроорганизмов в ходе микробной сукцессии в образцах почв, инкубируемых при разных температурах, в целом подтвердили закономерности, полученные при исследовании динамики активности дыхания во всех почвах (рис. 9).

Установленная зависимость коррелировала с полученными результатами по определению активности хитиназы in situ с использованием 4 метилумбеллиферон-меченого N-ацетил-B-D-глюкозоаминид дигидрата. Так, максимальная активность хитиназы в увлажненном черноземе in situ даже без внесения хитина при 27оС приходилась на 8-е сутки эксперимента и составляла 610 мкмоль/г в ч, что в шесть раз превышало активность хитиназы в этой же почве, инкубируемой при 5оС. Исследование отношений биомассы отдельных групп микроорганизмов в образцах с добавлением субстрата и контрольных образцах (рис. 10) показало, что вне зависимости от субстрата и типа почвы грибы имеют тенденцию разлагать полисахариды более активно при низких температурах. Активность прокариотного комплекса в значительной степени связана с типом почвы. Как бактериальный, так и актиномицетный гидролитические комплексы глее-подзолистой почвы особенно активны при низких температурах.

В бурой пустынно-степной почве вклад прокариотных организмов в процесс разложения полисахаридов максимален при 50оС. Активность актиномицетов при повышенных температурах особенно велика в бурой пустынно-степной почве и черноземе при внесении хитина. Выявленные особенности обусловлены структурой природного микробного комплекса, приспособленного к климатическим условиям и свойствам почвы.

Wilks lambda=,04873, F(30, 311,81)=18,701, p=0, Vertical bars denote 0,95 confidence intervals 0, А.

0, мг/ г почвы 0, 0, 0, Контроль Хитин 0, Пектин 0 1 4 8 15 30 0 1 4 8 15 30 0 1 4 8 15 сутки Wilks lambda=,07445, F(30, 311,81)=14,790, p=0, Vertical bars denote 0,95 confidence intervals 0, Б.

0, 0, мг/ г почвы 0, 0, 0, Контроль 0, Хитин Пектин 0 1 4 8 15 30 0 1 4 8 15 30 0 1 4 8 15 сутки Wilks lambda=,01800, F(30, 311,81)=30,457, p=0, Vertical bars denote 0,95 confidence intervals В.

5оС 27оС 50оС мг/г почвы Контроль Хитин Пектин сутки 0 0 1 4 8 15 30 1 4 8 15 30 1 4 8 15 Рис. 9. Динамика биомассы микроорганизмов (мг/г почвы) при различных температурах в ходе хитино- и пектолитической сукцессии в черноземе типичном: А – бактерии, Б – актиномицеты, В – грибы.

Б.

А. К6 К х п х п х п х п х п х п грибы бактерии акт-ты грибы бактерии акт-ты В. Т, оС:

5 27 K х п х п х п грибы бактерии акт-ты Рис. 10. Максимальные значения отношений биомассы основных групп микроорганизмов в почвах с добавлением хитина (х) и пектина (п) и биомассы тех же групп в контрольных образцах (К) в ходе эксперимента при различных температурах инкубации чернозема (А), глее-слабоподзолистой (Б) и пустынно-степной (В) почв.

Анализ основной информации о динамике структурных (биомасса грибов, бактерий и актиномицетов) и функционального (эмиссия диоксида углерода) показателей проведен с помощью методов многомерной математической статистики.

Пошаговая множественная регрессия для выявления связи между функциональным и структурными показателями определила существенную роль вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов в функционировании почвенного микробного сообщества – мицелиальных и одноклеточных бактерий, особенно актиномицетов (рис.11). Полученная регрессионная модель на основе двух переменных имеет высокую статистическую значимость (объясняет до 90% дисперсии функционального показателя).

Зависимость описывается следующими уравнениями для исследуемых почв: Resp = 52,87*B + 89,27*A – пустынно-степной почва Resp = 37,77*B + 555,49*A – серая лесная почва, где Resp – эмиссия СО2 (мкг С-CO2/гч), А – биомасса актиномицетов (мг/г), В – биомасса бактерий (мг/г).

Рис. 11. Регрессионная модель зависимости эмиссии диоксида углерода (Resp) от биомассы [мг/г] актиномицетов (А) и бактерий (В) в А – пустынно-степной почве и Б – серой лесной почве.

Таким образом, установлена высокая активность при гидролизе полисахаридов вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов микробного сообщества – мицелиальных и одноклеточных прокариот, которые, как показано, вносят существенный вклад в контролирование дыхания микробного сообщества в широком спектре условий (температура, влажность, поступление органического вещества, сукцессионное время). При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.

С помощью методов многомерной математической статистики был проведен анализ структурных (биомасса грибов, бактерий и актиномицетов) и функционального (эмиссия диоксида углерода) показателей гидролитических микробных сообществ в почвах с внесением и без внесения полимеров при различной увлажненности. На дендрограмме кластерного анализа (вертикальная ось отражает относительное сходство) можно выделить два кластера (рис.12). В первом кластере представлено 20, а во втором 7 объектов. По координатам центроидов можно судить о том, какие переменные играют наиболее важную роль в каждом кластере. По показателям обилия актиномицетов и дыхания указанные кластеры практически не различаются.

Рис. 12. Дендрограмма кластерного анализа (объекты обозначены следующим образом:

a, b и c –давление почвенной влаги -800, -3,2 и -0,5 кПа соответственно;

h, p и k – внесение хитина, пектина и контроль соответственно;

цифры отражают сукцессионные этапы, сутки) Вместе с тем, для первого кластера характерны относительно низкие значения показателей обилия грибов и бактерий (0,64 и 0,13 соответственно). Для объектов второго кластера эти показатели значительно выше (2,89 и 0, соответственно). Существенно, что все объекты второго кластера представлены образцами, которые инкубировались при давлении почвенной влаги -3,2 кПа.

Можно предположить, что в этом случае создаются более благоприятные условия для развития учитываемых грибов и бактерий.

Таким образом, кластерный анализ показал, что в первом приближении уровень увлажненности почвы в заданном диапазоне для некоторых структурных показателей может оказаться более значимым фактором по сравнению с такими существенными для микробного сообщества факторами как внесение органического вещества и время.

С помощью дискриминантного анализа проверена возможность определения показателя увлажненности почв по используемым структурно-функциональным показателям микробного сообщества. Точность диагностики образцов с давлением почвенной влаги -800 кПа составляет 89%. Для образцов с давлением -3,2 и -0, кПа показатели точности диагностики равны 78 и 67% соответственно.

Дискриминантные функции для натуральных значений структурно функциональных признаков имеют следующий вид:

F1= -1,41-9,73* (актиномицеты)+5,71*(бактерии)-0,07*(грибы)-0,03*(дыхание), F2=-1,49+17,54*(актиномицеты)+1,71*(бактерии)- 0,49*(грибы)+0,12*(дыхание).

На диаграмме рассеивания (рис. 13) на плоскости двух дискриминантных функций видно, что объекты с разными значениями давления влаги образуют достаточно обособленные группировки. Большой интерес представляет поиск связей между функциональными и структурными показателями природных микробных сообществ.

Рис. 13. Расположение образцов на плоскости двух дискриминантных функций F1 и F2.

Пошаговый многофакторный регрессионный анализ данных, полученных в разнообразных микробных сукцессиях (с внесением хитина и пектина и без внесения полимеров) в широком диапазоне давления почвенной влаги, позволил выявить и описать определенную связь с помощью регрессионной модели:

(Эмиссия, мкг С-CO2/г ч) = 399,03* (актиномицеты, мг/г) + 2,37*(грибы, мг/г).

Дисперсионный анализ свидетельствует о высоких качествах модели (p0,01, уровень 99%). В целом модель имеет достаточную информационную способность при коэффициенте детерминации 69%.

Вполне ожидаемой и традиционной оказалась связь дыхания с грибной биомассой, но весьма новым и неожиданным является определяющее влияние на функциональный показатель актиномицетов, степень влияния которых на дыхание по данным дисперсионного анализа составляет 87%.

Таким образом, налицо существенная роль минорного по биомассе компонента в функционировании почвенного микробного сообщества. Дыхание, как ключевой функциональный показатель природных микробных сообществ, может существенно контролироваться актиномицетами, роль которых, по всей видимости, определяется не столько их прямым вкладом в стехиометрию процессов разложения органического вещества, сколько вкладом в регуляцию функционирования микробного сообщества, включая механизмы на основе характерной для актиномицетов продукции биологически активных веществ.

Существенно, что этот результат получен в условиях, которые имитируют широкий спектр ситуаций (влажность, поступление органического вещества, сукцессионное время), которые могут создаваться in situ.

Таким образом, установлено, что, уровень увлажненности почвы в заданном диапазоне для некоторых структурных показателей может оказаться более значимым фактором по сравнению с такими существенными для микробного сообщества факторами как внесение ресурсов и время. Влажность имеет более значимое влияние на деятельность хитинолитического комплекса по сравнению с пектинолитическим. При деструкции полисахаридов с увеличением влажности почвы в микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных микроорганизмов, особенно - актиномицетов. Дыхание в широком спектре условий (влажность, поступление органического вещества, сукцессионное время) может существенно контролироваться актиномицетами, роль которых, по всей видимости, определяется вкладом в регуляцию функционирования микробного сообщества.

Молекулярно-биологический анализ компонентного состава гидролитического бактериального сообщества почв, развивающегося при различных влажностях и температурах Исследование прокариотного хитинолитического и 4. пектинолитического сообществ почв с помощью флюоресцентной гибридизации in situ Оценку метаболически активных клеток прокариот в микробном гидролитическом комплексе исследуемых почв проводили с помощью метода in situ гибридизации с rRNA-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (метод FISH) в сроки эксперимента, соответствующие накоплению максимальной микробной биомассы, измеренной с помощью люминесцентной микроскопии, и наибольшей активности дыхания при инкубировании почвы при 5, 27 и 50оС.

Проведенные исследования показали, что в целом суммарная доля идентифицируемых клеток, обнаруженных гибридизацией с универсальными зондами на представителей доменов Bacteria и Archaea, составила в образцах исследуемых почв от 26% для чернозема до 90% для глее-слабоподзолистой и бурой пустынностепной почв от общего числа клеток, выявленных окрашиванием акридином оранжевым. Особенно низким процент идентификации оказался для образцов чернозема, инкубируемых при 5оС, где основная масса бактерий была представлена клетками мелких размеров. Эти данные позволяют предположить, что значительная доля прокариотных организмов чернозема находится в форме покоящихся или метаболически неактивных клеток. В вариантах почв, инкубированных при всех исследуемых температурах с хитином и пектином по сравнению с контрольными вариантами отмечалось возрастание (в 1,5-3 раза) численности метаболически активных представителей доменов Bacteria и Archaea (рис. 14).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 10 8 кл./г п.

контроль хитин пектин 0 6 3 1 контроль хитин А. контрол пектин Bacteria ь контроль хитин хитин Arhaea контрол пектин ь Неидентифицированные 0 3 6 9 12 10 8 кл./г п.

хитин клоны (акридин оранж.) контроль 10*8 кл./г почвы Б. хитин контроль хитин пектин 10 8 кл./г п.

0 3 6 9 12 контроль В.

хитин контроль хитин Т, оС Рис. 14. Численность метаболически активных представителей доменов Bacteria и Аrchaea в микробном комплексе почв при различных температурах: А – чернозем, Б – глее подзолистая почва, В – пустнынно-степная почва.

В образцах почв разных типов с добавлением субстратов при разных температурах она составила от 4 до 20,5*108 клеток/г почвы (для Bacteria) и от 9 до 29*107 кл/г почвы (для Archaea).

Обращает на себя внимание высокая доля архей в гидролитическом микробном комплексе пустынно-степной и глее-слабоподзолистой почв, как при высоких, так и при низких температурах, особенно в образцах с внесением хитина.

Участие архей в минерализации азотсодержащего органического вещества в почвах обсуждается во многих работах (Leininger et al., 2006;

Timonen, Bomberg, 2009;

Stopnisek et al., 2010). Влияние температуры на метаболическую активность представителей домена Bacteria проявлялась наиболее наглядно в гидролитических комплексах глее-подзолистой и пустнынно-степной почв, где численность активных клеток возрастала с понижением или увеличением температуры соответственно.

В хитинолитическом и пектинолитическом комплексах чернозема общая численность метаболически активных форм Bacteria не существенно колебалась c изменением температуры, что, очевидно, связано с высокой буферной способностью чернозема и высоким содержанием органического вещества в этой почве.

Анализ компонентного соcтава клеток внутри домена Bacteria гидролитического комплекса в образцах чернозема типичного выявил дифференциацию групп бактерий при изменении температуры инкубирования почвы (рис 15). Было показано, что представители филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes отвечали значительным увеличением численности метаболически активных форм на внесение хитина и пектина во все исследованные почвы вне зависимости от тем пературы. Установленный факт свидетельствует об активном участии представителей перечисленных филогенетических групп в разложении полисахаридов в широком диапазоне температур. Эти группы организмов наиболее часто упоминаются в числе основных агентов деструкции органического вещества в природных экосистемах (Pourcher et al., 2001;

Звягинцев, Зенова, 2001). При понижении температуры до 5оС в гидролитическом микробном комплексе почв наблюдалось возрастание численности группы Firmicutes и Betaproteobacteria, и уменьшение количества грамположительных бактерий с высоким содержанием Г+Ц пар в ДНК, относящихся к филогенетической группе Actinobacteria по сравнению с их численностью в почвах при 50оС. Численность представителей филогенетической группы Actinobacteria заметно возрастала в опытных вариантах и составляла до 35% среди идентифицированных одноклеточных единиц внутри домена Bacteria в гидролитическом комплексе почв. Заслуживает внимания установленный факт увеличения мицелиальных форм актинобактерий, биомасса которых в пустынно степной почве и черноземе с добавлением хитина увеличивалась почти на порядок. Кроме того, в вариантах с полисахаридами при 50оС (в некоторых почвах и при 27оС) численность метаболически активных клеток Gammaproteobacteria была выше, чем в контрольных образцах. Увеличение численности Verrucomicrobia в вариантах с пектином указывает на их возможное участие в процессах деструкции этого субстрата.

3, А) 108 кл./г п.

2, 1, 0, 1 2 3 4 5 6 7 8 3, Б) 2, 108 кл./г п.

1, 0, 1 2 3 4 5 6 7 8 В) 3, 108 кл./г п.

2, контроль 1, хитин пектин 0, 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 15. Численность отдельных филогенетических групп домена Bacteria (1 – Actinobacteria, 2 – Firmicutes, 3 – Alphaproteobacteria, 4 – Betaproteobacteria, 5 – Gammaproteobacteria, 6 – Deltaproteobacteria, 7 – Cytophaga/Bacteroidetes, 8 – Chitinophaga, 9 – Verrucomicrobia) в черноземе с добавлением полисахаридов и без них при различных температурах инкубирования: А – 5оС, Б – 27оС, В – 50оС.

В настоящее время среди описанных и узаконенных представителей Verrucomicrobia выявлены бактерии, способные к росту на целлюлозе, пектине, крахмале (Chin et al., 2001;

Sangwan et al., 2004).

Выявлены особенности филогенетической структуры пектинолитического и хитинолитического комплексов в почвенных образцах различной степени увлажненности. Внутри домена Bacteria при среднем значении давления почвенной влаги (-3,2 кПа) из трех исследуемых среди пектинолитических и хитинолитических доминантов исследуемых почв являются представители филогенетических групп Firmicutes и Actinobacteria (рис. 16). С увеличением влажности отмечается возрастание числа грамотрицательных форм (протеобактерий). В литературе имеются сведения, свидетельствующие о преобладании в бактериальном пектинолитическом комплексе сфагновых болот филогенетических групп Proteobacteria и Bacteroidetes (Панкратов и др., 2005). Авторы объясняют такую особенность климатическими условиями, преобладающими в исследуемой территории — пониженные температуры и реакция pH, повышенная влажность и дефицит органического вещества. С понижением матричного давления до влажности, близкой к влаге завядания, в гидролитическом комплексе отмечается повышение численности гамма и альфа-протеобактерий и мицелиальных актинобактерий.

вертикальные линии отмечают 95% доверительный интервал биомасса, мкг пектин Archea Firmicutes Bettaproteo Deltaproteo Archea Firmicutes Bettaproteo Deltaproteo Archea Firmicutes Bettaproteo Deltaproteo хитин Actinobacter Alphaproteo Gammaproteo Actinobacter Alphaproteo Gammaproteo Actinobacter Alphaproteo Gammaproteo контроль -800 кПа -3,2 кПа -0,5 кПа Рис. 16 Усредненные значения биомассы отдельных филогенетических групп пектино- и хитинолитического микробных комплексов исследуемых почв при различных значениях матричного давления почвенной влаги на 14 сутки инкубации.

Таким образом, методом FISH установлены особенности в структуре гидролитического микробного комплекса исследуемых почв в условиях действия различных экологических факторов (температуры и влажности). Внутри домена Bacteria при средней влажности (60% от полной влагоемкости) и температуре (27оС) среди пектинолитических и хитинолитических доминантов исследуемых почв выделяются представители филогенетических групп Firmicutes и Actinobacteria. С возрастанием влажности и понижением температуры отмечается увеличение грамотрицательных альфа и бетапротеобактерий. С понижением влажности и возрастанием температуры особого внимания заслуживает достаточно резкое увеличение численности актинобактерий в исследуемом прокариотном микробном комплексе.

4.2. ДГГЭ-анализ амплифицированных фрагментов гена 16S rRNA микробных сообществ из почв, обогащенных полисахаридом и без них Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) суммарного ам плификата фрагментов гена 16S rRNA был применен с целью оценки сложности микробных гидролитических сообществ почв и различий в структурах их доми нантных составляющих (рис.17). Для анализа использовалась суммарная ДНК, вы деленная из микрокосмов чернозема и бурой пустынно-степной почв, инкуби руемых при различных температурах и значениях влажности с внесением поли сахаридов и без них. Продолжительность опытов аналогична опытам, прове денным по методу FISH.

Пектин, -800 кПа Хитин, -800 кПа Контроль, -800кПа хитин, -3,2 кПа Хитин, -0,5 кПа контроль, -3,2 кПа Контроль, -0,5 кПа пектин, -3,2 кПа пектин, -0,5 кПа Пектин, -0,5 кПа контроль, -0,5 кПа Пектин, -3,2 кПа хитин, -0,5 кПа Контроль, -3,2 кПа контроль, -800 кПа Хитин, -3,2 кПа хитин, -800 кПа пектин, -800 кПа 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Рис. 17. ДГГЭ профиль амплифицированных фрагментов гена 16S rRNA почвенных микробных сообществ чернозема при внесении полисахаридов и различных значениях давления почвенной влаги.

На полученных профилях ДГГЭ интенсивность и количество дискретных по лос в образцах с добавлением пектина и хитина была выше по сравнению с кон трольными образцами. Установлена практически полная идентичность ДГГЭ профилей образцов, инкубированных при различных значениях давления почвенной влаги с дендрограммой кластерного анализа общей биомассы всех исследуемых филогенетических групп.

a) b) c) Рис. 18. Дендрограмма, основанная на результатах DGGE-анализа амплифицированных фрагментов гена 16S rRNA почвенных сообществ. Опытные варианты обозначены кружками. Дерево построено с помощью алгоритма neighbour-joing, масштаб соответствует нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap» - анализа альтернативных деревьев. Буквенные обозначения выделенных кластеров см. в тексте.

В целом, для всех исследованных образцов влажность сильнее влияла на ДГГЭ-профиль, чем тип вносимого субстрата. Филогенетическое дерево, представленное на рис. 18, объединяет результаты ДГГЭ-анализа амплифицирован ных фрагментов гена 16S rRNA почвенных сообществ.

Сиквенс-анализ некоторых характерных ДГГЭ полос выявил в образцах почв с хитином, инкубируемых при 5оС, присутствие сиквенсных типов, наиболее близких к бактериям семейства группы Oxalobacteriacea (Jantinobacterium, Massilia) Betaproteobacteria (рис. 19, кластер а). Большинство проанализированных при 27оС последовательностей относилось к филлуму Bacteroidetes (кластер с). Характерные 50оС, полосы, выделенные при принадлежали представителям семейства гаммапротеобактерий, среди которых наиболее близкими Xantomonodaceaе оказались бактерии рода Lysobacter (кластер b).

Таким образом, комбинирование двух молекулярно-биологических методов (FISH и DGGE) дало возможность информативно оценить различия в структурах доминантных составляющих гидролитических сообществ почв, формирующихся при различных температурах и влажностях. Cреди сиквенсных типов, полученных методом ДГГЭ, были представители, выделяемые нами методом посева на плотные питательные среды.

Заключение Таким образом, применен подход с использованием широкого набора молекулярно-биологических и классических методов, что позволило многосторонне охарактеризовать биологическую активность изучаемых экосистем.

Разработанная модификация флюоресцентномикроскопического метода анализа гибридизации клеток in situ (FISH) позволила оценить численность и выявить филогенетический состав метаболически активных бактериальных гидролитических (хитинолитических и пектинолитических) комплексов вертикальных ярусов - почвенного, наземного (подстилка) и надземного (филлосфера) - наземных экосистем в зависимости от уровня увлажненности, температурного и окислительно-восстановительного режимов. Численность, согласно методу FISH, составляет третью часть от численности всех прокариотных организмов надземного, наземного и почвенного ярусов биогеоценозов, определяемой окрашиванием акридиновым оранжевым. Установлено, что деструкция полисахаридов осуществляется преимущественно представителями филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria.

Выявлены различия в филогенетической структуре метаболически активных гидролитических прокариотных комплексов пространственно-сукцессионного ряда. Деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, группой протеобактерий (альфа и бета). В почвенном гидролитическом комплексе, для образцов почв всех исследуемых типов, уменьшается доля протеобактерий и увеличиваются доли фирмикут и актинобактерий. Таким образом, в каждом ярусе формируется специфический гидролитический прокариотический комплекс.

Сиквенс-анализ характерных ДГГЭ полос выявил в образцах микрокосмов спектр сиквенсных типов, сходных с группами, получаемыми флюоресцентным методом гибридизации клеток in situ (FISH).

Исследование структурных и функциональных показателей гидролитических микробных комплексов в широком ряду почв выявило наиболее активные процессы разложения полисахаридов в черноземе и серой лесной почве. В черноземе впервые in situ показано присутствие фермента хитиназы и хитиназного гена группы А, принадлежащего представителям филогенетических групп Actinobacteria и Firmicutes, которые определены в качестве доминирующих молекулярно-биологическими и классическими методами. Среди близкородственных организмов, у которых методом ДГГЭ выявлен хитиназный ген, не всегда обнаруживались доминанты, выделенные нами методом посева на плотные среды с хитином, однако наблюдается корреляция между результатами, полученными исследованием филогении функционального хитиназного гена, и результатами филогении 16S rRNA. Следует отметить, что используемые методы пополняют результаты друг друга разнообразием представителей-гидролитиков.

Эти данные позволяют предполагать наличие горизонтального переноса хитиназных генов, как большинства генов биодеградации, сосредоточенных в плазмидной ДНК, внутри микробного сообщества.

Среди параметров, определяющих функциональную активность гидролитического (хитинолитического) комплекса почвенного яруса (влажность, питательный ресурс, время) наиболее значительным является влажность. Уровень влажности, обусловливающий максимальную активность гидролитического комплекса зависит от типа почвы. Развитие гидролитического микробного комплекса происходит при крайне широком диапазоне влажности от близкой к полной влагоемкости до близкой к влаге завядания, а также в нанометровых водных пленках.

Функциональная роль мицелиальных актинобактерий в метаболизме хитина заключается, с одной стороны, в активном разложении этого биополимера, а с другой – в регуляции функционирования микробного комплекса посредством продукции биологически активных регуляторных метаболитов, что реализуется в широком диапазоне экологических параметров (влажность, температура, поступление органического вещества, сукцессионное время).

ВЫВОДЫ 1. Использование модифицированного метода анализа гибридизации клеток in situ (FISH) позволило впервые установить, что численность физиологически активных гидролитических прокариотных комплексов составляет третью часть от комплексов всех прокариотных организмов надземного (филлосфера), наземного (подстилка) и почвенного ярусов исследованных биогеоценозов. Выявлены различия в филогенетической структуре гидролитического прокариотного комплекса пространственно-сукцессионного ряда. Наиболее активно процесс деструкции биополимеров в надземном ярусе ведут представители группы Proteobacteria (альфа и бета). В почве усиливается роль представителей групп Firmicutes и Actinobacteria.

2. Исследование структурных и функциональных показателей гидролитических микробных комплексов широкого ряда почв выявило, что наиболее активно процессы разложение полисахаридов протекают в черноземе и серой лесной почвах, где роль основных гидролитиков принадлежит прокариотам, главным образом, актиномицетам.

3. Впервые показано in situ наличие в черноземе фермента хитиназы и хитиназного гена группы А, принадлежащего представителям филогенетических групп Actinobacteria и Firmicutes. Эти филумы определены как доминирующие при исследовании прокариотного хитинолитического комплекса чернозема классическими методами посева из почвы и молекулярно-биологическими методами – методом гибридизации клеток in situ (FISH) и методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ).

4. Среди широкого ряда исследованных экологических факторов, влияющих на деятельность гидролитических микробных сообществ почв, наиболее значимым для развития почвенного микробного сообщества, в условиях проведенных опытов, оказывается уровень увлажненности почв. Уровень влажности, обусловливающий максимальную активность гидролитического комплекса, зависит от типа почвы.

Увлажненность почвы более значимо влияет на деятельность хитинолитического комплекса по сравнению с пектинолитическим.

5. При каждой совокупности факторов (температура, влажность, органическое вещество) формируется специфический микробный комплекс. При деструкции полисахаридов с увеличением влажности почвы в микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных микроорганизмов, особенно - актиномицетов. Дыхание в широком спектре условий (влажность, поступление органического вещества, сукцессионное время) может в большей степени контролироваться актиномицетами.

6. Действие температурного фактора на деятельность гидролитических микробных сообществ почв различных почвенно-климатических зон специфично. Деградация полисахаридов наиболее активно протекает в пустынно-степной зоне при высоких температурах, в почвах средних и северных климатических зон – при более низких температурах. Показано, что в почвах при высоких температурах основными деструкторами полисахаридов являются прокариоты. При низких температурах значимо возрастает роль грибов.

7. Внутри домена Bacteria при оптимальных для жизнедеятельности большинства микроорганизмов влажности (60% от полной влагоемкости) и температуре (27оС) среди пектинолитических и хитинолитических доминантов исследуемых почв выделяются представители филогенетических групп Firmicutes и Actinobacteria. С возрастанием влажности и понижением температуры отмечается увеличение грамотрицательных (альфа и бетапротеобактерий). С понижением влажности и возрастанием температуры в исследуемом прокариотном микробном комплексе отмечается резкое увеличение актинобактерий. При каждой совокупности факторов (температура, влажность, органическое вещество) формируется свой специфический комплекс прокариот.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, входящих в список ВАК :

1) Г.М. Зенова, Т.А. Грачева, Н.А. Манучарова, Д.Г. Звягинцев. Актиномицетные сообщества лесных экосистем. Почвоведение. 1996. №11. С. 1347-1351.

2) А.Л. Степанов, Н.А. Манучарова, Л.М. Полянская. Продуцирование закиси азота бактериями в почвенных агрегатах. Почвоведение. 1997. № 8. С. 973-976.

3) Э.А. Штина, Г.М. Зенова, Н.А. Манучарова. Альгологический мониторинг почв.

Почвоведение. 1998. № 12. С.1449-1461.

4) Н.А. Манучарова, А.Л. Степанов, М.М. Умаров. Особенности образования конечных продуктов денитрификации в водопрочных агрегатах почв разных типов.

Почвоведение. 1999. №6. С. 634-638.

5) И.И. Судницын, Н.А. Манучарова, А.Л. Степанов, М.М. Умаров Влияние микробиологических процессов на динамику окислительно- восстановительного потенциала в агрегатах суглинистых почв различного генетического типа.

Почвоведение. 1999. №7. с.866-870.

6) Манучарова Н.А., Добровольская Т.Г., Степанов А.Л. Таксономический состав денитрифицирующих бактерий в дерново-подзолистой почве // Микробиология.

2000.Т.69. №2. С.214-219.

7) Манучарова Н.А., Степанов А.Л., Умаров М.М. Особенности микробной трансформации азота в водопрочных агрегатах почв разных типов // Почвоведение.

2001. №10. С.1261-1267.

8) Манучарова Н.А., Сазонов С.Н., Садовская Э.Н., Степанов А.Л., Умаров М.М.

Влияние минеральных удобрений на эмиссию закиси азота из дерново-подзолистой почвы // Почвоведение. 2002. №5. С. 532-536.



Pages:   || 2 |
 


Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.