авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Адаптация микоплазм (mycoplasma gallisepticum s6) к неблагоприятным условиям

На правах рукописи

МУЗЫКАНТОВ Алексей Александрович АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ (MYCOPLASMA GALLISEPTICUM S6) К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ 03.00.04 - биохимия 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2008

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ патогенеза Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Научный консультант: доктор биологических наук Чернова Ольга Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович (Институт биологии РАН, г.Уфа) кандидат биологических наук, доцент Гимадутдинов Олег Александрович (Казанский Государственный Университет им. Ульянова-Ленина, г.Казань)

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, г.Москва

Защита состоится "" октября 2008 года в "" часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул.

Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.

Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан "_" сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Абрамова З.И.

Актуальность проблемы. Выяснение механизмов, обеспечивающих выживание микоплазм (класс Mollicutes) в разных условиях среды, представляет значительный интерес как с точки зрения фундаментальных исследований, так и практических разработок, связанных с определением молекулярных основ формирования и эволюции системы "паразит-хозяин" и способов её контроля [Борхсениус и др., 2002;

Razin et al., 2006].

Большой объем экспериментальных и теоретических данных, полученных в разных лабораториях мира за последние годы, значительно расширил представления о биологии мельчайших бесстеночных бактерий, способных к самостоятельному воспроизведению. Однако в исследовании адаптации этих бактерий к биогенным и абиогенным стрессорам сделаны лишь первые шаги [Чернов и др., 2005, 2007;

Cecchini et al., 2007]. Было обнаружено, что адаптация "вездесущей" микоплазмы Acholeplasma laidlawii к неблагоприятным условиям (ограничению по субстрату и понижение температуры) связана с превращением вегетативных форм (ВФ) клеток микоплазмы в некультивируемые формы (НФ) и показано, что ВФ и НФ A. laidlawii существенно различаются по морфологии, ультраструктуре, экспрессии генома и патогенности [Чернов и др., 2004;

Chernov et al., 2007]. Изменения размеров, морфологии, ультраструктуры, пролиферации и вирулентности клеток, возникающих при неблагоприятных условиях роста у аспорогенных бактерий, описаны в ряде работ [Головлев и др., 1998;

Вайнштейн, Кудряшова, 2000;

Oliver, 2005]. Однако соответствующие процессы у разных видов микоплазм не изучены.

Уникальным видом микоплазм с точки зрения адаптивных способностей является Mycoplasma gallisepticum. Эта микоплазма, известная как возбудитель болезней птиц и контаминант создаваемых на основе куриных эмбрионов вирусных вакцин, встречается также у растений [Коромыслов и др., 1987;

McGarrity et al., 1992]. Контроль и подавление инфекций, вызываемых M. gallisepticum, представляют серьезную проблему, решение которой связывают с успехами изучения молекулярной и клеточной биологии микоплазмы, определяющей адаптацию бактерий к неблагоприятным условиям (НУ) среды и патогенность.

Цель данной работы - выяснить особенности адаптации M. gallisepticum S6 к неблагоприятным условиям среды.

Основные задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ морфологии, ультраструктуры и пролиферации клеток M. gallisepticum S6, образующихся на полноценной питательной среде и в неблагоприятных условиях (ограничение по субстрату и понижение температуры) культивирования.

2. Провести сравнительный анализ амплификации нуклеотидных последовательностей ряда генов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.

3. Провести сравнительный анализ полипептидов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.

4. Провести сравнительный анализ ДНК-повреждающего действия клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.

5. Провести сравнительный анализ фитопатогенности клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.

Научная новизна. Впервые установлено, что адаптация M. gallisepticum S к НУ сопровождается переходом ВФ клеток микоплазмы в НФ. ВФ и НФ M. gallisepticum S6 существенно различаются по морфологии и ультраструктуре.

Впервые показано, что ВФ клеток M. gallisepticum S6 проявляют генотоксичность в отношении тестерного штамма E. coli PQ37, тогда как НФ микоплазмы в отношении соответствующего штамма бактерии ДНК повреждающего действия не оказывают.

Впервые определена полная нуклеотидная последовательность гена pvpA, кодирующего фазовариабельный белок цитоадгезии M. gallisepticum S6, у ВФ и НФ микоплазмы.

Впервые показано, что переход ВФ в НФ M. gallisepticum S6 связан с изменением топологии, структуры ДНК и экспрессии белков в клетках микоплазмы. Идентифицировано 63 белка, участвующие в адаптации M. gallisepticum S6 к НУ и составлена схема возможных изменений метаболических путей в клетках микоплазмы при культивировании их в НУ среды.





Впервые установлено, что M. gallisepticum S6 обладает фитопатогенным потенциалом и показано, что адаптация к НУ сопровождается изменением вирулентных свойств микоплазмы.

Научно-практическая значимость. Полученные данные вносят вклад в понимание адаптации M. gallisepticum S6 к неблагоприятным условиям среды.

Результаты работы могут служить основой для развития новых подходов к определению молекулярных механизмов формирования и эволюции системы "паразит-хозяин", а также способов контроля микоплазменных инфекций.

Разработаны методы исследования процесса адаптации к НУ среды M. gallisepticum S6 in vitro. Предложен молекулярно-генетический зонд для дифференциальной диагностики ВФ и НФ M. gallisepticum S6 – высокопатогенной для птиц микоплазмы, являющейся контаминантом создаваемых на основе куриных эмбрионов вирусных вакцин, способной также инфицировать растения.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в медицинских, ветеринарных, сельскохозяйственных, биологических и биотехнологических учреждениях, занимающихся разработкой способов диагностики и контроля микоплазменных инфекций, а также в учебном процессе, в том числе курсах лекций по биохимии, молекулярной биологии, микробиологии, стрессологии и физиологии растений в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследование. Работа в 2005-2008 гг. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме "Взаимодействие микоплазм с высшими организмами на молекулярно-генетическом уровне" (№ гос. рег.

0120.0 603845). Исследования автора, как исполнителя данной темы, поддержаны грантами ГК № 02.512.11.2067 в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России" на 2007-2012 годы по приоритетным направлениям "Живые системы" по теме "Сравнительный протеомный анализ вегетативных форм и наноклеток Mycoplasma gallisepticum для создания технологии контроля микоплазменных инфекций" и РФФИ 08-04-01047-а "Молекулярные основы адаптации микоплазм (M. gallisepticum) к биогенным и абиогенным стрессорам:

белки наноформ и их гены", 2008-2010 гг., а также грантами ведущей научной школы (руководитель акад. И.А. Тарчевский) № НШ-6042;

№ НШ 5399,2008,4. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Синтез праймеров, секвенирование нуклеотидных последовательностей, двумерный электрофорез и идентификацию полипептидов проводили на базе ФГУ НИИ физико химической медицины Минздрава РФ;

оценку генотоксичности клеток M.

gallisepticum S6 и наноскопию молекул ДНК – на базе КГУ (биолого почвенный факультет, кафедра микробиологии и физический факультет, кафедра оптики и нанофотоники, соответственно).

Благодарности: Приношу глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. О.А. Черновой за неоценимую помощь в выборе данного направления исследований, за внимательное и оперативное решение проблем, возникавших по ходу выполнения и написания диссертации, за постоянную заботу и поддержку;

приношу искреннюю благодарность д.б.н., проф. В.М.

Чернову заведующему лабораторией молекулярных основ патогенеза КИББ КазНЦ РАН и к.б.н. О.В. Горшкову за неоценимую помощь в выполнении исследований;

выражаю искреннюю благодарность к.б.н. М.В. Трушину, к.б.н.

Г.Ф. Шаймардановой, к.б.н. Т.Н. Нестеровой, к.б.н. А.А. Пономаревой КИББ КазНЦ РАН за всестороннюю помощь в проведении работ и анализе полученных данных;

выражаю искреннюю благодарность д.б.н., проф. О.Н.

Ильинской, к.б.н. А.Б. Маргулис, асп. А.Д. Пельникевич КГУ, а также д.б.н., проф. В.М. Говоруну, к.б.н. В.Н. Лазареву, к.б.н. И.А. Деминой, к.х.н. Т.А.

Акопиан, асп. Ю.И. Басовскому ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ за предоставленные возможности проведения совместных работ и ценные советы при обсуждении результатов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клетки M. gallisepticum S6, выращенные на полноценной питательной среде и в неблагоприятных условиях – при ограничении субстрата и понижении температуры, - имеют существенные различия по морфологии и ультраструктуре. Длительное культивирование M. gallisepticum S6 в неблагоприятных условиях приводит к превращению вегетативных форм (ВФ) клеток микоплазмы в некультивируемые формы (НФ).

2. Переход ВФ в НФ M. gallisepticum S6 связан с изменением топологии и структуры ДНК микоплазмы.

3. ВФ и НФ клеток M. gallisepticum S6 различаются по экспрессированным белкам.

4. Клетки M. gallisepticum S6 проявляют фитопатогенность в отношении специфичного и неспецифичного индикаторов фитомикоплазмозов.

5. Адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается изменениями генотоксичности, а также фитопатогенности микоплазмы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 11-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология – наука XXI века" (Пущино, 2007), XII Всероссийской научно практической конференции, посвященной 150-летию со дня рождения В.М.

Бехтерева (Казань, 2007), Всероссийской конференции "Фундаментальные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007), Итоговой конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (Казань, 2007), Итоговой конференции в рамках приоритетного направления "Живые системы" (Москва, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), I Всероссийском, с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов - биологов "Симбиоз - Россия - 2008" (Казань, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста;

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. В работе представлено 9 таблиц и 24 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 286 источников, из них 72 – в отечественных изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследований В работе был использован штамм Mycoplasma gallisepticum S6, полученный из коллекции микроорганизмов Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (РАМН, Москва). Культуру клеток M. gallisepticum S6 после музейного хранения выращивали при 37 С в жидкой питательной среде Эдварда, с модификациями [Борхсениус и др., 2002].

Для получения культуры M. gallisepticum S6, адаптированной к неблагоприятным условиям, и реверсии использовали методы индукции некультивируемого состояния у A. laidlawii PG8 и пробуждения клеток ахолеплазмы из некультивируемого состояния в активно пролиферирующую культуру [Чернов и др., 2004, 2005], соответственно.

Оценку числа жизнеспособных клеток в популяции M. gallisepticum S проводили путем подсчета количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в 0,3% агаризованной питательной среде (метод Коха) и методом предельных разведений (МПР) в жидкой питательной среде [Пименова и др., 1983], с учетом особенностей культивирования микоплазмы [Борхсениус и др., 2002].

Целостность плазматической мембраны клеток M. gallisepticum S определяли по ее проницаемости для красителей: метиленового синего и бромистого этидия [Ильинская и др., 2006]. Препараты анализировали на конфокальном микроскопе LSM 510 META ("Carl Zeiss", ФРГ). Наблюдения проводили в 5 полях зрения для каждого образца.

Трансмиссивную электронную микроскопию проводили согласно Cole [1983]. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция).

Образцы просматривали на электронном микроскопе JEM-1200EX (Япония).

Выяснение токсичных и генотоксичных эффектов клеток M. gallisepticum S6 и их культуральной жидкости проводили по Quillardet et al.

[1982].

Выделение ДНК из клеток микоплазм и тканей растений осуществляли с помощью метода фенольной экстракции [Маниатис и др., 1984].

Дополнительно препараты ДНК обрабатывали РНКазой ("Serva", ФРГ) и протеиназой К ("Sigma", США).

Атомно-силовую микроскопию образцов ДНК M. gallisepticum S проводили по Braga, Ricci [2004]. Исследование образцов ДНК проводили на атомно-силовом микроскопе Solver P47H ("НТ-МДТ", Россия). Для обработки данных использовали программу Nova 1.0.26 RC1 (разработчик - НТ-МДТ, Россия).

Направленную амплификацию фрагментов ДНК M. gallisepticum S посредством ПЦР проводили с использованием праймеров, синтезированных на основе известных нуклеотидных последовательностей генов (himA/hup, pvpA, rpoD, recA, dnaB) M. gallisepticum Rlow [Papazisi et al., 2003]. Олигонуклеотиды синтезировали в НПО "ЛИТЕХ" (г. Москва). Анализ продуктов ПЦР проводили с помощью электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 2% агарозном геле ("Helicon", Россия) с последующим окрашиванием бромистым этидием ( мг/мл).

Клонирование фрагментов ДНК M. gallisepticum S6 в плазмиде pGEM-T Easy Vector ("Promega", США) осуществляли согласно инструкции изготовителя. Трансформацию проводили с помощью электропорации в ампициллин-резистентный штамм E. coli DH5.

Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли с помощью автоматического секвенатора ABI 3130 ("Applied Biosystems", США), согласно инструкции изготовителя на базе лаборатории протеомного анализа ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ (г. Москва).

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с использованием пакетов программ Informax Vector NTI Suite 9 и DNAMAN 4.0. Поиск доменов проводили в BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), SwissProt (http://cn.expasy.org/), BLOCKs (http://blocks.fhcrc.org/), Prosite (http://cn.expasy.org/prosite/), Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/), SMART (http://smart.embl heidelberg.de/).

Подготовку препаратов, двумерный электрофорез и идентификацию белков проводили по Говоруну и др. [2003], Blum et al. [1987] и Grg et al.

[2000] на базе лаборатории протеомного анализа ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ (г. Москва).

Белки, выделенные из ВФ и НФ клеток M. gallisepticum S6, составляли контрольную и опытную группы, соответственно. Белки идентифицировали по массам протеолитических фрагментов с использованием программы Mascott Peptide Fingerprint (Matrix Science, США) и базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank), содержащей полную последовательность генома M. gallisepticum Rlow [Papazisi et al., 2003].

Инфицирование растений (Vinca minor L. и Vigna radiata L.) клетками М. gallisepticum S6 проводили по Чернову и др. [2007] спонтанным заражением 3-х дневных проростков растений через корневую систему посредством инкубирования корешков растений в течение 24 часов в растворах фосфатно солевого буфера, содержащих и не содержащих клетки М. gallisepticum S6, для опытных и контрольных растений, соответственно.

Статистический анализ данных проводили с применением стандартных математических методов расчета среднеквадратичного отклонения и сравнения средних по критерию Стъюдента в программе Microsoft Excel 2002. Критерий вероятности P0,05 принимали достаточным для достоверной разницы опытной и контрольной групп данных [Лакин, 1990].

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Особенности морфологии, ультраструктуры и пролиферации клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования В результате сравнительного анализа трансмиссивных микрографий было обнаружено, что морфология и ультраструктура клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования, различаются. На полноценной питательной среде Эдварда (ППСЭ) M. gallisepticum S6 образует грушевидные клетки (длина 0,6-1 мкм), которые имеют четкие цитоскелетоподобные образования и терминальную структуру "bleb". Эти клетки образуют на твердых питательных средах характерные колонии ("fried eggs") и соответствуют типичным вегетативным (пролиферирующим) формам (ВФ) клеток микоплазмы.

Рис. 1. Трансмиссивные микрографии ВФ (А) и НФ (Б) клеток M. gallisepticum S Т – тубулиноподобные структуры, В – терминальная структура "bleb", М – клеточная мембрана, КПС – капсулоподобная структура.

На среде с ограничением субстрата и при понижении температуры культивирования M. gallisepticum S6 образует кокковидные клетки (диаметр 0,2-0,8 мкм), лишенные полярных образований. Такие клетки имеют конденсированный нуклеоид и электронно-плотную структуру мембран.

Цитоскелетоподобные структуры в кокковидных клетках M. gallisepticum S6 не визуализируются. При этом некоторые клетки оказываются окруженными капсулоподобными образованиями (рис. 1Б).

На основании данных МПР и определения КОЕ было установлено, что клетки M. gallisepticum S6 при статическом культивировании на ППСЭ и в НУ теряют способность к пролиферации и образованию колоний через 15 и 8 суток, соответственно. Однако, по данным ПЦР, а также цитохимических методов и электронной микроскопии, интактность ДНК M. gallisepticum S6, а также целостность мембраны клеток микоплазмы при культивировании их в НУ сохраняются на протяжении всего срока наблюдения (180 суток). При этом было обнаружено, что при увеличении срока статического культивирования клеток микоплазмы в НУ происходит уменьшение клеточных размеров и исчезновение класса клеток с линейными размерами 0,8-1 мкм (рис. 2).

Подобные уменьшения размера клеток характерны для аспорогенных бактерий, в том числе A. laidlawii PG8, при адаптации бактерий к НУ среды, связанной с переходом ВФ клеток в НФ [Головлев, 1998;

Чернов и др., 2005].

Рис. 2. Изменение основных модальных классов клеток M. gallisepticum S6, при культивировании в разных условиях – на ППСЭ (А) и в НУ в течение (Б), 12 (В), 16 (Г) и 20 (Д) недель По оси ординат – среднее значение длины клеток (нм) ± стандартное отклонение Полученные нами данные позволяют заключить, что адаптация M.

gallisepticum S6 к НУ среды, как и ряда аспорогенных бактерий, в том числе A. laidlawii PG8, связана с переходом ВФ микоплазмы в НФ. Однако, по данным Чернова с соавт. (2005), клетки A. laidlawii PG8 на ППСЭ теряют способность к образованию колоний через 21 сутки, а в НУ среды у части (менее 0,1 %) популяции клеток микоплазмы способность формировать колонии сохраняется на протяжении 380 суток. При этом преобладающим классом популяции адаптированных к НУ среды клеток A. laidlawii PG является класс кокковидных клеток размером 0,2 мкм и менее (наноклетки и наноформы). Между тем появление клеток размером 0,2 мкм и менее связывают с промежуточной стадией формирования НС у бактерий [Kaprelyants et al., 1993]. В наших исследованиях такой класс клеток M. gallisepticum S появлялся на 16 неделе культивирования микоплазмы в НУ среды, составлял только 19% клеточной популяции и исчезал к 20 неделе статического культивирования бактерий в соответствующих условиях. Полученные нами данные могут свидетельствовать о существенных различиях реактивности клеточных популяций A. laidlawii PG8 и M. gallisepticum S6 в отношении соответствующих условий среды.

Применение метода "пробуждения" НФ клеток A. laidlawii PG8 оказался неэффективным для реверсии НФ M. gallisepticum S6 – превращение НФ в типичные ВФ клеток микоплазмы. Известно, что условия пробуждения из некультивируемого в активно пролиферирующее состояние у различных бактерий весьма различаются [Головлев, 1998]. Для НФ некоторых бактерий единственным эффективным способом реверсии является пассаж через восприимчивый организм [Романова, Гинцбург, 1998]. Вероятно, реверсия M. gallisepticum S6 требует специфичных факторов, которые еще предстоит определить.

2.2. Особенности амплификации нуклеотидных последовательностей ряда генов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования Изменения топологии ДНК бактерий в НУ, ассоциированные в том числе с конденсацией нуклеоида, могут приводить к дифференциальной амплификации нуклеотидных последовательностей некоторых генов клеток микроорганизмов, образующихся в соответствующих условиях среды [Warner, Oliver, 1998]. Этот эффект может вызываться ДНК-связанными белками и проявляться аттенуацией ПЦР-сигнала при использовании матричной ДНК без специальной очистки [Зигангирова и др., 1995].

В наших исследованиях дифференциальная амплификация была установлена при использовании в ПЦР специфичных праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности pvpA-гена микоплазмы (рис. 3). Этот эффект был связан, в частности, с появлением у НФ M. gallisepticum S6 дополнительного ампликона (рис. 3, дор. 4). Специфичные Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации нуклеотидных последовательностей ДНК ВФ (1, 2), НФ (3, 4), а также адаптированных клеток M.

gallisepticum S6 при отмене НУ (5), обработанных (2, 4) и необработанных (1, 3, 5) протеиназой K, М – маркер длины фрагментов.

праймеры для амплификации нуклеотидной последовательности гена pvpA M. gallisepticum S6 позволяют определять с помощью ПЦР в тестируемых образцах клетки микоплазмы, образующиеся в разных условиях, – ВФ и НФ.

Образование дополнительного ПЦР-продукта размером 582 н.п.о. при амплификации ДНК НФ M. gallisepticum S6 и клеток адаптированной культуры при отмене НУ может свидетельствовать как о появлении дополнительных сайтов отжига праймеров, так и рекомбинационных процессах, связанных с нуклеотидной последовательностью гена pvpA, при культивировании клеток микоплазмы в новых условиях. PvpA M. gallisepticum является фазовариабельным белком цитоадгезии, подверженным высокочастотным перестройкам [Boguslavsky et al., 2000]. Вариабельность антигенных детерминант белков клеточной поверхности является способом преодоления микоплазмами иммунного контроля организма-хозяина [Yogev et al., 2002].

Вариации обусловливаются структурными перестройками генов соответствующих белков. Такие данные были получены нами в отношении vaa генов клинических изолятов M. hominis при сравнительном анализе их нуклеотидных последовательностей [Chernov et al., 2005].

В этой связи нами были определены первичные нуклеотидные последовательности основных и дополнительных ампликонов, возникающих при использовании в ПЦР ДНК клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях (рис. 4). В нуклеотидных последовательностях основных Рис. 4. Ампликоны ДНК клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях, полученные в ПЦР с праймерами для амплификации pvpA-гена микоплазмы (А) и нуклеотидные последовательности соответствующих ПЦР продуктов (Б, В, Г).

На электрофореграмме представлены ампликоны ВФ (1), НФ (2,3), образующихся при статическом культивировании в НУ в течение 8 и 20 недель, соответственно, и адаптированных клеток микоплазмы при отмене НУ (4).

pvpA-ампликонов размером 1150 н.п.о. ВФ и НФ M. gallisepticum S6 была выявлена ОРС размером 1086 н.п.о., которая на 97% оказалась гомологичной нуклеотидным последовательностям pvpA-генов штаммов R и Pendik M. gallisepticum. Первичная структура гена pvpA клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования (ВФ и НФ), оказалась идентичной.

В нуклеотидной последовательности дополнительного ампликона ( н.п.о.), возникающего у НФ микоплазмы, были выявлены две ОРС, не зарегистрированные в геноме ВФ M. gallisepticum Rlow. Высокая степень гомологии нуклеотидной последовательности соответствующего ампликона с геном pvpA (54%) при отсутствии других протяженных гомологичных участков на хромосоме M. gallisepticum R позволяет предполагать, что pvpA-ген может быть основой для формирования новых участков в геноме микоплазмы.

В литературе имеются данные, что адаптация организмов (про- и эукариот) к новым условиям окружающей среды может быть связана с внутригеномными рекомбинационными перестройками, определяющими образование новых нуклеотидных последовательностей, а также генов [Гогвадзе, Буздин, 2005;

Гогвадзе и др., 2005;

Torkelson et al., 1997;

Esnault et al., 2000]. Однако молекулярные механизмы соответствующего явления у M. gallisepticum S6 еще предстоит выяснить.

2.3. Сравнительный анализ полипептидов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования В результате сравнительного анализа полипептидов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования, было установлено, что адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается существенным изменением экспрессии белков в клетках микоплазмы (табл. 1). Количественный и качественный состав полипептидных пулов ВФ и НФ M. gallisepticum S6 весьма различается. Различия связаны как с редукцией, так и индукцией экспрессии продуктов ряда генов, а также появлением в клетках НФ микоплазмы изоформ белков. У НФ микоплазмы наблюдается тенденция к смещению значительного количества белков в кислую область.

Всего в результате сравнительного анализа полипептидных спектров ВФ и НФ M. gallisepticum S6 было идентифицировано 63 белка, участвующие в адаптации клеток микоплазмы к НУ.

Образование изоферментов, участвующих в энергетическом метаболизме в НФ клеток, может способствовать оптимизации катализа реакций в клетках бактерий в НУ среды [Хочачка, Сомеро, 1988]. При этом чрезвычайно высокое в НФ M. gallisepticum S6 разнообразие изоформ адгезинов (в том числе PvpA), отличающихся не только по рН, но и по массе, может быть универсальной защитной реакцией микоплазм, связанной с усилением адгезии бактерий к клеткам хозяина под действием стрессовых факторов [Wasinger et al., 2000].

Полученные нами данные свидетельствовали, что в НФ клеток M. gallisepticum S6 сохраняется значительная часть ферментов гликолитического пути. При этом наличие изоформ соответствующих ферментов позволяет предполагать, что одним из путей, активирующихся в клетках M. gallisepticum S6 при культивировании их в НУ среды, является Табл. 1.

Идентифицированные белки, экспрессия которых значительно изменяется при адаптации M. gallisepticum S6 к НУ Локус ОРС на Локус ОРС на Белок Белок хромосоме хромосоме ch_1510 MGA_0123 ch_1066 MGA_ PykF * MGA_0156 ch_1080 MGA_ AcoB * MGA_0164 ch_1080 (N-конец) MGA_ AcoA * MGA_0165 PstS MGA_ ch_1566 MGA_0226 Tsf * MGA_ uh_1572 MGA_0241 NusA MGA_ uh_1579 * MGA_0252 PutA * MGA_ PvpA * MGAL_0256_0258 ch_1190 MGA_ EF-G MGA_0260 ch_1200 MGA_ DnaK * MGA_0279 Smc-like * MGA_ ch_1601 MGA_0306 MGC3 * MGA_ GAPDH* MGA_0330 GreA MGA_ VlhA 3.03 * MGA_0380 TufB * MGA_ MALLP * MGA_0398 ch_1301 MGA_ ch_1660 MGA_0416 ch_1316 MGA_ ch_1670 MGA_0431 Pgk * MGA_ RpoA * MGA_0443 ch_1369 MGA_ ch_1709 MGA_0495 ch_1371 MGA_ Fba MGA_0498 ch_1381 MGA_ GTPase MGA_0500 GrpE MGA_ PtsA * MGA_0508 DnaJ MGA_1324d - экспрессирован у НФ, но не у ВФ;

- не экспрессирован у НФ, или экспрессия понижается;

* - белок представлен изоформами у НФ;

ch / uh – консервативный/уникальный гипотетический белок глюконеогенез. Неуглеводными компонентами, определяющими функционирование этого пути, могут быть аминокислоты и, в меньшей степени, липиды, высвобождающиеся при лизисе части клеток популяции.

Интенсификация глюконеогенеза обеспечивает синтез необходимого пула сахаров, в том числе для формирования капсулоподобных структур M. gallisepticum S6 (рис. 1Б), способствующих выживанию клеток бактерий в НУ [Степанова и др., 2001]. На основании полученных экспериментальных данных и анализе их in silico составлена схема возможных перестроек метаболических путей в клетках M. gallisepticum S6 при адаптации к НУ.

2.4. Особенности генотоксичности клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования Адаптация микроорганизмов к действию различных стрессорных факторов может определять значительные изменения метаболизма и вирулентности бактериальных клеток [Хмель, 2005;

Чернов и др., 2007], в том числе связанные с секрецией специфических метаболитов, обладающих мутагенной [Ильинская и др., 2002] или антимутагенной активностью [Воробьева и др., 1993].

В результате наших исследований было обнаружено, что адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается изменением генотоксичных свойств клеток микоплазмы и их культуральной жидкости (рис. 5).

Рис. 5. Индукция SOS-ответа тестерного штамма E. coli PQ37 при воздействии ВФ и НФ клеток M.

gallisepticum S6 и их культуральной жидкости Клетки M. gallisepticum S6, образующиеся на полноценной питательной среде, а также их культуральная жидкость индуцируют SOS-ответ у клеток тестерного штамма E. coli PQ37. Клетки M. gallisepticum S6, образующиеся в НУ, а также их культуральная жидкость генотоксичных эффектов не проявляют.

Отсутствие SOS-ответа у клеток тестерного штамма E. coli PQ37 при воздействии НФ и их культуральной жидкости может свидетельствовать, что у M. gallisepticum S6, как и у ряда других аспорогенных бактерий, при адаптации к НУ происходит аттенуация вирулентных свойств, связанных с генотоксичными эффектами. Проявление генотоксичных эффектов как у ВФ, так и у культуральной жидкости этих клеток в отношении E. coli PQ37, позволяет предположить секрецию генотоксичных метаболитов из клеток микоплазмы в окружающую среду и/или изменения компонентов культуральной среды под действием секретируемых метаболитов ВФ M.

gallisepticum S6. Природа этих метаболитов представляет особенный интерес с точки зрения патогенного потенциала этой широко распространенной микоплазмы в отношении инфицированных клеток хозяина и микроорганизмов в микробиоценозах [Hudson et al., 2006].

2.5. Фитопатогенность M. gallisepticum S6 и ее особенности у клеток микоплазмы, образующихся в разных условиях культивирования M. gallisepticum – широко распространенный возбудитель респираторных микоплазмозов птиц, контаминант создаваемых на основе куриных эмбрионов вирусных вакцин [McGarrity et al., 1992]. Вместе с тем в литературе имеются данные о выявлении M. gallisepticum у растений [Коромыслов и др., 1987].

Однако сообщения об исследованиях влияния инфекции M. gallisepticum на развитие деструктивных процессов в тканях растений в литературе отсутствуют. В этой связи выяснение способности клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования (ВФ и НФ), инфицировать растения специфичного и неспецифичного индикаторов фитомикоплазмозов – барвинка малого (Vinca minor L.) и фасоли золотистой (Vigna radiata L.), соответственно, и вызывать у них морфофизиологические и ультрацитоструктурные изменения явилось задачей наших исследований.

Определение фитопатогенности у M. gallisepticum S6 выполняли с использованием алгоритма, разработанного для проведения соответствующих исследований в отношении A. laidlawii PG8 [Чернов, 1998;

Чернов и др., 2007].

Для выявления ВФ и НФ M. gallisepticum S6 в тканях растений использовали методы трансмиссивной микроскопии [Чернов и др., 1996], а также полимеразной цепной реакции [Чернов и др., 2007] с праймерами, сконструированными на основе нуклеотидной последовательности гена himA/hup, кодирующего HU-белок (heat-unstable nucleoid protein) штамма M.

gallisepticum, для которого нами было установлено отсутствие аттенуации ПЦР сигнала при адаптации клеток микоплазмы к НУ среды.

В результате наших экспериментов было обнаружено, что заражение V. minor L. клетками M. gallisepticum S6 вызывает у 100 % опытных растений аппарантную инфекцию с типичной картиной морфозов, возникающих у растений при инфицирование их фитопатогенными микоплазмами.

Заражение V. radiata L. клетками M. gallisepticum S6 приводило к развитию латентной микоплазменной инфекции. В результате анализа 90 образцов 18-ти дневных проростков растений (V. radiata L.) выраженные морфологические аномалии, характерные для фитомикоплазмозов (апикальный некроз, карликовость, скручивание листьев, развитие боковых побегов), не были обнаружены. Только у единичных растений был отмечен некроз краевой пластинки листа и слабые проявления хлороза. Однако результаты ПЦР анализа свидетельствовали о присутствии ДНК M. gallisepticum S6 в клетках тканей (корень, стебель, лист) всех растений опытной группы. В результате исследования трансмиссивных микрографий было установлено, что инфицирование V. radiata L. клетками НФ M. gallisepticum S6 вызывает характерные для фитомикоплазмозов изменения в тканях растений. При этом выраженность деструктивных процессов у растений, инфицированных ВФ и НФ микоплазмы, различается.

В растениях, зараженных ВФ микоплазмы, наблюдаются изменения в ультраструктуре клеток околососудистой паренхимы (рис. 6А, Б). Хлоропласты в клетках паренхимы имеют светлый матрикс, тилакоиды расположены рыхло, Рис. 6. Трансмиссивные микрографии клеток растений (V. radiata L.), инфицированных ВФ (А, Б) и НФ (В, Г) M. gallisepticum S Кз – крахмальные зерна, Мк – микоплазмы, М – митохондрии, Т – тилакоиды, Хл хлоропласты образуют стопки из 3-5 гран, между которыми локализованы небольшие крахмальные зерна (рис. 6А). Митохондрии имеют извилистую форму и светлую, лишенную крист, область матрикса. В трахеидах обнаруживаются единичные клетки микоплазмы размером 0,6-0,8 мкм (рис. 6Б).

В растениях, зараженных НФ M. gallisepticum S6, ультраструктура клеток проводящего пучка полностью нарушена и наблюдается деградация всех органелл (рис. 6В, Г). В зараженных клетках не просматривается плазматическая мембрана, нарушена плотность цитоплазмы. Ядро в зараженных микоплазмой клетках паренхимы имеет очень рыхлую гиалоплазму. В хлоропластах отсутствуют крахмальные зерна, упаковка тилакоидов рыхлая, а строма светлая (рис. 6В). Подобная ультраструктура хлоропластов отражает снижение их функциональной активности при развитии хлороза, характерного для фитомикоплазмозов [Christensen et al., 2005]. Клетки губчатой паренхимы листа еще сохраняют свою ультраструктурную организацию, тогда как граничащие с ними паренхимные клетки обкладки пучка полностью разрушены. По краю клеточной стенки обнаруживается большое количество мелких кокковидных клеток микоплазмы, в том числе размером 0,1-0,15 мкм (рис 6В, Г), характерным для наноформ бактерий [Чернов и др., 2007]. Полученные нами результаты позволяют заключить, что M. gallisepticum S6 обладает фитопатогенным потенциалом. При этом адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается усилением вирулентности микоплазмы в отношении растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Большой интерес к молекулярным основам адаптации микоплазм связан, с одной стороны, с уникальностью биологии мельчайших прокариот, а с другой – диктуется практической необходимостью. Микоплазмы – возбудители заболеваний человека, животных, растений, основные контаминанты клеточных культур, в том числе используемых в биотехнологии для производства вирусных вакцин [Борхсениус и др., 2002;

Razin, 2006].

Сравнительно недавно были получены данные об особенностях адаптации к НУ A. laidlawii PG8 (сем. Acholeplasmataceae, кл. Mollicutes) [Чернов и др., 2004, 2005, 2007;

Chernov et al., 2007]. В результате нашей работы были выявлены особенности адаптации к НУ представителя другой филогенетической группы молликут – M. gallisepticum S6 (сем.

Mycoplasmataceae, кл. Mollicutes). Полученные нами данные могут свидетельствовать, что выживание в новых условиях клеток M. gallisepticum S связано с репрограммированием клеточной и молекулярной биологии микоплазмы. Адаптация M. gallisepticum S6, как и A. laidlawii, а также ряда аспорогенных бактерий, связана с переходом ВФ клеток микоплазмы в НФ.

Однако реактивность клеток A. laidlawii PG8 и M. gallisepticum S6 в отношении НУ различается. Одной из причин этого могут быть существенные различия биологии M. gallisepticum и A. laidlawii, - микоплазм, принадлежащим к разным филогенетическим группам молликут [Oshima, Nishida, 2007].

M. gallisepticum способна успешно преодолевать защитные системы высших организмов и выживать в разных условиях среды [Nagatomo et al., 2001;

Collett, 2005]. Эта микоплазма, известная как возбудитель заболеваний птиц и контаминант вирусных вакцин, создаваемых на основе куриных эмбрионов, встречается также у растений. Однако данные о фитопатогенности этой микоплазмы в литературе отсутствуют.

В нашей работе впервые с точки зрения критериев вирулентности (инфекционность, инвазивность, токсигенность и персистенция) было показано, что M. gallisepticum S6 способна проявлять фитопатогенность в отношении как специфичного, так и неспецифичного индикаторов фитомикоплазмозов.

M. gallisepticum S6 может проникать через корневую систему растений, распространяться по разным тканям, персистировать в них и вызывать деструктивные процессы, характерные для фитомикоплазмозов, возникающих спонтанно [Скрипаль, 1988]. При этом было обнаружено, что НФ M. gallisepticum S6, не вызывающие (в отличие от ВФ микоплазмы) токсичных и мутагенных эффектов в отношении тестерного штамма E. coli PQ37, являются более фитопатогенными, чем ВФ клеток бактерии.

Наличие у M. gallisepticum S6 механизмов смены программ жизни, определяющих адаптацию микоплазмы к разным условиям среды и изменение вирулентных свойств, диктует необходимость разработки новых подходов для исследования формирования и эволюции системы "патоген-хозяин", а также способов ее контроля.

В результате наших исследований предложен способ выявления ВФ и НФ клеток M. gallisepticum S6 с помощью ПЦР при использовании праймеров для амплификации нуклеотидной последовательности гена pvpA микоплазмы. Этот способ может быть эффективным средством дифференциальной детекции ВФ и НФ M. gallisepticum в природных источниках. Однако решение проблемы контроля микоплазменных инфекций, вероятно, лежит на пути геномно протеомного профилирования микоплазм и клеток эукариот при их взаимодействии. Реализация таких проектов уже началась как за рубежом, так и в России [Чернов, 2007, 2008;

Wang et al., 2006;

Cecchini et al., 2007;

Madsen et al., 2008].

ВЫВОДЫ 1. Адаптация M. gallisepticum S6 к неблагоприятным условиям (НУ) сопровождается изменениями морфологии, ультраструктуры, а также пролиферации клеток микоплазмы. На полноценной питательной среде Эдварда M. gallisepticum S6 образует грушевидные клетки (длина 0,6-1 мкм), имеющие терминальную структуру "bleb", а на среде с ограничением субстрата, при понижении температуры культивирования – кокковидные клетки (диаметр 0,2-0,8 мкм), лишенные полярных образований. Длительное культивирование M. gallisepticum S6 в НУ приводит к превращению вегетативных форм (ВФ) клеток микоплазмы в некультивируемые формы (НФ).

2. При адаптации клеток M. gallisepticum S6 к НУ в структуре ДНК микоплазмы возникают изменения. У НФ определяется нуклеотидная последовательность (582 н.п.о.) с двумя ОРС, не регистрируемая у ВФ микоплазмы.

3. ДНК-связанные белки НФ клеток M. gallisepticum S6 могут обусловливать аттенуацию амплификации нуклеотидной последовательности (582 н.п.о.) при использовании в ПЦР со специфичными праймерами для выявления pvpA-гена микоплазмы матричной ДНК без специальной очистки.

4. Клетки M. gallisepticum S6, образующиеся в разных условиях культивирования, существенно различаются по экспрессированным белкам.

Идентифицировано 63 белка, участвующие в адаптации клеток микоплазмы к НУ. На основании полученных данных представлены возможные схемы изменения метаболических путей в клетках НФ микоплазмы.

5. Адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается изменением генотоксичных свойств клеток микоплазмы и их культуральной жидкости. ВФ клеток M. gallisepticum S6, а также их культуральная жидкость индуцируют SOS-ответ у клеток тестерного штамма E. coli PQ37. НФ клеток микоплазмы, а также их культуральная жидкость генотоксичных эффектов не проявляют.

6. M. gallisepticum S6 обладает фитопатогенным потенциалом. Клетки микоплазмы способны инфицировать растения через корневую систему, проникать в разные ткани растений, персистировать в них и вызывать деструктивные процессы, характерные для фитомикоплазмозов. При этом заражение клетками M. gallisepticum S6 V. minor L. (специфичный индикатор фитомикоплазмозов) вызывает у растений аппарантную инфекцию, а заражение V. radiata L. (неспецифичный индикатор фитомикоплазмозов) приводит к развитию латентной инфекции.

7. Адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается изменением вирулентности микоплазмы в отношении растений. НФ M. gallisepticum S индуцируют более выраженные нарушения ультраструктуры тканей растений (V. radiata L.), чем ВФ микоплазмы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Баранова Н.Б. Персистенция микоплазм у человека: полиморфизм генов адгезии (vaa) Mycoplasma hominis и цитокинов (IL-1, IL-10) у носителей микоплазмы / Н.Б.Баранова, А.А.Музыкантов, О.В.Горшков, Г.Ф.Шаймарданова // "Молодые ученые в медицине" XII Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 150-летию со дня рождения В.М. Бехтерева: Тез. докл. – Казань: Отечество, 2007 – С.275-276.

2. Баранова Н.Б. Молекулярные основы персистенции микоплазм у человека: гены vaa у клинических изолятов Mycoplasma hominis и IL (1, 10) у носителей микоплазмы / Н.Б.Баранова, А.А.Музыкантов, Г.Ф.Шаймарданова, О.В.Горшков // "Фундаментальные аспекты исследования симбиотических систем", Всероссийская конференция с международным участием: Тез. докл. – Саратов, 2007. – С.35.

3. Музыкантов А.А Молекулярно-генетические и морфофизиологические особенности клеток микоплазм (Mycoplasma gallisepticum) при использовании различных источников энергии / А.А.Музыкантов, Г.Ф.Шаймарданова, О.В.Горшков // "Биология – наука XXI века" 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых:

Сб. тез. – Пущино: Изд-во Пущинского научного центра, 2007. – С.102.

4. Баранова Н.Б. Особенности вариабельности генов vaa у клинических изолятов Mycoplasma hominis и IL (1, 10) у носителей микоплазмы / Н.Б.Баранова, А.А.Музыкантов, Г.Ф.Шаймарданова, О.В.Горшков // "Биология – наука XXI века" 11-я Международная Пущинская школа конференция молодых ученых. Сб. тез. – Пущино: Изд-во Пущинского научного центра, 2007. – С.69-70.

5. Чернов В.М. Сравнительный протеомный анализ вегетативных форм клеток и наноформ микоплазм (Mycoplasma gallisepticum S6 и Acholeplasma laidlawii PG8) / В.М.Чернов, В.М.Говорун, И.А.Демина, О.В.Горшков, А.А.Музыкантов и др. // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Сб. тез. – Новосибирск: Арта, 2008. – С.255.

6. Чернов В.М. Адаптация микоплазм к неблагоприятным условиям роста связана с превращением вегетативных форм клеток в наноформы / В.М.Чернов, О.А.Чернова, О.В.Горшков, Г.Ф.Шаймарданова, А.А.Музыкантов и др. // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Сб. тез. – Новосибирск: Арта, 2008. – С.144.

7. Чернов В.М. Сравнительный протеомный анализ вегетативных форм и наноклеток Mycoplasma gallisepticum для создания технологии контроля микоплазменных инфекций / В.М.Чернов, О.А.Чернова, М.Н.Давыдова, О.В.Горшков, М.В.Трушин, Г.Ф.Шаймарданова, А.А.Музыкантов и др. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы". Сб. тез. – Москва, 2007.

– С.87-88.

8. Музыкантов А.А. Феноменология микоплазменных инфекций растений: особенности ультраструктуры клеток Vigna radiata L., инфицированных Mycoplasma gallisepticum S6 / А.А.Музыкантов, Е.Н.Антуфьева, А.А.Пономарева // "Биология: традиции и инновации в XXI веке": Материалы I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов биологов "Симбиоз Россия-2008" с международным участием. / Под научной редакцией Т.В. Балтиной. – Казань: Изд-во КГУ, 2008. – С.21.

9. Музыкантов А.А. Изменение вирулентных свойств микоплазм (Mycoplasma gallisepticum S6) при адаптации к стрессорам / А.А.Музыкантов, А.Д.Пельникевич // "Биология: традиции и инновации в XXI веке: Материалы I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2008" с международным участием. 6-10 июля 2008 г. / Под научной редакцией Т.В. Балтиной. – Казань: Изд-во КГУ, 2008. – С.67-71.

10. Чернов В.М. Адаптация микоплазм к неблагоприятным условиям роста: морфология, ультраструктура и экспрессия генома клеток Mycoplasma gallisepticum S6 / В.М.Чернов, В.М.Говорун, И.А.Дёмина, О.В.Горшков, А.А.Музыкантов и др. // ДАН. – 2008. – Т. 421. – С.701-704.

11. Чернов В.М. Адаптация Mycoplasma gallisepticum к неблагоприятным условиям роста: изменение морфологических и физиологических свойств / В.М.Чернов, О.А.Чернова, О.В.Горшков, А.А.Музыкантов и др. // Микробиол.

– 2008. – Т. 77. – № 6.

12. Chernova O.A. Mycoplasma gallisepticum strain S6 surface cytadhesin (pvpA) gene, complete cds. ACCESSION EU847585. / O.A.Chernova, O.V.Gorshkov, A.A.Mouzykantov, V.M.Chernov // Режим доступа:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/viewer.fcgi?val=EU847585, свободный. – Проверено 25.08.2008.

Список сокращений и условных обозначений ВФ – вегетативные формы ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота КОЕ – колониеобразующие единицы мкм – микрометр МПР – метод предельных разведений н.п.о. – нуклеотидные пары оснований НУ – неблагоприятные условия НФ – некультивируемые формы ОРС – открытая рамка считывания ППСЭ – полноценная питательная среда Эдварда ПЦР – полимеразная цепная реакция PvpA – фазовариабельный белок А (phase variable protein A) Vaa – вариабельный антиген, участвующий в адгезии (variable adherence- associated antigen)

 


Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.