авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани

На правах рукописи

Ефименко Анастасия Юрьевна ВЛИЯНИЕ ВОЗРАСТА НА АНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ 03.01.04 – Биохимия 14.01.05 - Кардиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва – 2011 1

Работа выполнена на кафедре биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Парфенова Елена Викторовна кандидат биологических наук, доцент Калинина Наталья Игоревна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Панченко Елизавета Павловна доктор медицинских наук, профессор Ивков Николай Николаевич

Ведущая организация:

ФГУ «Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины» Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится 23 сентября 2011 года в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, Медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан «_» 2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор Е.В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе ишемическая болезнь сердца (ИБС), занимают первое место в структуре причин смертности в большинстве стран, несмотря на значительный прогресс в развитии медикаментозных методов лечения и хирургической и эндоваскулярной реваскуляризации. Одним из перспективных подходов к их лечению является терапевтический ангиогенез, основанный на введении в ишемизированные ткани генетических конструкций с генами факторов роста или стволовых/прогениторных клеток. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выделенные из костного мозга или жировой ткани (МСК-ЖТ), считаются перспективным инструментом для терапевтического ангиогенеза благодаря своей способности стимулировать рост кровеносных сосудов, в частности путем секреции ангиогенных факторов роста. Причем МСК-ЖТ, обладающие теми же свойствами, что и МСК костного мозга, значительно легче получить в достаточно большом количестве при малоинвазивной процедуре ограниченной липосакции. На моделях ишемии конечностей и миокарда у животных показано, что локальное и системное введение МСК-ЖТ способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением и улучшению перфузии тканей кровью [Трактуев, 2005;

Парфенова, 2006;

Gimble, 2007;

Rehman, 2004;

Nakagami, 2006;

Kondo, 2009;

Miyahara, 2006;

Zhang, 2007;

Cai, 2009]. Восстановление кровотока в ишемизированной ткани при трансплантации МСК-ЖТ обусловлено несколькими механизмами. Во-первых, эти клетки секретируют широкий набор ангиогенных факторов роста, которые способствуют миграции и пролиферации эндотелиальных клеток и их предшественников, а также формированию новых сосудов [Rehman, 2004;

Gimble, 2007;

Kondo, 2009;

Rubina, 2009;

Madonna, 2010]. Во-вторых, МСК-ЖТ секретируют активаторы плазминогена и матриксные протеазы, что способствует локальному разрушению внеклеточного матрикса и миграции клеток, участвующих в образовании сосудистой стенки, а также высвобождению связанных с матриксом ангиогенных факторов [Kaсhgal, 2011]. В-третьих, МСК-ЖТ могут дифференцироваться в гладкомышечные и эндотелиальные клетки, встраивающиеся в растущие сосуды, а также стабилизировать вновь образованные сосуды, выполняя функцию перицитов [Miranville, 2004;

Planat-Benard, 2004;

Miyahara, 2006;

Sumi, 2007]. Это согласуется с данными, демонстрирующими, что во всех тканях организма МСК являются компонентами сосудистой стенки и, по-видимому, играют важную роль в развитии и поддержании сосудистой сети как в норме, так и при патологическом ремоделировании тканей [Nombella-Arietta, 2011].

Хотя МСК-ЖТ уже используются в ранних фазах клинических исследований по клеточной терапии заболеваний ишемического генеза [Madonna, 2009;

Murohara, 2009;

Bailey, 2010;

Gimble, 2011], их свойства у больных с этими заболеваниями практически не изучены. Подавляющее большинство результатов, касающихся ангиогенных и регенеративных свойств МСК-ЖТ человека, получено на клетках, выделенных из жировой ткани относительно здоровых молодых доноров. В то же время известно, что старение и само заболевание может оказывать негативное влияние на состояние МСК [Fehrer, 2005;

Sethe, 2006;

Stolzing, 2008;

Katsara, 2011;

Madonna, 2011;

Sun, 2011]. В единичных работах показано, что при старении снижается пролиферативный потенциал МСК-ЖТ и их способность к дифференцировке [Zhu, 2009;

Huang, 2010], а также ухудшаются их ангиогенные свойства [El-Ftesi, 2009;

Huang, 2010]. Поскольку МСК входят в состав сосудистой стенки и принимают участие в процессах ее репарации при повреждении, изменения, происходящие с ними при старении, могут являться важным патогенетическим фактором заболеваний, ассоциированных с возрастом, включая атеросклероз, сахарный диабет и артериальную гипертонию. Изменения свойств МСК, в том числе их способности стимулировать рост сосудов, могут снижать эффективность аутологической клеточной терапии у пожилых пациентов с ИБС или хронической ишемией нижней конечностей - наиболее вероятных кандидатов для клеточной терапии.

Для повышения эффективности клеточной терапии собственными клетками пациента, а также для разработки методов стимуляции эндогенных регенеративных процессов необходимо изучение молекулярных механизмов, обусловливающих снижение терапевтических свойств клеток, в частности, их способности стимулировать васкуляризацию ишемизированных тканей.

Цель работы: Оценить влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани пациентов без кардиологических заболеваний и больных ишемической болезнью сердца.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить иммунофенотип, пролиферативную активность и накопление маркеров старения в МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и без нее.

2. Оценить содержание ангиогенных факторов (VEGF, PlGF, HGF, ангиопоэтина-1, ангиогенина и тромбоспондина-1) в кондиционированной среде и ангиогенную активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и без нее.

3. Проанализировать профиль экспрессии генов, кодирующих факторы, которые участвуют в регуляции ангиогенеза, в МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и без нее.

4. Определить влияние возраста на пролиферацию, жизнеспособность, способность к дифференцировке и продукцию активных форм кислорода в МСК-ЖТ мышей.

5. Сравнить способность МСК-ЖТ мышей разного возраста стимулировать ангиогенез на моделях in vitro и in vivo.

6. Проанализировать профиль экспрессии генов, кодирующих факторы, которые участвуют в регуляции ангиогенеза, в МСК-ЖТ мышей разного возраста.

7. Определить влияние гипоксии на ангиогенные свойства МСК-ЖТ.

Впервые проведено комплексное исследование Научная новизна.

морфофункциональных и молекулярных характеристик МСК, выделенных из жировой ткани пациентов разного возраста с ИБС и без нее. Установлено, что в МСК-ЖТ с возрастом происходит укорочение теломер и снижается доля активно пролиферирующих клеток. Это указывает на развитие процессов клеточного старения в МСК-ЖТ пожилых пациентов, что особенно выражено у больных ИБС. Впервые показано, что при старении снижается секреция этими клетками важнейших проангиогенных факторов, таких как VEGF, PlGF, HGF, ангиопоэтин-1, ангиогенин, и ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ, оцененная по способности кондиционированной среды от МСК-ЖТ стимулировать образование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками. Впервые установлено, что при старении МСК-ЖТ снижается вклад VEGF в ангиогенную активность суммарных продуктов секреции. Впервые обнаружено, что в МСК-ЖТ, полученных от пациентов в возрасте старше 60 лет, происходит активация системы внеклеточного протеолиза: увеличение экспрессии PAI-1, урокиназы и урокиназного рецептора, что особенно выражено в группе кардиологических больных, а также увеличение экспрессии и активности матриксных металлопротеиназ 2 и 9 типов.

Вклад возрастного фактора в ухудшение ангиогенных свойств МСК-ЖТ подтвержден на клетках мышей с использованием моделей ангиогенеза in vitro и in vivo.

Показано, что при введении МСК-ЖТ in vivo в составе подкожного имплантата Матригеля степень васкуляризации имплантата зависит как от возраста донора клеток, так и от возраста реципиента.

Изучено влияние гипоксии на ангиогенные свойства МСК-ЖТ мыши. На модели васкуляризации подкожных имплантатов Матригеля впервые показано, что гипоксия усиливает способность МСК-ЖТ не только стимулировать прорастание кровеносных сосудов в имплантат, но и способствовать их стабилизации. С помощью полногеномного скрининга МСК-ЖТ человека установлено, что при культивировании в условиях гипоксии преимущественно активируется экспрессия генов факторов, стимулирующих ангиогенез, по сравнению с ингибиторами ангиогенеза. Обнаружены различия в ответе МСК-ЖТ на гипоксию в зависимости от возраста доноров.

Результаты данной работы помогают также расширить представление о молекулярных механизмах снижения регенеративного потенциала стволовых и прогениторных клеток с возрастом, в том числе их ангиогенной активности.

Практическая значимость. Результаты диссертационной работы раскрывают механизмы снижения регенеративных свойств МСК у пожилых людей и больных ИБС, что целесообразно учитывать при разработке методов клеточной терапии и, в частности, тактики терапевтического ангиогенеза на основе МСК-ЖТ у больных ИБС. Полученные в исследовании данные о снижении ангиогенного потенциала МСК-ЖТ с возрастом и выявление конкретных ангиогенных факторов, секреция которых снижается с возрастом, могут быть положены в основу разработки методов предтрансплантационной подготовки МСК-ЖТ пожилых пациентов, способствующих усилению способности клеток стимулировать рост кровеносных сосудов. К таким методам может относиться генетическая модификация МСК-ЖТ конструкциями, несущими гены факторов роста, продукция которых снижена у пожилых больных. Мишени для этой модификации определены в данной работе. Другим методом, согласно полученным в работе данным, может быть предтрансплантационное культивирование МСК-ЖТ в условиях гипоксии.

Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в научно-исследовательскую и педагогическую деятельность ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова: используются в материалах лекций для студентов по курсу «Молекулярная медицина».

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на совместном заседании кафедры биохимии и молекулярной медицины, научно исследовательской лаборатории генных и клеточных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова и лаборатории ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗСР РФ (31 мая 2011г.), на заседании кафедры биохимии медицинского факультета РУДН (2 июня 2011г.), а также на научных конференциях: Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2007), 32ом Международном конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS) (Вена, Австрия, 2007), конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2008), Международном форуме аспирантов Тихоокеанского региона (Омаха, США, 2008), Всероссийской школе-конференции стволовые и прогениторные клетки:

«Аутологичные экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), Всероссийской научно практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2010), Международной конференции Международного общества изучения стволовых клеток (ISSCR) (Сан-Франциско, США, 2010), Международной конференции «Биология старения» (Лес Диаблеретс, Швейцария, 2010), Всероссийской школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), Международной конференции «Ангиогенез-2011» (Амстердам, Голландия, 2011), Международной конференции Международного общества тканевой инженерии и регенеративной медицины (TERMIS) (Гранада, Испания, 2011).

Работа выполнялась в рамках Государственных контрактов №02.527.11.0007 от апреля 2009 года (договор № 02.527.11.0007-1) по ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2007 - 2012 годы и №02.740.11.0093 от 15 июня 2009 года в рамках ФЦП «Научные и научно педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 статей, 11 тезисов докладов, 2 главы в сборнике статей.

Структура работы. Диссертация содержит 186 страниц и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 323 источника. Работа иллюстрирована таблицами и 19 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование.

В исследование были включены 62 пациента, у которых были выделены образцы подкожной жировой ткани в ходе хирургических операций. В первую группу (n=31) вошли пациенты, у которых жировая ткань была выделена в ходе операции по поводу эндопротезирования бедренного или коленного сустава (ГКБ №31), общей хирургической (аппендицит, паховая грыжа) или гинекологической (миома матки) патологии (ГКБ №29), травмы верхней или нижней конечности (Центральный институт травматологии и ортопедии им. И.О. Приорова).

Вторую группу (n=31) составили пациенты с ишемической болезнью сердца, стенозирующим коронарным атеросклерозом по данным коронароангиографии, стабильной стенокардией II-III функционального класса (по классификации Канадского общества по изучению сердечно-сосудистых заболеваний), которым проводилось аортокоронарное шунтирование в Отделе сердечно-сосудистой хирургии Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГУ РКНПК МЗСР РФ (рук. академик РАМН Р.С. Акчурин).

Все исследования, связанные с образцами ткани, выполнялись на основании разрешения Этического комитета ФГУ РКНПК МЗСР РФ.

Критериями исключения, общими для обеих групп пациентов, считали: наличие аутоиммунных патологий;

наличие злокачественных новообразований, в том числе в анамнезе;

наличие острых или хронических воспалительных заболеваний;

декомпенсированного сахарного диабета (СД);

длительную гормональную или антибиотикотерапию;

анемию (гемоглобин 10 г/дл) и гематологические заболевания;

острые нарушения мозгового кровообращения или черепно-мозговые травмы в предшествующие 12 месяцев. Специальными критериями исключения для первой группы больных считали наличие сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе инфаркта миокарда (ИМ) или миокардита в анамнезе, клиники стенокардии, клинических признаков сердечной недостаточности, нарушений ритма сердца, таких как пароксизмальная или постоянная форма мерцательной аритмии, частая желудочковая экстрасистолия, пароксизмальная желудочковая тахикардия, блокада левой ножки пучка Гиса, выраженных гиперлипидемий.

Пациенты были разделены на подгруппы по возрасту, согласно классификации ВОЗ (1963). В первой группе пациентов, условно обозначенной нами как пациенты без ИБС, выделяли детей 2-12 лет (подгруппа I, средний возраст 7,3±5,4 лет, n=4), пациентов 35 55 лет (подгруппа II, средний возраст 42,3±7,1 лет, n=14) и пациентов старше 60 лет (подгруппа III, средний возраст 66,2±6,8 лет, n=13), а во второй группе пациентов с ИБС – больных в возрасте 44-48 лет (подгруппа А, средний возраст 46,0±1,67 лет, n=6), 52-58 лет (подгруппа Б, средний возраст 55,4±1,9 лет, n=10) и старше 60 лет (подгруппа В, средний возраст 68,9±4,2 лет, n=15). По основным клинико-анамнестическим признакам, а именно по полу, индексу массы тела, функциональному классу стенокардии, частоте ИМ в анамнезе, наличию ожирения, артериальной гипертонии, СД 2 типа и нарушения толерантности к глюкозе, дислипидемии подгруппы больных ИБС разного возраста статистически значимо не различались между собой.

Следует отметить, что группы пациентов с ИБС и без ИБС различались по полу (р0,001): в группе пациентов без ИБС было 77,4% женщин, а в группе больных ИБС почти все пациенты были мужского пола (87,1%). Учитывая, что пол пациента может оказывать существенное влияние на свойства МСК-ЖТ, в частности, было показано, что МСК-ЖТ мужчин обладают большим остеогенным потенциалом, чем МСК-ЖТ женщин [Aksu, 2008], мы не сравнивали между собой группы пациентов с ИБС и без ИБС. Все сравнения касались только разных возрастных подгрупп внутри двух основных групп пациентов.

Экспериментальные животные. Часть работы была выполнена на мышах линии C57/Bl6 (самцы), предоставленных питомником г. Пущино. В эксперимент были включены 4 группы животных: возраст мышей первой группы составлял 1-2 месяца (n=16), второй – 12 месяцев (n=6), третьей – 18 месяцев (n=9) и четвертой группы – 24 месяца (n=7).

Выделение и культивирование МСК-ЖТ. Для выделения МСК-ЖТ использовали фрагменты жировой ткани, отсекаемые при проведении абдоминальных операций, операций по поводу травм и заболеваний суставов, а также при выделении сосудов и постановке шунтов при АКШ. Выделение МСК из подкожной жировой ткани проводили с помощью ферментативной обработки [Zuk, 2001]. Выделенные клетки высаживали на чашки Петри в концентрации 5х104/см3 и инкубировали при 37°С, 5% СО2. На следующий день в чашках меняли среду. Выход клеток при использованном нами методе выделения составлял 4-7х104 `прикрепившихся клеток на 1 мл ткани.

Полученные клетки выращивали на стандартном пластике для культивирования клеток (Corning Costar) в СО2 – инкубаторе (5% СО2;

95% воздуха;

370С), используя среду, поддерживающую рост недифференцированных мезенхимальных прогениторных клеток (Advance Stem Cell Basal Medium, HyClone), содержащую 10% смеси факторов роста (Advance Stem Cell Growth Supplement, HyClone) (МСК-ЖТ человека) или среду DMEM (HyClone), содержащую 10% ФБС (МСК-ЖТ мыши). Среды роста также содержали Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина/фунгизона (HyClone). При достижении 70-80% конфлуента клетки рассаживали в соотношении 1:3 с использованием 0,25% раствора трипсина/0,02% ЭДТА. Для получения кондиционированной среды клетки 2 ого пассажа в течение 24 часов депривировали в среде роста, не содержащей сыворотку, затем меняли среду на свежую, также не содержащую сыворотку, и культивировали клетки в течение 48 часов. После этого среду собирали, центрифугировали при 200g мин, добавляли коктейль ингибиторов протеаз (1:500, Sigma, кат. № Р1860), аликвоты по 1,5 мл замораживали в жидком азоте и хранили при -700С.

Для изучения влияния гипоксии на МСК-ЖТ клетки 2-ого пассажа в течение часов инкубировали в среде роста, не содержащей сыворотку, а затем помещали в условия 1% (гипоксия) или 20% (нормоксия) содержания кислорода на 48 часов [Ohnishi, 2007;

Potier, 2007]. Клетки анализировали немедленно после изъятия из гипоксического инкубатора, чтобы предотвратить влияние оксидативного стресса, вызванного реперфузией.

Характеристика МСК-ЖТ. Для того чтобы оценить содержание МСК в популяции культивируемых клеток, МСК-ЖТ 2-ого пассажа окрашивали антителами против CD14 (eBioscience, кат. №14-0141-81), CD34 (BD Pharmingen, кат. №555824), CD45 (BD Pharmingen, кат. №340953), CD73 (BD Pharmingen, кат. №550257), CD90 (BD Pharmingen, кат. №555597), CD105 (BD Pharmingen, кат. № 560819), NG2 (Chemicon, кат.

№ab5320) и PDGFRB (BD Pharmingen, кат. №558821), конъюгированными с различными флуорохромами, и анализировали с помощью проточного сортера клеток MoFlo (Dako Cytomation, Дания).

Для анализа способности к адипогенной и остеогенной дифференцировке МСК-ЖТ культивировали в индукционных средах, используя наборы реагентов (Invitrogen, США), по методике, приложенной к набору. В качестве отрицательного контроля использовали фибробласты кожи и МСК-ЖТ того же донора, культивируемые в обычной среде роста.

Количество МСК-ЖТ на разных стадиях апоптоза оценивали с помощью проточной цитофлуорометрии по связыванию аннексина V, конъюгированного с фикоэритрином (AnnexinV–PE, BD Pharmingen, кат. №556422), и накоплению красителя 7 аминоактиномицина D (7-AAD, BD Pharmingen, кат. №559925) как популяцию AnnexinV+ 7-AAD- клеток.

Для анализа изменений пролиферативной активности МСК-ЖТ человека клетки окрашивали 25мкМ раствором карбоксилфлуоресцеин диацетата сукцинимидильного эфира (CFSE, Molecular Probes, США) перед вторым пассированием. Окрашенные клетки культивировали в течение 5 дней, после этого оценивали процентное соотношение активно и слабо пролиферирующих клеток по степени снижения содержания CFSE относительно исходного уровня с помощью проточного сортера клеток MoFlo (Dako Cytomation, Дания). Пролиферацию МСК-ЖТ мыши оценивали при помощи MTT теста (Invitrogen, США).

Анализ продукции активных форм кислорода (АФК) в МСК-ЖТ проводили с помощью анализа инкубированных с H2DCF-DA (50µM) клеток на флуоресцентном спектрофотометре.

Относительную длину теломер в МСК-ЖТ оценивали методом ПЦР в реальном времени, нормируя значения по длине теломер в клетках линии HeLa [Cawthon, 2002].

Анализ экспрессии генов в МСК-ЖТ. Содержание мРНК исследуемых факторов, участвующих в регуляции ангиогенеза, проводили методом ПЦР в реальном времени.

Для этого из клеток выделяли РНК при помощи набора реагентов RNeasy Miny Kit (50) (QIAGEN, США), затем на матрице РНК строили кДНК, используя набор Fermentas Reverse Transcription Reagents (Fermentas, Литва). Далее проводили ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green І («Синтол», Россия) в амплификаторе BIO-RAD iQ5 Multicolor Real-time PCR detection system (Bio rad, США). Данные для каждого образца нормировали по экспрессии генов l7, b-actin и gapdh.

Оценку дифференциальной экспрессии генов в МСК-ЖТ человека, культивированных в стандартных или гипоксических условиях (n=5), проводили с помощью набора HumanRef-8 (Illumina, США), согласно протоколу производителя. Для анализа полученных данных использовали программное обеспечение GenomeStudio software (Illumina, США) и базы данных по классификации генов он-лайн (The Gene Ontology database, GO: http://www.geneontology.org, http://gostat.wehi.edu.au/cgi bin/goStat.pl).

Оценка экспрессии урокиназного рецептора (uPAR) на поверхности МСК-ЖТ человека. Уровень экспрессии uPAR на поверхности МСК-ЖТ человека оценивали с использованием моноклональных антител кролика против uPAR человека (AmD, кат.

№399R, США) и вторичных антител осла, конъюгированных с флуорохромом DyLight649 (Jackson, США), на проточном сортере клеток MoFlo (Dako Cytomation, Дания).

Анализ содержания факторов роста в кондиционированной среде. Содержание VEGF, PlGF, HGF, ANGPT1, TBS1 и Ang в среде культивирования МСК-ЖТ человека оценивали с помощью наборов реагентов для иммуноферментного анализа (ELISA) компании R&D Systems (США). Уровень поглощения раствора в лунках определяли при длине волны 450 нм с корректировкой при 620 нм. Полученные значения концентрации исследуемого белка в образцах кондиционированных сред нормировали на количество клеток.

Оценка активности металлопротеиназ 2 и 9 типов (ММП-2 и ММП-9) в кондиционированной среде. Содержание латентной и активной форм матриксных металлопротеиназ (ММП-2 и ММП-9) в образцах кондиционированной среды от МСК ЖТ человека (n=4), не содержащих коктейль ингибиторов протеаз, исследовали методом прямой желатиновой зимографии с предварительным вертикальным электрофорезом [Laemmli, 1970].

Формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле. Ангиогенную активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ в среду культивирования оценивали с помощью методики образования капилляроподобных структур на Матригеле, обедненном ростовыми факторами (Growth factors reduced эндотелиальными клетками пупочной вены человека Matrigel, BD Biosciences), (HUVEC) или эндотелиальными клетками линии EA.hy926 [Aranda, Owen, 2009] в присутствии кондиционированной среды от МСК-ЖТ. Для блокирования действия VEGF добавляли антитела против VEGF (Abcam, кат. № ab9570) в концентрации 0,1мкг/мл. Суммарную длину образованных трубчатых структур в 5 случайно выбранных полях зрения в лунке подсчитывали на изображениях, полученных при использовании объектива х10, с помощью программы MetaMorph 5.0 (Universal Imaging).

Ангиогенез в подкожном имплантате Матригеля. Влияние МСК-ЖТ мыши на рост кровеносных сосудов in vivo оценивали на модели ангиогенеза в подкожном имплантате Матригеля. Для этого 7х105 МСК-ЖТ 2-ого пассажа вводили подкожно сингенным мышам линии Balb/c в виде суспензии в Матригеле, обедненном факторами роста, инсулиновым шприцем с иглой толщиной 23G таким образом, чтобы Матригель успевал полимеризоваться под кожей и образовывал желеобразный имплантат неправильной формы.

Были сформированы следующие экспериментальные группы:

Мышам (возраст 1-2 мес) вводили МСК-ЖТ мышей в возрасте 1-2 мес, 1.

культивированные в стандартных условиях или в условиях гипоксии (n = 8).

Мышам (возраст 18 мес) вводили МСК-ЖТ мышей в возрасте 1-2 мес или 18 мес 2.

(n=3) Через 10 дней после подкожного введения суспензии клеток в Матригеле мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации, полностью изымали имплантаты и замораживали их в жидком азоте в среде для заморозки тканей Tissue-Tek (Sakura, Япония) для последующего приготовления срезов (6 мкм). Оценку плотности кровеносных сосудов на срезах Матригеля проводили с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием моноклональных антител крысы против маркерного антигена эндотелия сосудов CD31 (BD Pharmigen, кат.

№550274, США) и антител кролика против маркера перицитов NG2 мыши (Chemicon, кат. №ab5320, США). Ядра клеток докрашивали флуоресцентным красителем DAPI.

Полученные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа ZeissAxiovert200M. Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRc (Zeiss, Германия) и обработки в программе Axiovision.

Размер сосудов и их плотность оценивали с помощью программного обеспечения MetaMorph 5.0 (Universal Imaging) и ClickCounter. Подсчет сосудов проводили в 5 полях зрения на срезе (по 12 срезов на каждый имплантат) при 20-кратном увеличении, отдельно выделяя капилляры (CD31-положительные образования без просвета или длиной менее 20 мкм), сосуды среднего диаметра (CD31-положительные образования диаметром или длиной 20–50 мкм) и крупные сосуды (диаметром более 50 мкм).

Полученное число сосудов нормировали на единицу площади среза.

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ SigmaStat 9.0. При подтверждении нормальности распределения признака методами Колмогорова-Смирнова и Шапиро Уилксона для сравнения двух независимых групп использовали t- критерий Стьюдента, для сравнения зависимых групп - парный t-критерий Стьюдента, для анализа данных в нескольких независимых группах - метод ANOVA, в случаях малочисленных выборок и ненормальных распределений для тех же целей использовали U-критерий Манна-Уитни, парный критерий Уилкоксона и ANOVA по методу Крускал-Уоллиса, соответственно.

Для сравнения распределений порядковых и номинальных признаков применяли тест 2.

Корреляционный анализ проводили с использованием метода Пирсона для нормально распределенных выборок и метода Спирмена – в остальных случаях. Для оценки тесноты связи по значению коэффициента корреляции использовали шкалу Чеддока.

Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p0,05. Данные в тексте и на графиках представлены в виде среднее±стандартное отклонение (SD) или как медиана (25-й и 75-й процентили), если не указано иначе.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние возраста на морфологию, иммунофенотип, пролиферативную активность и накопление маркеров старения в МСК-ЖТ. Клетки, выделяемые из жировой ткани с помощью обработки ферментами, представляют собой смешанную популяцию различных клеточных типов, однако при культивировании в среде, поддерживающей рост недифференцированных МСК, ко 2-ому пассажу в культуре остаются клетки, имеющие фибробластоподобную морфологию, причем заметных различий по морфологии клеток, полученных от пациентов разных возрастных групп, выявлено не было.

Анализ иммунофенотипа культивированных до 2-ого пассажа МСК-ЖТ с помощью метода проточной цитофлуориметрии показал, что эти клетки несут мезенхимальные маркеры CD73 (85%), CD90 (95%) и CD105 (99%), но не экспрессируют или экспрессируют в малом количестве CD14 (10%), CD19 (10%), CD34(5%), CD (2%), CD79 (10%). Такой профиль экспрессии является типичным для МСК, согласно определению Международного общества клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy Statement) [Dominici, 2006]. МСК-ЖТ также экспрессируют маркеры, характерные для перицитов, такие как NG2 (99%) и PDGFRB (80%), что свидетельствует в пользу принадлежности этих клеток к периваскулярным прогениторным клеткам. Доля клеток, несущих мезенхимальные маркеры, была одинаковой в разных возрастных группах.

Одной из определяющих характеристик МСК является их мультипотентность, т.е.

способность к направленной дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях [Zuk, 2001;

Dominici, 2006;

Gimble, 2007]. Мы культивировали выборочные образцы клеток в соответствующих индукционных средах и показали, что МСК-ЖТ и молодых, и пожилых пациентов способны к адипогенной и остеогенной дифференцировке.

Важным маркером старения клеток, напрямую связанным с их пролиферативной активностью, является длина теломерных участков хромосом. С помощью ПЦР в реальном времени мы оценили относительную длину теломер в МСК-ЖТ и показали наличие статистически значимой обратной связи между длиной теломер и возрастом пациентов как без ИБС (r = -0,47, p = 0,03), так и с ИБС (r = -0,6, p = 0,006). Интересно отметить, что в подгруппах пациентов старше 60 лет средняя длина теломер в МСК-ЖТ больных ИБС была значительно снижена по сравнению со средней длиной теломер в клетках пациентов без ИБС той же возрастной группы (р = 0,01). По-видимому, МСК ЖТ больных ИБС старели быстрее, не пропорционально возрасту организма. Это может свидетельствовать об активном участии МСК в патогенезе хронических ишемических заболеваний, что приводит к ускоренному клеточному старению и снижению их пролиферативного потенциала.

Для того чтобы оценить пролиферацию МСК-ЖТ, мы окрашивали клетки флуоресцентным красителем CFSE. С каждым клеточным делением количество красителя в клетке уменьшалось вдвое. Методом проточной цитофлуорометрии мы определяли, какое количество клеток поделилось определенное число раз за 5 дней.

Анализ кривых распределения клеток в популяции по количеству делений не выявил статистически значимой зависимости пролиферации МСК-ЖТ от возраста. Однако мы обнаружили, что доля активно делящихся клеток (прошедших более 10 делений за дней) в популяции МСК-ЖТ, выделенных от пациентов группы II (35-55 лет), в среднем в 3,6 раз больше, чем в группе III (старше 60 лет): 5 (3;

6)% vs. 1,4 (0;

5,1)%, соответственно (р = 0,07). Возможно, это связано со снижением активности теломеразы, особенно в клетках с высоким пролиферативным потенциалом. Ожидаемым результатом оказалось выявление сильной положительной связи между длиной теломер в МСК-ЖТ и пролиферативной активностью клеток (r = 0,8, p = 0,006).

Таким образом, МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, сходны по морфологии и иммунофенотипу, характерному для МСК, обладают способностью дифференцироваться в адипогенном и остеогенном направлениях, значимо не различаются по пролиферативной активности, однако доля активно делящихся клеток и средняя длина теломер в МСК-ЖТ снижаются с возрастом пациентов.

Влияние возраста на ангиогенные свойства МСК-ЖТ человека. Способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов обусловлена в значительной степени продукцией ими широкого набора ангиогенных факторов [Rehman, 2004;

Gimble, 2007;

Kondo, 2009;

Rubina, 2009;

Madonna, 2010]. Учитывая это, мы проанализировали ангиогенную активность суммарных продуктов секреции клеток в среду культивирования, содержание основных ангиогенных факторов в кондиционированной среде от этих клеток и экспрессию мРНК факторов, регулирующих ангиогенез, в МСК ЖТ пациентов разного возраста. Было обнаружено, что способность кондиционированной среды от МСК-ЖТ стимулировать образование тубулярных структур эндотелиальными клетками на Матригеле in vitro снижается с возрастом как в группе пациентов без ИБС, так и в группе кардиологических больных, что выражалось в обратной корреляции между общей длиной тубулярных структур и возрастом пациентов (r = -0,68, p=0,01 и r = -0,53, p=0,03, соответственно). Кондиционированная среда от клеток, выделенных из жировой ткани пациентов старшего возраста (старше 60 лет), стимулировала образование тубулярных структур достоверно менее выражено, чем среда от клеток, полученных от более молодых пациентов (Табл. 1).

Таблица 1. Формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле в присутствии кондиционированной среды от МСК-ЖТ.

Пациенты без ИБС Пациенты с ИБС Группа I Группа II Группа III р Группа А Группа Б Группа В Р 2-12 лет 35-55 лет 60 лет 42-48 лет 52-58 лет 60 лет (группы (группы А vs. В) n= 1 n= 9 n= 9 II vs. III) n= 4 n=9 n= 107518 99003 89134 64171 ОДТ*/ млн. кл., 139795,8 (98302;

(89519;

(79153;

(37887;

(40258;

0,056 0, *** 113163) 100813) 188711) 104482 отн.ед.

-0,68, р=0,01 -0,53, р=0, r** ** Примечание. * – общая длина трубочек;

- коэффициент корреляции показателя общей длины трубочек и возраста пациентов;

*** - в группе I результат был получен только для одного образца (ребенок К., 2,5 года) и не был включен в корреляционный анализ.

Помимо этого, была выявлена прямая корреляционная связь между ангиогенной активностью суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ и длиной теломер в этих клетках (r = 0,49, p=0,01;

n=45), что позволяет предлагать оценку длины теломер в качестве клеточного маркера возраст-ассоциированного снижения ангиогенной активности МСК ЖТ.

Основным ангиогенным фактором, играющим центральную роль в стимуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, является VEGF. Было показано, что МСК жировой ткани секретируют значительное количество VEGF, и этот фактор является одним из ключевых во взаимодействии МСК и эндотелиальных клеток [Traktuev, 2008]. Мы проанализировали вклад VEGF в ангиогенную активность кондиционированной среды от МСК-ЖТ. Добавление блокирующих VEGF антител приводило к подавлению стимуляции образования тубулярных структур на Матригеле в среднем на 57 (40;

65)%, причем этот эффект был тем больше, чем выше было содержание VEGF в среде культивирования (r = 0,94, p = 0,02;

n=18). Мы отметили наличие тенденции к положительной корреляционной связи между степенью подавления ангиогенной активности среды культивирования антителами к VEGF и длиной теломер в МСК-ЖТ (r = 0,46, p = 0,09;

n=18), что может свидетельствовать о снижении вклада VEGF в ангиогенный потенциал продуктов секреции МСК-ЖТ при клеточном старении.

Роль конкретных факторов, секретируемых МСК-ЖТ, в паракринных эффектах этих клеток изучена лишь в единичных работах [Сasteilla, 2010]. Для того чтобы установить, изменение продукции каких именно ангиогенных факторов лежит в основе снижения ангиогенной активности МСК-ЖТ пациентов старшего возраста, мы оценили содержание VEGF, PlGF, HGF, ангиопоэтина-1 (Angpt1), ангиогенина и тромбоспондина-1 (TBS1) в кондиционированных средах от МСК-ЖТ пациентов разного возраста (Табл. 2).

Таблица 2. Содержание ангиогенных факторов роста в кондиционированной среде от МСК-ЖТ (нг/млн. клеток), измеренное с помощью ИФА.

Пациенты без ИБС Пациенты с ИБС Группа I Группа II Группа III р Группа А Группа Б Группа В р Факто 2-12 лет 35-55 лет 60 лет I vs. 42-48 лет 52-58 лет 60 лет р A n=4 n= 14 n= 13 III n= 4 n= 6 n= 13 vs.B 30,1 11,0 5,7 0,07 23 22 16 0, VEGF (12,4;

68,3) (4,0;

17,1) (3,2;

12,4) (19;

28) (19;

25) (8;

22) -0,42, р=0,02 -0,37, р=0, r* нд** 1,08*** 0,04 0,04 0,5 0,2 0,14 0, PlGF (0,03;

0,04) (0,02;

0,08) (0,2;

1,0) (0,1;

0,22) (0,06;

0,2) -0,59, р=0,01 -0,59, р=0, r нд нд 1,72*** 0,7 0,4 1,0 0,8 0, Angpt (0,4;

1,2) (0,1;

0,8) (0,9;

3,0) (0,5;

1,3) (0,2;

1,7) -0,38, р=0,11 -0,40, р=0, r нд нд TBS1 122,81*** 202,9 143,6 159 19 (120,8;

438,9) (47,8;

511,4) (71;

656) (12;

80) (64;

265) Нд нд r нд 13,53*** 2,4 1,2 6,8 4,3 1, Ang 0, (1,9;

2,9) (0,3;

1,9) (4,0;

9,0) (2,9;

5,2) (1,2;

3,0) -0,66, р=0,005 -0,72, р=0, r нд 4,5 2,2 1,1 0,07 20,0 11,8 13, HGF (3,5;

17,7) (1,7;

4,3) (0,6;

2,8) (18,7;

42) (9,5;

21,7) (3,3;

23,5) -0,59, р=0,03 -0,44, р=0, r Примечание. * - коэффициент корреляции содержания фактора роста и возраста пациентов;

** - уровень значимости p0,15;

*** - в группе I содержание всех факторов, кроме VEGF и HGF, было проанализировано только в одном образце (ребенок К., 2,5 года), показатели которого приведены в таблице, статистически значимых различий между группами II и III для всех факторов не наблюдали. VEGF – фактор роста эндотелия сосудов, PlGF – плацентарный фактор роста, Angpt1 – ангиопоэтин 1 типа, TBS1 – тромбоспондин 1 типа, Ang – ангиогенин.

Несмотря на то, что средние значения содержания ангиогенных факторов в среде культивирования МСК-ЖТ были в несколько раз ниже в старших возрастных подгруппах, чем в более молодых подгруппах, достоверных различий для большинства факторов из-за выраженного разброса показателей не получено. Исключение составляет уровень ангиогенина, который у больных ИБС старше 60 лет был достоверно снижен более чем в три раза по сравнению с пациентами более молодой подгруппы (42-48 лет) (Табл. 2). Четкие тенденции к снижению секреции VEGF и HGF с возрастом (р=0,07) наблюдались в группе больных без ИБС. Однако корреляционный анализ показал наличие достоверных или близких к достоверным обратных связей между содержанием проангиогенных факторов VEGF, PlGF, HGF, Angpt1 и ангиогенина в кондиционированной среде от МСК-ЖТ и возрастом пациентов как в группе больных ИБС, так и в группе пациентов без кардиологических заболеваний (Табл. 2, Рис. 1).

Следует отметить, что ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ коррелировала с содержанием ангиогенина в группе больных без ИБС (r=0,66, p=0,05;

n=18) и ангиопоэтина-1 в группе кардиологических больных (r=0,79, p=0,004;

n=23), но не с уровнем VEGF в среде культивирования, что указывает на существенный вклад других ангиогенных факторов, возможно, модулирующих эффект VEGF, в ангиогенную активность МСК-ЖТ.

Рисунок 1. Обратные корреляции между содержанием ангиогенных факторов (VEGF и ангиогенина) в кондиционированной среде от МСК-ЖТ и возрастом больных ИБС (r = -0,37, p = 0,09 и r = -0,72, p = 0,001, соответственно).

Таким образом, снижение при старении продукции основных ангиогенных факторов (VEGF, PlGF, HGF, Angpt1, ангиогенина) может лежать в основе ухудшения ангиогенных свойств МСК-ЖТ пожилых пациентов.

Для того чтобы выявить механизмы снижения секреции ангиогенных факторов МСК-ЖТ, мы проанализировали содержание мРНК генов основных регуляторов ангиогенеза в клетках пациентов разных возрастных групп. Мы наблюдали статистически значимое снижение содержания мРНК PlGF и HGF в МСК-ЖТ пациентов старшего возраста из обеих групп, в то время как содержание мРНК генов других про- и антиангиогенных факторов с возрастом изменялось незначительно. Как и в случае паспортного возраста пациентов, содержание мРНК генов различных ангиогенных факторов слабо коррелировало с длиной теломер в соответствующих клетках. При сопоставлении уровня мРНК в клетках и белка соответствующего фактора в кондиционированной среде, обнаружено, что только содержание VEGF (r=0,31, p=0,03;

n=53), PlGF (r=0,54, p=0,001;

n=41) и HGF (r=0,39, p=0,09;

n=53) коррелировало с содержанием мРНК этих генов в клетках. Таким образом, снижение секреции PlGF и HGF может быть обусловлено снижением экспрессии соответствующих генов. Однако содержание мРНК других ангиогенных факторов в клетках меняется при старении незначительно, что позволяет предполагать наличие посттрансляционных механизмов снижения секреции проангиогенных факторов МСК-ЖТ при старении.

Влияние возраста на экспрессию и активность протеаз в МСК-ЖТ. Важную роль в процессах роста сосудов играют системы протеаз, регулирующих направленную миграцию и инвазию клеток и ремоделирование внеклеточного матрикса. К ним относится урокиназная система, представленная активатором плазминогена урокиназного типа, или урокиназой (uPA), ее рецептором (uPAR) и ингибитором активаторов плазминогена (PAI-1), а также система матриксных металлопротеаз. С помощью ПЦР в реальном времени мы показали, что с возрастом в МСК-ЖТ пациентов с ИБС значимо возрастает содержание мРНК PAI-1 и uPAR (Табл. 3). Для пациентов без ИБС эта тенденция менее заметна, тем не менее, отмечена положительная корреляция между содержанием мРНК PAI-1 и возрастом пациентов и обратная связь между содержанием мРНК uPAR и длиной теломер в клетках (r = -0,55, p = 0,06;

n=31).

Таблица 3. Содержание мРНК компонентов урокиназной системы и матриксных металлопротеаз в МСК-ЖТ (отн.ед.), оцененное методом ПЦР в реальном времени.

Пациенты без ИБС Пациенты с ИБС Группа I Группа II Группа III р Группа А Группа Б Группа В р Фактор 2-12 лет 35-55 лет 60 лет Ivs.III 42-48 лет 52-58 лет 60 лет Avs.B n=4 n=14 n=13 n=6 n=10 n= нд** 2,7 2,6 1,4 4,3 6,4 6,3 0, uPA (2,6;

2,9) (2,2;

3,6) (1,0;

3,0) (3,6;

4,9) (5,4;

8,6) (4,1;

7,7) 0,02* нд 0,9 0,3 1,0 1,9 1,8 3, uPAR 0, (0,6;

1,4) (0,3;

1,5) (0,3;

1,9) (1,5;

2,0) (1,1;

2,4) (2,5;

4,9) нд 0,46, p=0, r*** нд 1,9 2,3 3,4 4,3 6,5 11, PAI-1 0, (1,2;

2,7) (1,2;

3,0) (1,7;

5,1) (3,6;

11,6) (3,0;

8,1) (6,7;

20,4) 0,32, p=0,08 0,47, p=0, r нд нд 27,4 16,0 34,3 25,1 37,7 31, ММП (23;

36) (13;

46) (7,4;

64,1) (9,6;

42,4) (30;

66) (18;

50) нд нд 2,9 0,9 1,9 1,8 2,1 4, ММП (1,1;

5,3) (0,2;

5,5) (0,1;

7,3) (0,8;

2,5) (1,4;

2,8) (0,2;

5,9) Примечание. * - уровень значимости различий между группами A и Б;

** - статистически незначимый коэффициент корреляции или недостоверная разница между группами;

*** коэффициент корреляции содержания мРНК гена фактора и возраста пациентов. uPA – урокиназа, uPAR –урокиназный рецептор, PAI-1 – ингибитор активатора плазминогена 1 типа, ММП-2 – металлопротеиназа 2 типа, ММП-9 – металлопротеиназа 9 типа.

Анализ части образцов МСК-ЖТ (n=19) на содержание uPAR на поверхности клеток с помощью проточной цитометрии (Рис. 2) показал, что с возрастом экспрессия этого рецептора на поверхности МСК-ЖТ значимо увеличивается (r= 0,65, p=0,01;

n=19).

2.

Рисунок Увеличение экспрессии урокиназного рецептора на поверхности МСК-ЖТ у пожилых пациентов. Уровень экспрессии рассчитывали как разницу средней интенсивности флуоресценции при окраске клеток специфическими антителами против uPAR и средней интенсивности флуоресценции при окраске неспецифическими иммуноглобулинами.

Данные приведены в виде медиана (25-й, 75-й процентили). r – коэффициент корреляции экспрессии uPAR с возрастом пациентов.* - р=0,046, **- р=0,039.

Была обнаружена тенденция к увеличению содержания мРНК ММП-2 и ММП-9 в МСК-ЖТ пациентов старшей возрастной группы (Табл. 3). Исследование содержания и активности ММП-2 и ММП-9 в кондиционированной среде от МСК-ЖТ четырех пациентов разного возраста показало, что активные формы ММП-2 и ММП- обнаруживались только в кондиционированной среде от МСК-ЖТ одной пациентки лет, и у нее же было повышено содержание неактивных про-ММП-2 и -9 по сравнению с молодыми пациентами (Рис. 3).

Рисунок 3. Увеличение активности ММП-2 и ММП-9 в кондиционированной среде от МСК-ЖТ, оцененное с помощью прямой желатиновой зимографии с предварительным вертикаль ным электрофорезом. А – ребенок К., 2,5 года;

Б – пациент П., 52 года;

В – пациентка Д., 73 года.

Таким образом, мы обнаружили, что в МСК-ЖТ, полученных от пациентов старшего возраста, происходит активация компонентов системы внеклеточного протеолиза, что связано, возможно, с участием этих клеток в процессах ремоделирования внеклеточного матрикса, происходящих при старении [Wang, 2010].

Так, активация с возрастом ММП-2, необходимой для деградации коллагена [Moses, 1997], может происходить в ответ на накопление коллагена во внеклеточном пространстве [Eto, 2008;

Wang, 2010]. Повышение экспрессии TGF при старении стимулирует экспрессию NADPH-оксидазы Nox4 и продукцию АФК, что может привести к увеличению продукции PAI-1 [Liu, 2010].

Влияние возраста на ангиогенные свойства МСК-ЖТ мышей. При анализе ангиогенных свойств МСК-ЖТ пациентов разного возраста и с различными патологиями необходимо отметить, что подбор хорошо сопоставимых друг с другом групп больных, различающихся только по возрасту, вызывает серьезные затруднения. В связи с этим, часть экспериментов была проведена на мышах. Мы подобрали группы животных, примерно соответствующие по возрасту детям (возраст мышей 1-2 мес., МСК-ЖТмол), людям 30-50 лет (возраст мышей 12 мес.), людям 50-70 лет (возраст мышей 18 мес., МСК-ЖТстар) и людям старше 70 лет (возраст мышей 24 мес.) [Austad, 1997].

Мы обнаружили, что в МСК-ЖТ старых животных наблюдаются признаки, характерные для стареющих клеток [Sethe, 2006;

Stolzing, 2008;

Dasgupta, 2010;

Flores, 2010;

Wang, 2010]. Так, в МСК-ЖТстар по сравнению с МСК-ЖТмол в 3 раза были укорочены теломеры (р0,001), в 3 раза снижена скорость пролиферации клеток (р0,05), в 3 раза увеличена доля апоптозных клеток в популяции (р0,001), в 4 раза повышена продукция АФК (р0,001) и на 30% снижена экспрессия глутатион пероксидазы, одного из компонентов антиоксидантной защиты клеток (p0,05). Кроме того, активность ALP, отражающая уровень остеогенной дифференцировки клеток после культивирования в остеоиндуктивной среде роста, была выше в МСК-ЖТ старых животных по сравнению с молодыми (р0,05).

На модели образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле in vitro мы показали, что кондиционированная среда от МСК-ЖТ старых мышей (возраст 18 мес.) стимулировала формирование тубулярных структур достоверно менее выражено, чем среда от клеток молодых животных (возраст 1-2 мес.) (21052± отн.ед. vs. 22781±412 отн.ед., соответственно, p = 0,01).

Для оценки ангиогенного потенциала МСК-ЖТ, полученных от молодых (1-2 мес.) и старых (18 мес.) животных, in vivo мы имплантировали подкожно мышам Матригель, содержащий эти клетки. С помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания срезов Матригеля антителами против маркеров эндотелия сосудов CD31 и перицитов NG2 было установлено, что МСК-ЖТ старых животных в среднем в полтора раза слабее стимулировали васкуляризацию имплантатов, чем МСК-ЖТ молодых мышей, хотя различия не достигали статистической значимости (средняя плотность всех сосудов 47, (41,2;

49,9) vs. 69,0 (60,0;

73,6), соответственно, p=0,09;

средняя плотность капилляров 36,2 (31,9;

36,2) vs. 59,0 (54,3;

62,6), соответственно, р=0,06).

Реализация ангиогенного потенциала стволовых и прогениторных клеток после трансплантации во многом определяется микроокружением, в которое попадают клетки, и состоянием организма-реципиента. Для того чтобы оценить, зависит ли эффект стимуляции роста кровеносных сосудов с помощью МСК-ЖТ от возраста реципиента, мы сравнили васкуляризацию имплантатов Матригеля, содержащих МСК-ЖТ молодых мышей (возраст 1-2 мес.), введенных мышам разного возраста. Оказалось, что клетки молодых мышей слабее стимулировали прорастание кровеносных сосудов в имплантат у старых мышей, чем у молодых (средняя плотность сосудов 69,0 (60,0;

73,6) vs. 80,1 (75,9;

82,0), соответственно, p=0,09;

средняя плотность капилляров 59,0 (54,3;

62,6) vs. 72, (67,5;

78,8), соответственно, р=0,048).

Для выявления механизма ослабления ангиогенной активности МСК-ЖТ с возрастом, мы проанализировали в клетках экспрессию генов факторов, регулирующих ангиогенез, и обнаружили, что в МСК-ЖТ старых мышей происходит снижение содержания мРНК VEGF и PlGF и повышение - HGF, TGF1 и TBS1, а также компонентов внеклеточного протеолиза (uPAR, ММП-2 и 9, PAI-1) (Табл. 4), что соответствует данным, полученным на МСК-ЖТ человека.

Таблица 4. Содержание мРНК генов факторов, регулирующих ангиогенез, в МСК-ЖТ мыши (отн.ед.), оцененное с помощью ПЦР в реальном времени.

1-2 мес. 12 мес. 18 мес. 24 мес.

Возраст n=16 n=6 n=9 n= мышей 3,45 1,98* 1,65* 1,47* VEGF (2,83;

4,08) (2,17;

1,80) (2,30;

1,01) (1,83;

1,10) 8,64 4,20* 1,25*# 2,03*# PlGF (5,90;

11,4) (4,10;

4,30) (1,05;

1,46) (1,37;

2,70) 5,61 15,17* 14,18* 14,18* HGF (3,71;

7,50) (13,57;

16,76) (11,51;

16,64) (5,25;

23,10) 2,63 0,92* 1,38 2, TGF (2,24;

3,02) (0,80;

1,10) (1,13;

1,62) (1,16;

4,10) 7,88 4,51 17,6*# 4, TBS (6,10;

9,67) (2,13;

6,88) (13,3;

21,90) (2,91;

5,16) 3,37 0,75 1,16 9, ENDS (1,73;

5,01) (0,64;

0,86) (0,87;

1,44) (2,1;

17,0) 15,10 3,47* 33,7*# 42,1*# PAI- (12,60;

17,70) (2,26;

4,68) (27,2;

40,2) (24,1;

60,2) 10,82 0,82* 7,12 4, uPA (6,88;

14,76) (0,53;

1,12) (5,93;

8,31) (1,18;

6,97) 2,77 0,67* 5,91*# 4,04*# uPAR (2,15;

3,40) (0,58;

0,75) (5,69;

6,14) (2,91;

5,16) 3,64 3,26 9,65*# 0,79* ММП- (2,68;

4,59) (2,28;

4,24) (7,48;

11,71) (0,23;

1,36) 1,21 1,80 6,36*# 0, ММП- (0,87;

1,55) (1,53;

2,08) (5,28;

7,43) (0,57;

1,88) Примечание. * - статистически значимые различия с группой молодых мышей (возраст 1-2 мес.), p0,05;

# - статистически значимые различия с группой мышей в возрасте 12 мес., p0,05. TGF – трансформирующий фактор роста бета.

Полученные на клетках мышей данные подтвердили вклад возрастного фактора в ухудшение ангиогенных свойств МСК-ЖТ. С возрастом в МСК-ЖТ накапливаются маркеры клеточного старения, снижается продукция ангиогенных факторов и увеличивается активность системы компонентов внеклеточного протеолиза. По видимому, МСК-ЖТ пожилых доноров приобретают ассоциированный со старением секреторный фенотип, описанный для стареющих фибробластов [Coppe, 2008] и гладкомышечных клеток сосудов [Wang, 2010], к признакам которого относятся повышение продукции провоспалительных цитокинов, ангиопоэтина-2, TGF1, PAI-1, ММП-2, укорочение теломер, накопление АФК, увеличение экспрессии ингибиторов клеточного цикла (p16, p21, p53) и др. Полученные нами данные позволяют добавить к этим признакам снижение продукции ангиогенных факторов роста (VEGF, PlGF, HGF, ангиогенина, ангиопоэтина-1).

Влияние кратковременной гипоксии на ангиогенные свойства МСК-ЖТ при старении. Гипоксия является мощным стимулятором роста кровеносных сосудов.

Культивирование клеток при низком содержании кислорода (1%) является одним из способов стимуляции ангиогенных свойств МСК-ЖТ ex vivo [Rehman, 2004;

Thangarajah, 2008;

Rubina, 2009;

Калинина, 2009], поэтому в нашей работе МСК-ЖТ, полученные от молодых и старых доноров, были культивированы как в стандартных, так и гипоксических условиях.

Используя микрочипы (Illumina), мы проанализировали транскриптом МСК-ЖТ человека (n=5), культивированных при стандартном (нормоксия) или пониженном (гипоксия) содержании кислорода и обнаружили, что в гипоксических условиях преимущественно активировалась экспрессия генов, отвечающих за клеточный метаболизм, передачу внутриклеточных сигналов, межклеточные взаимодействия, а также генов факторов роста и хемокинов, что хорошо соотносится с данными Буравковой и соавт. (2011).

Среди всех проанализированных генов с помощью базы данных GeneOntology были выделены 240 генов, принимающих участие в процессе ангиогенеза (гены про- и антиангиогенных факторов роста и их рецепторов, факторов, опосредующих инвазию и миграцию клеток в процессе ветвления и созревания сосудистой сети, участвующих в ремоделировании внеклеточного матрикса и др.). Анализ этих групп генов показал, что большая часть генов, экспрессия которых в МСК-ЖТ повышается при гипоксии, относится к факторам, стимулирующим ангиогенез (31 ген, например, VEGF, ангиогенин, uPAR), а меньшая - к ингибиторам ангиогенеза (8 генов, например, фактор морфогенеза кости (BMP4), гистоновая ацетилаза-5 (HDAC5)).

Влияние гипоксии на способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов in vivo мы оценивали на модели васкуляризации подкожных имплантататов Матригеля. С помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания срезов Матригеля было установлено, что МСК-ЖТ, культивированные в условиях гипоксии, сильнее стимулировали васкуляризацию, чем клетки, культивированные в стандартных условиях (плотность сосудов 150,8 (143,6;

169,5) и 80,1 (75,9;

82,0), соответственно, p=0,06). Различия в эффекте МСК-ЖТ, культивированных в гипоксических или стандартных условиях, наблюдались для капилляров (средняя плотность 143,3 (136,1;

160,0) и 72,3 (67,5;

78,8), p=0,05), сосудов среднего калибра (средняя плотность 5,3 (5,1;

5,6) и 3,0 (2,9;

3,5), p=0,002) и зрелых сосудов (средняя плотность 2,3 (2,1;

2,4) и 0,8 (0,6;

1,0), p=0,026) (Рис. 4). Это позволяет предполагать, что МСК-ЖТ, культивированные в условиях гипоксии, не только лучше стимулируют рост сосудов, чем клетки, культивированные в стандартных условиях, но и способствуют стабилизации новообразованных сосудов и формированию в имплантатах зрелых сосудов.

Рисунок 4. Гипоксия усиливает способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов. Выявление эндотелия и перицитов с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания замороженных срезов Матригеля антителами против CD31 (зеленая флуоресценция) и антигена NG2 (красная флуоресценция), увеличение х20 (А, Б) или х40 (В, Г).

Ядра клеток окрашены DAPI (синяя флуоресценция). А, В – Матригель, содержащий МСК-ЖТ, культивированные в стандартных условиях;

Б, Г - Матригель, содержащий МСК-ЖТ, культивированные в гипоксических условиях. Капилляры указаны одинарными стрелками, сосуды среднего калибра – двойными стрелками, крупные сосуды – острием стрелки.

Гипоксия стимулировала экспрессию генов проангиогенных факторов (VEGF, PlGF, HGF) в МСК-ЖТ, причем ответ клеток зависел от возраста доноров (Рис. 5). Экспрессия генов урокиназы и ММП-2 и -9 снижалась при культивировании МСК-ЖТ в гипоксических условиях, а экспрессия uPAR повышалась в МСК-ЖТ самых молодых мышей и слабо менялась в других группах. Содержание мРНК ингибиторов ангиогенеза снижалось при гипоксии во всех возрастных группах.

Таким образом, мы показали, что в условиях гипоксии в МСК-ЖТ изменяется баланс экспрессии генов факторов, подавляющих и активирующих ангиогенез, в пользу последних, что обусловливает повышение способности этих клеток стимулировать рост кровеносных сосудов, а также стабилизировать новообразованные сосуды. Усиление экспрессии генов ангиогенных факторов в МСК-ЖТ старых доноров в ответ на гипоксию меньше выражено по сравнению с молодыми животными. Это может быть связано с уменьшением содержания [Rivard, 2000], нарушением стабилизации [Hoenig, 2008] и внутриклеточного транспорта [Ahluwalia, 2010] фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1), при старении.

Рисунок 5. Изменения содержания мРНК проангиогенных факторов роста в МСК-ЖТ в ответ на гипоксию различаются у мышей разных возрастных групп. Данные представлены в виде среднее±SEM. * - р0,05.

В то же время мы обнаружили, что кондиционированная среда, полученная от МСК-ЖТ, культивированных в условиях гипоксии, стимулировала образование эндотелиальными клетками капилляроподобных структур в одинаковой степени для клеток старых и молодых животных (13±3% vs. 11±4%, соответственно, p=0,49). Это позволяет предлагать гипоксическое прекондиционирование для стимуляции ангиогенных свойств МСК-ЖТ пожилых пациентов.

ВЫВОДЫ 1. МСК-ЖТ, полученные от пациентов разного возраста, не различаются по морфологии и иммунофенотипу, способности к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях и пролиферативной активности, однако доля активно делящихся клеток и средняя длина теломер в МСК-ЖТ уменьшаются с возрастом пациентов, что особенно выражено у больных ИБС и может свидетельствовать об ускоренном клеточном старении при данном заболевании.

2. Секреция VEGF, PlGF, HGF, ангиопоэтина-1 и ангиогенина, а также ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ снижаются с возрастом, как у пациентов без кардиологических заболеваний, так и у больных ИБС, что сопровождается снижением содержания мРНК PlGF и HGF, но не других ангиогенных факторов. Блокирование VEGF в кондиционированной среде приводит к подавлению ангиогенной активности суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ в среднем на 57%, и степень подавления тем меньше, чем короче теломеры в клетках.

3. В МСК-ЖТ пациентов в возрасте старше 60 лет, особенно в группе кардиологических больных, происходит активация системы компонентов внеклеточного протеолиза (повышение содержания мРНК урокиназы, урокиназного рецептора и PAI-1, увеличение экспрессии урокиназного рецептора на поверхности клеток, а также содержания и активности матриксных металлопротеиназ 2 и 9 типов).

В МСК-ЖТ старых мышей наблюдаются признаки, характерные для стареющих 4.

клеток: укорочение теломер, снижение скорости пролиферации, увеличение доли апоптотических клеток, усиление оксидативного повреждения, а также повышается их способность к остеогенной дифференцировке.

Способность МСК-ЖТ стимулировать ангиогенез in vitro и in vivo снижается с 5.

возрастом.

В МСК-ЖТ старых мышей происходит снижение экспрессии генов VEGF и PlGF и 6.

повышение HGF, TGF1 и TBS1, а также генов некоторых компонентов внеклеточного протеолиза (uPAR, ММП-2 и 9, PAI-1).

Гипоксия повышает экспрессию генов ангиогенных факторов, подавляет экспрессию 7.

ингибиторов ангиогенеза в МСК-ЖТ и усиливает способность этих клеток, как молодых, так и старых животных, стимулировать рост кровеносных сосудов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах:

1. Rubina K.A., Kalinina N.I., Efimenko A.Y., Lopatina T.V., Melikhova V.A., Tsokolaeva Z.N., Sysoeva V.Y., Tkachuk V.A., Parfyonova Yе.V. Adipose Stromal Cells Stimulate Angiogenesis via Promoting Progenitor Cell Differentiation, Secretion of Angiogenic Factors, and Enhancing Vessel Maturation. Tissue Eng Part A. 2009;

15(8):2039-50.

2. Efimenko A. Yu., Starostina E. E., Rubina K. A., Kalinina N. I., Parfenova E. V. Viability and Angiogenic Activity of Mesenchymal Stromal Cells from Adipose Tissue and Bone Marrow under Hypoxia and Inflammation in vitro. Cell and Tissue Biology. 2010;

4;

2: 117–127.

3. Efimenko A., Starostina E., Kalinina N, Stolzing A. Angiogenic properties of aged adipose derived mesenchymal stem cells after hypoxic conditioning. Journal of Translational Medicine. 2011;

9(1):10-22.

4. Ефименко А.Ю., Калинина Н.И., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Жизнеспособность мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани и костного мозга и изменения их экспрессионного профиля при культивировании в условиях гипоксии и действия воспалительных факторов. Вестник молодых ученых «Ломоносов» выпуск IV. М.: изд.

А.В.Воробьев, СП Мысль, 2007. – С. 359-363.

5. Калинина Н.И., Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Гипоксия как основной активатор ангиогенеза и роста жировой ткани. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2009;

95(3):283-9.

6. Рубина К.А., Калинина Н.И., Ефименко А.Ю., Лопатина Т.В., Мелихова В.А., Цоколаева З.И., Сысоева В.Ю., Ткачук В.А., Парфенова Е.В. Механизм стимуляции ангиогенеза в ишемизированном миокарде с помощью стромальных клеток жировой ткани. Кардиология.

2010;

50(2): 51-61.

7. Кочегура Т.Н., Ефименко А.Ю., Акопян Ж.А., Парфенова Е.В. Клеточная терапия сердечной недостаточности: клинический опыт, проблемы и перспективы. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010;

5(2): 11-18.

8. Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Рубина К.А., Калинина Н.И., Парфенова Е.В. Влияние гипоксии и воспалительных факторов на жизнеспособность и ангиогенную активность мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани и костного мозга. Цитология. 2010;

52(2): 144-154.

Тезисы конференций:

1. Ефименко А.Ю., Калинина Н.И., Парфенова Е.В., Ткачук В.А.Функциональная активность стромальных клеток-предшественников из жировой ткани и костного мозга в условиях гипоксии и воспаления in vitro. Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов". Москва, 12-15 апреля 2007 г. С. 187.

2. Efimenko A., Kalinina N., Parfyonova E., Tkachuk V. Functional activity of adipose- and bone marrow derived mesenchymal stromal cells under hypoxia and inflammation in vitro. Сборник тезисов 32 Международного FEBS Конгресса, Вена, Австрия, 7-12 июля 2007 г. С. 39.

3. Ефименко А.Ю., Калинина Н.И., Старостина Е.Е., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Влияние гипоксии на ангиогенную активность стромальных клеток-предшественников жировой ткани и костного мозга. Сборник тезисов конференции «Молодые ученые в медицине-2008», Казань, 23-26 апреля 2008 г. С. 203.

4. Efimenko A.Yu., Kalinina N.I., Parfyonova E.V., Tkachuk V.A. Angiogenic activity of mouse mesenchymal stromal cells is stimulated by hypoxia in vitro and in vivo. Сборник тезисов международного форума аспирантов Тихоокеанского региона, Омаха, США, 2-6 июня 2008 г. С.25.

5. Ефименко А.Ю., Калинина Н.И., Старостина Е.Е., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Влияние возраста на ангиогенную активность стромальных клеток-предшественников из жировой ткани. Сборник тезисов всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», Москва, 9-11 июня 2008 г. С. 38.

6. Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Калинина Н.И. Влияние возраста на ангиогенные свойства стромальных клеток-предшественников жировой ткани. Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы медицинской науки», Ярославль, 21-23 апреля 2010 г. С. 23.

7. Efimenko A., Starostina E., Kalinina N., Stolzing A. Angiogenic properties of aged adipose derived mesenchymal stem cells after hypoxic conditioning. Сборник тезисов 8-ой ежегодной международной конференции ISSCR, Сан-Франциско, США, 16-19 июня 2010 г. С. 183.

8. Starostina EE, Efimenko AYu, Kalinina NI, Parfenova EV, Tkachuk VA. Ageing inhibits proliferation, viability and angiogenic potential of adipose-derived stem cells. Сборник тезисов международной конференции Biology of Aging;

Determinants of Health-Span: From Cells to Humans, Gordon Research Conference, Лес Диаблеретс, Швейцария, 22-27 авг. 2010 г. С. 39.

9. Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Калинина Н.И., Парфенова Е.В. Изменение функциональных свойств мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани при старении.

Сборник тезисов Всероссийской школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина», Москва, 25-28 октября 2010 г. С. 26.

10. A.Yu. Efimenko, E.E. Starostina, N.I. Kalinina, E.V. Parfyonova, A. Stolzing. Angiogenic properties of aged adipose derived mesenchymal stem cells after hypoxic conditioning. Сборник тезисов международной конференции Angiogenesis 2011, Амстердам, Голландия, 2-4 марта 2011 г. С. 92.

11. Efimenko A.Yu., Dzhoyashvili N.A., Starostina E.E., Kalinina N.I., Parfyonova E.V. Age dependent impairment of human adipose-derived mesenchymal stem cells angiogenic properties.

Histology and Histopathology. 2011;

26(1): 14.

АННОТАЦИЯ Ефименко Анастасия Юрьевна «Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани» Целью работы была оценка влияния возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани (МСК-ЖТ). В работе проведено подробное исследование морфофункциональных характеристик МСК, выделенных из жировой ткани пациентов разного возраста с ишемической болезнью сердца (ИБС) и без нее. Охарактеризованы морфология, иммунофенотип, дифференцировочный потенциал, пролиферативная активность, накопление маркеров клеточного старения, а также ангиогенные свойства МСК-ЖТ, культивированных до пассажа. Показано, что при старении секреция МСК-ЖТ таких важнейших проангиогенных факторов, как VEGF, PlGF, HGF, ангиопоэтин-1 и ангиогенин, снижается. Обнаружено, что ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ снижается с возрастом пациентов, при этом вклад VEGF в реализацию способности МСК-ЖТ стимулировать образование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками уменьшается при старении. Показано, что в МСК-ЖТ, полученных от пациентов в возрасте старше 60 лет, происходит активация системы урокиназы и матриксных металлопротеиназ.

Вклад возрастного фактора в изменение ангиогенных свойств МСК-ЖТ при старении был подтвержден на клетках мышей. Показано, что при введении МСК-ЖТ in vivo в составе подкожного имплантата Матригеля степень васкуляризации имплантата зависит как от возраста донора клеток, так и от возраста реципиента.

Изучено влияние культивирования МСК-ЖТ в гипоксических условиях (1% кислорода, часов) на ангиогенные свойства клеток. Показано, что в условиях гипоксии в МСК-ЖТ изменяется баланс экспрессии генов факторов, подавляющих и активирующих ангиогенез, в пользу последних, что обусловливает повышение способности этих клеток стимулировать рост кровеносных сосудов, а также стабилизировать новообразованные сосуды. Исследованы особенности ответа МСК-ЖТ на гипоксию в зависимости от возраста доноров.

Anastasia Yu. Efimenko “Influence of aging on angiogenic properties of adipose-derived mesenchymal stem cells” The aim of the work was to evaluate the influence of donor age on angiogenic properties of adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC). We performed a detailed study of morphological and functional characteristics of ADSC isolated from adipose tissue of patients of different ages with ischemic heart disease (CHD) and without it. Morphology, immunophenotype, differentiating potential, proliferative activity, accumulation of cellular aging markers and angiogenic properties of ADSC cultured up to 2 passages were characterized. It was shown that secretion of such important proangiogenic factors like VEGF, PlGF, HGF, angiopoetin-1 and angiogenin by ADSC was reduced with age. We found that the angiogenic activity of the summary products of ADSC secretion decreased with age, whereas the contribution of VEGF in the implementation of ADSC conditioned medium ability to stimulate the formation of capillary-like tubes by endothelial cells may also decrease during aging. It was shown that in ADSC obtained from patients aged more than 60 years urokinase and matrix metalloproteinases were activated.

The contribution of the age factor in ADSC angiogenic properties changes during aging was confirmed on mice. It was shown that when ADSC were injected in vivo within subcutaneous Matrigel implants vascularization of implants was depended both on the age of ADSC donor and age of recipient.

The influence of hypoxia (1% oxygen, 48 hours) on angiogenic properties of ADSC was analyzed. We showed that under hypoxic conditions balance between gene expression of pro- and antiangiogenic factors in ADSC changed to more angiogenic expression profile which enhanced the ability of ADSC to stimulate the blood vessels growth and to stabilize newly formed vessels. The features of ADSC response to hypoxia depending on donor age were also investigated.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.