авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Оценка живой реассортантной гриппозной вакцины по индукции в- и т-клеточной иммунологической памяти

На правах рукописи

КОРЕНЬКОВ Даниил Анатольевич ОЦЕНКА ЖИВОЙ РЕАССОРТАНТНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ ПО ИНДУКЦИИ В- И Т-КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ПАМЯТИ 14.00.36 – Аллергология и иммунология 03.00.06 – Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2009 2

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук научно исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Научный консультант: доктор медицинских наук Найхин Анатолий Нойевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Назаров Петр Григорьевич доктор медицинских наук Зазимко Любовь Александровна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «НИИ эпидемиологии и микробиологии им.

Пастера Роспотребнадзора»

Защита диссертации состоится « » _ 2009 года в часов на заседании Диссертационного Совета ДМ 001.022.01 при НИИЭМ СЗО РАМН (197376, Санкт Петербург, ул. Акад. Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН.

Автореферат разослан «» 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Бурова Л.А.

доктор медицинских наук Актуальность проблемы. Грипп, наряду с вирусными гепатитами и ВИЧ инфекцией, является одной из главных вирусологических проблем. Мировой научной общественностью уделяется огромное внимание разработке методов предотвращения именно этих заболеваний. В настоящее время к самым эффективным способам борьбы с гриппом относят вакцинопрофилактику [Global pandemic influenza action plan to increase vaccine supply, WHO Document Production Services, 2006].

Качество противогриппозных вакцин, как и других вакцинных препаратов, оценивают по трем главным критериям: эпидемиологическая эффективность, безвредность и иммуногенность. До сих пор об иммуногенности гриппозных вакцин судят только по их способности стимулировать продукцию сывороточных антигемагглютинирующих антител. В последнее время развернута дискуссия о достаточности такой оценки [Meeting report: FDA/NIH/WHO public workshop on immune correlates of protection against influenza A viruses in support of pandemic vaccine development, Vaccine 26 (2008) 4299–4303].

Принцип вакцинации основан на создании у людей иммунологической памяти к возбудителю инфекции. За счет вакцинации организм при последующей встрече с патогеном отвечает ускоренной и усиленной мобилизацией факторов иммунной защиты. Поэтому совершенно логично, что главная задача вакцинальной иммунологии должна быть связана именно с оценкой препаратов по индукции иммунологической памяти [Медуницин Н.В., 2004;

Welsh R.M. et al, 2004;

Halwani R. et al, 2006]. В последние годы это направление активно развивается за рубежом [Lanzavecchia A., Sallusto F., 2005;

Halwani R. et al, 2006;

Takahashi Y., 2007;

Sanz I.

et al, 2008;

Galli G. et al, 2009]. В России подобные исследования не проводились.

Настоящая работа является первой попыткой комплексной оценки эффективности вакцинации людей по стимуляции В- и Т-клеточной памяти живыми реассортантными вакцинными штаммами, входящими в состав отечественной живой гриппозной вакцины (ЖГВ).

Цель исследования: изучить способность ЖГВ стимулировать В- и Т клеточную иммунологическую память.

Задачи исследования:

1. Разработать методические приемы оценки иммунологической памяти у людей.

2. На материале обследования добровольцев 18 – 20 лет, привитых ЖГВ и не прививавшихся этой вакциной, а также в экспериментальном исследовании in vivo изучить:

локальную В-клеточную память по критерию авидитета секреторных IgA антител к вирусам гриппа;

Т-клеточную память по выявлению общих циркулирующих лимфоцитов с мембранными маркерами CD45RO+;

Т-клеточную иммунологическую память по определению уровней вирусспецифических циркулирующих лимфоцитов.

Научная новизна работы.

1. Впервые осуществлено исследование у людей В-клеточной иммунологической памяти к вирусам гриппа А и В по критерию авидитета локальных IgA-антител, включающее оценку количественных характеристик скорости, интенсивности и прочности образования иммунных комплексов. Показано, что иммунизация ЖГВ повышает эти показатели, т.е. увеличивает продукцию высокоавидных антител в верхнем отделе респираторного тракта.

2. Впервые проведена оценка ЖГВ по индукции у людей общих циркулирующих Т лимфоцитов иммунологической памяти фенотипов CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+. Установлено, что введение ЖГВ вызывает увеличение уровня этих клеток в периферической крови.

3. Разработана модификация метода TRAP (T-cell recognition of antigen presenting cells by protein capture) для количественного определения у людей и животных специфических к вирусу гриппа А Т-клеток иммунологической памяти. С помощью данной методики показано, что вакцинация ЖГВ индуцирует продукцию этих клеток, отраженную в поствакцинальном увеличении их уровня в периферической крови.

4. Впервые осуществлено сравнение активности индукции на локальном уровне (назоассоциированная лимфоидная ткань мышей) вирусспецифических Т-клеток памяти при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации животных живым реассортантным вирусом гриппа. Отмечено, что как при инфекции, так и при вакцинации происходит увеличение уровней вирусоспецифических CD8+CD44hi Т-лимфоцитов памяти в этой лимфоидной ткани.



Практическая значимость работы.

1. Разработан метод количественного измерения в иммуноферментном анализе авидности IgA-антител к вирусам гриппа А и В в секретах верхних дыхательных путей. Метод дает возможность характеризовать эти иммуноглобулины одновременно по трем параметрам: (i) титры антител;

авидность антител с точки зрения (ii) скорости и интенсивности соединения с антигеном, (iii) прочности соединения с антигеном.

2. Разработана модификация TRAP для количественного выявления у людей циркулирующих в крови Т-клеток, специфических к вирусу гриппа А.

3. Эти методы могут быть использованы для оценки индукции В- и Т-клеточной иммунологической памяти у людей, привитых различными гриппозными вакцинами.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Однократная прививка ЖГВ взрослых лиц, уже контактировавших ранее с возбудителями гриппа, вызывает стимуляцию В- и Т-клеточной иммунологической памяти.

2. Даже люди практически одного возраста (18 – 20 лет) весьма гетерогенны по показателям предвакцинального состояния иммунологической памяти к вакцинному штамму вируса гриппа А, входящему в состав ЖГВ.

3. Обнаружена обратная зависимость между предвакцинальными значениями изученных параметров В- и Т-клеточной иммунологической памяти и их поствакцинальными изменениями.

4. Имеются значительные расхождения между данными оценки иммунологических свойств ЖГВ по конверсии титров сывороточных антител в РТГА, с одной стороны, и по тестированию поствакцинальных изменений уровней вирусспецифических Т-клеток памяти, с другой.

Личный вклад автора заключается в непосредственном участии в клинических испытаниях, самостоятельном проведении всех лабораторных исследований, анализе материалов, статистической обработке полученных результатов. Вклад соавторов состоит в помощи при отборе волонтеров, проведения вакцинации и сборе материалов в клинических испытаниях с участием добровольцев, а также в освоении и постановке новых методов исследования (Донина С.А., Григорьева Е.П., Петухова Г.Д., Чиркова Т.В.).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на X Всероссийском Научном Форуме с международным участием им. акад. В.И. Йоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 29 мая – 1 июня 2006 г.);

Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 30 июня – 5 июля 2008 г.);

The Third European Influenza Conference (Vilamoura, Portugal, September 14 – 17, 2008);

Школе-Конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 6 – 10 октября 2008 г.).

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отделов иммунологии и вирусологи НИИЭМ СЗО РАМН «9» апреля 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемых литературных источников. Работа изложена на 135 страницах текста, включающего 20 таблиц и 15 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 175 источников, в том числе 20 отечественных и 155 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. Для воспроизведения экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации использовали линейных мышей CBA/J (самок) в возрасте 8 – 10 недель, полученных из питомника «Рапполово» РАМН.

Модель экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации.

Уровни клеток иммунологической памяти в назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ) мышей изучали на экспериментальной модели, разработанной ранее в отделе вирусологии НИИЭМ СЗО РАМН. Животным вводили следующие вирусы гриппа: (i) патогенный для мышей A/PR/8/34 (H1N1) в дозе 4,0 lg ЭИД50 – моделирование естественной гриппозной инфекции;

(ii) аттенуированный реассортантный вирус A/47/PR/8/34 (H1N1) в дозе 6,0 lg ЭИД50 – моделирование вакцинации ЖГВ;

(iii) инактивированный формалином вирус A/47/PR/8/34 (H1N1) в дозе 10 мкг по гемагглютинину - моделирование вакцинации инактивированной гриппозной вакциной. Реассортант имел 2 гена наружных белков от вируса (i) и 6 генов внутренних белков от вируса гриппа А/Ленинград/134/47/ (H2N2). Вирусы вводились под легким эфирным наркозом, живые – интраназально в объеме 50 мкл (по 25 мкл в каждый носовой ход), а инактивированный – парентерально (внутрибрюшинно) в объеме 200 мкл. В качестве контроля использовались интактные животные. Уровни клеток памяти в НАЛТ определяли на 7 и 60 сутки после введения вирусов.

Волонтеры и вакцинация. Во всех исследованиях участвовали условно здоровые молодые люди 18 – 20 лет, не имевшие противопоказаний к вакцинации ЖГВ. В исследованиях по формированию авидитета секреторных антител было обследовано 109 непривитых волонтеров, 112 лиц, вакцинированных рекомендованными ВОЗ аттенуированными реассортантными штаммами для ЖГВ:

A/17/Соломоновы Острова/06/9 (H1N1) или B/60/Флорида/04/181. 48 лиц получили препарат плацебо (стерильный физиологический раствор). В исследованиях уровней CD45RO+ и CD45RA+ Т-лимфоцитов участвовали 85 непривитых людей, человека, вакцинированных тривалентной коммерческой ЖГВ;

25 лиц составили контрольную группу - плацебо. В состав ЖГВ входили реассортантные штаммы, рекомендованные ВОЗ: А/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) и B/60/Джилин/01/1. Для изучения изменений в уровнях вирусспецифических Т-лимфоцитов памяти обследовано 25 непривитых добровольцев, 20 вакцинированных и 10 получивших препарат плацебо.

Вакцинация проводилась реассортантным штаммом для ЖГВ A/17/Соломоновы Острова/06/9 (H1N1), рекомендованным ВОЗ.

Все вирусы вводили однократно, интраназально, по 0,25 мл в каждый носовой ход. Лицам из группы плацебо таким же способом вводился стерильный физиологический раствор. Медицинский осмотр и забор венозной крови у добровольцев проводили до вакцинации и через 1 месяц после вакцинации. Отбор секретов верхних дыхательных путей осуществляли до и через 21 день после введения препаратов. От каждого волонтёра было получено письменное добровольное информированное согласие об участии в исследовании.

Выделение лимфоцитов НАЛТ. Сепарацию НАЛТ осуществляли по ранее разработанной методике[Asanuma H. et al., 1997]. После цервикальной дислокации у мышей отделяли верхнюю челюсть кзади от глазных яблок и удаляли кожу. Далее выделенную часть черепа освобождали от мозга, мышц и тканей наружного носа вместе с верхними резцами. После сепарации небной пластинки выделяли непосредственно НАЛТ – парные лимфоидные образования по бокам от носовой перегородки. НАЛТ осторожно гомогенизировали с помощью предметных стекол с матовым краем. Приготовление суспензии лимфоцитов осуществляли общепринятым методом [Current Protocols in Immunology, 2003].





Выделение и приготовление суспензии мононуклеаров периферической крови (МПК) людей осуществляли центрифугированием в градиенте плотности Histopaque-1077 традиционным способом [Current Protocols in Immunology, 2003].

Иммуногенность ЖГВ оценивали по уровню антигемагглютинирующих сывороточных антител в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В качестве антигена использовали по 4 гемагглютинирующие единицы вирусов гриппа А или В, входящих в состав вакцины. Перед постановкой РТГА сыворотки инкубировали с RDE (II) (receptor destroying enzyme, “Seiken”, Япония) и прогревали в течении 0, часа при 56С.

IgA-анитела в секретах верхних дыхательных путей (СВДП) определяли в непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА) по ранее разработанной методике [Донина С.А. и др., 1997]. За титр антител принимали последнее разведение образца, оптическая плотность (ОП) которого превышала в 2 и более раза среденее арифметическое значение ОП контрольных лунок (все компоненты кроме образцов СВДП).

Авидность локальных IgA-антител у людей в тесте с мочевиной определяли в ИФА по методике [de Souza V.A. et al., 2003], модифицированной в части, касающейся его адаптации для исследования СВДП. Расчёт индекса авидности (ИА) осуществляли по формуле:

среднее арифметическое ОП в лунках, обработанных мочевиной ИА = ------------------------------------------------------------------------------------ х100, (%) среднее арифметическое ОП в контрольных лунках Авидность локальных IgA-антител у людей в динамическом варианте ИФА проводили по ранее разработанной методике [Найхин А.Н. и др., 1993], основанной на определении скорости и интенсивности образования комплекса антиген-антитело. Индексы авидности (ИА) рассчитывали по формуле:

(Т1:Т0,25)+( Т1:Т0,5)+(T1:T1) ИА = ---------------------------------, где tmax Т1, Т0,5, Т0,25 – обратные величины титров антител соответственно после инкубации СВДП в течение 1 часа, 0,5 часа и 0,25 часа. tmax – время достижения максимального титра, то есть через 1 час или 0,5 часа или 0,25 часа. В случае, когда титры секреторных IgA были меньше 1:8, индексы авидности считали равными 1,0;

при титрах от 1:8 до 1:16 – равными 2,0;

для тиров свыше 1:16, индексы авидности всегда были выше 2,0.

Распределение лимфоцитов по мембранным маркерам. Для определения количества (%) Т-клеток фенотипов CD4+СD45R0+, CD8+СD45R0+ и CD4+СD45RA+, CD8+СD45RA+ использовали моноклональные антитела к этим молекулам («BD Biosciences Pharmigen», CША). Клетки окрашивали по стандартному протоколу, предоставленному производителем в инструкции к антителам. Учёт результатов проводили по данным проточной цитометрии на приборе «COULTER EPICS XL», США.

Вирусспецифические T-клетки в периферической крови людей и мышей определяли с использованием модифицированного метода TRAP (T-cell recognition of antigen presenting cells by protein capture), основанного на опубликованных методиках [Beadling, Slifka, 2006;

Daubeuf et al., 2006]. Схема метода представлена на рис. 4. Для фенотипирования клеток применяли антитела к СD4 человека или к CD8 и CD44 мыши (BD Biosciences Pharmigen, USA). Результаты учитывали по данным проточной цитометрии на приборе «COULTER EPICS ALTRA», США.

Статистические методы. Статистический анализ проводился в программе «МS Excel» c применением непарамертических методов (U-критерий Манна-Уитни, тест Вилкоксона для парных сравнений и коэффициент корреляции по Спирмену).

За уровень статистической значимости была принята p0,05. Средние величины уровней локальных IgA и антигемагглютинирующих антител представлены в виде средних геометрических обратных значений титров (СГТ).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Оценка у людей локальной В-клеточной иммунологической памяти по критерию авидитета секреторных IgA-антител В целом вопрос о формировании иммунологической памяти во входных воротах инфекции носит дискуссионный характер [Ярилин А.А., 1999;

Takahashi Y., 2007;

Sanz I. et al, 2008]. Это относится и к локальным В-клеткам памяти.

Существует несколько методов оценки В-клеточной памяти: (i) по количественному определению в ELISPOT плазматических клеток, секретирующих антитела различных изотипов;

(ii) по тестированию в проточной цитометрии уровней В клеток, несущих мембранные маркеры памяти CD27, CD38, IgD–, Bcl-2;

(iii) по повышению авидности продуцируемых антител при повторных контактах организма с возбудителем. Нами был выбран последний метод, поскольку, во первых, он более прост, во-вторых, отражает функциональное состояние В клеточной памяти, в-третьих, не требует выделения клеток. Кроме того, сведения об авидитете локальных антител в литературе отсутствовали.

Адаптированы два метода количественной оценки в ИФА авидности локальных антител к вирусам гриппа А и В, ранее применявшиеся только для изучения авидитета сывороточных иммуноглобулинов [Найхин A.H. и др, 1995;

Souza V. et al, 1997;

Paunio M. et al, 2003] – динамический тест и тест с мочевиной.

Эти тесты неравнозначны по своей сути, поскольку первый измеряет авидитет с позиции скорости реагирования антитела с антигеном (время достижения максимального титра) и интенсивности иммунной реакции (частное от деления максимального титра на минимальный), тогда как второй в большей мере оценивает авидитет с точки зрения прочности соединения антигена с антителом на основании количественных данных о разрыве слабоавидных связей под действием мочевины.

Обследование 109 условно здоровых лиц 18 – 20 лет, ранее не прививавшихся ЖГВ, показало наличие широкого диапазона индивидуальных показателей авидности локальных IgA-антител. Так, по данным теста с мочевиной и динамического теста, значения индексов авидности этих антител колебались соответственно от 33 до 96% и от 1 до 23. Полученные результаты позволили произвести разделение добровольцев на три группы: с низким авидитетом антител (индексы авидности в тесте с мочевиной от 33 до 60% и в динамическом тест от 1 до 3), средним (индексы авидности соответственно от 61 до 80% и от 4 до 7) и высоким (индексы авидности соответственно от 81 до 96 % и от 8 до 23).

Далее на материале обследования тех же лиц был проанализирован вопрос о связи между титрами и индексами авидности секреторных IgA-антител.

Актуальность такого анализа заключалась в том, что в случае наличия полного совпадения этих показателей, необходимость оценки антител по ИА отпадает, поскольку о нем можно будет судить по величине титров.

Оказалось, что у части людей (до 50%) наблюдались расхождения в этих данных, то есть наличие у волонтеров локальных IgA-антител с высокими индексами авидности при низких титрах и, наоборот, c низкими индексами при высоких титрах. Кроме того, коэффициент корреляции между показателями теста с мочевиной и динамического теста, с одной стороны, и титрами антител, с другой, не был статистически значимым (0,22 и 0,47 соотвественно, p0,05).

Обобщая результаты этой части работы, можно отметить, что проведенное обследование непрививавшихся ЖГВ людей позволило, во-первых, убедиться в хорошей воспроизводимости двух использованных методов оценки авидности IgA в СВДП, во-вторых, выбрать конкретные параметры такой оценки.

На следующем этапе методы были апробированы на материале обследования добровольцев, иммунизированных вакцинными штаммами вирусов гриппа А (H1N1) и В.

При разработке любого иммунологического метода важно установить, происходит ли изменение его показателей под влиянием антигенного стимула. Это, с одной стороны, является проверкой специфичности теста, а с другой – дает представление о действии препарата с точки зрения его способности индуцировать изучаемые факторы иммунитета. Сказанное в полной мере относится и к авидности антител.

После прививки волонтеров вакцинными штаммами для ЖГВ средние геометрические титры локальных IgA к вирусам гриппа А (H1N1) и В увеличились соответственно в 2,3 (p0,001) и 2,1 (p0,01) раза, а доля лиц, давших достоверный прирост этих антител, составила соответственно 50 и 39%. В группе лиц, получивших препарат плацебо, эти показатели не превышали 3,7% (1 человек).

Таким образом, штаммы обладали достаточной иммуногенностью в отношении индукции локального гуморального иммунного ответа.

Далее мы проследили характер изменений индексов авидности секреторных IgA в до- и поствакцинационный периоды у трех групп волонтеров: (i) у привитых с наличием достоверного прироста в ИФА локальных антител;

(ii) у привитых с отсутствием такого прироста и (iii) у получивших препарат плацебо (рис. 1).

Тест с мочевиной Динамический тест % % 40 64,3 64,3 64, 35, 32, 52, 28, 42,9 42, 19, 9, 3, ИФА(+) Плацебо ИФА(–) Плацебо ИФА(+) ИФА(–) Рисунок 1. Авидность локальных IgA-антител к вирусу гриппа А (H1N1) у привитых ЖГВ добровольцев в зависимости от наличия или отсутствия локального иммунного ответа на вакцинацию. По оси абсцисс: ИФА(+) – лица, давшие после вакцинации достоверный прирост титров IgA-антител в секретах верхних дыхательных путей (n=28);

ИФА(–) – лица, не давшие такого прироста(n=28);

плацебо – лица, получившие препарат плацебо(n=21). По оси ординат: процент лиц, с высокими показателями авидности антител (для теста с мочевиной – индексы авидности 81 – 96%, для динамического теста – индексы авидности 8 – 23). – до вакцинации;

– после вакцинации.

После иммунизации среди вакцинированных волонтеров с наличием достоверной конверсии секреторных IgA-антител, доля лиц с высокими показателями индексов авидности к вирусу гриппа А (H1N1), по данным теста с мочевиной и динамического теста, увеличилась соответственно в 8,9 (р0,001) и в 1,5 раза (р0,05). У привитых людей без достоверного накопления IgA-антител эти показатели либо изменились очень незначительно (p0,05), либо не изменились вообще, а у добровольцев, получивших препарат плацебо они даже снизились.

Результаты, полученные при изучении авидности секреторных IgA-антител к вирусу гриппа В, значительно не отличались.

Таким образом, после прививки ЖГВ количественное накопление антител в секретах верхних дыхательных путей сопровождалось увеличением их авидности.

Выраженность этого увеличения зависила от количественных характеристик авидитета, на фоне которых осуществлялась прививка.

При измерении индивидуальной авидности антител у конкретного вакцинируемого человека важно зафиксировать не только изменения данного показателя после вакцинации, но и установить величины достоверности такого изменения, так как нельзя исключить, что в каких-то пределах значения индексов авидности антител могут быть подвержены не связанным с вакцинацией неспецифическим колебаниям в промежуток между отбором проб. Результаты такого анализа для обоих тестов представлены в таблице 1. При выработке этих критериев опирались на наиболее надежный биологический принцип достоверности – отсутствие увеличения измеряемого признака в контрольной группе, то есть группе, получавшей препарат плацебо.

Таблица Диапазон изменения авидности локальных IgA-антител к вирусам гриппа А (H1N1) и В у привитых людей Число и доля (%) лиц с измененными индексами авидности антител Вирус Число Тест с мочевиной Динамический тест Группа гриппа лиц Сниже Увеличение на Сниже- Увеличение в -ние ние 1 – 15% 16 – 24% 25% 1,0 – 1,4 1,5 – 4,2 2, 4 16 4 9 7 1 ИФА(+)* А 14,3% 57,1% 14,3% 32,1% 17,9% 25,0% 3,5% 35,7% (H1N1) 12 9 6 11 Плацебо* 21 0 0 57,1% 42,9% 28,6% 52,4% 19,0% 5 6 4 10 2 9 ИФА(+) 22,7% 27,3% 18,2% 45,4% 31,8% 9,1% 40,9% 4,5% B 14 13 9 12 Плацебо 27 0 0 51,9% 48,1% 33,3% 44,4% 22,2% ИФА(+) – лица, давшие достоверный прирост титров IgA-антител в СВДП после вакцинации;

Плацебо – лица, получившие препарат плацебо.

По данным теста с мочевиной, достоверный показатель находился в пределах поствакцинального увеличения индексов авидности антител к вирусам гриппа А и В на более чем 15%, а по данным динамического теста – в 2,5 и более раза.

Обращает на себя внимание тот факт, что доля лиц в контрольных группах со снижением показателей авидности антител в период между отборами секретов оказалась в 4,1 (вирус гриппа А, р0,001) и в 2,7 (вирус гриппа В, р0,01) раза выше, по сравнению с аналогичными показателями в группе привитых по данным теста с мочевиной. Это косвенно свидетельствует, что вакцинация не только увеличивает авидитет секреторных IgA, но тормозит скорость снижения данного покзателя, то есть влияет на длительность сохранения высокоавидных иммуноглобулинов.

При анализе вопроса о широте информации, получаемой в обоих тестах измерения авидности локальных IgA-антител, оказалось, что из иммунизированных лиц, у 21 волонтера (38%) было зафиксировано достоверное возрастание индексов авидности антител в одном сравниваемом тесте без констатации такого возрастания в другом.

Таким образом, по уровню информации о поствакцинальных сдвигах в авидности антител тест с мочевиной и динамический тест полностью не «перекрывали» друг друга.

Ранее отмечено существование обратной зависимости между исходными показателями авидитета циркулирующих сывороточных антител перед противогриппозной вакцинацией и выраженностью последующих изменений этого показателя в поствакцинальный период [Найхин A.H. и др, 1995]. Точно такая же зависимость наблюдалась и в отношении авидности секреторных IgA-антител. Так, по данным динамического теста, у привитых добровольцев с зафиксированным достоверным приростом авидности этих антител на прививку, средние значения их индексов авидности перед введением вакцинных штаммов составили 1,8 (вирус гриппа А) и 2,0 (вирус гриппа В), тогда как у лиц, которые не ответили достоверным увеличением индексов авидности на иммунизацию, этот показатель был намного выше – соответственно 8,7 и 8,2 (p0,01). Аналогичная, но менее выраженная зависимость отмечена и по результатам теста с мочевиной. Проведенный статистический анализ индивидуальных данных показал наличие обратной корреляционной зависимости поствакцинальных уровней авидности этих антител от их исходных значений (коэфициенты корреляции между исходными значениями и кратностями их изменения для динамического теста и теста с мочевиной составили соотвественно -0,63 и -0,48 при р0,05).

Таким образом, успешность постакцинального повышения авидитета секреторных IgA-антител зависела от фоновых предвакцинальных уровней авидности этих иммуноглобулинов.

В целом проведенные исследования с теоретических позиций показали способность живых реассортантных штаммов вируса гриппа А и В увеличивать у взрослых праймированных людей авидитет IgA-антител в верхнем отделе дыхательного тракта (входные ворота инфекции), а с точки зрения практики – разработать простые и доступные методы измерения авидности этих антител.

Оценка у людей Т-клеточной иммунологической памяти по выявлению в крови общих Т-лимфоцитов с мембранным фенотипом CD45RO+ Полноценность развития у людей поствакцинального иммунного ответа к возбудителям инфекций зависит от способности вакцинных штаммов индуцировать не только В-клеточную, но и Т-клеточную иммунологическую память.

Американскими авторами оценена иммуногенная активность инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ) по индукции у людей циркулирующих общих CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+ Т-клеток памяти [McElhaney J.E. et al, 1995]. Цель настоящего раздела работы заключалась в анализе данного вопроса в отношении ЖГВ. Ранее подобные исследования не проводились.

На примере вакцинации ЖГВ была предпринята попытка получить ответ на главный вопрос: происходит ли при интраназальном введении взрослым людям аттенуированного реассортантного вируса гриппа изменение уровня этих клеток памяти в периферической крови, и, если да, то какова количественная характеристика такого изменения.

На сегодняшний день отсутствуют общепринятые нормы содержания CD4 CD45RO+, CD8+CD45RO+ Т-клеток в периферической крови. Поэтому были + изучены их количественные показатели у условно здоровых людей 18 – 20 лет, ранее не прививавшихся ЖГВ.

При подсчете от общего числа подвергшихся цитометрическому анализу лимфоцитов доля CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+-лимфоцитов колебалась соответственно от 7 до 17% и от 2 до 11%. При этом наибольшие значения превышали наименьшие в 2,3 – 5,5 раза (p0,01 и 0,001).

Таким образом, отмечено наличие значительных колебаний индивидуальных уровней изученных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови молодых людей.

Далее были прослежены изменения уровня этих же клеток памяти у лиц того же возраста после вакцинации ЖГВ (рис. 2).

РТГА + РТГА – Плацебо 2, CD4+CD45RO+ 2, 1, 1, 0, 0, 3, CD8+CD45RO+ 3, 2, 2, 1, 1, 0, 0, Рисунок 2. Индивидуальные показатели кратности изменения уровней (%) CD45RО+-лимфоцитов в периферической крови вакцинированных ЖГВ людей 18 – 20 лет. Столбик – величина кратности изменения у конкретного волонтёра. Кратность изменения – частное от деления поствакцинального уровня (%) на предвакцинальный. Значения: 1,0 – кратность прироста, 1,0 – кратность снижения, 1,0 –без изменения. РТГА(+) – лица с конверсиями сывороточных антител после вакцинации;

РТГА(–) – лица с отсутствием конверсий этих антител после вакцинации. Пунктирной линией обозначены границы достоверности кратности изменения уровней клеток.

Средняя кратность увеличения уровня CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+ лимфоцитов оказалась самой высокой у волонтеров с поствакцинальной конверсией сывороточных антител в РТГА (в 1,6 и 1,9 раза соотвественно, p0,01). У добровольцев, не давших прирост этих антител на прививку, этот показатель был меньше (в 1,2 и 1,5 раза соотвественно, p0,05 и р0,05 соотвественно). Самые низкие значения отмечены у лиц из контрольной группы (в 1,1 и 1,2 раза соотвественно, p0,05).

У части людей наблюдалось снижение уровня изученных субпопуляций лимфоцитов в период между отборами образцов крови. Доля таких волонтеров среди РТГА-положительных составила 28 – 29%, среди РТГА-отрицательных – от 33 до 39%, а у людей из контрольной группы – от 64 до 72%.

Таким образом, приведенные на рисунке 2 результаты свидетельствуют о поствакцинальном повышении уровня изученных субпопуляций лимфоцитов не только у добровольцев с зафиксированным системным гуморальным иммунным ответом на прививку, но и у лиц с отсутствием такового. При этом иммунизация, как и в случае с авидитетом секреторных IgA-антител, изменяла интенсивность снижения уровня иммунологической памяти, опосредованной CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+-лимфоцитами.

Рассмотрение индивидуальных показателей кратности поствакцинального прироста уровней клеток памяти у каждого отдельного добровольца, в сравнении с аналогичными показателями у лиц контрольной группы, позволило установить границы достоверности получаемых результатов – увеличение уровня клеток в 1,5 и более раз (рис. 2). Доля этих лиц среди привитых РТГА-положительных волонтеров составила 36 и 57%, среди привитых РТГА-отрицательных 11 и 22%, тогда как у людей из контрольной группы не наблюдалось ни одного такого случая (рис. 3).

57, % 35, 22, 11, CD4+CD45RO+ CD8+CD45RO+ Рисунок 3. Показатели достоверного увеличения уровня общих Т-лимфоцитов памяти в периферической крови людей 18 – 20 лет после вацинации ЖГВ. По оси абсцисс – фенотипы клеток. По оси ординат – процент лиц с достоверным (в 1,5 раза) увеличением уровней данных клеток. – лица с достоверными приростами титров сывороточных антител в РТГА (n=14);

– лица, не давшие такого прироста(n=18);

– лица, получившие препарат плацебо(n=25).

Проведенный корреляционный анализ совпадения случаев достоверного увеличения у вакцинированных добровольцев уровней CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+-лимфоцитов показал очень высокую степень зависимости между данными показателями: коэффициенты корреляции колебались от 0,84 до 0,90 при p0,01. Это свидетельствует, что, в принципе, факт поствакцинальной активации Т клеточной памяти можно фиксировать даже при определении только одной из двух субпопуляций Т-лимфоцитов памяти.

Установлено, что между исходными (перед введением ЖГВ) уровнями изученных субпопуляций клеток памяти и кратностью их поствакцинального увеличения существует обратная зависимость, то есть, чем ниже был исходный уровень, тем выше кратность его увеличения и наоборот (коэффициенты корреляции от –0,36 до –0,52 при p0,05).

В итоге можно отметить, что проведенные исследования свидетельствовали о способности ЖГВ индуцировать Т-клеточную иммунологическую память в виде увеличения в периферической крови молодых людей уровней (%) общих CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+-лимфоцитов.

Оценка у людей и животных иммунологической памяти по тестированию вирусспецифических Т- и В-лимфоцитов Важным фактором постинфекционного и поствакцинального иммунитета к острым инфекциям является формирование иммунологической памяти в виде специфических к возбудителю Т-клеток [Нalwani R. et al, 2006;

Takahashi Y., 2007;

Sanz I. et al, 2008]. Только в последние годы вопрос об индукции Т-клеток памяти перешел в плоскость практического изучения в связи с разработкой методик их тестирования.

До недавнего времени в мировой практике для количественного измерения ex vivo антигенспецифических Т-клеток использовались два метода: тетрамерный и цитокиновый.

Тетрамерный метод [Gilanders W.E. et al, 1997;

Novak E.J. et al, 1999] основан на специфическом взаимодействии TCR Т-лимфоцита с мультимерным (чаще всего тетрамерным) комплексом, представляющим собой молекулу МНС, связанную с пептидом вирусного антигена. Несмотря на высокую специфичность метод имеет ряд недостатков, прежде всего – сложность рекомбинантной технологии получения комплекса МНС-пептид. Кроме того, метод выявляет популяцию Т-клеток, специфичных только к данному комплексу МНС-пептид, и не дает полного представления о суммарном Т-клеточном ответе на все антигенные эпитопы.

Второй метод основан на выявлении антиген-активированных Т-лимфоцитов по внутриклеточному выявлению продукции Th-1 и Th-2 цитокинов [Prussin C., Metcalfe D.D., 1995]. По сравнению с тетрамерной технологией он более прост и дешев и используется гораздо шире. Однако цитокиновый метод не является витальным тестом (см. ниже) и требует достаточно длительной стимуляции in vitro клеток антигеном для формирования полноценного цитокинового ответа.

На сегодняшний день альтернативой перечисленным двум тестам является метод TRAP [Daubeuf S. et al, 2006], базирующийся на открытом феномене трогоцитоза [Joly E., Hudrisier D., 2003] – обмена участками клеточных мембран между АПК и Т-лимфоцитом в процессе презентации антигена. Выбор нами этого метода связан с тем, что он имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с двумя первыми тестами:

TRAP более прост, менее дорогостоящ, результаты можно получить в течение 24 часов [Daubeuf S. et al, 2006];

в отличие от тетрамерной технологии он не требует МНС-типирования и знаний об особенностях презентации отдельного антигена [Puaux A.L. et al, 2006];

позволяет осуществлять определение активированных Т- и В-клеток в одной пробе [Puaux A.L. et al, 2006];

в отличие от метода определения внутриклеточных цитокинов TRAP является витальным тестом, то есть исследуемые клетки можно не подвергая фиксации использовать для дальнейших прижизненных исследований [Daubeuf S. et al, 2006];

выявляет межклеточные реакции уже на этапе взаимодействия АПК с лимфоцитом, поскольку трогоцитоз начинается через несколько минут после контакта этих клеток [Joly E., Hudrisier D., 2003;

Rechavi O. et al, 2007].

По данным литературы информация, полученная в TRAP, хорошо коррелирует с результатами тетрамерного и цитокинового методов [Puaux A.L. et al, 2006;

Beadling C., Slifka M.K., 2006].

Ранее TRAP использовался в условиях in vitro на клеточных линиях [Puaux A.L. et al, 2006;

Machlenkin A. et al, 2008]. Проведено только одно исследование in vivo в эксперименте на мышах [Beadling C., Slifka M.K., 2006]. Поэтому первой задачей настоящего раздела работы являлась адаптация данной методики для тестирования специфических к вирусу гриппа клеток памяти у людей.

Разработанная нами модификация TRAP в значительной мере отличалась от модификации, использовавшейся авторами [Beadling C., Slifka M.K., 2006] – рис. 4.

Активность трогоцитоза определяли в общем пуле вирусспецифических В- и Т-лимфоцитов памяти и в субпопуляции CD4+-лимфоцитов.

Испытания модификации TRAP при исследовании образцов периферической крови 25 условно здоровых невакцинированных ЖГВ добровольцев 18 – 20 лет показало, во-первых, наличие значительных колебаний индивидуальных показателей содержания клеток памяти, специфических к вакцинному штамму вируса гриппа А (H1N1), во-вторых, довольно низкие значения их уровней. Так, показатели концентрации изученных клеток варьировали от 0,01 до 1,15%, то есть могли отличаться в 100 и более раз.

На следующем этапе работы была проведена апробация разработанной модификации TRAP при исследовании образцов периферической крови людей 18 – 20 лет, отобранных до и спустя 1 месяц после прививки вакцинным штаммом для ЖГВ (рис. 5). Контрольной группой служили лица, получившие препарат плацебо.

Выбор интервала между двумя отборами проб крови (1 месяц) был сделан по следующим причинам:

во-первых, он гарантировал тестирование во второй пробе именно клеток памяти, поскольку у людей элиминация вакцинного вируса после прививки отечественной ЖГВ происходит не позднее 7 дня с момента введения препарата [Александрова Г.И., Климов А.И., 1994], что Периферическая кровь человека Выделение МПК АПК Эффекторы Эф Мишени (АПК) Этап I – выделение и Нагрузка АПК Контроль АПК стимуляция клеток вирусом + – Окраска CFSE Биотинилирование АПК Этап II – метка клеток Эф АПК АПК Эф – + Инкубация 1 час Эф АПК Этап III – индукция Смешивание 1: АПК Эф – трогоцитоза + Трогоцитоз Трогоцитоз спонтанный (фон) стимуляционный Этап IV – проведение Эф Эф ПЦФ Свечение вступивших Окраска стрептавидином в трогоцитоз клеток (реакция биотин ПЦФ (Т-, В-лимфоцитов – стрептавидин) в зависимости от СD-маркеров) + любые анти-CD Рисунок 4. Схематическое отображение этапов постановки TRAP. МПК – мононуклеары периферической крови;

Эф – клетки-эффекторы;

АПК – клетки-мишени – антиген-презентирующие клетки;

CFSE – внутриклеточный флюорохром;

ПЦФ – проточная цитофлюориметрия.

Знаками (+) и (–) обозначены соответственно мишени, стимулированные или нестимулированные вирусом.

сопровождается быстрой апоптотической выбраковкой эффекторных клеток [Lenardo M.J., 1997];

во-вторых, отбор второй пробы крови в более отдаленные сроки мог привести к тому, что он совпал бы с эпидемией, когда трудно отдифференцировать причину индукции клеток памяти – собственно вакцинация или гриппозная инфекция. В нашем случае вторая проба отбиралась в предэпидемический сезон.

До- и поствакцинальные средние уровни специфических к вакцинному вирусу гриппа А(H1N1) клеток памяти (общий пул В- и Т-лимфоцитов и CD4+ Т лимфоцитов) определяли у добровольцев, давших (РТГА+) и не давших (РТГА-) достоверный прирост титров сывороточных антител в РТГА. Предвакцинальные уровни изученных субпопуляций лимфоцитов в группе РТГА-положительных людей оказались в 7,0 и 12,1 раза ниже по сравнению с РТГА-отрицательными (p0,001). После введения ЖГВ средние уровни пула Т- и В-клеток и CD4+ лимфоцитов увеличились у первых в 19,2 и 25,6 раза соответственно (p0,001), а у вторых, только в 2,2 и 1,4 раза (p0,01 и р0,05). В контрольной группе наблюдалось снижение показателей.

Пул Т-, В- лимфоцитов памяти 0, % 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, РТГА (–) РТГА (+) Плацебо СD4+ Т-лимфоциты памяти % 0, 0, 0, 0,4 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,1 0, 0, РТГА (+) РТГА (–) Плацебо Рисунок 5. Средний арифметический показатель доли (%) специфических к вирусу гриппа A(H1N1) лимфоцитов памяти в периферической крови вакцинированных ЖГВ людей 18 – 20 лет (по данным TRAP). По оси абсцисс: РТГА(+) и РТГА(-) – лица соответственно давшие (n=10) и не давшие (n=10) достоверный прирост титров сывороточных антител в РТГА после прививки. Контрольная группа - лпацебо (n=10). По оси ординат – % определяемых клеток от числа соответственно всех лимфоцитов или СD4+ лимфоцитов. – средние уровни клеток до вакцинации;

– средние уровни клеток через месяц после вакцинации.

Эти данные свидетельствуют о влиянии исходных фоновых уровней вирусоспецифических клеток памяти как на кратноность их возрастания, так и на гуморальный иммунный ответ в РТГА после прививки. Кроме того, у привитых добровольцев была обнаружена обратная зависимость между исходными уровнями перед вакцинацией пула Т- и В-лимфоцитов памяти и CD4+-лимфоцитов памяти, с одной стороны, и накоплением этих клеток, с другой. Коэффициенты корреляции между данными признаками колебались от –0,54 до –0,84 при p0,05 и 0,01.

У сравнительно небольшой части волонтеров (20 и 30%) было отмечено увеличение уровня клеток памяти после введения препарата плацебо. Как и в случае с общими CD45RO+-лимфоцитами памяти, возник вопрос о критерии достоверности полученных результатов. Рисунок 6 содержит сведения по этому вопросу.

Пул Т-, В- лимфоцитов памяти РТГА (+) РТГА (–) Плацебо 0, 0, СD4+ Т-лимфоциты памяти РТГА (+) РТГА (–) Плацебо 0, 0, Рисунок 6. Индивидуальные показатели кратности изменения уровней специфических к вирусу гриппа A(H1N1) лимфоцитов памяти у людей 18 – 20 лет после иммунизации ЖГВ (по данным TRAP). РТГА(+) и РТГА(–) – лица соответственно давшие и не давшие достоверный прирост титров циркулирующих антител в РТГА после прививки. По оси ординат – кратность изменения уровней клеток. Кратность изменения – частное от деления поствакцинального уровня (%) на предвакцинальный. По оси абсцисс – столбики, отражающие индивидуальные данные по каждому волонтеру. Пунктирной линией обозначены границы достоверности кратности изменения уровней клеток.

В группе людей, получивших препарат плацебо, не было зафиксировано ни одного случая с десятикратным и более возрастанием уровня вирусспецифических CD4+-лимфоцитов. В той же контрольной группе в отношении пула вирусспецифических Т- и В-лимфоцитов данный показатель не превышал пятикратное увеличение. Эти результаты позволили определить границу достоверности в отношении кратности поствакцинального увеличения клеток памяти в периферической крови людей: для пула Т- и В-лимфоцитов – в 5 и более раз, для CD4+-лимфоцитов памяти – в 10 и более раз.

По этим критериям среди РТГА-положительных людей доля лиц, давших достоверные увеличения пула Т- и В-лимфоцитов памяти и CD4+-лимфоцитов памяти, составила соответственно 80 и 70%, среди РТГА-отрицательных – соответственно 60 и 40% (рис. 7).

% CD4+ Т-лимфоциты памяти пул Т-, В- лимфоцитов памяти Рисунок 7. Показатели достоверного увеличения уровней специфических к вирусу гриппа А (H1N1) лимфоцитов памяти в периферической крови людей 18 – 20 лет после вакцинации ЖГВ. По оси абсцисс:

фенотипы лимфоцитов. По оси ординат – процент лиц с достоверным увеличением уровней клеток памяти после вакцинации. – лица, с достоверными приростами титров сывороточных антител в РТГА после вакцинации (n = 10);

-- лица, не давшие такого прироста (n = 10);

– лица, получившие препарат плацебо (n = 10).

Таким образом, поствакцинальный иммунный ответ, опосредованный достоверным накоплением в периферической крови волонтеров изученных вирусспецифических клеток памяти, наблюдался не только у лиц с системным гуморальным иммунным ответом на прививку, но и у людей без этого ответа. У последних увеличение уровней таких клеток была менее выражена (p0,05).

На заключительном этапе были проведены экспериментальные исследования, касающиеся индукции у мышей специфических к вирусу гриппа А (H1N1) клеток памяти на локальном уровне – в НАЛТ мышей (рис. 8). Ранее подобные исследования не проводились.

Сравнивали в TRAP уровни CD8+CD44hi Т-лимфоцитов памяти в НАЛТ спустя 7 и 60 дней после воспроизведения экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации. Выбор НАЛТ связан с тем, что этот лимфоидный орган наиболее часто используется для изучения локального иммунитета в экспериментах на грызунах.

Полученные результаты свидетельствуют, во-первых, об отсутствии существенных отличий в индукции CD8+ Т-лимфоцитов памяти в НАЛТ при гриппозной инфекции и интраназальной вакцинации живым аттенуированным реассортантным вирусом – экспериментальным аналогом вакцинного штамма для ЖГВ, во-вторых, о явном преимуществе в стимуляции этих длительно живущих Т клеток живым вирусом по сравнению с парентеральным введением инактивированного штамма.

% 15. 11. 2 0.86 0. Контроль Аттенуированный Инактивированный A/PR/8/34 (H1N1) реассортант A/47/PR/8/34 (H1N1) (интактные мыши) (гриппозная инфекция) A/47/PR/8/34 (H1N1) (вакцинация ИГВ) (вакцинация ЖГВ) Рисунок 8. Уровень (%) вирусспецифических CD8+CD44hi Т-лимфоцитов памяти в НАЛТ мышей после гриппозной инфекции и вакцинации (по данным TRAP). По оси абсцисс – введенные вирусы. По оси ординат – процент вирусспецифических CD8+CD44hi Т-лимфоцитов на 60 день после введения вирусов (клетки иммунологической памяти).

Таким образом, по данным, полученным при использовании разработанной модификации TRAP, после прививки живыми реассортантными вирусами гриппа А наблюдалось значительное увеличение уровней вирусспецифических клеток иммунологической памяти как на системном (периферическая кровь людей), так и на органном (НАЛТ мышей) уровнях.

ВЫВОДЫ 1. Однократная вакцинация ЖГВ лиц 18 – 20 лет вызывает стимуляцию:

В-клеточной иммунологической памяти в верхнем отделе респираторного тракта в виде повышения продукции В-лимфоцитами высокоавидных локальных IgA-антител;

Т-клеточной иммунологической памяти в виде увеличения в периферической крови уровня общих лимфоцитов памяти фенотипов CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+, а также специфических к вирусу гриппа CD4+-лимфоцитов памяти.

2. Лица 18 – 20 лет могут значительно различаться по показателям предвакцинального состояния В- и Т-клеточной иммунологической памяти к вакцинному штамму вируса гриппа А: по авидитету локальных IgA антител и по количеству циркулирующих вирусспецифических CD4+ Т лимфоцитов памяти.

3. Предвакцинальные значения показателей авидности локальных IgA антител и уровней циркулирующих вирусоспецифических CD4+ лимфоцитов влияют на интенсивность их поствакцинального изменения (обратная корреляционная зависимость).

4. Часть вакцинированных ЖГВ отвечают достоверным увеличением в периферической крови уровня изученных субпопуляций Т-клеток памяти без наличия зафиксированного в РТГА системного гуморального иммунного ответа. Доля таких лиц составляет 40 – 60%.

5. Вакцинация мышей живым реассортантным вирусом гриппа А (H1N1) не уступает гриппозной инфекции, вызванной патогенным вирусом гриппа А того же сероподтипа, в активности стиуляции CD8+CD44hi Т-лимфоцитов памяти во входных воротах инфекции – назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ). Вакцинация инактивированным вирусом гриппа А (H1N1) практически не индуцирует эти клетки в НАЛТ. Специфичные к вирусу гриппа А (H1N1) CD8+CD44hi Т-лимфоциты сохраняются после вакцинации не менее двух месяцев – срок наблюдения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Найхин А.Н., Кореньков Д.А., Петухова Г.Д., Чиркова Т.В., Григорьева Е.П., Руденко Л.Г. Оценка Т-клеточной иммунологической памяти по экспрессии молекул CD45 у людей, привитых живой реассортантной гриппозной вакциной // «Медицинская иммунология». – 2008. – Т.10. – №6. – с. 535 –542.

2. Донина С.А., Кореньков Д.А., Руденко Л.Г., Найхин А.Н. Оценка авидности локальных IgA-антител у людей, привитых живой гриппозной вакциной // «Медицинская иммунология». – 2008. – Т.10. – № 4 – 5. – с. 423 – 430.

3. Petukhova G, Chirkova T., Donina S., Korenkov D., Naykhin A., Rudenko L.

Comparative studies of local antibody and cellular immune responses to influenza infection and vaccination with live attenuated reassortant influenza vaccine (LAIV) utilizing a mouse nasal-associated lymphoid tissue (NALT) separation method // Vaccine. – 2009, -vol.27:2580-2587.

Тезисы:

1. Кореньков Д.А., Петухова Г.Д., Рекстин А.Р., Найхин А.Н. Оценка поствакцинального иммунного ответа к вирусам гриппа по индукции Т клеточной иммунологичесой памяти // «Медицинская иммунология». – 2006. – Т.8. - № 2 – 3. – с. 272 – 273.

2. Donina S.A., Korenkov D.A., Chirkova T.V., Naykhin A.N., Rudenko L.G. Local antibody immune response to live attenuated reassortant influenza vaccine:

generation of secretory IgA and their avidity // The Third European Influenza Conference, Vilamoura, Portugal, September 14 – 17, 2008, Programme and

Abstract

Book, P. 3. Донина С.А., Кореньков Д.А., Чиркова Т.В., Петухова Г.Д., Найхин А.Н., Руденко Л.Г. Авидность секреторных IgA-антител у людей после иммунизации живой гриппозной вакциной // Российский иммунологический журнал. – 2008. – Т. 2. - № 2-3. – С. 4. Кореньков Д.А., Чиркова Т.В., Петухова Г.Д., Найхин А.Н. Применение метода выявления трогоцитоза для оценки формирования Т-клеточной иммунологической памяти у людей после вакцинации живой гриппозной вакциной // Российский иммунологический журнал. – 2008. – Т. 2. - № 2-3. – С. 5. Кореньков Д.А., Петухова Г.Д., Чиркова Т.В. Апробация метода выявления трогоцитоза для определения вирус-реактивных Т-лимфоцитов // Цитология. – 2008. – Т. 50. - №9. – С. 810- 6. Кореньков Д.А., Чиркова Т.В., Найхин А.Н. Оценка формирования иммунологической памяти у людей при иммунизации живой гриппозной вакциной // Аллергология и иммунология. – 2009. Т.10. – № 2. – С. 299-

 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.