авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Роль ретропозонов alu-семейства в регуляции генной экспрессии в клетках линий hek293 и a549 человека

На правах рукописи

УСМАНОВА Надежда Маратовна РОЛЬ РЕТРОПОЗОНОВ ALU-СЕМЕЙСТВА В РЕГУЛЯЦИИ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ ЛИНИЙ HEK293 И A549 ЧЕЛОВЕКА 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Казаков Василий Иванович Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Воробьев Владимир Иосифович доктор биологических наук, профессор Горбунова Виктория Николаевна

Ведущая организация: ВНИИ Генетики и разведения сельскохозяйственных животных, Санкт-Петербург – Пушкин

Защита состоится 25 апреля 2008 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан 21 марта 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Секвенирование генома человека позволило установить, что ~55% нуклеотидной последовательности составляют различные повторяющиеся элементы [1]. Изначально эти последовательности относили к «эгоистической ДНК», представляющей собой нефункциональную часть генома. В последние годы накапливаются доказательства того, что те или иные повторяющиеся элементы генома выполняют различные функции, как на генном, так и на геномном уровнях [2, 3]. Ретропозоны Alu семейства относятся к классу SINE повторов (короткие диспергированные нуклеотидные элементы) и представлены более копий в геноме человека. В настоящее время имеются данные, указывающие на то, что Alu повторы могут участвовать в регуляции генной экспрессии на нескольких уровнях [4, 5]. Например, Alu повторы содержат в своем составе множественные CpG динуклеотиды, являющиеся сайтами метилирования в геноме. Посредством метилирования осуществляется не только регуляция генной экспрессии, но и контроль эмбрионального развития, а также подавление амплификации мобильных элементов генома [6]. Многие исследования показали наличие в Alu повторах сайтов связывания транскрипционных факторов. Экспериментально доказано связывание некоторых из этих транскрипционных факторов, например, Yin Yang 1 (YY1), Estrogen receptor (ER), Stimulating protein 1 (Sp1), с консенсусной последовательностью Alu [7]. Инсерции Alu повторов в экзоны белок-кодирующих генов, в области экзон-интронных границ, а также незаконная гомологичная рекомбинация между различными копиями Alu могут приводить к возникновению наследственных заболеваний [4]. Показано, что Alu РНК стимулирует трансляцию всех репортерных мРНК в бесклеточной системе трансляции [8]. Регуляция стабильности транскрипта может осуществляться за счет связывания Alu повтора, локализованного в 3’-нетранслируемой области, с SRP9/14 субъединицей сигнал распознающей частицы [9].

Регуляция генной экспрессии является важным этапом в поддержании клеточного гомеостаза. Она лежит в основе клеточной пролиферации и дифференцировки в ходе эмбрионального развития. Изменение экспрессии генов в ответ на внеклеточные стимулы обуславливает адаптацию организмов к условиям окружающей среды [10].

В свете вышеизложенного, изучение роли Alu повторов в регуляции генной экспрессии представляется актуальной задачей. Такие исследования позволят не только детализировать механизмы регуляции, но и сделать выводы касательно функций повторяющихся элементов генома.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании регуляции экспрессии генов посредством Alu повторов на уровне транскрипции и на уровне формирования факультативного гетерохроматина. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) При помощи методов компьютерного анализа выбрать гены для изучения роли Alu повторов, локализованных в промоторах, в регуляции экспрессии генов;

2) Экспериментально показать сайленсерную или энхансерную функцию Alu повторов, расположенных в промоторах выбранных генов, в постоянных клеточных линиях человека;

3) На примере AluYa5 повтора, содержащегося в 16-м интроне гена ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), показать функциональную роль Alu повторов, локализованных в интронах;

4) На примере инактивации Х хромосомы показать возможность функционирования Alu повторов и SINE повторов мыши в качестве вспомогательных элементов при формировании факультативного гетерохроматина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Alu повторы, локализованные в промоторах генов лиганда циклофилина, регулирующего кальциевый ответ (CAML) и дезоксирибонуклеазы II (DNAse II), участвуют в регуляции их транскрипции в клетках линий HEK293 и A человека.

2. Инсерция AluYa5 повтора в 16-й интрон гена АПФ коррелирует с уровнем фенилаланина и смеси лейцин+изолейцин в плазме крови людей.

3. Alu-ассоциированные кластеры сайтов связывания транскрипционных факторов (ССТФ) способствуют формированию в ходе эволюции регуляторных элементов в промоторах и интронах некоторых человеческих генов.

4. Распределения Alu повторов человека и SINE повторов мыши (В1, В2), но не LINE1 повторов, в Х хромосомах коррелируют с распределениями CpG островков, белок-кодирующих генов и некоторых маркеров гетерохроматина.

Вспомогательными элементами при формировании факультативного гетерохроматина в ходе инактивации Х хромосомы могут служить SINE ассоциированные негативные элементы транскрипции.

Научная новизна. Впервые предложен принцип поиска в промоторах генов Alu повторов, участвующих в регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции.

Этот принцип подтвержден экспериментально на примере Alu повторов, локализованных в промоторах генов CAML и DNAseII. Впервые показано, что инсерция AluYa5 повтора в 16-й интрон гена АПФ коррелирует с уровнем некоторых аминокислот в плазме крови людей. На этом примере показана функциональная роль Alu повторов, локализованных в интронах. Впервые показано, что Alu повторы человека и SINE повторы мыши могут участвовать в регуляции генной экспрессии на уровне формирования факультативного гетерохроматина в ходе инактивации Х хромосомы.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в работе результаты важны для понимания функций повторяющихся элементов генома. Работа вносит определенный вклад в современные представления о механизмах регуляции экспрессии генов. В практическом отношении представляет интерес установленная корреляция между инсерционно-делеционным полиморфизмом в гене АПФ и уровнем фенилаланина и смеси лейцин+изолейцин в плазме крови людей. Коррекция уровня свободных аминокислот имеет значение при лечении некоторых наследственных заболеваний, в частности, аминоацидопатий. Результаты настоящего исследования могут быть использованы в курсах лекций по клеточной и молекулярной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), Международной конференции «II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН» (Санкт-Петербург, 2007). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных семинарах лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 274 ссылки.

Диссертация изложена на 151 странице и иллюстрирована 38 рисунками и таблицами.

Список основных сокращений.

CAML – ген лиганда циклофилина, регулирующего кальциевый ответ, DNAseII – ген дезоксирибонуклеазы II, LINE – (long interspersed nucleotide elements) – длинные диспергированные нуклеотидные элементы, L1 – повторы LINE1 семейства, PcG – белки группы Polycomb, SINE – (short interspersed nucleotide elements) – короткие диспергированные нуклеотидные элементы, XIC – (X inactivation center) – центр инактивации Х хромосомы, АПФ – ангиотензинпревращающий фермент, ПЦР – полимеразная цепная реакция, ССТФ – сайты связывания транскрипционных факторов, ЦРМ – цис-регуляторный модуль.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Компьютерный анализ. Из базы данных промоторов DBTSS (http://dbtss.hgc.jp) произвольным образом выбрали 3375 промоторов. Каждый промотор содержал 1000 н.п. до и 200 н.п. после точки инициации транскрипции.

Нуклеотидные последовательности X хромосом человека и мыши взяли из базы данных Ensembl v.44 (www.ensembl.org). Alu повторы человека, SINE повторы мыши, LINE1 повторы и CpG островки идентифицировали в промоторах, в 16-м интроне гена АПФ и в Х хромосомах при помощи программ RepeatMasker (www.repeatmasker.org) и CPGPLOT (www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/). Весовые матрицы для поиска ССТФ Sp1, YY1 и ER взяли из базы данных транскрипционных факторов TRANSFAC (www.gene-regulation.com/pub/databases.html/). Поиск ССТФ в промоторах осуществляли при помощи программы RSA-tools-patser (http://rsat.ulb.ac.be/rsat/).

Клонирование фрагментов промоторов генов DNAse II и CAML в плазмидный вектор pGL3-Basic. При помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировали различные фрагменты промоторов генов DNAse II и CAML.

Последовательности олигонуклеотидных праймеров подбирали при помощи программы Vector NTI™ (InforMax, США). Для удобства клонирования в 5’-концы праймеров вводили сайты для эндонуклеаз рестрикции BglII, XhoI или HindIII. Для более точной амплификации мы использовали смесь двух полимераз - Platinum®Pfx DNA Polymerase и Taq DNA Polymerase (Invitrogen, США). Температуру отжига (Тотж °С) подбирали экспериментально для каждой пары праймеров. В качестве матрицы использовали геномную ДНК, выделенную из лейкоцитарной фракции периферической крови человека. По окончании ПЦР реакционную смесь очищали от излишков праймеров, dNTPs и полимераз при помощи QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen, Германия). Продукты ПЦР и вектор pGL3-Basic (Promega, США) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BglII, XhoI или HindIII. Векторную ДНК дополнительно обрабатывали щелочной фосфатазой Shrimp Alkaline Phosphatases (Fermentas, Литва). После рестрикции фрагменты ДНК разделяли при помощи электрофореза в 0,7 %-ом агарозном геле и выделяли из геля при помощи QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen, Германия). Затем проводили лигирование вектора и вставки в соотношении 1:3 при помощи ДНК-лигазы фага T4 (Invitrogen, США).

Трансформацию бактериального штамма E.coli DH5 продуктами лигазной реакции проводили по методу Мандела и Хиги [11] с применением хлористого кальция.

Плазмидную ДНК из положительных трансформантов выделяли при помощи Plasmid Midi Kit (Quiagen, Германия). Наличие необходимых фрагментов промоторов в рекомбинантных плазмидах подтверждали секвенированием.

Трансфекция клеточных линий человека рекомбинантными плазмидами и измерение активности люциферазы. Клетки карциномы легкого человека линии A549 и клетки почки эмбриона человека линии HEK293, предоставленные банком клеточных культур Института цитологии РАН, культивировали в среде RPMI (Биолот, Россия), содержащей 10 % эмбриональной сыворотки телят (Gibco BRL, США), 1 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Клетки котрансфицировали 0,5 мкг ДНК конструкции и 5 нг плазмиды pRL-TK при помощи реагента Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Через 1 сутки после трансфекции клетки лизировали при помощи буфера Passive Lysis Buffer (Promega, США). Активность люцифераз измеряли ручным люминометром TD 20/20 DLReady™ Luminometer (Turner BioSystems, США) при помощи Dual-Luciferase® Reporter Assay system (Promega, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. Векторы pGL3-Basic и pGL3-Control (Promega, США) использовали как отрицательный и положительный контроли соответственно. Трансфекцию и измерения активности люциферазы в лизатах проводили трижды в двойной повторности.

Определение I/D полиморфизма в гене АПФ. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитарной фракции периферической крови. К пробе крови добавляли лизирующий буфер, содержащий 0,15 мг/мл протеиназы К, 0,1 М NaCl, 20 мМ ЭДТА, 1 % додецилсульфата натрия и 50 мМ трис-HCl. Полученную смесь инкубировали в течение ночи при 37 °С. ДНК выделяли из лизата стандартным фенол-хлороформным методом. Амплификацию фрагмента 16-го интрона гена проводили при помощи ПЦР.

В качестве праймеров использовали следующие олигонуклеотидные последовательности: прямой праймер 5'- CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT - 3', обратный праймер 5'- GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T - 3' [12].

Температура отжига праймеров составляла 60 °С. Материал, полученный в результате ПЦР, подвергали разделению при помощи гель-электрофореза в 8% полиакриламидном геле. По окончании разделения гель окрашивали при помощи бромистого этидия. Фрагменты визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете.

Определение уровня свободных аминокислот в плазме крови. Определение уровня свободных аминокислот в плазме крови проводили в клинико диагностической лаборатории Санкт-Петербургской Медицинской Академии Последипломного Образования методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выбор генов для изучения функциональной роли Alu повторов, локализованных в промоторах. Консенсусная последовательность Alu повторов содержит цис-регуляторные элементы, которые взаимодействуют с различными эффекторами: гормонами, кальцием, транскрипционными факторами [7, 13].

Единичные изолированные ССТФ, как правило, не оказывают существенного влияния на транскрипцию большинства эукариотических генов. Важную роль в регуляции экспрессии генов играют так называемые цис-регуляторные модули (ЦРМ). Они представляют собой последовательности ДНК длиной 100-1000 н.п., с которыми взаимодействует целый набор транскрипционных факторов. Различными группами исследователей [14-16] было показано, что важную роль в регуляции транскрипции в ходе раннего эмбрионального развития у Drosophila melanogaster играют кластеры сайтов связывания 3-6 транскрипционных факторов, плотность которых превышает некоторое критическое значение. Для изучения функциональной роли Alu повторов мы решили выбрать промоторы белок-кодирующих генов, которые содержат в своем проксимальном сегменте Alu элементы, перекрывающиеся с CpG островками и ЦРМ. ЦРМ мы считали те области в составе промоторов, которые, имея длину не более 700 н.п., содержали 7 или более ССТФ Sp1, ER, YY1. При помощи методов компьютерного анализа мы идентифицировали перечисленные элементы в последовательностях 3375 промоторов, выбранных случайным образом.

Фракция Alu повторов в промоторах составила 7,5%, что ниже содержания Alu в интронах, в межгенных промежутках, а также в геноме в целом. Вероятно, в ходе эволюции выработались механизмы, препятствующие инсерции Alu повторов в промоторы белок-кодирующих генов. Оказалось, что c Alu повторами перекрываются лишь 133 из 3044 идентифицированных в промоторах CpG островков. Из этих CpG островков 48 (1,58%) находятся в проксимальном положении в промоторах.

Бльшая часть Alu повторов в геноме метилирована [17] и, следовательно, путем спонтанной реакции дезаминирования в них происходит постепенное снижение фракции CpG-динуклеотидов [18]. Остается неясным, почему некоторые члены этого семейства повторов неметилированы и способствуют формированию CpG островков.

Мы полагаем, что Alu повторы, ассоциированные с CpG островками, участвуют в регуляции генной экспрессии, так как могут нести в своем составе важные цис регуляторные элементы для РНК-полимеразы II.

В результате компьютерного анализа мы идентифицировали несколько белок кодирущих генов, промоторы которых полностью удовлетворяют нашим критериям.

Например, ген выживаемости мотонейронов (SMN), ген человеческого гомолога белка Rad51 дрожжей (hRad51), ген субъединицы 4 пуринэргического рецептора (P2X), ген субъединицы IV третьего фактора инициации трансляции эукариот (EIFS4), ген, ассоциированный с многоочаговой лейкоэнцефалопатией (MLC1), ген поли(АДФ-рибоза) полимеразы 1 (ADPRT1), ген субъединицы B сукцинатдегидрогеназного комплекса (SDHB). В качестве моделей для дальнейшего исследования функциональной роли Alu повторов в промоторах были выбраны промоторы двух генов: дезоксирибонуклеазы II (DNAse II) и лиганда циклофилина, регулирующего кальциевый ответ (CAML) (рис. 1).

Рис. 1. Схема строения промоторов генов CAML (а) и DNAse II (б) и расположения олигонуклеотидных праймеров, используемых в ПЦР. Sp1, YY1, ER – сайты связывания транскрипционных факторов Sp1, YY1, ER;

ЦРМ – цис регуляторный модуль;

CaMAluF2, CaMDF, CaMF, DNAluF, DNAluF2, DNF – прямые олигонуклеотидные праймеры, CaMAluR, CaMR, DNAluR, DNR – обратные олигонуклеотидные праймеры;

CpG – CpG островки;

AluSg, AluJb, AluSq – Alu повторы различных подсемейств. Ноль на оси соответствует точке инициации транскрипции.

Звездочками отмечены сайты связывания Sp1, функциона льная значимость которых была доказана эксперимен тально [19].

На первом этапе мы амплифицировали различные фрагменты этих промоторов при помощи ПЦР. Олигонуклеотидные праймеры для реакции выбирали таким образом, чтобы ее продукты различались по составу элементов: Alu повторов и CpG островков (Табл. 1). Продукты ПЦР субклонировали в полилинкер плазмиды pGL3 Basic, содержащей репортерный ген люциферазы Photinus pyralis (рис. 2).

Полученными конструкциями трансфицировали клетки линии карциномы легкого человека (А549) и почки эмбриона человека (НЕК293). Эти линии были выбраны по следующим причинам: по литературным данным в легких и почках наблюдается высокий уровень экспрессии генов DNAse II и САML, культивирование этих клеток не требует особых условий и сложных по составу сред, а эффективность трансфекции этих клеток относительно высокая. Для внутреннего контроля эффективности трансфекции клеток мы проводили котрансфекцию полученных конструкций с вектором pRL-TK, который содержит ген люциферазы Renilla reniformis и промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса. Вектор pGL3-Control использовали в качестве положительного контроля трансфекции. Он отличается от вектора pGL3 Basic тем, что перед геном люциферазы в него встроен промотор вируса SV обезьян, а после гена – его энхансер.

Таблица 1. Состав амплифицируемых фрагментов промоторов № Пара Амплифицируе- Длина, Состав амплифицируемого фрагмента п/па мый фрагментб праймеров н.п.

DNAluF 1 –926/+163 DNAluR DNAluF2 2 –603/+163 DNAluR DNF 3 –161/+163 DNAluR DNAluF 4 –926/+243 DNR DNAluF2 5 –603/+243 DNR 6 DNF-DNR –161/+243 CaMAluF2 7 –908/+116 CaMAluR CaMDF 8 –549/+116 CaMAluR CaMF 9 –178/+116 CaMAluR CaMAluF2 10 –908/+215 CaMR CaMDF 11 –549/+215 CaMR CaMF 12 –178/+215 CaMR а Пары праймеров №№1-6 используются для амплификации фрагментов промотора гена DNAse II, №№7-12 – CAML, бПоложение амплифицируемого фрагмента указано относительно точки инициации транскрипции.

Результаты измерения активности люциферазы в лизатах клеток, трансфицированных различными конструкциями. В ходе измерений определяли относительную люциферазную активность лизата – отношение интенсивностей люминесценции, сопровождающей две люциферазные реакции: с участием люциферазы Photinus pyralis и с участием люциферазы Renilla reniformis. Результаты измерения активности люциферазы в лизатах клеток линий A549 и HEK293, трансфицированных различными конструкциями, представлены на рис. 3. Относительная люциферазная активность для положительного и отрицательного контролей составила соответственно 2,0 ± 0,1 и 415 ± 25 (для клеток линии A549) или 2,6±0,7 и 3272±170 (для клеток линии HEK293). Клетки линии HEK293 трансфицировали только конструкциями –908/+116, –549/+116, –178/+ (CAML) и –926/+243, –603/+243, –116/+243 (DNAse II). Выбор данных конструкций был обусловлен результатами, полученными при измерении активности люциферазы в лизатах трансфицированных клеток линии A549.

Рис. 2. Карта плазмиды pGL3 Basic: luc+ - ген люциферазы Photinus pyralis, Ampr – ген лактамазы, обусловливающий ус тойчивость бактерии-хозяина к ампициллину, f1 ori – f1 ориджин репликации. Жирным шрифтом выделены эндонуклеазы рестрик ции, по сайтам которых прово дили клонирование фрагментов промоторов.

Рис. 3. Результаты измерения активности люцифераз в лизатах клеток линий A549 и HEK293, трансфициро ванных конструкциями, содержащими различ ные фрагменты промо торов генов CAML (а) и DNAse II (б).

Заштрихованные столбики – результаты для клеток линии HEK293, светлые – для клеток линии A549.

Для конструкций с фрагментами промотора гена CAML (рис. 3, а.) самая высокая активность (для обеих клеточных линий) соответствовала конструкции – 178/+116, которая не содержала в своем составе Alu. Активность люциферазы в лизатах клеток, трансфицированных конструкцией –549/+116, была на 32 (линия А549) и на 23 % (линия НЕК293) ниже. Эта конструкция включает в себя фрагмент промотора, содержащий повтор AluSg. Активность люциферазы, соответствующая конструкции –908/+116, достоверно не отличалась от активности, соответствующей конструкции –549/+116, в клетках линии А549, но отличалась в клетках линии HEK293. Конструкции –908/+215, –549/+215, –178/+215 при трансфекции в клетки линии A549 показали активность на порядок меньшую, чем конструкции –178/+116, -549/+116 и –908/+116 (на рисунке не показано, см. стр. 97 диссертации). При этом активности, соответствующие этим конструкциям, достоверно не отличались друг от друга. Для конструкций с фрагментами промотора гена DNAse II (рис. 3, б.) самая высокая активность (для обеих клеточных линий) также соответствовала конструкции, не содержащей в своем составе Alu (–161/+243). Активность люциферазы в клетках, трансфицированных конструкцией –603/+243, содержащей AluSq повтор, была на 32 (линия A549) и на 60 % (линия HEK293) ниже.

Люциферазная активность в лизатах клеток, трансфицированных конструкцией -926/+243, содержащей повторы AluJb и AluSq, была также ниже, но всего на (линия A549) и на 32 % (линия HEK293). После трансфекции в клетки линии A конструкции –926/+163, –603/+163, –161/+163 показали активности люциферазы того же порядка, что и другие конструкции с фрагментами промотора гена DNAse II. Эти активности не отличались друг от друга, но достоверно отличались от активности, соответствующей конструкции –161/+243 (на рисунке не показано, см. стр. диссертации).

Таким образом, исследования промотора гена CAML показали, что AluSg повтор, находящийся в районе –526/–271, ослабляет экспрессию гена как в клетках линии A549, так и в клетках линии HEK293. Конструкции –908/+215, –549/+215, -178/+215 для клеток линии A549 показали активность на порядок меньшую, чем конструкции –178/+116, –549/+116 и –908/+116. Это может быть связано с тем, что на участке +116/+215 расположены два ССТФ Sp1 или же сайты связывания других транскрипционных факторов, которые мы не рассматривали в настоящей работе.

Исследования промотора гена DNAse II показали, что AluSq повтор, находящийся в проксимальном сегменте, ослабляет, а повтор AluJb, локализованный в дистальном сегменте, усиливает экспрессию гена. С AluJb повтором перекрываются два ССТФ ER. Возможность функционирования Alu повтора как ER-зависимого транскрипционного энхансера была показана на примере гена BRCA-1 [20]. Помимо этого, воспользовавшись базой данных SAGEmap (www.ncbi.nlm.nih.gov/sage), мы определили, что специфический маркер транскриптов гена DNAse II (AGCTGAGCTA) встречается в клетках MCF7, обработанных эстрадиолом, в 6 раз чаще. Наши результаты свидетельствуют о том, что Alu повторы в составе промоторов генов CAML и DNAse II обладают аналогичной активностью в клетках линии A549 и HEK293. Возможно, в клетках других типов эти Alu повторы обладают прямо противоположной активностью или не имеют таковой вовсе.

Тканеспецифическая активность некоторых сайтов для YY1 обнаружена на примере миозиновых генов мышей [21]. Экспрессия обоих генов осуществляется во всех тканях человека. Можно сделать предположение, что негативные Alu ассоциированные элементы в промоторах генов CAML и DNAse II не работают в тех тканях, где гены экспрессируются на высоком уровне: в лимфоцитах, тканях мозга и мочеполовой системы – ген CAML, в тканях простаты, легких, щитовидной железы – ген DNAse II (http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/).

В гене паратиреоидного гормона был обнаружен негативный кальций чувствительный элемент 2-го типа (nCARE2) расположенный в Alu повторе, находящимся за 3,6 т.п.н. вверх по течению от точки инициации транскрипции [22].

Таким образом, Alu повторы могут выполнять регуляторную функцию, находясь за несколько тысяч пар нуклеотидов от точки инициации транскрипции. Мы обнаружили, что область -5000/0 гена DNAse II содержит еще 3 Alu повтора, помимо тех, которые указаны на рис. 1. Область –5000/0 гена CAML содержит еще полноразмерных и 7 частично делетированных Alu повторов. Вполне вероятно, что указанные последовательности также участвуют в регуляции экспрессии этих генов.

Помимо этого, интроны указанных генов также содержат многочисленные Alu элементы.

Вероятнее всего, инсерция Alu повторов в промоторы генов CAML и DNAse II произошла до дивергенции архантропов и высших обезьян, так как они содержатся в гомологичных локусах шимпанзе (Pan troglodytes) и макаки-резуса (Macaca mulatta).

При этом число ССТФ, ассоциированных с Alu повторами, неодинаково у разных видов. У человека ЦРМ полностью перекрываются с промоторами, в то время как у обезьян в промоторах уже можно обнаружить фрагменты, в которых плотность ССТФ меньше критического значения. Возможно, что данные гены регулируются у обезьян посредством Alu повторов иным образом или не регулируются вовсе. На данном примере видно, что в ходе эволюции может происходить формирование ЦРМ.

Изначальное наличие в промоторах Alu повторов, перекрывающихся с ССТФ, ускоряет этот процесс.

Анализ 16-го интрона гена АПФ. В результате компьютерного анализа в составе нуклеотидной последовательности 16-го интрона гена АПФ нами был обнаружен ЦРМ, перекрывающийся с двумя Alu повторами и CpG островком (рис. 4.). Полиморфизм гена АПФ по типу инсерция/делеция (I/D) определяется наличием или отсутствием AluYa5 повтора в 16-м интроне.

Рис. 4. ЦРМ в составе 16-го интрона гена АПФ. Звездочкой обозначен AluYa5-повтор, серым цветом – CpG островок, плюсами – ЦРМ. Цифрами обозначено расстояние в т.п.н. от точки инициации транскрипции.

Известно, что у инсерционных гомозигот (II) уровень АПФ в плазме крови вдвое ниже, чем у делеционных гомозигот (DD) [23]. На основании того, что Alu повтор локализован в интроне, многие исследователи считают маловероятной возможность его непосредственного участия в регуляции экспрессии гена. В большинстве случаев они склоняются к мысли, что Alu повтор находится в неравновесном сцеплении с каким-либо локусом количественных признаков. Однако поиски функциональных полиморфизмов пока что не увенчались успехом [24]. Мы полагаем, что в случае гена АПФ AluYa5 повтор играет роль транскрипционного сайленсера. Примеры негативной регуляции экспрессии генов транскрипционными факторами YY1 и ER хорошо известны [25, 26], фактор Sp1 также может выступать в роли репрессора транскрипции [27].

Влияние ID-полиморфизма в гене АПФ на уровень фенилаланина и смеси лейцин+изолейцин в плазме крови людей. Проанализировав ди- и трипептиды, отщепляемые АПФ от его основных субстратов, мы пришли к выводу, что в их состав входит неодинаковое количество различных аминокислотных остатков. Поскольку уровень фермента в крови у делеционных гомозигот превосходит таковой у инсерционных гомозигот почти в два раза, у нас возникло предположение о возможной корреляции между инсерцией AluYa5 повтора в 16-й интрон и уровнем некоторых аминокислот в плазме крови людей. Нами были определены I/D полиморфизм в гене АПФ и уровень свободных аминокислот в плазме крови у человек [28]. Статистическая обработка материалов проводилась при помощи t критерия Стьюдента. Во всех случаях различия в уровнях свободных аминокислот между II и ID, а так же между DD и ID оказались недостоверными. У ID этот уровень практически не отличался от средних значений. У DD по отношению к II оказались повышены уровни Leu+Ile (P = 0,03) и Phe (P = 0,004).

Анализ Х хромосом человека и мыши. Инактивация Х хромосомы – это один из наиболее примечательных примеров эпигенетической регуляции генной экспрессии, посредством которой происходит полное подавление транскрипции большинства генов одной из двух хромосом в диплоидных соматических клетках самок млекопитающих. Она инициируется в так называемом «центре инактивации» (XIC) и распространяется в обе стороны in cis [29]. Самым важным геном этого района является Xist. Усиленная транскрипция гена Xist начинается на ранних стадиях эмбриогенеза. Образующаяся нетранслируемая Xist РНК специфически покрывает инактивированную Х хромосому в течение клеточного цикла. Это приводит к многочисленным последовательным модификациям гистонов, которые способствуют установлению и поддержанию транскрипционно неактивного гетерохроматина [30, 31]. Еще одним признаком гетерохроматина является метилирование CpG островков, локализованных в промоторах [32]. Согласно принятой модели, в Х хромосоме имеются специализированные вспомогательные элементы («way stations» или «boosters»), которые способствуют процессу распространения инактивации [33]. Сначала Xist РНК связывается с вспомогательными элементами, расположенными около XIC, индуцируя тем самым локальные конформационные изменения. Вследствие этого становится возможным связывание с белками, способствующими гетерохроматинизации. РНК-белковые комплексы привлекают более удаленные вспомогательные элементы, происходит кооперативное распространение инактивации. Была выдвинута гипотеза, утверждающая, что подобными «way station» являются LINE повторы, в частности, LINE1 (L1) повторы мыши и человека [34].

При помощи методов компьютерного анализа мы установили, а затем сравнили распределения генов, SINE и L1 повторов, CpG островков и некоторых маркеров гетерохроматина в Х хромосомах человека и мыши (рис. 5.). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что распределение SINE повторов (Alu и B1, B2 B4), но не L1 повторов, сходно с распределениями CpG островков и таких важных признаков факультативного гетерохроматина в Х хромосоме, как Xist РНК и H3-K27m3 (триметилирование гистона H3 по лизину в 27-м положении). Известно, что распределение другого маркера гетерохроматина – убиквитинилированного гистона H2A по лизину в 119-м положении – также совпадает у мыши с распределением ген-богатых сегментов, а также с распределением Xist РНК [35].

Исходя из вышесказанного, мы полагаем, что именно SINE повторы млекопитающих играют роль вспомогательных элементов при распространении инактивации вдоль Х хромосомы.

Важную роль в инактивации Х хромосомы играют белки группы Polycomb (PcG), которые могут образовывать два белковых комплекса - Polycomb repressive complex 1 и 2. Белки EED и Ring1A/B этой группы осуществляют метилирование гистона H3 по лизину в 27-м положении и убиквитинилирование гистона Н2А соответственно [36, 37]. Транскрипционный фактор YY1 единственный из всей группы PcG способен специфически связываться с последовательностью ДНК. Мы считаем, что взаимодействие комплексов PcG с SINE повторами может осуществляться за счет связывания с ССТФ YY1. Известно, что ССТФ YY присутствуют в консенсусной последовательности Alu. Кроме того, непосредственное связывание YY1 c Alu было доказано нами экспериментально [38].

Мы обнаружили (рис. 6.), что распределение Alu повторов (но не L1 повторов) строго коррелирует с распределением ССТФ YY1, то есть большое число Alu повторов, локализованных вХ хромосоме, могут связывать YY1. Мотив CCATSTTGNC, который является консенсусной последовательностью ССТФ YY1 у человека, не обнаруживает корреляции с SINE повторами мыши. При этом, консенсусная последовательность B2 элементов у мыши содержит мотив GCCATCTCACC, который, вероятно, и является сайтом связывания YY1 у мышей, что, однако, требует экспериментального подтверждения.

Рис. 5. (а) Распределение генов, Alu повторов, CpG островков и LINE повторов (L1) в Х хромосоме человека. Распределение H3-K27m3 взято из [39]. (б) Распределение генов, SINE повторов (B1, B2-B4), CpG островков и L1 в Х хромосоме мыши.

Распределение Xist РНК взято из [35].

Рис. 6. Корреляция между потенциальными сайтами связывания YY1 (YBS) и плотностью Alu повторов (а) и L1 (б) в Х хромосоме человека.

ВЫВОДЫ 1. Транскрипция генов CAML и DNAse II в клетках линий HEK293 и A регулируется Alu повторами, локализованными в их промоторах.

2. Инсерция AluYa5-повтора в 16-й интрон гена ангиотензинпревращающего фермента приводит к формированию в его составе цис-регуляторного модуля и коррелирует с уровнем Phe и Leu+Ile в плазме крови людей.

3. Глобальное распределение Alu повторов человека и SINE повторов мыши (В1, В2) в Х хромосомах коррелирует с распределением CpG островков и белок кодирующих генов.

4. SINE–ассоциированные негативные элементы транскрипции могут служить вспомогательными элементами при формировании факультативного гетерохроматина в ходе инактивации Х хромосомы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Oei S.L., Babich V.S., Kazakov V.I., Usmanova N.M., Kropotov A.V., Tomilin N.V.

2004. Clusters of regulatory signals for RNA polymerase II transcription associated with Alu family repeats and CpG islands in human promoters. Genomics. 83: 873-882.

2. Казаков В.И., Кадурина Т.И., Усманова Н.М., Томилин Н.В. 2003. Влияние инсерционно-делеционного полиморфизма в гене ангиотензин-превращающего фермента на уровень свободных аминокислот в сыворотке крови больных с дисплазиями соединительной ткани. Генетика. 39 (8): 1136-1140.

Имеется перевод: Kazakov V.I., Kadurina T.I., Usmanova N.M., Tomilin N.V. 2003.

Insertion-deletion polymorphism of the angiotensin converting enzyme gene and its relationship to serum levels of free amino acids in the patients with connective tissue dysplasias. Russian Journal of Genetics. 39: 955-959.

3. Усманова Н.М., Казаков В.И., Томилин Н.В. 2008. Ретропозоны Alu-семейства из цис-регуляторных модулей промоторов генов DNAse II и CAML влияют на генную экспрессию в клетках A549 и HEK293. Цитология. 50 (3): 249-255.

4. Усманова Н.М., Казаков В.И., Томилин Н.В. 2008. SINE элементы в геномах млекопитающих могут служить вспомогательными элементами при формировании факультативного гетерохроматина. Цитология. 50 (3): 256-260.

5. Усманова Н.М., Казаков В.И. 2007. Роль Alu повторов в регуляции экспрессии гена дезоксирибонуклеазы II человека. Сборник материалов международной молодёжной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», Томск, Май 9–12. 1: 172-173.

6. Усманова Н.М., Казаков В.И., Томилин Н.В. 2007. Особенности строения промотора гена CAML человека и роль Alu повтора в регуляции экспрессии этого гена. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, Июнь 5–7. 1: 44-45.

7. Усманова Н.М., Казаков В.И., Томилин Н.В. 2007. О роли ретротранспозонов Alu семейства в негативной регуляции транскрипции в клетках человека. Тезисы докладов и сообщений, представленных на II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, Октябрь 16–19, Цитология. 49(6): 800.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Lander E.S. et al. 2001. Nature. 409: 860-921. 2. Makalowski W. 2003. Science. 300:

1246-1247. 3. Slotkin R.K., Martienssen R. 2007. Nat. Rev. Genet. 8: 272-285. 4. Grover D.

et al. 2005. Genetica. 124: 273-289. 5. Hsler J., Strub K. 2006. Nucleic Acids Res. 34:

5491-5497. 6. Paulsen M., Ferguson-Smith A.C. 2001. J. Pathol. 195: 97-110. 7. Polak P., Domany E. 2006. BMC Genomics. 7: 133. 8. Hsler J., Strub K. 2006. Nucleic Acids Res.

34: 2374-2385. 9. Hsler J. et al. 2007. Cell. Mol. Life Sci. 64: 1793-1800. 10. Villard J.

2004. Swiss. Med. Wkly. 134: 571-579. 11. Mandel M., Higa A. 1970. J. Mol. Biol.

53: 159-62. 12. Rigat B. et al. 1992. Nucleic Acids Res. 20: 1433. 13. Shankar R. et al.

2004. BMC Evol. Biol. 4: 37. 14. Berman B.P. et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:

757-762. 15. Halfon M.S. et al. 2002. Genome Res. 12: 1019-1028. 16. Rajewsky N. et al.

2002. BMC Bioinformatics. 3: 30. 17. Weisenberger D.J. et al 2005. Nucleic Acids Res. 33:

6823-6836. 18. Xing J. et al. 2004. J. Mol. Biol. 344: 675-682. 19. Chou S.F. et al. 2003.

Eur. J. Biochem. 270: 1855-1862. 20. Norris J. et al. 1995. J. Biol. Chem. 270: 22777 22782. 21. Caretti G. et al. 2004. Genes Dev. 18: 2627-2638. 22. Hamdi H.K. et al. 2000. J.

Mol. Biol. 299: 931-939. 23. Rigat B. et al. 1990. J. Clin. Invest. 86: 1343-1346. 24. Sayed Tabatabaei F.A. et al. 2006. Circ. Res. 98: 1123-1133. 25. Gordon S. et al. 2006. Oncogene.

25: 1125-1142. 26. Heldring N. et al. 2007. Physiol. Rev. 87: 905-931. 27. Won J. et al.

2002. J. Biol. Chem. 277: 38230-38238. 28. Казаков В.И. и др. 2003. Генетика. 39 (8):

1136-1140. 29. Duthie S.M. et al. 1999. Hum. Mol. Genet. 8: 195-204. 30. Chow J.C. et al.

2005. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6: 69-92. 31. Duret L. et al. 2006. Science. 312:

1653-1655. 32. Norris D.P. et al. 1991. Mamm. Genome. 1: 78-83. 33. Gartler S.M., Riggs A.D. 1983. Annu. Rev. Genet. 17: 155-190. 34. Lyon M.F. 1998. Cytogenet. Cell. Genet.

80: 133-137. 35. Smith K.P. et al. 2004. Chromosoma. 113: 324-335. 36. Ng K. et al. 2007.

EMBO Rep. 8: 34-39. 37. Moss T.J., Wallrath L.L. 2007. Mutat. Res. 618: 163-174. 38. Oei S.L. et al. 2004. Genomics. 83: 873-882. 39. Chadwick B.P., Willard H.F. 2004. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA. 101: 17450-17455.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.