авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Реорганизация системы микротрубочек в ходе эндоцитоза эфр-рецепторных комплексов в интерфазных клетках

На правах рукописи

ХАРЧЕНКО Марианна Викторовна РЕОРГАНИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ МИКРОТРУБОЧЕК В ХОДЕ ЭНДОЦИТОЗА ЭФР-РЕЦЕПТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ В ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008 2

Работа выполнена в Институте цитологии РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, Корнилова Елена Сергеевна, Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Пинаев Георгий Петрович, Институт цитологии РАН кандидат биологических наук Сабанеева Елена Валентиновна, Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского МГУ

Защита состоится 19 декабря 2008 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Электронный адрес: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан ноября 2008 г.

Ученый секретарь Е.В. Каминская диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Эндоцитоз – один из видов везикулярного транспорта, присущего всем эукариотам. В случае эндоцитоза, опосредованного рецептором, лиганд взаимодействует со своим рецептором, находящимся на плазматической мембране, и образовавшийся лиганд-рецепторный комплекс поступает внутрь клетки (интернализуется). Затем комплексы либо рециклируют на плазматическую мембрану, либо деградируют в лизосомах. Лиганд рецепторные комплексы, направляемые на деградацию, переходят в поздние мультивезикулярные эндосомы (МВЭ), локализованные в околоядерной области. В этой части клетки зрелые МВЭ взаимодействуют с лизосомами.

Считается, что такие перемещения происходят с участием компонентов цитоскелета, в том числе, микротрубочек (МТ). Это предположение получило в дальнейшем множество подтверждений, был идентифицирован ряд белков, обеспечивающих взаимодействие эндосом с плюс-концами МТ и движение везикул в сторону центра организации МТ (ЦОМТ), – таких как СLIP170, динеин/динактиновый комплекс, Rab-белки и др. (Folker et al., 2005;

Oda et al., 1995;

Valetti et al., 1999;

Harrison et al., 2003). Перемещения эндосом с периферии клетки в околоядерную область не происходит при обработке клеток агентами, разрушающими МТ (van Deurs et al., 1985;

Соколова и др., 1998;

Xie et al., 2004). Данные различных исследователей о роли МТ в эндоцитозе чрезвычайно противоречивы. Сообщается, например, о замедлении разных стадий эндоцитоза – от сортировки молекул из ранних эндосом в поздние до взаимодействия поздних эндосом с лизосомами после разрушения МТ деполимеризующими агентами (Aniento et al., 1993;

D’Arrigo et al., 1997;

Xie et al., 2004). В других работах эта точка зрения ставится под сомнение (Diaz et al., 1991;

van Deurs et al., 1995;

Соколова и др., 1998).

Клетки, экспрессирующие рецепторы эпидермального фактора роста (ЭФР), широко используются для изучения эндоцитоза, передачи внутриклеточного сигнала, а также взаимосвязи этих двух процессов. За последние два десятилетия были идентифицированы многие белки (такие, как адаптерный белок Eps15, убиквитин-лигаза с-Cbl, малые ГТФазы Rab5 и Rab7, фосфатидилинозитол-3-киназы и др.), участвующие в регуляции эндоцитоза на разных этапах, выяснены некоторые механизмы сортировки. Однако морфология тубулинового цитоскелета после стимуляции эндоцитоза до сих пор не изучалась. В ходе наших исследований роли фосфатидилинозитол-3 киназ 1-го класса в регуляции эндоцитоза было доказано, что они ассоциируются с некими внутриклеточными структурами, отличными от эндосом (Железнова и др., 2003). Эти структуры находятся в области ЦОМТ и совпадают с МТ. В дальнейшем мы впервые описали перестройки тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза, связанные с нарушением радиального расположения МТ.

Цель и задачи исследования Цель настоящей работы выявить основные закономерности перестройки тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза рецептора ЭФР.

Задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. описать изменения системы МТ, происходящие после стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, в культивируемых интерфазных клетках;

2. выявить взаимосвязь характера реорганизации тубулинового цитоскелета от скорости эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов;

3. выяснить, различаются ли МТ на разных стадиях реорганизации по свойствам;

4. оценить участие других типов цитоскелета – актиновых и промежуточных филаментов – в реорганизации микротрубочек в ходе эндоцитоза;

5. выяснить специфичность изменения тубулинового цитоскелета по отношению к различным лигандам и клеточным линиям.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Радиальная система МТ после стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в клетках подвергается последовательным реорганизациям, включающим видимую «фрагментацию» и (или) деполимеризацию МТ и последующее восстановление радиальности.

2. Длительность, характер и степень проявления отдельных этапов реорганизации МТ коррелируют с динамикой эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов. Реорганизация МТ не наблюдается в клетках, в которых рецептор ЭФР не переходит в поздние эндосомы.

3. Радиальные МТ, присутствующие в клетке до начала эндоцитоза, отличаются от «фрагментированых» и радиальных МТ, наблюдаемых на более поздних этапах эндоцитоза, по чувствительности к обработке цитоскелетным буфером и по ацетилированности.

4. Реализация стадии «фрагментации» МТ нуждается в присутствии промежуточных (виментиновых) микрофиламентов, но не зависит от интактности актинового цитоскелета.

Научная новизна работы Впервые показано, что радиальная система МТ претерпевает последовательные изменения в ходе эндоцитоза. Описанный феномен характерен для широкого ряда культивируемых клеточных линий эпителия и фибробластов. Впервые выявлена связь между стадиями эндоцитоза и архитектурой тубулинового цитоскелета. Впервые продемонстрировано, что радиально расположенные МТ на ранних и на поздних стадиях эндоцитоза отличаются по свойствам.

Теоретическое и практическое значение работы Работа имеет фундаментальную направленность. Наши данные позволяют выдвинуть гипотезу о координирующей и интегрирующей роли МТ в ходе эндоцитоза, опосредованного рецепторами ЭФР. Эта гипотеза составляет альтернативу общепринятым представлениям о МТ как о пассивных «рельсах» для перемещения везикул. Теоретические результаты могут быть использованы в курсах лекций по цитологии и молекулярной биологии.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликованы 8 печатных работ (в том числе, статьи). Основные положения были доложены и обсуждались на на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006), на II съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), на 33-й конференции FEBS (Афины, 2008) и на научных семинарах Отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения и списка цитируемой литературы, включающего 212 источников. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста и иллюстрирована 21 рисунком.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Культивирование клеточных линий. В работе использовали клетки эпидермоидной карциномы человека линии А431 и линии HeLa, полученные из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт Петербург) и Европейской коллекции клеточных культур, соответственно. Клетки эпителия молочной железы линии SKBR3 любезно предоставлены проф. С.М.

Деевым (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.A. Овчинникова).

Клетки эмбриональной почки человека HEK 293 любезно предоставлены П.С.

Грудинкиным (Каролинский университет, Швеция). Клетки, экспрессирующие нормальную или мутантные формы рецептора ЭФР человека (HER14, DC165, DC123, DC63), независимо полученные на основе фибробластов мыши линии NIH 3Т3, были любезно предоставлены Дж. Шлессинджером (Нью-Йоркский университет, США).

Клетки эндотелия аорты (PAE А II), трансфицированные плазмидой, кодирующей рецептор ЭФР, слитый с зеленым флуоресцирующим белком, получены от А.Д. Соркина (Университет Колорадо, США).

Все клетки культивировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 7-10 % фетальной сыворотки (РАА, Австрия) при 37 С в атмосфере с 5 % СО2. Клетки выращивали до 50-70 % монослоя. За 12 ч до опыта клетки переводили на среду, содержащую 0,25 % фетальной сыворотки.

Лиганды и их производные. В работе были использованы рекомбинантный ЭФР (Sigma) и ЭФР, выделенный из подчелюстных желез мыши (Никольский и др., 1985), в концентрации 50 нг/мл, рекомбинантный фактор роста тромбоцитов ВВ (PDGF) (Oncogene, Германия) в концентрации 20 нг/мл. Иодирование ЭФР проводили по модифицированному методу Вайли и Каннингама (Wiley, Cunningham, 1982) c Na125I.

использованием иодогена (1,3,4,6-тетрахлор-3,6-дифенилглюкоурила) и Специфическая активность полученного препарата составляла 200-400 тысяч имп./мин на 1 нг ЭФР.

Антитела. Для специфического выявления рецептора ЭФР использовали поликлональные антитела кролика, узнающие экстраклеточный домен рецептора ЭФР человека (любезно предоставлены Д.Б. Твороговым, Университет Вандербильда, США), в разведении 1:500. Моноклональные мышиные антитела против -тубулина (Sigma) использовали в разведении 1:2000, а против ацетилированного тубулина (Sigma) – в разведении 1:1000. В качестве вторых антител использовали конъюгаты GAR-Alexa Fluor 568 и GAM-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Англия) в разведении 1:500. Антитела разводили фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7,4), содержащим 1 % БСА.

Обработка клеток цитохалазином D. Клетки инкубировали в течение 60 мин при 37 С в рабочей среде, содержащей 10 мкМ цитохалазин D (Sigma). Все дальнейшие инкубации проводили в постоянном присутствии цитохалазина в рабочей среде.

Обработка клеток буфером для экстракции растворимых цитоплазматических белков (цитоскелетным буфером). После завершения стимуляции эндоцитоза клетки дважды промывали PBS и инкубировали 1 мин при комнатной температуре в цитоскелетном буфере. Затем клетки дважды промывали PBS и фиксировали 4 %-ным раствором формалина (Sigma) в PBS. Цитоскелетный буфер содержал 20 мМ HEPES (рН 7,2) или 10 мМ PIPES (рН 6,8), 3 мМ MgCl, 50 мМ NaCl, 10 % глицерин, 0,1 % Triton-X100, 1 мМ Na3V04, 1 мМ NaF и коктейль протеазных ингибиторов (Invitrogen,США).

Исследование динамики эндоцитоза проводили по схеме предварительного связывания и по схеме импульсной загрузки лиганда.

Предварительное связывание. Для связывания лиганда с рецепторами клетки инкубировали в рабочей среде Игла, содержащей 0,1 % БСА и 20 мМ HEPES (pH 7,4) при С в течение 60 мин в присутствии лиганда. После 5-кратной отмывки PBS от несвязавшегося лиганда эндоцитоз стимулировали переводом клеток в среду, не содержащую лиганд, нагретую до 37 С, на указанное время.

Импульсная загрузка лиганда. Для связывания лиганда с рецепторами монослойные культуры клеток инкубировали в рабочей среде Игла, содержащей 0,1 % БСА и 20 мМ HEPES (pH 7,4) при 37 С в течение 15 мин в присутствие лиганда. После 5-кратной отмывки теплой средой (20 С), клетки переводили в рабочую среду, не содержащую лиганда (при 37 С), на указанное время с учетом 15-минутной инкубации.

Субклеточное фракционирование в градиенте плотности 17 %-ного Перколла позволяет разделить внутриклеточный пул везикул на три основные фракции - ранних эндосом (1,04 г/мл, 8-12-я фракция), поздних эндосом (1,05 г/мл, 3-6-я фракция) и лизосом (1,07 г/мл, 1-4-я фракция). Для изучения распределения эндоцитированного ЭФР внутри клеток мы собирали клетки в буфер ТЭС (10 мМ триэтаноламина, 250 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, рН 6,8) и после осаждения ядер и неразбитых клеток надосадок смешивали с Перколлом, конечная концентрация которого составляла 17 %. Градиент формировали мин при 50000 g на центрифуге Spinko L2-65K с угловым ротором 65 (Beckman).

Фракционирование градиента на 17 фракций проводили со дна пробирки через иглу.

Измерение радиоактивности проб осуществляли на гамма-счетчике Mini-Gamma (LKB).

Количественную оценку радиоактивности интернализованного и деградированного лигандов проводили по программе «Градиент». Результаты выражали в относительных единицах, полученных путем приведения радиоактивности каждой фракции к общей радиоактивности, первоначально связанной клетками.

Определение степени деградации лиганда. Количество деградированного лиганда определяли методом осаждения высокомолекулярных пептидов раствором, содержащим 5 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 1 % фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК). Для этого после окончания инкубационного периода среду сливали и смешивали с раствором ТХУ/ФВК в объемном соотношении 1:6. Через 2 ч инкубации при 4 С смесь подвергали центрифугированию при 6000 об./мин на центрифуге К23, осадок промывали аналогичным образом 2 раза, надосадочную жидкость собирали и по содержащейся в нем радиоактивности оценивали количество деградированного лиганда.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток. После окончания инкубации клетки дважды промывали PBS, а затем фиксировали 4 %-ным раствором формалина (Sigma) на PBS при комнатной температуре в течение 15 мин. После этого клетки промывали 5 раз по 3 мин раствором PBS и обрабатывали 15 мин при комнатной температуре раствором PBS, содержащим 0,5 % Triton-X 100 (Sigma). Неспецифическое окрашивание блокировали инкубацией в растворе БСА (1 %), приготовленном на PBS, 30 мин при комнатной температуре. С первыми антителами клетки инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После этого промывали 3 раза по 5 мин раствором PBS, содержащим 0,1 % Tween 20 (BioRad). Инкубацию со вторыми антителами проводили 30 мин при комнатной температуре. Потом промывали, как описано выше. Для выявления актина использовался 6,6 мкМ раствор родамин-фаллоидин (Invitrogen).

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Распределение флуоресцентно-меченных белков в клетках изучали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL (Zeiss, Германия). Зеленую флуоресценцию возбуждали аргоновым лазером (488 нм), красную – He-Ne лазером (543 нм). Флуоресценцию на разных длинах волн сканировали раздельно с помощью программы Leica Confocal Software. Анализ изображений выполняли с помощью программы ImageJ 1.40g (National Institute of Health, Maryland, USA). На черно-белых рисунках приведено инвертированное изображение.

Измерение интенсивности флуоресценции антител, связанных с тубулином, в цитоплазме клеток. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью программы ImageJ 1.40g. Была использована методика, разработанная для оценки соотношения свободных и связанных с ЦОМТ МТ (Смурова и др., 2007). Исследуемую область клетки от ЦОМТ до ее периферии разделили на 10 равных отрезков, на каждом из которых определяли среднюю интенсивность флуоресценции с 95 %-ным доверительным интервалом. Измерения проведены для 5 клеток каждого типа.

Воспроизводимость экспериментов. Все эксперименты проводили не менее 3 раз.

Для анализа выбирали клетки с максимальной степенью распластывания, на краю или вне островков монослоя. Для каждой временной точки просматривалось по крайней мере по три поля (около 20-30 клеток) на двух разных стеклах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Реорганизация тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза ЭФР рецепторных комплексов (Железнова и др., 2003;

Харченко и др., 2007;

Kharchenko et al., 2007;

Kornilova et al., 2008). Для исследования эндоцитоза, опосредованного рецепторами, используют два подхода: импульсную загрузку и предварительное связывание лиганда. При импульсной загрузке лиганд добавляли к клеткам при температуре 37 С и удаляли через определенное время. Такая постановка эксперимента приближена к физиологическим условиям, однако, процессы связывания лиганда с рецепторами, интернализация и переход в поздние эндосомы лиганд-рецепторных комплексов перекрываются во времени. Альтернативно используется схема предварительного связывания: при 4 С лиганд связывается с рецептором на поверхности клетки, но лиганд-рецепторные комплексы не подвергаются интернализации. Дальнейшее нагревание клеток до 37 С стимулирует синхронную волну транспортных событий. Недостатком метода является необходимость охлаждения клеток, приводящего к деполимеризации структур цитоскелета во многих типах клеток. Мы исследовали эндоцитоз ЭФР рецепторных комплексов и реорганизацию тубулинового цитоскелета в клетках HeLa с помощью методов двойной непрямой иммунофлуоресценции и параллельного субклеточного фракционирования в градиенте плотности Перколла, используя обе схемы стимуляции клеток, для того чтобы установить их применимость и адекватность.

При использовании метода импульсной загрузки 125I-ЭФР выявлялся в везикулах с большим разбросом по плавучей плотности, от очень низкого до максимального, характерного для лизосом (рис. 1 А). Наибольшее количество радиоактивной метки приходилось на чуть более тяжелые везикулы, чем в Рис. 1. Компартментализация (А) и деградация (Б) 125I-ЭФР в ходе эндоцитоза при использовании методик предварительного связывания и импульсной загрузки лиганда. Отмечены фракции лизосом (Лиз), поздних и ранних эндосом (ПЭ и РЭ).

случае предварительного связывания, для той же временной точки. Общее количество интернализованного 125I-ЭФР также было выше при импульсной загрузке лиганда. В этом случае также наблюдался более быстрый выход радиоактивной метки во внеклеточную среду, что свидетельствует о более высокой скорости деградации 125I-ЭФР в лизосомах, чем в случае предварительного связывания лиганда (рис. 1 Б). Мы объясняем эти различия синхронным, но относительно медленным из-за постепенного нагревания протеканием стадий эндоцитоза в случае предварительного связывания лиганда. Методом иммунофлуоресценции также было показано, что при импульсной загрузке лиганда содержание рецептора ЭФР во внутриклеточных пузырьках было больше, и перераспределение везикул в околоядерную область происходило быстрее, чем при предварительном связывании лиганда (рис. 2, 3).

При анализе реорганизации тубулинового цитоскелета с использованием схемы импульсной загрузки (рис. 2) мы выявили следующие изменения. До добавления ЭФР сеть МТ была радиальной. Через 30 мин после стимуляции эндоцитоза, одновременно с перераспределением везикул, содержащих рецептор ЭФР, в область ЦОМТ, существенно увеличивалась интенсивность окрашивания тубулина в околоядерной области, а на периферии клетки появлялись спутанные МТ. Через 90 мин после стимуляции эндоцитоза тубулиновый цитоскелет переходит в изначальное состояние (радиальная сеть МТ максимально сконцентрирована вокруг ЦОМТ и занимает всю периферию клетки). Это совпадало по времени с уменьшением интенсивности окрашивания околоядерных структур, содержащих рецептор ЭФР, что свидетельствует о начале деградации рецептора.

Более четкие изменения тубулинового цитоскелета наблюдались при стимуляции эндоцитоза рецептора ЭФР по схеме предварительного связывания (рис. 3). После инкубации клеток при 4 С происходила разборка МТ. Через 15 мин после стимуляции эндоцитоза восстанавливалась радиальная сеть МТ. В это время мелкие везикулы, содержащие рецептор ЭФР, детектировались на периферии клеток. Затем параллельно с увеличением размера эндосом и перемещением их к центру клетки (30 и 60 мин) число длинных радиальных МТ уменьшалось, а интенсивность окрашивания тубулина вокруг ЦОМТ усиливалась. В целом система приобретала «губкоподобный» вид (спутанная сеть МТ), отдельные МТ укорачивались, возможно, фрагментировались и даже частично деполимеризовались.

Разрешение метода иммунофлуоресценции не позволяет нам утверждать, что имеет место истинная фрагментация. Возможно, что наблюдаемая спутанная сеть вызвана изменением связывания специфических антител с тубулином из за экранирования МТ какими-то белками. В результате этого длинная МТ может выглядеть как набор фрагментов. При этом очевидно, что сеть МТ утрачивает радиальность и что появляются отдельные сильно изогнутые МТ.

Рис. 2. Выявление рецептора ЭФР и тубулина методом иммунофлуоресценции в клетках HeLa. Эндоцитоз ЭФР стимулировали по схеме импульсной загрузки лиганда.

Рис. 3. Выявление рецептора ЭФР и тубулина методом иммунофлуоресценции в клетках HeLa. Эндоцитоз ЭФР стимулировали по схеме предварительного связывания лиганда.

Наибольшие изменения претерпевали МТ именно в той области, в которой концентрировались эндосомы. Стадия дезорганизации радиальной системы совпадала с переходом ЭФР-рецепторных комплексов в поздние эндосомы по данным субклеточного фракционирования. В дальнейшем радиальная система МТ восстанавливалась. Эта стадия совпадала по времени с уменьшением окрашивания везикул антителами к рецептору ЭФР и появлением продуктов деградации 125I-ЭФР в среде, то есть со стадией лизосомальной деградации ЭФР и рецептора ЭФР. Степень «фрагментации» и деполимеризации различалась от эксперимента к эксперименту: внешний вид тубулинового цитоскелета варьировал от «губкоподобного» до почти деполимеризованного, с несколькими длинными и изогнутыми МТ.

Наши данные свидетельствуют о том, что методика предварительного связывания рецептора с ЭФР принципиально не изменяет путь лиганд рецепторных комплексов в клетке, но, в то же время, синхронизирует и несколько замедляет прохождение этих молекул через компартменты клетки, по сравнению с импульсной загрузкой лиганда. Реорганизация тубулинового цитоскелета также происходит при использовании любой из методик, хотя в случае предварительного связывания она более выражена и при этом замедлена. Также мы доказали, что изменения тубулинового цитоскелета не вызваны нагреванием клеток после охлаждения при предварительном связывании лиганда: уже через 5 мин после перевода клеток в среду температурой 37 оС в отсутствие ЭФР система МТ восстанавливалась и сохраняла радиальность по крайней мере несколько часов (данные не представлены). Таким образом, методика предварительного связывания дает более четкую картину и физиологически значимые данные. Все дальнейшие результаты получены с применением схемы предварительного связывания лиганда.

Описанная нами реорганизация тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза наблюдалась не только в клетках HeLa, но и во многих других эпителиальных и фибробластоподобных клеточных линиях (А431, SKBR-3, PAE A II, HEK 293, NIH 3T3, Her 14). Кроме того, схожие изменения тубулинового цитоскелета были обнаружены при стимуляции эндоцитоза фактором роста тромбоцитов (PDGF), хотя их скорость обычно была выше, чем в случае ЭФР (данные не представлены). Таким образом, наблюдаемый феномен в большей степени связан со стадиями эндоцитоза, чем с определенной линией клеток или определенным лигандом.

Реорганизация тубулинового цитоскелета в клетках с разной скоростью эндоцитоза (Kharchenko et al., 2007). Ранее было показано (Авров и др., 1996;

Melikova et al., 2006), что в различных экспериментах клетки отличаются по скорости интернализации, сортировки лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы, рециклирования и деградации.

Перечисленные параметры могут варьировать в широких пределах даже в клетках одной и той же линии в зависимости от внешних условий. Можно выделить два крайних варианта эндоцитоза – «медленный» и «быстрый».

Выше были приведены данные для клеток с быстрым эндоцитозом, с эффективной лизосомной деградацией рецептора (рис. 3). Для быстрого эндоцитоза характерна смена стадии радиальности сети МТ на стадию дезорганизации или фрагментирования с последующим восстановлением радиальности. В клетках с медленным эндоцитозом, в которых сортировка рецептора в поздние эндосомы и его деградация оказывались неэффективными, транспорт эндосом в околоядерную область уменьшался вплоть до полного прекращения. При такой динамике эндоцитоза изначальные радиальные МТ в незначительной степени фрагментировались, а затем полностью деполимеризовались (рис. 4). Даже через 150 мин после начала стимуляции эндоцитоза радиальная сеть МТ не восстанавливалась. При этом эндосомы не увеличивались в размере, что свидетельствует о подавлении процесса их созревания.

Мы можем заключить, что при стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов стадия перехода лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы сопровождается «спутыванием», «фрагментацией» и (или) деполимеризацией МТ, в то время как деградация ЭФР коррелирует с восстановлением радиальности. Эта корреляция со стадиями эндоцитозного пути справедлива для обоих методов стимуляции клеток и для обоих типов эндоцитоза, несмотря на различие временных параметров. Результаты свидетельствуют о том, что вся последовательность реорганизаций системы МТ не запрограммирована изначально на ранней стадии эндоцитоза. Мы предполагаем, что сигналы на реорганизацию сети МТ и на ее восстановление формируются на разных стадиях эндоцитоза, с различающихся по степени «зрелости» эндосом.

Чувствительность МТ к экстракции и степень ацетилирования тубулина изменяются в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов (Kharchenko et al., 2007). Соотношение свободных и ассоциированных с ЦОМТ МТ одна из важных характеристик тубулинового цитоскелета.

Существует подход для оценки этого параметра по скорости падения интенсивности флуоресценции тубулина от центра к периферии клетки она выше для клеток с преобладанием МТ, связанных с ЦОМТ (Смурова и др., 2007). Применение этой модели к нашим данным показало, что клетки с радиальной организацией тубулинового цитоскелета различаются по соотношению свободных и связанных с ЦОМТ МТ, при этом преобладают МТ, связанные с ЦОМТ (рис. 5 А, Б). В клетках с деполимеризованным тубулином интенсивность флуоресценции слабо меняется от центра к периферии клетки (рис. 5 Г, Д). Наибольший интерес представляет описание «губкоподобной» организации тубулинового цитоскелета (рис. 5 В). В большинстве таких клеток хорошо выявляется ЦОМТ. Падение интенсивности флуоресценции антител, связанных с тубулином, от ЦОМТ к периферии таких клеток, близкое к Рис. 4. Совместное выявление рецептора ЭФР (отдельные везикулы указаны стрелкой) и тубулина в клетках HeLa с разной скоростью эндоцитоза.

Рис. 5. Изменения интенсивности флуоресценции антител, связанных с тубулином, от ЦОМТ к периферии клеток с разной организацией МТ цитоскелета (А, Б – радиальная сеть МТ;

В - губкоподобная сеть;

Г, Д – деполимеризация тубулина, полная и частичная, соответственно).

линейному, соответствует предположению о преобладании «свободных» МТ разной длины. По причине большого разброса между отдельными клетками точно оценить параметры зависимостей между интенсивностью флуоресценции и расстоянием от ЦОМТ не представляется возможным.

Для оценки доли деполимеризованного тубулина и незакрепленных фрагментов МТ в клетках на разных стадиях эндоцитоза мы использовали раствор для экстракции растворимых цитоплазматических белков, далее Рис. 6. Выявление тубулина методом иммунофлуоресценции в клетках HeLa до и после обработки клеток цитоскелетным буфером (ЦБ) HEPES (рН 7,2).

А – клетки с быстрой сортировкой лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы. Б – клетки с медленной интернализацией называемый цитоскелетным буфером. Такая методика позволяет удалить из клетки все молекулы, растворенные в цитоплазме, в том числе димеры тубулина. Мы ожидали разделить полимеризованный и деполимеризованный тубулин, однако использование цитоскелетного буфера (на основе HEPES рН 7.2) дало парадоксальные результаты. Радиальные МТ в контрольных клетках практически полностью вымывались, в них оставались единичные искривленные МТ разной длины (рис. 6). Когда же в необработанных буфером клетках МТ приобретали наиболее спутанный, фрагментированный вид («губкоподобная» организации тубулинового цитоскелета), обработка клеток цитоскелетным буфером практически не изменяла морфологию МТ цитоскелета. На рис. 6 А представлен случай эндоцитоза с быстрой сортировкой в поздние эндосомы. В клетках с медленной интернализацией максимальная дезорганизация МТ наблюдается через 60 мин после стимуляции эндоцитоза. Радиальные МТ, существовавшие в клетках до этой стадии, также чувствительны к действию буфера, тогда как фрагментированные дезорганизованные МТ – нет (рис. 6 Б). Таким образом, «фрагментированная», дезорганизованная сеть МТ отличается устойчивостью к действию цитоскелетного буфера вне зависимости от времени ее возникновения.

Радиальная сеть МТ, восстановившаяся на стадии деградации рецептора ЭФР, оказалась устойчивой к экстракции цитоскелетным буфером. Эти данные позволяют предположить, что свойства МТ в ходе эндоцитоза изменяются.

Применение цитоскелетного буфера на основе PIPES (pH 6.8) дало в целом схожие результаты.

Одной из возможных посттрансляционных модификаций МТ, влияющих на их стабильность, является ацетилирование тубулина (McKean et al., 2001). В контрольных клетках ацетилирование тубулина было выражено слабо – были видны только отдельные короткие ацетилированные участки МТ (рис. 7).

После стимуляции эндоцитоза постепенно происходило ацетилирование участков МТ, приближенных к ЦОМТ. На стадии восстановления радиальной сети МТ их ацетилированнность значительно увеличивалось, и протяженные ацетилированные участки МТ оказывались распределенными по всей длине МТ. Таким образом, восстановленная радиальная структура тубулинового цитоскелета отличается от исходной устойчивостью к экстракции и усилением ацетилирования.

Зависимость реорганизации сети МТ от других типов цитоскелета (Kornilova et al., 2008). Наши данные позволяют предположить, что фрагменты МТ могут стабилизироваться в околоядерной зоне, возможно, за счет взаимодействия с другими элементами цитоскелета. Поэтому мы попытались выяснить, существенны ли микрофиламенты и промежуточные виментиновые филаменты для вышеописанной реорганизации МТ. В условиях коллапса актиновых структур под действием цитохалазина D реорганизация системы МТ в ходе эндоцитоза протекала без нарушений. Можно заключить, Рис. 7. Ацетилирование тубулина при реорганизации системы МТ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в клетках HeLa.

что изменения тубулинового цитоскелета не связаны с реорганизацией актиновой сети.

Для проверки влияния промежуточных филаментов на перестройку сети МТ были использованы клетки мыши и MFT-6, лишенные гена виментина, и клетки MFT-16 с восстановленной экспрессией виментина. В клетках обеих линий до стимуляции эндоцитоза мы наблюдали спутанную сеть МТ (рис. 8). В клетках MFT-16 эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов приводит к фрагментации МТ, в некоторых клетках наблюдается частичная деполимеризация (30-90 мин). Подобных изменений в клетках, лишенных виментина, не происходит. Таким образом, можно предположить непосредственное участие виментина в реорганизации системы МТ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов.

Рис. 8. Изменение организации тубулинового цитоскелета зависит от промежуточных филаментов (виментина).

Реорганизация тубулинового цитоскелета в клетках, экспрессирующих мутантные формы рецептора ЭФР (Корнилова и др., 2005). Чтобы подойти к ответу на вопрос о том, какие сигналы инициируют преобразования, мы использовали клеточные линии, полученные на основе фибробластов мыши NIH 3Т3, экспрессирующие нормальную и мутантные формы рецептора ЭФР человека. Эти формы лишены С-терминальных доменов разной длины, несущих сайты связывания с сигнальными субстратами рецептора (СD165, СD123, CD63). Одной из особенностей этих клеток является разная динамика эндоцитоза (Корнилова и др., 2005). Так, лиганд-рецепторные комплексы в клетках CD165 не попадают в поздние эндосомы, а в основном рециклируют из ранних. В клетках СD123 комплексы сортируются в поздние эндосомы с низкой эффективностью, а CD63 с эффективностью, присущей нормальному рецептору (HER14) (рис. 9 Б). В клетках линий HER14, CD63 и CD123 эндоцитоз рецептора ЭФР приводит к описанной выше фрагментации МТ (15 мин), а потом и к деполимеризации тубулина (60 мин). В то же время, радиальная система МТ в клетках CD сохраняется в ходе всего эксперимента и не подвергается никаким изменениям. Таким образом, способность рецептора ЭФР к переходу в поздние эндосомы может быть критичной для инициации перестроек тубулинового цитоскелета.

Рис. 9. Стимуляция эндоцитоза рецептора ЭФР в фибробластах мыши, экспрессирующих нормальную (HER 14) или мутантные формы рецептора ЭФР человека (DC63, DC123, и DC165). Выявление тубулина в клетках методом иммунофлуоресценции (А);

компартментализация 125I-ЭФР ходе эндоцитоза (Б): по оси абсцисс – количество 125I-ЭФР во фракции, %;

по оси ординат – номер фракции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Приведенные результаты позволяют предположить, что для начала реорганизации радиальной системы МТ необходимо достижение рецептор содержащими эндосомами определенной стадии зрелости, по-видимому, соответствующей переходу в поздние эндосомы. Для созревания поздних эндосом необходимо участие определенных сортирующих комплексов, компоненты которых могут взаимодействовать с белками, дестабилизирующими МТ (Tsang et al., 2006). Например, есть сообщения о том, что компонент ESCRTI-комплекса, TSG101, способен взаимодействовать со статмином. Статмин привлекает наше внимание также и потому, что по крайней мере два сигнальных каскада способны изменять активность статмина - МАР-киназный каскад приводит к фосфорилированию статмина, а STAT образует комплексы со статмином в неактивированном состоянии. Кроме того, статмин не является единственным кандидатом, список белков, способных взаимодействовать как с эндосомами, так и с МТ, постоянно растет. Поэтому, хотя из общих соображений, а также из данных, полученных на мутантах, было бы разумно предположить, что такие модификации МТ должны стимулироваться при достижении эндосомами, нагруженными любым грузом, направляемым на лизосомную деградацию, определенной степени «зрелости», нельзя исключать вероятность того, что и передача сигнала с рецептора участвует в регуляции реорганизаций МТ. Аналогично, сигналом к восстановлению системы тубулинового цитоскелета может служить слияние поздних МВЭ с лизосомами или отсоединение вторичных МВЭ.

Характерно, что радиальная сеть МТ присутствует именно на тех стадиях эндоцитоза, которые нуждаются в радиальном перемещении везикул.

Действительно, на ранних этапах эндоцитоза необходимо переместить ранние эндосомы в околоядерную область. Передвижение везикул на стадиях формирования МВЭ и существования гибридной эндо-лизосомы не нужно.

Вторичные МВЭ после отделения от лизосом, по-видимому, выводятся из клеток экзоцитозом с участием МТ. Действительно, появление продуктов деградации ЭФР имеет место при восстановлении радиальных МТ. Косвенно это подтверждается тем, что количество ацетилированного тубулина, предпочтительно взаимодействующего с кинезинами (Reed et al., 2006), значительно возрастает, когда деградация ЭФР-рецепторных комплексов достигает максимальной скорости. Тем не менее, реальная картина может быть гораздо сложнее схем, рассматривающих только транспортную функцию МТ.

Например, при фрагментации и деполимеризации МТ могут высвобождаться сигнальные молекулы, депонированные на МТ. Таким образом, МТ, как и цитоскелет в целом, могут играть роль интегратора транспортных и сигнальных процессов.

ВЫВОДЫ 1. Радиальная система МТ в культивируемых интерфазных клетках подвергается последовательным реорганизациям при стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов. Стадия перехода лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы сопровождается видимой «фрагментацией» и (или) деполимеризацией МТ, в то время как выход продуктов деградации ЭФР во внеклеточную среду коррелирует с восстановлением радиальности сети МТ.

2. Длительность, характер и степень проявления отдельных этапов реорганизации МТ связана с динамикой эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов.

3. Радиальные МТ, поддерживающие перенос ранних эндосом в околоядерную область, отличаются от «фрагментированых» и радиальных МТ, наблюдаемых на более поздних этапах эндоцитоза, по чувствительности к обработке цитоскелетным буфером и по ацетилированности.

4. Реализация стадии «фрагментации» МТ нуждается в присутствии промежуточных (виментиновых) микрофиламентов, но не зависит от интактности актинового цитоскелета.

5. В клетках, экспрессирующих мутантную форму рецептора ЭФР, не способную к переходу в поздние эндосомы, перестроек тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза не наблюдается. Можно предполагать, что для начала изменений тубулинового цитоскелета необходимо достижение эндосомами определенной степени зрелости, т.е. их ассоциация с определенными белковыми комплексами.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Железнова Н.Н., Меликова М.С., Харченко М.В., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С.

2003. Роль фосфатидилинозитол-3-киназ p85/p110 и hVPS34 в эндоцитозе ЭФР рецепторных комплексов. Цитология. 45 (6): 574- 2. Харченко М.В., Корнилова Е.С., Меликова М.С. 2007. Изменение организации системы микротрубочек в ходе эндоцитоза рецептора ЭФР. Цитология. 49 (3): 236- 3. Kharchenko M.V., Aksyonov A. A., Melikova M.M., Kornilova E.S. 2007. Epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis is accompanied by reorganization of microtubule system in HeLa cells. Cell Biol. Int. 31: 349-359.

5. Корнилова Е.С., Харченко М.В., Авров К.О. 2005. Роль эндоцитоза в регуляции сигналов, стимулируемых рецепторами эпидермального фактора роста. Тезисы Международной конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация”: 12-13.

6. Харченко М.В., Аксенов А.А., Шрамко Б.В., Корнилова Е.С. 2006. Реорганизация тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в культивируемых клетках. Цитология. 48: 808.

7. Харченко М.В., Злобина М.В., Шрамко Б.В., Корнилова Е.С. 2007. Характер реорганизации радиальной системы микротрубочек в клетках HeLa с различной динамикой эндоцитоза. Цитология. 49 (9): 803.

8. Kornilova E.S., Zlobina M.S., Kharchenko M.V. 2008. Interphase microtubules undergo reorganizations at late stages of EGF receptor degradative pathway. Abstracts of 33rd FEBS Congress: 253.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Авров К.О., Благовещенская А.Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1996.

Зависимость типа эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов от базального уровня активности тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 38(10):

1084-1091.

Железнова Н.Н., Меликова М.С., Харченко М.В., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С.

2003. Роль фосфатидилинозитол-3-киназ p85/p110 и hVPS34 в эндоцитозе ЭФР рецепторных комплексов. Цитология. 45: 574-581.

Корнилова Е.С., Харченко М.В., Авров К.О. 2005. Роль эндоцитоза в регуляции сигналов, стимулируемых рецепторами эпидермального фактора роста. Тезисы Международной конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация”: 12-13.

Смурова К.М., Алиева И.Б., Воробьев И.А. 2007. Свободные и связанные с центросомой микротрубочки: количественный анализ и моделирование двухкомпонентной системы.

Цитология. 49: 270-279.

Соколова И.П., Арнаутов А.М., Благовещенская А.Д., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 1998. Влияние нокодазола на эндоцитоз рецептора эпидермального фактора роста.

Цитология. 40: 855-681.

Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. 1993. Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to late endosomes. J. Cell Biol. 123: 1373.

D'Arrigo A., Bucci C., Toh B.H,, Stenmark H. 1997. Microtubules are involved in bafilomycin A1-induced tubulation and Rab5-dependent vacuolation of early endosomes. Eur J Cell Biol.

72(2): 95-103.

Diaz E., Pfeffer S.R. 1998. TIP47: a cargo selection device for mannose 6-phosphate receptor trafficking. Cell. 93(3): 433-443.

Folker E., Baker B., and Goodson H. 2005. Interaction of the Microtubule Cytoskeleton with Endocytic Vesicles and Cytoplasmic Dynein in Cultured Rat Hepatocytes. J. Biol. Chem. 270:

15242.

Harrison R., Bucci C., Vieira O., Schroer T., Grinstein S. 2003. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23: 6494-6506.

Kharchenko M.V., Aksyonov A. A., Melikova M.M., Kornilova E.S. 2007. Epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis is accompanied by reorganization of microtubule system in HeLa cells. Cell Biol. Int. 31: 349-359.

Kornilova E.S., Zlobina M.S., Kharchenko M.V. 2008. Interphase microtubules undergo reorganizations at late stages of EGF receptor degradative pathway. Abstracts of 33rd FEBS Congress: 253.

McKean P.G., Vaughan S., and Gul K. 2001. The extended tubulin superfamily. J. Cell Sci.

114: 2723-2733.

Melikova M.S., Kondratov K.A., and Kornilova E.S. 2006. Two different stages of epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis are sensitive to free ubiquitin depletion produced by proteasome inhibitor MG132. Cell Biol. Int. 30(1): 31-43.

Oda H., Stockert R.J., Collins C., Wang H., Novikoff P.M., Satir P., Wolkoff A.W. 1995.

Interaction of the Microtubule Cytoskeleton with Endocytic Vesicles and Cytoplasmic Dynein in Cultured Rat Hepatocytes. J. Biol. Chem. 270: 15242.

Reed N.A., Cai D., Blasius T.L., Jih G.T., Meyhofer E., Gaertig J., Verhey K.J. 2006.

Microtubule acetylation promotes kinesin-1 binding and transport. Curr Biol. 16(21): 2166-2172.

Tsang H.T., Connell J.W., Brown S.E., Thompson A., Reid E., Sanderson C.M. 2006. A systematic analysis of human CHMP protein interactions: additional MIT domain-containing proteins bind to multiple components of the human ESCRT III complex. Genomics. 88: 333 346.Valetti C., Wetzel D.M., Schrader M., Hasbani M.J., Gill S.R., Kreis T.E., Schroer T.A.

1999. Role of Dynactin in Endocytic Traffic: Effects of Dynamitin Overexpression and Colocalization with CLIP-170. Mol. Cell. Biol. 23: 6494-6506.

Van Deurs B., Holm P.K., Kayser L., Sandvig K. 1995. Delivery to lysosomes in the human carcinoma cell line Hep-2 involves an actin filament-facilitated fusion between mature endosomes and preexisting lysosomes. Eur. J. Cell Biol. 66: 309-323.

Xie J., Quan L., Wang Y., Hamma-Alvares S.F., Mircheff A.K. 2004. Role of the microtubule cytoskeleton in traffic of EGF through the lacrimal acinar cell endomembrane network. Exp Eye Res. 78(6): 1093-1106.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.