авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Новый споровый пробиотик ирилис и его использование в ветеринарной практике

На правах рукописи

МЕФЁД Кирилл Михайлович НОВЫЙ СПОРОВЫЙ ПРОБИОТИК ИРИЛИС И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВЕТЕРИНАРНОЙ ПРАКТИКЕ 03.00.07 –микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета Государственно го образовательного учреждения высшего профессионального образования Российского университета дружбы народов

Научный консультант:

доктор биологических наук Осипова Ирина Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук член-корр. РАСХН Девришов Давуд Абдулсемедович доктор биологических наук профессор Смирнова Ирина Павловна

Ведущая организация:

Государственное учреждение науки «Всероссийский научно-исследовательский и техно логический институт биологической промышленности»

Защита состоится «30» мая 2007 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д212.203.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессиональ ного образования Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8. корп. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образова тельного учреждения высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан «_»2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент О. Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Согласно данным Департамента ветеринарии РФ, па тология ЖКТ инфекционной этиологии, в общей структуре заболеваний молодняка животных составляет до 75% (Антипов В. А. и соавт., 1980;

1992, Лоенко Н. Н. и соавт. 2002;

Наташкина М.Ю., 2006).

Особенности этиологии и патогенеза инфекционных желудочно-кишечных заболеваний молодняка неонатального возраста связаны со структурными, количе ственными и качественными нарушениями в микробиоценозе кишечника, сниже нием активности колострального иммунитета, низкой естественной резистентно стью, повышенной восприимчивостью новорожденных к бактерийным и вирусным антигенам, поступающим пероральным путем (Малик Н. И., 2002;

Alexopoulus C.

et al., 2004).

Особенно остро эта проблема стоит в одной из приоритетных областей пуш ного животноводства – кролиководческой отрасли. По данным НИИ Пушного зве роводства и кролиководства до 50% новорожденных крольчат подвержены различ ным инфекционным заболеваниям. Падеж молодняка наблюдается в первые дней жизни в основном от острых кишечных инфекций и пневмонии различной этиологии (Рютова В. П. 1986, Плугина И. В. 2004;

Стрижаков А.А., 2006).

Использование антибиотиков для профилактики желудочно-кишечных бо лезней, ассоциированных с дисбиотическими явлениями в микробиоценозе кишеч ника животных, проблему усугубило. Негативные последствия фармакологическо го прессинга выразились в нарастании быстрыми темпами множественной лекарст венной резистентности условно патогенных микроорганизмов, адаптации бакте рий к несвойственным им экологическим нишам, появлении и циркуляции в хозяй ствах высоко вирулентных штаммов эшерихий, сальмонелл, стафилококков, иер синий, кампилобактерий и др. микроорганизмов (Куликовский А. В., 1997, Киржа ев Ф. С.,1999, Бакулина Л. Ф., 2001).

С 2007 г в странах Евросоюза вводится полный запрет на использование пищевых антибиотиков ветеринарного назначения (H.A. Hong et al., 2005). Выше изложенное, заставляет исследователей пересмотреть многие методологические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болез ней, возбудителями, которых являются условно патогенная бактериальная микро флора. Недостаточная эффективность традиционных мероприятий, направленная на повышение сохранности молодняка, обусловливает необходимость применения принципиально новых эффективных препаратов (G. M. M. Quigley, B. Flourie, 2007).

Наиболее полно этим требованиям отвечают пробиотики – препараты, содер жащие живые микроорганизмы. Аспекты использования пробиотиков в ветерина рии затрагивают широкий круг проблем, который включает коррекцию кишечного биоценоза, иммунной, гормональной и ферментной систем животных (T. W. Tan nock, 1997, M. De Angelis, 2007, A. E. Flinterman, 2007).

В последние годы в ветеринарной практике в качестве препаратов пробиотиков для терапии и профилактики желудочно-кишечных и других инфек ций находят широкое применение бактерии рода Bacillus (M. R. Oggioni et al, 2003).

В странах Евросоюза активно используются препараты Paciflor® C10, основу кото рого составляет штамм B. cereus ATCC 1489;

Toyocerin (B. cereus var toyoi NCIMB 40112/CNCM-1012);

BioPlus 2B (B. subtilis DSM 5750 и B. licheniformis DSM 5749) и некоторые другие (H.A. Hong et al., 2004, 2005). Следует отметить, что только японский препарат Toyocerin с успехом применяется при лечении заболеваний кроликов (T. T. Hoa et al., 2001;

2003).

В ветеринарную практику Российской Федерации внедрены несколько ба циллярных пробиотических препаратов: Споровит, Ветом-4, СЛ-бактерин, Споро лакт, Ветбактерин, Субтилис, Биоплюс 2Б (Литвин В.П. и др.,1986.;

Бакулина Л.Ф.

и др., 2001;

Литвин В.П. и др., 1986;

Ноздрин Г.Л. и др., 1997;





Alexopoulus C. et al., 2004). Но ни один из перечисленных пробиотиков не применяется в кролиководст ве. В последнее время российскими учеными разработан новый ветеринарный пре парат Ирилис, включающий штаммы B. subtilis ВКПМ 2335 и B. licheniformis ВКПМ 2336 и обладающий рядом преимуществ перед отечественными и зарубеж ными аналогами (Сорокулова И.Б. с соавт., 2006). Однако этот препарат также не испытывался в кролиководстве.

Использование бациллярных препаратов в ветеринарии делает необходимым тщательное изучение безопасности применяемых культур. В тоже время, практиче ски отсутствуют данные об изучении патогенности используемых штаммов про биотиков.

Кроме того, также требуют совершенствования методы и критерии оценки биологических свойств штаммов, обеспечивающих лечебную эффективность пре паратов.

Цели и задачи исследований Целью исследования явилось всестороннее изучение биологических свойств перспективного ветеринарного пробиотика Ири лис (B. subtilis ВКПМ 2335 и B. licheniformis ВКПМ 2336) in vitro и in vivo и вне дрение его в систему лечебно-профилактических мероприятий при выращивании кроликов.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Сравнительное исследование пробиотических культур, входящих в перспек тивный ветеринарный препарат Ирилис и коммерческий пробиотик Paciflor® C10, по физиолого-биологическим характеристикам.

2. Изучение безопасности штаммов исследуемых пробиотиков.

3. Сравнительное исследование колонизационной активности (антагонизма, ад гезивных свойств и персистирования в желудочно-кишечном тракте) штаммов, входящих в Ирилис и Paciflor® C10.

4. Проведение клинических испытаний и оценка лечебной и профилактической эффективности ветеринарного пробиотика Ирилис.

Научная новизна Впервые при сравнительном изучении биологических свойств перспективного ветеринарного пробиотика Ирилис выявлено его преимущество перед коммерче ским ветеринарным препаратом Paciflor® C10, и доказана его безопасность для ис пользования в ветеринарной практике.

Впервые продемонстрировано преимущество пробиотического препарата Ирилис перед коммерческим ветеринарным препаратом Paciflor® C10 по антагони стической активности в отношении клинических штаммов УПБ, выделенных от больных кроликов.

Впервые доказана терапевтическая эффективность перспективного пробиоти ка Ирилис на фоне эпизоотии миксоматоза кроликов, позволившая значительно снизить падеж животных в различных возрастных группах, а также увеличить при вес животных.

Практическая значимость Показана высокая лечебно-профилактическая эффективность перспективного препарата Ирилис на поголовье кроликов в хозяйстве длительно неблагополучном по многим инфекционным и инвазионным заболеваниям.

Изучено влияние пробиотика на рост, развитие и сохранность молодняка кро ликов. Полученные данные подтверждены актами, утвержденными руководителя ми хозяйств.

Разработаны наставления по применению ветеринарного пробиотического препарата Ирилис в кролиководческих хозяйствах.

Положения, выносимые на защиту При разработке новых пробиотических препаратов ветеринарного назначе 1.

ния на основе спорообразующих бактерий необходимо проведение доклинических испытаний штаммов, входящих в пробиотики для ветеринарной практики.

Сравнительные исследования нового ветеринарного пробиотика Ирилис с 2.

коммерческим препаратом Paciflor® C10 выявили преимущество первого по пока зателю безопасности и специфической активности.

Экспериментально-клиническое изучение перспективного пробиотика Ири 3.

лис свидетельствует об его высоком лечебно-профилактическом потенциале.

Апробация результатов диссертации Основные результаты диссертацион ной работы доложены и представлены в материалах научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Н. Новгород 2006 г.) и Всероссийской научно-практической конфе ренции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва 2006 г.), на заседании кафедры микробиологии РУДН (2006, 2007).

Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в том чис ле в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России и в материалах все российских конференций.

Объем и структура работы Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов иссле дования, собственных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Ра бота изложена на 92 страницах текста компьютерной верстки и иллюстрирована таблицами и 12 рисунками. Список литературы представлен 126 источниками ( отечественными и 67 зарубежными).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы Работа выполнена в период с 2004 по 2007 год на кафедре микробиологии ме дицинского факультета РУДН, в лаборатории диагностических бактерийных пре паратов с коллекцией микроорганизмов ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича, кроли ководческом хозяйстве ООО «ТрансАгро» Истринского района Московской облас ти.

В исследовании были использованы:

- штаммы спорообразующих бактерий рода Bacillus: B. subtilis ВКПМ 2335 и B.

licheniformis ВКПМ 2336;

B. cereus ATCC 1489;

- штаммы патогенных и условно патогенных микроорганизмов /УПБ/ (n = 210), вы деленные от больных кроликов, а так же полученные из коллекции ГКПБ ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича;

- препараты: лабораторные серии препарата Ирилис;

коммерческая серия ветери нарного пробиотика Paciflor® C10 (Intervet International B.V. Wim de KoЁrverstraat 35 NL-5831 AN Boxmeer (NL).

Экспериментальные исследования проводились на лабораторных животных – беспородных мышах (n = 720) и мышах линии “black” (n = 100) обоего пола, мас сой 10 – 16 г;

беспородных крысах (n=100) обоего пола, массой 100-120 г, самцах кроликов «шиншилла» (n = 15), массой 2-2,5 кг. При выполнении экспериментов на животных руководствовались «Правилами гуманного обращения с лабораторными животными» (2003).



Клинические испытания проводились на 743 особях кроликов пород «Сереб ристый», «Черно-Бурый» и «Белый великан» обоего пола различных возрастных групп.

В ходе работы использованы стандартные питательные среды, традиционно применяемые в микробиологии.

При выполнении работы применялись следующие биологические жидкости:

желчь медицинская консервированная (ООО «Самсон – мед», г. Санкт-Питербург) и сок желудочный натуральный «Эквин» («Иммунопрепарат», г. Уфа) При изучении видовой принадлежности штаммов рода Bacillus использовали Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacil lus из организма человека и животных (Смирнов В. В. с соавт. 1983).

Идентификацию патогенных и условно патогенных микроорганизмов прово дили общепринятыми методами (Бригер М. О., 1992) Изучение токсичности, вирулентности, токсигенности проводили в соответст вии с Методическими рекомендациями (Смирнов В. В. с соавт. 1983), “острую” и “хроническую” токсичность - по РД 42-28-8-89.

«Острую» токсичность культур изучали на мышах при пероральном введении культур в различных дозах (1х109-1х1012 КОЕ/0,5 мл) и внутрибрюшинном (0,5х09, 1х109, 5х109, 1х1010 КОЕ/0,5 мл). Животные контрольной группы получали забу ференный физиологический раствор (ЗФР). Наблюдение за животными проводили в течение 7 сут. Учитывали поведенческие реакции, состояние шерстяного покро ва. Через 1 и 7 сут. после последнего введения пять мышей из каждой группы умерщвляли эфиром и проводили макроскопическое исследование внутренних ор ганов. Одновременно с этим отбирали пробы для гистологических и микробиоло гических исследований.

При исследовании «хронической» токсичности животным в течение 30 суток ежедневно перорально вводили бактериальные культуры по 106 КОЕ/0,5 мл. По окончании срока введения культур через 1 и 7 сут животных умерщвляли и их ор ганы также подвергали макроскопическому, бактериологическому и гистологиче скому исследованию.

Изучение влияния препарата Ирилис на морфологический состав и свойства крови было проведено на 15 кроликах массой 2-2,5 кг. Было создано 3 группы жи вотных - 2 опытных и 1 контрольная, по 5 голов в каждой. Кроликам I опытной группы перорально вводили Ирилис по 1 дозе в течение 10 дней ежедневно, а кро ликам II опытной группы - в той же дозе в течение 30 дней ежедневно, после чего брали кровь на исследование. У кроликов контрольной группы, которым никаких препаратов не вводили, брали кровь на исследование на 10 и 30 дни с начала по становки опыта. У кроликов как опытных, так и контрольной групп по общеприня тым методикам определяли скорость оседания эритроцитов, лейкоцитарную форму лу, содержание гемоглобина, общего белка, общего билирубина, подсчитывали ко личество эритроцитов.

Для определения устойчивости бактерий к действию биологических жидко стей (желчь медицинская консервированная, желудочный сок «Эквин») суточную культуру смывали ЗФР и доводили концентрацию до 109 КОЕ/мл. В пробирку с мл бактериальной взвеси добавляли 9 мл биологической жидкости, в контрольную пробирку вносили 9 мл ЗФР;

все пробирки выдерживали в термостате при 37 0С в течение 2 ч, затем определяли количество жизнеспособных клеток методом серий ных разведений с высевом на среду Гаузе №2 (Осипова И. Г. 2006).

Антагонистическую активность (АА) определяли методом отсроченного анта гонизма на агаризованной среде Гаузе №2 (ФС 42-3476-98), по зоне задержки рос та (ЗЗР) тест-штаммов (в мм). АА считали нулевой при зоне задержки роста до мм, низкой – при ЗЗР от 5 до 10 мм, средней – от 10 до 15 мм, высокой – от 15 до 20 мм, очень высокой – свыше 20 мм.

Адгезивные свойства бактерий рода Bacillus изучали на эпителиальных клет ках кишечника крыс. Уровень адгезии отдельных штаммов бактерий условно диф ференцировали на 4 степени: неадгезивную (СПА = 0);

слабоадгезивную (СПА = – 5);

среднеадгезивную (СПА = 5 – 10);

высокоадгезивную (СПА = 10 и выше).

(Горская Е. М. с соавт. 1989).

Изучение персистирования штаммов, входящих в исследуемые препараты проводили на мышах линии “black”, массой 14 - 16 г. Для исключения копрофагии группы мышей находились в отдельных клетках с сетчатым полом. Суточную культуру после роста на агаризованной среде Гаузе №2 смывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) и доводили до концентрации 2х109 КОЕ/мл.

Пробиотик растворяли ЗФР из расчета 0,5 мл на дозу. По 0,5 мл. суспензии культу ры вводили через зонд per os однократно. Контрольным животным вводили 0,5 мл.

ЗФР. Свежий кал взвешивали и гомогенизировали в ЗФР, затем путем последова тельных десятикратных разведений высевали на агаризованную среду Гаузе №2.

Посевы инкубировали при температуре 37° С в течении 48 ч. Выросшие колонии морфологически и биохимически (Осипова И. Г.с соавт., 2005).

Исследования лечебно-профилактической эффективности препарата прово дили на 504 особях кроликов обоего пола различных возрастных групп пород «Се ребристый», «Черно-бурый» и «Белый великан».

Испытания профилактической эффективности с целью оценки влияния пер спективного пробиотика Ирилис на рост, развитие и сохранность животных были проведены на 239 особях молодняка кроликов обоего пола пород «Серебристый», «Черно-бурый» и «Белый великан» в возрасте до 120 дней и на 36 самках в возрас те до 2 лет.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Доклинические исследования перспективного препарата Ирилис В ходе исследования изучены пробиотические культуры B. subtilis ВКПМ 2335 и B.

licheniformis ВКПМ 2336, входящие в перспективный ветеринарный препарат Ири лис и штамм B. cereus ATCC 1489, составляющий основу коммерческого пробио тика Paciflor® C10. Культуры Ирилиса существенно различались своими физиоло го-биохимическими характеристиками (табл.1). B. subtilis ВКПМ 2335, в отличие от B. licheniformis ВКПМ 2336, не проявил способности к росту в анаэробных услови ях, что является одним из показателей различной адаптационной возможности культур в разных отделах ЖКТ. Различаются они и по другим свойствам, среди ко торых – ферментация углеводов, продукция аргининдегидролазы и пр. В отличие от штамма B. cereus ATCC 1489, штаммы ВКПМ 2335 и ВКПМ 2336 характеризу ются отсутствием гемолитической активности, не проявляют вирулентность, ток сичность и токсигенность. Культуры не продуцируют ферменты, способные обу словливать патогенные свойства препарата (лецитиназа, гиалуронидаза).

Таблица 1. Культуральные, морфологические и биохимические свойства бактерий рода Bacillus Штаммы бактерий рода Bacillus B.cereus B. subtilis B.licheniformis Свойства ATCC 1489 ВКПМ 2335 ВКПМ Рост в анаэробных условиях + - + Ферментация - глюкоза + + + - арабинозы - + - ксилозы - + + - маннита - + + Каталаза + + + Образование кислоты и газа из глюкозы - - Образование кислоты из глюкозы + + + Утилизация - цитрата + + + - пропионата - - + Гидролиз - крахмала + + + - мочевины - - - казеина + + + - тирозина + - Лизоцимная активность - + + Редукция нитратов + + + Образование газа из NO3- в анаэробных ус + - + ловиях Реакция Фогес-Проскауэра + + + Аргининдегидролаза - - + Лецитиназа + - Гиалуронидаза + - Гемолитическая активность + - Вирулентность + - (в/б доза 1х109КОЕ/мл) Токсичность + - (в/б доза 1х109ОЕ/мл) Токсигенность + - (в/б 1 мл супернатанта) Примечание: в/б – внутрибрюшинно Изучение влияния пробиотика Ирилис на морфологический состав и свой ства крови проводили на кроликах. Животным вводили ежедневно препарат по мл: 1 опытной в течение 10 дней, а кроликам 2 опытной группы – в течение дней, после чего брали кровь на исследование. У кроликов контрольной группы, ин тактных, брали кровь на исследование на 10 и 30 сутки с начала постановки опыта.

Изучение влияния Ирилис на морфологический состав и свойства крови показало, что препарат не влияет на состав и свойства крови животных (табл.2.).

Таблица 2. Показатели крови животных опытных и контрольных групп Показатели Количество (М±т) в кон- Количество (М±ш) после троле (интактные) курса введения Ирилиса в течение 10 сут 30 сут 10 сут 30 сут Общий белок, г% 7, 1±1, 0 6,5±0,5 7,8±0,2 7,2±1, Общий билирубин, мг% 0,1±0,1 0 0 Количество эритроцитов, 6,0±1,5 6,5±1,0 6,6±1,0 6,5±0, млн/мл СОЭ, мм/30 мин 0,4±1,0 0,4±1,0 0,4±1,0 0,4±1, Содержание гемоглобина, г/л 74,3±6,2 78,2±2,3 76,5±4,2 75,5±4, Лейкоциты тыс/ мл 8,0±1,5 9,0±0,5 8,5±1,0 8,8±0, Лейкоцитарная формула, %: 3,7±1,3 3,9±1,0 3,6±1,5 3,8±1, - базофилы 2,0±1,0 0 1,5±0,5 1,0±0,5 2,0±1, - эозинофилы 0 7,0±2,0 0 8,0±1,0 7,9±0,5 8,0±0, - миелоциты 36,5±3,7 38,5±3,3 36,0±2,5 37,0±3, - нейтрофилы 49,5±2,0 48,9±2,9 48,4±2,7 4,8±2, - лимфоциты 2,0±1,0 2,5±1,0 2,2±1,0 2,5±1, - моноциты Препарат не оказывает побочного действия на организм, не вызывает ос ложнений и аллергических реакций, хорошо переносится животными и совершенно безвреден. Следовательно, длительное пероральное введение изучаемых пробио тических штаммов рода Bacillus является безопасным, поскольку не приводит к развитию токсических или инфекционных осложнений.

При изучении "острой" и "хронической" токсичности выявлено (табл.3), что животные всех групп (кроме мышей, которым вводили B. cereus ATCC 1489) во время периода наблюдения были здоровы, активны, их поведенческие реакции не нарушены, масса тела не снижалась, не выявлены побочные эффекты или ос ложнения, связанные с введением культур. Не было отмечено каких-либо патоло гических изменений при макро- и микроскопическом изучении ЦНС и внут ренних органов животных. В то же время при исследовании «острой» и «хрониче ской» токсичности в группе животных, которым вводили в/б культуры B. cereus ATCC 1489 в дозе 1х109 КОЕ/0,5мл, отмечалась тотальная гибель. Гибель 50% мышей имела место при введении B. cereus ATCC 1489 дозы 0,5х109 КОЕ/0,5 мл. У выживших животных объективно отмечались: снижение массы тела, вялость, диарея. При макроскопическом исследовании выявлены, неравномерное полно кровие внутренних органов и резкое полнокровие печени, кровоизлияния, призна ки шоковых реакций в селезенке, ишемия коры почек, эмфизематозные изменения легких. На 7-е сутки интенсивность указанных изменений значительно снижалась.

Сплено- и гепатомегалия характерные признаки инфекционного процесса. В исследовании «хронической» токсичности не обнаружено микроскопических из менений морфологии селезенки и печени у животных, получавших исследуемые штаммы. Селезеночный индекс мышей, которым вводили изучаемые штаммы, не отличался от показателей животных контрольной группы (табл. 4).

Таблица 3. «Острая» и «хроническая» токсичность пробиотических штаммов ро да Bacillus Способ введе- Доза введения, Количество живот Вид и штамм пробиотика ния КОЕ/0,5 мл ных, живых/павших 10x в/б 40/ Bacillus subtilis 100x per os 40/ ВКПМ 1x per os 40/ 10x в/б 30/ Bacillus licheniformis 100x per os 30/ ВКПМ 1x per os 30/ 1,0x в/б 0/ 0,5x в/б B. cereus 10/ 100x ATCC 1489 per os 1x per os в/б 0,5 мл Контроль, изотонический 0,5 мл per os физ. раствор 0,5 мл per os - - Интактные - Таблица 4. Селезеночный индекс мышей после перорального введения бактериаль ных культур (хроническая токсичность) Количество мы- Селезеночный индекс (СИ)*:

Исследуемый штамм шей в группе вес селезенки (мг)/вес мышей (г) Bacillus subtilis ВКПМ 2335 10 3,35+0, Bacillus licheniformis ВКПМ 2336 10 3,39+0, B. cereus ATCC 1489 10 3,37+0, Контроль 10 3,40+1, При бактериологическом исследовании крови и внутренних органов живот ных установлено отсутствие диссеминации этих культур, т. е. изучаемые штаммы являются неинвазивными. Таким образом, длительное пероральное введение изу чаемых пробиотических штаммов рода Bacillus является безопасным, поскольку не приводит к развитию токсических или инфекционных осложнений.

Следует отметить, что штамм B. cereus ATCC 1489, в отличие от штаммов В.

subtilis ВКПМ 2335 и В. licheniformis ВКПМ 2336, характеризуется гемолитической активностью, а исследования, проведенные Научным Комитетом по питанию жи вотных при Европейской Комиссии (SKAN), выявили у данного штамма способ ность к продукции энтеротоксинов Hbl и Nhe (2003). Таким образом, штамм B.

cereus ATCC 1489, входящий в коммерческий препарат Paciflor® C10 обладает вы раженными вирулентными свойствами.

Следующим этапом нашей работы было изучение чувствительности штаммов бактерий рода Bacillus к действию желудочного сока и желчи. Показано, наиболее чувствительным к желчи и желудочному соку из исследуемых культур оказался штамм B. cereus ATCC 1489 (рис. 1).

B.subtilis2335 B.licheniformis 2336 B.cereus АТСС lg КОЕ/мл Исходное Желудочный Желчь Контроль ЗФР сок Рис.1. Устойчивость бацилл к воздействию желудочного сока и желчи Важнейшей характеристикой колонизационной активности пробиотических штаммов является изучение антагонизма и адгезии. В проведенном сравнитель ном изучении антагонистической активности (АА) Ирилиса и Paciflor® C10 особое внимание было уделено изучению воздействия этих биопрепаратов на культуры, выделенные от больных кроликов и тест-штаммов, используемых при контроле пробиотиков (табл. 5).

Полученные данные свидетельствуют о том, что Ирилис характеризуется вы сокой АА в отношении стафилококков, энтерококков и кандид. Установлено также, что исследованные пробиотические штаммы, входящие в состав препа рата Ирилис, эффективно воздействуют на штаммы разных таксономических групп, выделенных от больных животных, в том числе и на полирезистентные к антибиотикам культуры.

Следует отметить, что Paciflor® C10 не проявлял высокой антагонистиче ской активности воздействия на тест-штаммы: зоны задержки роста тест штаммов были менее 10- 12 мм.

Таблица 5. Сравнительное изучение антагонистической активности пробиотиков Кол-во штаммов, чувствительных к Количество пробиотикам Тест-культура тест- (зона задержки роста тест-культур штаммов более 15 мм) Paciflor® C Ирилис Escherichia coli (гемолит.) 12 6 Klebsiella pneumoniae* 29 10 Serratia marcescens 11 5 Proteus vulgaris 18 12 Proteus mirabilis 19 14 Staphylococcus aureus* 25 23 Pseudomonas aeruginosa* 18 0 Candida albicans 15 10 Entherococcus spp. 22 19 * штаммы, полирезистентные к антибиотикам При сравнительном изучении адгезивной активности штаммов рода Bacillus к эпителиальным клеткам кишечника крыс (энтероциты и колоноциты) обнару жено, что штамм В. subtilis 2335 обладает низкой адгезивностью. Штамм В.

licheniformis 2336 проявляет средний уровень адгезивной активности к эпители альным клеткам кишечника, однако лучше к колоноцитам (рис.2).

Рис. 2. Адгезивная активность изучаемых штаммов к эпителиальным клеткам кишечника крыс Энтероциты Колоноциты B. cereus АТСС B. subtilis 2332 B. licheniformis Обращает внимание факт, что штамм B. cereus ATCC 1489 обладает высокой адгезивностью к энтероцитам, это создает дополнительные условия неблаго приятного физиологического воздействия на организм животного при примене нии препарата, т. к. высокая адгезивная активность штамма приводит к коло низации и персистированию в ЖКТ.

Исследование динамики персистирования показало, что штаммы Bacillus subtilis ВКПМ 2335, B. licheniformis ВКПМ 2336 быстро элиминировали из кишеч ника мышей, они не определялись в фекалиях уже через 8 сут после их однократ ного введения. Дольше всего в кишечнике персистировал штамм B. cereus ATCC 1489 – 24 дня (рис 3).

lg KOE/г 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 18 - Сутки B.subtilis 2335 B.licheniformis 2336 B.cereus IP Рис.3. Динамика персистирования штаммов-пробиотиков в ЖКТ мышей Таким образом, в результате исследований установлено, что перспективный ветеринарный пробиотик Ирилис обладает рядом преимуществ перед коммерче ским препаратом Paciflor® C10, а именно: безопасностью, выраженным антагони стическим воздействием на патогенные и условно патогенные штаммы, низкой ад гезивной активностью и кратковременным персистированием в кишечнике.

Завершающим этапом внедрения Ирилиса в систему лечебно профилактических мероприятий при выращивании кроликов является изучение пе реносимости и клинической эффективности препарата, это и послужило предметом нашей дальнейшей работы.

Клинические исследования Ирилиса Исследование профилактической и терапевтической эффективности прово дилось в кролиководческом хозяйстве ООО «ТрансАгро» Истринского района Московской области. Первый этап исследования проводился на фоне эпизоотии миксоматоза кроликов – остро протекающей контагиозной вирусной болезни, ле тальность которой по данным литературы составляет до 100 %.

Следует отметить, перед нашими исследованиями в хозяйстве в течение июня месяца проведена вакцинация кроликов против миксоматоза вакциной из штамма В-82, изготовленного в ШНУ ВНИИВВиМ. Однако иммунизацию животных осу ществили по сокращенной схеме, т.е. ревакцинацию не проводили. В результате взрослое и «ремонтное» маточное поголовье было привито однократно, хотя со гласно наставлению по применению вакцины первую вакцинацию кроликов необ ходимо проводить в 1,5-месячном возрасте, а ревакцинацию – через 3 мес (при этом напряженный иммунитет формируется на 7-е сутки после введения препарата и сохраняется в течение 9 мес). Нарушения в проведении в вакцинации привели к заболеваемости молодняка с клиническими признаками миксоматоза, заболевае мость достигала 80 %.

Табл. 6. Распределение больных животных по степени выраженности миксоматоза Форма и степень Основная группа Контрольная Общее количество выраженности (Ирилис) п=343 группа п=161 больных п= заболевания Абс. Абс. Абс.

% % % Нодулярная форма (серозно-гнойный 109 31,8 59 36,6 68 33, конъюнктивит,образование опухолевых узелков на коже) Классическая форма (отеки в об ласти головы, подгрудка, генита- 145 42,3 58 36 203 40, лий) Смешанная форма (совокуп 89 25,9 44 27,4 133 26, ность клинических симптомов) У больных кроликов наблюдались: повышенная температура, одышка, воспа ление слизистых оболочек: серозногнойный конъюнктивит, переходящий в гной ный блефароконъюнктивит, гнойный ренит;

на коже обнаруживались опухолевид ные узелки. У некоторых кроликов развивались студенистые отёки в области голо вы, ануса, гениталий, опухание век, ушей. При вскрытии была выявлена отечно сосудистая инфильтрация подкожной клетчатки в области головы, туловища, ану са, изменения в легких. Анализ эпизоотической обстановки и клинические прояв ления заболевания позволили поставить диагноз миксоматоз.

При изучении лечебной эффективности Ирилиса животные были разделены по возрастным группам методом случайной выборки (табл.7) Опытные и кон трольные группы были равноценны по форме и степени выраженности заболевания (табл.6) Таблица 7. Схема проведения испытания лечебной эффективности Ирилиса Возраст кроликов Название Доза Способ Сроки Подгруппа группы препарата введения введения (дней) 5х109КОЕ/мл 1 опытная 14 дней per os 1-25 1 контрольная Питьевая вода 14 дней per os 5х109КОЕ/мл 2 опытная 14 дней per os 25-80 2 контрольная Питьевая вода 14 дней per os 5х109КОЕ/мл 3 опытная 14 дней per os 80-120 3 контрольная Питьевая вода 14 дней per os Одним из наиболее частых, сопутствующих миксоматозу, заболеваний являет ся пневмония, вызываемая различными УПБ. По результатам бактериологических исследований, из легких и фекалий больных животных в больших количествах ( –109 КОЕ/г) выделяли представителей патогенной и условно патогенной микро флоры (стафилококки, эшерихии, энтерококки и др.), являющихся причиной се кундарных инфекций.

Кролики основной группы получали Ирилис per os в концентрации 5х109 КОЕ в 1 мл в течение 14 дней. Кролики контрольной группе препарат не получали.

Таблица 8. Состав микрофлоры, выделенной из легких и фекалий больных кроли ков Количество микрофлоры выделяемой от животных (КОЕ/г) По завершению опыта Контрольная В начале опыта Опытная группа Название микроорганизма группа фека- фека- фека легкие легкие легкие лии лии лии 5 7 5 Staphylococcus aureus 10 10 - 10 107 107 S.epidermidis - - 109 103 104 Enterococcus spp. (гемолит.) - 103 107 103 Escherichia coli (гемолит.) - 109 107 Enterobacter spp - - 108 106 103 Proteus vulgaris - 4 7 P.mirabilis 10 10 - 10 104 105-6 103- Lactobacterium spp. - - 104 105-6 103- Bifidobacterium spp. - - Учет лечебной эффективности препарата проводился на основании сохранно сти поголовья, нормализации клинической симптоматики и микробиоценоза.

В таблице 9 представлены данные, которые свидетельствует, что использова ние препарата Ирилис в процессе выращивания молодняка кроликов позволило значительно снизить падеж животных. В 1-й и 2-й опытных подгруппах выживших животных было 60,8% и 60,7% соответственно, тогда как в 1-й и 2-й контрольных подгруппах только 44,6% и 29,5 % соответственно.

Таблица 9. Выживаемость животных опытных и контрольных подгруппах Группа Подгруппа Выжило животных, % Пало животных, % 1 Опытная 60,8 39, 1 Контрольная 44,6 55, 2 Опытная 60,7 39, 2 Контрольная 29,5 70, 3 Опытная 100 3 Контрольная 100 У животных опытных групп отмечено положительное влияние Ирилиса на те чение болезни: со 2-го дня приема препарата у кроликов появился аппетит, живот ные стали более активными, на 6 сутки уменьшались явления конъюнктивита и одышки, на 6-7 сут нормализовалась температура, на 5-6 сут прекратились гнойные выделения из носа, на 10-12 сут исчезали отеки. При вскрытии кроликов, через сут после последнего введения препарата, видимых патологических изменений во внутренних органах не обнаружено. В опытных группах зарегистрировано 39,2% и 39,3% павших животных. Это связано с тем, что у части животных к началу лече ния, была клиническая картина заболевании в разгаре, лечение начато поздно. В третьей группе падежа не наблюдалось, т.к. в нее вошли животные, у которых сформировался иммунитет.

В контрольной группе у кроликов наблюдались слизисто-фибринозные, а за тем гнойно-фибринозные выделения из носа и глаз. Из-за обильного гнойного от деляемого образовывались корочки у носовых отверстий, что затрудняло носовое дыхание, уши были отечными и опущенными. Животные были сильно истощенны.

При проведении патолого-анатомического вскрытия павших кроликов обнаружены эмфизематозные изменения в легких, выявлена очаговая гнойная пневмония.

Бактериологическое исследование показало, что Ирилис не только не оказы вал отрицательного влияния на облигатных представителей кишечной микрофло ры, но и способствовал нарастанию их количества (табл.7). После проведенного лечения существенно возрастало количество бифидо- и лактобактерий (с 104 до 106КОЕ/г). Применение Ирилиса способствовало элиминации УПБ из легких, а об семененность фекалий энтеробактериями и кокками под воздействием препарата снижалась в 2-3 раза.

В контрольных группах выявлена тенденция к ухудшению бактериологиче ских показателей: понижение количества бифидо- и лактофлоры, уровень УПБ ос тавался без изменения, а в некоторых случаях зарегистрирован рост бактерий (на пример, количество стафилококков, Proteus mirabilis увеличилось на два порядка) (табл.7). Выявлено усиление контаминации УПБ в легких, являющейся причиной пневмонии.

Таким образом, проведенные испытания перспективного ветеринарного про биотика Ирилис показали высокую терапевтическую эффективность и возможность его применения в ветеринарной практике для лечения секундарных инфекций.

На втором этапе исследования изучали влияние пробиотика Ирилис на сохран ность, рост и развитие молодняка кроликов в хозяйстве, длительно неблагополуч ном по многим инфекционным заболеваниям бактериальной и вирусной этиологии в зимнее время. Испытания профилактической эффективности Ирилиса проведены на 239 особях молодняка кроликов обоего пола пород «Серебристый», «Черно-бурый» и «Белый великан» в возрасте до 120 дней и на 36 самках в возрасте до 2 лет.

Таблица 10. Схема проведения испытания профилактической эффективности Ирилиса Группа Подгруппа Препарат/дозы Способ вве- Сроки вве дения дения/дни самки Ирилис 5х10 Per os 1 опытная молодняк/до отъема - Per os самки Физ. раствор Per os 1 контроль молодняк/до отъема - Per os самки - Per os 2 опытная молодняк/после отъема Ирилис 1х10 Per os самки - Per os 2 контроль молодняк/после отъема Физ. раствор Per os Для проведения опыта по возрастному принципу методом случайной выборки было сформировано: 1-я и 2-я основные и 1-я и 2-я контрольные группы животных.

Условия содержания групп были идентичны. С целью изучения опосредованного влияния препарата на организм новорожденных, самки 1 основной группы получа ли Ирилис per os, в дозе 5х109 КОЕ/мл, в течение 7 суток (табл.9).Вторую основную группу составил молодняк кроликов в возрасте после отъема, получавший препа рат per os, в дозе 1х109 КОЕ/мл, в течение того же времени. Самки и молодняк ана логично сформированных контрольных групп во время проведения эксперимента ежедневно получали ЗФР в том же объеме (табл.9). Длительность наблюдения в опытной и 1 контрольной группах составила 120 сут;

в 2 опытной и 2 контрольной – 90 суток. Профилактическая эффективность оценивалась по результатам сохран ности, коррекции микробиоценоза и данным предубойного взвешивания.

% опыт 1 контроль 1 опыт 2 контроль выжило животных пало животных Рис.4. Выживаемость молодняка кроликов в опытных и контрольных группах Полученные данные свидетельствовали, что использование препарата Ирилис в процессе выращивания молодняка кроликов оказывает положительное действие на организм животных, обеспечивая сохранность поголовья выживших животных и больший прирост живой массы по сравнению с контролем. В контрольных группах выявлена высокая летальность (47,2% и 62,2%), тогда как в опытных группах она была в три раза ниже (17,9% и 29,6%) /рис.4/. При проведении патолого анатомического исследования кроликов контрольных групп обнаружены эмфизе матозные изменения в легких, выявлена гнойная очаговая пневмония.

Таблица11. Весовые характеристики молодняка кроликов Разница Привес среднего ве кроликов ос Количество Средний вес са опытной № группы новной / кон кроликов кроликов, кг и контроль трольной групп ной группы ( %) (г) 1 основная 56 2,47±0,03 5, 140 г 1 контроль 61 2,33±0,04 2 основная 56 2,95±0,13 2, 160 г 2 контроль 66 2,79±0,13 Таблица 12. Состав микрофлоры, выделенной из легких и фекалий кроликов опытной и 2 контрольной групп Количество микрофлоры выделяемой от животных (КОЕ/г) Конец опыта Название микроорганизма Начало опыта 2 опытная группа 2 контрольная группа легкие фекалии легкие фекалии легкие фекалии 103 106 105 104 Staphylococcus aureus 6 S.epidermidis - 10 - 10 108 103 103 Enterococcus spp. (гемолит.) - 3 Escherichia coli (гемолит.) 10 10 - - 7 Enterobacter spp - 10 - 10 107 104 103 Proteus vulgaris - 5 4 P.mirabilis - 10 - 10 4 Lactobacterium spp. - 10 - 10 4 Bifidobacterium spp. - 10 - 10 Бактериологическое исследование показало, что Ирилис оказывал корректи рующее действие на кишечную микрофлору, и способствовал увеличению количе ства бифидо- и лактобактерий (с 104 до 106КОЕ/г). Наиболее выраженное влияние Ирилиса выявлено при оценке обсемененности легких условно патогенными бак териями, которые не были обнаружены у кроликов 2 опытной группы. Обсеменен ность фекалий УПБ под воздействием препарата снизилась от 2 до 5 lg. Во 2 кон трольной группе выявлена тенденция к ухудшению бактериологических показате лей: понижение количества бифидо- и лактофлоры, уровень УПБ оставался без из менения, а в некоторых случаях зарегистрирован рост стафилококков (на 2 lg).

Выявлено усиление контаминации УПБ в легких, являющейся причиной пневмо нии.

Изучение влияния нового ветеринарного пробиотика Ирилис на сохранность, рост и развитие молодняка кроликов в хозяйстве, длительно неблагополучном по инфекционным заболеваниям показали возможность применения препарата для профилактики и лечения инфекционных заболеваний кроликов, при этом значи тельно снизить риск инфицирования молодняка кроликов УПМ.

Выводы 1. Изучение пробиотических свойств перспективного пробиотика Ирилис по казало его безопасность, авирулентность, отсутствие токсичных и токсигенных свойств.

2. Сравнительные исследования пробиотических культур, входящих в новый ветеринарный препарат Ирилис, показали их преимущества перед штаммом – ос новой коммерческого пробиотика Paciflor® C10, по физиолого-биологическим ха рактеристикам (по отсутствию гемолитической активности и ферментов, обуслов ливающих патогенные свойства, а также устойчивости к биологическим жидко стям).

3. Штаммы В. subtilis ВКПМ 2335 и В. licheniformis ВКПМ 2336 проявляют низкий уровень адгезивной активности и кратковременное персистирование в же лудочно-кишечном тракте, что исключает условия для неблагоприятного физиоло гического воздействия на организм животного при терапевтическом применении препарата.

4. Перспективный ветеринарный пробиотик Ирилис обладает высокой анта гонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных штам мов, выделенных от больных животных.

5. Применение Ирилиса для лечения и профилактики миксоматоза и секун дарных инфекционных заболеваний животных оказывает защитное действие и по зволяет увеличить выживаемость молодняка кроликов от 60,7 до 100%.

6. Схема применения препарата Ирилис, апробированная в условиях кролико водческого хозяйства, длительно неблагополучного по инфекционным заболевани ям, показала высокую лечебно- профилактическую эффективность в рекомендуе мых дозах при применении пробиотика в течение 7-14 суток.

7. Препарат Ирилис способствует увеличению прироста живой массы ново рожденных крольчат в среднем на 150 г к концу откорма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Мефёд К.М., Осипова И.Г., Васильева Е.А. Изучение антагонистической активности споровых пробиотиков в отношении грибов рода Candida//Сборник на учных трудов конгресса «Успехи медицинской микологии». – Москва. -2005. -Том VII. -с. 2. Мефёд К. М., Осипова И. Г., Давыдов Д. С. Результаты комплексного ис следования безопасности штаммов-пробиотиков рода Bacillus// материалы научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и ле чении инфекционных заболеваний» - Н. Новгород. - 2006. –с. 3. Мефёд К. М., Осипова И. Г., Васильева В. А., Давыдов Д. С. Результаты сравнительного исследования новых ветеринарных пробиотиков Ирилис и Пациф лор// Вестник РУДН Серия медицина Юбилейный выпуск № 2(34) -2006. –с. 27 – 4. Мефёд К. М., Давыдов Д. С., Осипова И. Г., Шарая В. С., Васильева Е. А.

Применение споровых пробиотиков в мировой практике// тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование им мунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» - Москва 2006. – с. 5. Стяжкин К. К., Васильев Н. Т., Поберий И. А., Забокрицкий А. Н., Рогожин А. З., Сирик М. С., Чебыкин А. М., Давыдов Д. С., Мефёд К. М. 10-летний опыт се рийного производства и применения пробиотика «Биоспорин» и новые задачи// Там же – с.89 – МЕФЕД Кирилл Михайлович (Россия). Новый споровый пробиотик Ирилис и его использование в ветеринарной практике.

Диссертация посвящена комплексному исследованию нового пробиотического пре парата на основе аэробных споровых бактерий рода Bacillus – Ирилис. В ходе исследова ний были изучены биологические свойства штаммов препарата (B. subtilis 2335и B. licheni formis 2336) in vitro и in vivo. Исследование пробиотических культур, входящих в состав препарата Ирилис, проводилось в сравнении со штаммом B. cereus ATCC 1489 – основой коммерческого ветеринарного пробиотика Paciflor C10.

Было проведено исследование безопасности штаммов, которое включало изучение вирулентности, общей токсичности, токсигенности, «острой» и «хронической» токсично сти, а также адгезивной активности штаммов-пробиотиков к энтероцитам и колоноцитам и динамики персистирования штаммов и препаратов в кишечнике. Всестороннее изучение пробиотических штаммов B. subtilis 2335 и B. licheniformis 2336 показало их безопасность, они не вызывали патологических состояний животных.

В ходе исследований было установлено, что пробиотические штаммы B. subtilis и B. licheniformis 2336 обладают широким спектром антагонистической активности в от ношении клинических штаммов, выделенных от больных животных, а также вакцинных штаммов. В работе рассмотрена возможность внедрения препарата Ирилис в систему ле чебно-профилактических мероприятий при выращивании кроликов.

Выполнены клинические исследования терапевтической и профилактической эффек тивности препарата Ирилис, проводившиеся на фоне эпизоотии миксоматоза кроликов.

Использование препарата позволило значительно снизить падеж животных в различных возрастных группах, а также увеличить привес животных опытных групп по сравнению с контрольными.

Ключевые слова: споровый пробиотик, Ирилис, пробиотические штаммы, кролики, мик соматоз.

MEFED K.M. (Russia). New spore-forming probiotic Irilis and its use in veterinary.

The dissertation is devoted to the complex research of new veterinary probiotic based on aerobic spore-forming bacteria of Bacillus genus – Irilis. During researches biological properties of preparation strains (B. subtilis ВКПМ 2335 and B. licheniformis ВКПМ 2336) in vitro and in vivo have been investigated. Research probiotic cultures of Irilis was spent in comparison with strain B. cereus ATCC 1489 – a basis of commercial veterinary probiotic Paciflor C10.

It has been carried out research of safety of the strains which included studying virulence, the general toxicity, toxigenicity, "acute" and "chronic" toxicity, and also adhesive activity of probiotic strains to enterocytes and colonocytes both dynamics of persistence of strains and preparations in intestines. All-round studying of probiotic strains B. subtilis 2335 and B. licheni formis 2336 has shown their safety, they did not cause pathological conditions of animals.

During researches it has been established that probiotic strains B. subtilis 2335 and B.

licheniformis 2336 possess a wide spectrum of antagonistic activity concerning clinical strains, allocated from sick animal, and also vaccinal strains. In work the opportunity of introduction of preparation Irilis in system of treatment-and-prophylactic actions at cultivation of rabbits is con sidered.

Clinical researches of therapeutic and preventive efficiency of preparation Irilis, spent on a background of rabbit myxomatosis epizooty are executed. Use of a preparation has allowed to lower considerably a mortality of animals in various age groups, and also to increase an addi tional weight of animal skilled groups in comparison with control.

Key words: spore probiotic, Irilis, probiotic strains, rabbits, myxomatosis

 


Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.