авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Молекулярно-генетическая характеристика возбудителей фасциолёза – fasciola hepatica (linnaeus,

На правах рукописи

ГУЛЯЕВ Андрей Сергеевич МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФАСЦИОЛЁЗА – FASCIOLA HEPATICA (LINNAEUS, 1758) И F.GIGANTICA (COBBOLD, 1855) Специальность 03.02.11 – Паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в лаборатории фармакологии, токсикологии и терапии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина» Россельхозакадемии Научные руководители: доктор ветеринарных наук Архипов Иван Алексеевич кандидат биологических наук Семёнова Серафима Константиновна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Бенедиктов Игорь Иванович, ГНУ «Всероссийский научно исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина» Россельхозакадемии, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и биотехнологии доктор биологических наук Сивкова Татьяна Николаевна, ФГБОУ ВПО «Пермская государственная сельскохозяйственная академия им. академика Прянишникова», доцент кафедры инфекционных болезней

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Курский государственный университет»

Защита диссертации состоится «19» июня 2013 г. в 1100 часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук Д 006.011.01, созданного на базе ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии имени К.И. Скрябина Адрес: 117218, Москва, ул. Б. Черемушкинская, д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС

Автореферат разослан « » мая 2013 г.

Учёный секретарь совета по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук, д.б.н., профессор Бережко Вера Кузьминична Введение Актуальность проблемы. Фасциолез является одним из опасных гельминтозов животных и человека. В мире до 17 миллионов человек заражено фасциолёзом и ещё 250 миллионов находятся под угрозой заражения (Robinson and Dalton, 2009). Инвазированность жвачных животных фасциолами в отдельных регионах России достигает 80%, глобальные потери сельского хозяйства от фасциолёза, оцениваются в три миллиарда долларов (Горохов, 1986;

Boray, 1994;

Архипов, 1999;

Лошкарева, 2005).

Для борьбы с фасциолезом применяются антигельминтики из класса салициланилидов и бензимидазолов. Известны случаи возникновения резистентности фасциол к действию препаратов обеих групп, причины которой пока еще полностью не раскрыты (Fairweather, 1999;

Miller et al., 1994;

Gaasenbeek, 2000;

Jackson, 2000;

Robinson, 2002).

Ядерные и митохондриальные ДНК интенсивно используются для изучения родственных взаимосвязей и динамики генетических процессов в популяциях, описания структуры вида и истории его возникновения. Общебиологический интерес представляют процессы систематики и филогении трематод, взаимодействия паразита с окружающей средой, в качестве которой выступает не только комплекс природных абиотических факторов, но и сам организм животного хозяина.

Все эти результаты свидетельствуют о высокой генетической неоднородности популяций сосальщиков двух видов в разных частях мирового ареала. Частичные последовательности мт-генов nad1 и cox были успешно использованы для дифференциации западно-азиатских и восточно-европейских популяций фасциол. На изученном ареале были обнаружены 13 гаплотипов, распределенные по двум генеалогическим линиям (Semyenova et al., 2006). Генетический полиморфизм обнаружен в отдельных популяциях F.hepatica стран Европы, Латинской Америки и Африки (Mas-Coma et al., 2003;

Walker et al., 2007, 2011;

Teofanova et al., 2011;

Kantzoura et al., 2011). Неожиданно высокая нуклеотидная дивергенция мтДНК обнаружена у морфологически неразличимых образцов F.gigantica из Танзании и Индии, инфицирующих различных дефинитивных хозяев (Walker et al., 2012).

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в поиске новых маркеров ядерного и митохондриального генома для выявления генетической дифференциации Fasciola hepatica и F.

gigantica и установления взаимосвязей между этими видами печеночных сосальщиков.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Скрининг генетической изменчивости популяций из разных частей ареала (Россия, Белоруссия, Армения, Эквадор) по полным последовательностям двух митохондриальных генов (мт-генов) nad1, cox1.

2. Подтвердить существование двух генеалогических линий F.hepatica и остановить особенности внутривидовой изменчивости трематод рода Fasciola из популяций России, Белоруссии, Армении, Эквадора, Узбекистана и Дагестана на основании полных последовательностей мт-генов, которые кодируют двенадцать белков, две субъединицы рРНК и 23 транспортных РНК.

3. Определить уровни генетической дивергенции и выявить филогенетические взаимосвязи между двумя видами трематод рода на основании полиморфизма белок-кодирующих Fasciola последовательностей мтДНК.

4. Изучить структуру ядерного гена тубулина-2 (tubb2) и оценить уровни внутри- и межвидовой изменчивости сосальщиков рода Fasciola.

5. Разработать методические рекомендации для быстрого и эффективного способа выделения ДНК печеночных сосальщиков, пригодной для дальнейшего использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Научная новизна. Впервые выделены и охарактеризованы кодирующие последовательности мт-генома двух видов печеночных сосальщиков F. hepatica и F. gigantica, обитающих на территории России, Белоруссии, Армении, Эквадора, Узбекистана и Дагестана. На основании полиморфизма белок-кодирующих последовательностей мтДНК определен уровень генетической дивергенции и установлены филогенетические взаимосвязи между двумя видами сосальщиков рода Fasciola. Впервые у сосальщиков рода Fasciola изучена структура ядерного гена тубулина-2 (tubb2), являющегося основной мишенью для действия антигельминтных препаратов группы бензимидазолов.

Практическое значение работы. Разработаны методические рекомендации для быстрого и эффективного способа выделения ДНК печеночных сосальщиков, пригодной для дальнейшего использования в полимеразной цепной реакции, одобренные секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН от марта 2012 года (протокол №1). Разработанные новые маркеры мтДНК могут использоваться для видовой идентификации возбудителей фасциолеза на разных стадиях жизненного цикла, что значительно повышает эффективность санитарно-эпидемиологических мероприятий, направленных на выявление природных очагов фасциолеза и разработку методов борьбы с ними. Кроме того, особенности популяционного распространения полиморфизма гена (tubb2) в перспективе могут быть использованы для поиска генов резистентности к действию антигельминтных препаратов. Все эти результаты могут найти применение при разработке медико ветеринарных программ в соответствующих учреждениях РАН и РАСХН, таких как Центр Паразитологии ИПЭЭ РАН и ВИГИС РАСХН, ветеринарных академиях, институтах, факультетах и других учреждениях медико-ветеринарного профиля.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях: Международная научная конференция «Биоразнообразие и экология паразитов наземных и водных ценозов», посвященная 130-летию со дня рождения академика К.И. Скрябина (Москва, 9 – 11 декабря 2008 года);

III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия» (Нижний Новгород, 24 – 29 мая 2010);

Международная научная конференция «Теоретические и практические проблемы паразитологии» (Москва, 30 ноября – 3 декабря 2010);

Международная научная конференция «Ломоносов» (Москва, 9 – апреля, 2012);

Научная конференция «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 16 – 18 мая, 2012);

The 3rd Moscow International Conference “Molecular Phylogenetics (MolPhy-3)” (Moscow, July 31 – August 4, 2012). Результаты работы обсуждались на межлабораторном семинаре Института биологии гена РАН (29 января 2013 г.).

Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом 4-х летних научных исследований автора.

Подтверждение существования генеалогических линий F.hepatica, скрининг генетической изменчивости популяций из разных частей ареала (Россия, Белоруссия, Армения, Эквадор) по полным последовательностям митохондриальных генов;

выявление внутри- и межвидовой изменчивости сосальщиков рода Fasciola из разных географических популяций;

выявление филогенетических взаимосвязей между двумя видами сосальщиков рода Fasciola;

разработка методических рекомендаций для быстрого и эффективного способа выделения ДНК печеночных сосальщиков аспирантом выполнены лично. В совместных статьях с Васильевым В.А., Семеновой С.К., Архиповым И.А., Гороховым В.В. и Москвиным А.С. основная часть исследований (более 80%) была выполнена диссертантом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Существование двух генеалогических линий F.hepatica в популяциях из разных частей ареала (Россия, Белоруссия, Армения, Эквадор).

2. Особенности внутри- и межвидовой изменчивости трематод рода Fasciola из популяций России, Белоруссии, Армении, Эквадора, Узбекистана и Дагестана.

3. Уровни генетической дивергенции и филогенетические взаимосвязи между двумя видами сосальщиков рода Fasciola.

4. Структурные особенности гена тубулина-2 (tubb2) и уровни внутри- и межвидовой изменчивости у трематод рода Fasciola.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе, 3 статьи в издании, рекомендованном ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы и собственных исследований, включающих описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждения, выводов и практических предложений. Список литературы включает 145 наименований, в том числе 18 отечественных и 127 иностранных.

Работа иллюстрирована 14 таблицами и 23 рисунками. Приложение на 25 страницах.

1. Обзор литературы Представлен анализ отечественной и зарубежной литературы по вопросам биологии, эволюции, молекулярной генетики и филогении, а также устойчивости к антигельминтным препаратам трематод рода Fasciola.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы Сбор образцов. Образцы были любезно предоставлены сотрудниками ВИГИС Архиповым И.А., Москвиным А.С., Гороховым В.В. Для исследования полиморфизма структурных локусов шести митохондриальных геномов, а также для изучения геномной вариабельности ядерного гена tubb2 нами было использовано экземпляров марит двух видов печеночных сосальщиков Fasciola hepatica (n=10) и F.gigantica (n=4) из разных частей ареала. Помимо этого, использованы 86 последовательностей двух митохондриальных генов nad1, cox1, представленные ранее в работе Semyenova et al., 2006.

В дополнение к ним мы включили в анализ известные ранее последовательности ядерных и мт-локусов печеночных сосальщиков, занесенные в GenBank, и полную последовательность мт-генома F.hepatica из Австралии (NC002546).

Фиксация образцов и выделение ДНК. Выделение ДНК фасциол проводили из 10 марит F.hepatica и 4 марит F.gigantica с помощью набора реагентов «Diatom DNA Prep 100» («ИзогенЛаб», Москва) согласно инструкции производителя и стандартным фенол хлороформным методом с использованием протеиназы К.

Подбор праймеров. Праймеры подбирали с помощью программы PrimerSelect из пакета DNAStar 5.0. Всего было синтезировано 28 пар праймеров.

Амплификация. Амплификацию ДНК проводили в разных температурных режимах в термоциклерах «BioRad» (США) и «Терцик» (ДНК-Технология, Россия).

Элюция, клонирование и секвенирование. ПЦР-продукты элюировали с использованием наборов реагентов GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, США), клонировали с использованием набора pGEM®-T Easy Vector System (Promega, США) согласно инструкциям производителей. Секвенирование ДНК осуществляли на автоматическом 4-х капиллярном секвенаторе ДНК ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» (Институт молекулярной биологии РАН).

Обработка результатов. Статистическую и биоинформатическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ:

MEGA (ver.5.1), ARLEQUIN (ver 3.11), SplitsTree (v.4), KineFold и Mfold.

2.2. Результаты 2.2.1. Характеристика полиморфизма белок-кодирующих локусов митохондриального генома фасциол Нами были получены полные последовательности всех 12 белок кодирующих генов у четырех особей F.hepatica и двух – F.gigantica, Кроме того, а также еще 86 последовательностей только генов nad1 и cox1 F.hepatica. Общая длина исследованных последовательностей ДНК составила 249756 п.н. для F.hepatica и 20130 п.н. для F.gigantica.

Наиболее полиморфными оказались популяции с территории Армении и Восточной Европы (Россия, Белоруссия и Болгария). Число вариабельных и парсимониально информативных сайтов в этих последовательностях почти одинаково (62 и 55, 1.068 и 0.985, соответственно) и почти в два раза превышает эти же показатели у эквадорских F.hepatica (19 и 0.575). Значение нуклеотидного разнообразия оказалось наибольшим у европейских популяций (0.54), что в два раза выше, чем в эквадорской популяции (0.27). В первых двух группах фасциол (Армения и Европа) по сравнению с третьей (Эквадор) велики значения несинонимичных замен. Исследованные популяции обладают низким гаплотипическим F.hepatica разнообразием, особенно фасциолы из Армении.

2.2.2. Филогенетический анализ локусов nad1 и cox1 F.hepatica из разных частей ареала По полученным нами первичным и предполагаемым транслируемым аминокислотным последовательностям мт-генов cox (1533 п.н.) и nad1 (903 п.н.) F.hepatica и F.gigantica были построены дендрограммы и сплитограммы (сети), отражающие филогенетические связи между особями и популяциями в выборке (рис. 1). Среди изученных последовательностей можно вычленить две большие клады, или линии, I и II, каждая из которых, в свою очередь, содержит две подлинии. Первая линия объединяет образцы из Армении (n=21), России (n=7), Болгарии (n=2), Австралии (n=1) и Белоруссии (n=2). Во вторую линию попали образцы из Армении (n=2), Болгарии (n=2), России (n=10), Белоруссии (n=2) и все образцы из Эквадора (n=10).

Рис. 1. Сплитограмма, отражающая филогенетические связи между исследуемыми популяциями F.hepatica. Четыре образца F.hepatica, взятых в дальнейшем для секвенирования полных кодирующих последовательностей мтДНК, отмечены кругами.

Проведенный анализ молекулярных варианс (AMOVA) не выявил статистически достоверного вклада в общую популяционную изменчивость F.hepatica инфрапопуляций различных регионов и географических популяций. Уровень нуклеотидного разнообразия оказался примерно одинаков в популяциях с территории России, Белоруссии и Болгарии (0,63% – 0,70%). Самое низкое значение нуклеотидного разнообразия характерно для эквадорских географических популяций (0,27%).

2.2.3. Филогенетические реконструкции с использованием последовательностей генов Fasciola spp. из открытых источников На основании полученных нами 58 последовательностей cox F.hepatica, а также 30 известных последовательностей фрагмента гена cox1 (421 п.н.) построена дендрограмма генетических различий между сосальщиками разных стран и континентов. Всю совокупность образцов можно разделяется на две большие клады, соответствующие двум описанным ранее линиям I и II, и одну более мелкую, включающую три образца из Египта. Отметим, что образцы фасциол из одного географического региона часто принадлежат к двум разным линиям. Только образцы из Эквадора полностью принадлежат к линии II. По сравнению со второй первая линия оказалась более однородна. В линии II можно выделить несколько субклад, объединяющих от одной до десяти последовательностей. Практически все фасциолы с территории Армении принадлежат к линии I, и только две из них относятся к линии II. Анализ географического распределения указывает на возможное азиатское происхождение первой линии. Происхождение второй линии определить сложнее, так как принадлежащие ей образцы распространены в более западных регионах Европы, а также в Азии, Африке и Америке (рис. 2).

Рис. 2. Схема мирового распространения двух генеалогических линий по гену cox1 в популяциях F.hepatica (N=88). Доля той или иной линии в популяции пропорциональна площади круга, закрашенной соответствующим цветом. Серый цвет – линия I, черный – линия II.

Для реконструкции взаимосвязей между F.gigantica и F.hepatica мы использовали частичные последовательности генов cox3 и cytb (1064 п.н.) у шести наших образцов из Армении, России, Белоруссии, Эквадора (F.hepatica), Узбекистана и Дагестана (F.gigantica), а также образцы из популяций F.gigantica и F.hepatica из Танзании и Индии, F.hepatica из Нидерландов, Греции, Болгарии и Польши (Teofanova et al., 2011;

Walker et al., 2011, 2012). Сеть, отражающая генетическую дифференциацию 46 изолятов F.hepatica, подтверждает наличие двух основных генеалогических ветвей, соответствующих ранее обнаруженным по локусам cox1 и nad1. Образцы из Австралии, России, Армении, Греции, Болгарии и Польши попали в одну кладу (соответствует линии I), а из Эквадора и Белоруссии вместе с образцами из Нидерландов – в другую (соответствует линии II).

Генетическая дифференциация 25 изолятов F.gigantica характеризуется двумя глубоко разделенными кладами – африканской и индо-азиатской.

Характерно, что наши F.gigantica из Дагестана и Узбекистана попали в индо-азиатскую ветвь (рис. 3).

Рис. 3. Генетическая дифференциация 84 изолятов двух видов печеночного сосальщика на основании частичных последовательностей митохондриальных генов cox3+cob ( п.н.). Общий вид сплитограммы для двух видов. В рамки обведены исследованные нами образцы Fasciola.

2.2.4. Характеристика митохондриального генома F.hepatica и F.gigantica Суммарная белок-кодирующая нуклеотидная последовательность у F.hepatica составляет 10065 п.н. и 10062 п.н. у F.gigantica. Длина большинства белок-кодирующих генов не отличается между двумя видами. Исключение составляет локус nad5, который на 3 п.н. короче у F.gigantica. Отличия в длине у генов тРНК и рРНК невелики и колеблются от одной до четырех пар нуклеотидов. Имеются межвидовые отличия в использовании старт- и стоп-кодонов. Помимо указанных различий, кодирующие мт-последовательности четырех фасциол F.hepatica отличаются между собой по числу и локализации единичных мутаций, или SNP (рис. 4).

Рис. 4. Распределение SNP в кодирующих последовательностях митохондриального генома F.hepatica.

Обнаружены небольшие различия по числу SNP и между двумя последовательностями F.gigantica. Межвидовой уровень полиморфизма в среднем в десять раз выше, чем внутривидовой. Наиболее полиморфными при внутривидовом сравнении оказались гены cob, nad4l, cox1 и nad6 (доля SNP от 1,77% до 1,89%). Наименее полиморфным локусом оказался cox2 (0,66%). Внутривидовой полиморфизм аминокислотных последовательностей F.hepatica колеблется от 0 (cox2) до 2,65% (nad6), а при межвидовом сравнении возрастает от 6 до 16 раз (6,46% – 13,87%). Средний межвидовой уровень полиморфизма по всей последовательности составляет 1,25% при внутривидовом сравнении и 9,38% – при межвидовом. Еще одной характеристикой генома является распределение и соотношение транзиций и трансверсий по кодонам. Во всех локусах транзиции преобладают над трансверсиями, а число транзиций и трансверсий больше всего в третьей позиции кодона, а меньше всего – во второй.

Различия в нуклеотидном составе у разных организмов (или их групп) сопряжены с различием в аминокислотном составе белков и является важным признаком при сравнении геномов и их описании. Как и у других беспозвоночных, в митохондриальных геномах плоских червей преобладают АТ-основания. У обоих видов фасциол AT оснований почти в два раза больше, чем GC. В целом уровень AT/GC содержания (65/35) у F.hepatica и F.gigantica средний для Platyhelminthes. AT/GC-содержание в разных локусах мт-генома всех шести исследованных особей варьирует в небольших пределах от 62/ (cytb) до практически 67/33 (nad3). Наиболее часто встречающимся кодоном является кодон UUU, реже всех используется кодон CCA.

Относительное использование синонимичных кодонов (RSCU) варьирует у двух видов в пределах от 2,57 (UUG, GCU) до 0,15 (CCA).

В совокупной белок-кодирующей последовательности наибольшие доли имеют шесть аминокислот: лейцин, фениаланин, валин, глицин, цистеин и серин. Содержание фенилаланина и валина у F.gigantica немного превышает таковое у F.hepatica. Белки, кодируемые генами cox2 и nad4l, имеют наибольшие отличия в первичной структуре у двух видов фасциол.

Мы построили дендрограмму по полным белок-кодирующим последовательностям мт-геномов двух видов фасциол (рис. 5), подтверждающую наличие двух основных генеалогических линий (I и II).

Рис. 5. Дендрограмма филогенетических различий, построенная по полным белок-кодирующим последовательностям мт-генома F.hepatica и F.gigantica.

2.2.5. Внутри- и межвидовой полиморфизм транспортных РНК мт-генома печеночных сосальщиков Помимо 12 белок-кодирующих генов и двух генов рРНК мы получили первичные последовательности 22 генов тРНК у четырех образцов F.hepatica и двух - F.gigantica. Гены тРНК являются самыми полиморфными структурными генами митохондриального генома фасциол: лишь восемь генов из 22 не отличаются по длине у двух видов. Кроме того, сразу в трех генах тРНК уровень полиморфизма выше 14%, в то время в то время как среди белковых генов максимальный уровень полиморфизма составляет 13,87%. Наиболее полиморфными оказались последовательности генов tRNA-Tre (14,7%), tRNA-Val (14,3%), tRNA-Asn (14,3%) и tRNA-Met (12,5%). Наиболее консервативны последовательности генов tRNA-Pro (5,8%) и tRNA-Tyr (5,3%). Результаты моделирования, показывают, что вторичная структура тРНК не изменяется даже в тех молекулах, которые имеют наибольшие отличия в первичной последовательности у двух видов.

2.2.6. Структура, полиморфизм и филогенетический анализ генов тубулина-2 (tubb2) При амплифицировании участка гена tubb2 на 8 образцах ДНК F.hepatica и F.gigantica получены 8 единичных фрагментов по п.н., внутри которых определены границы трех экзонов и двух интронов путем выравнивания с двумя известными последовательностями кДНК tubb2 F.hepatica из Великобритании. В последовательностях tubb2 российских образцов мутации в два раза чаще встречаются в интронах по сравнению с экзонами (5,5% и 2,5 2,8%), причем более короткий второй интрон оказался и наиболее полиморфным (11,6%). При сравнении российских и английских образцов показано, что наиболее полиморфными оказались протяженные второй и третий экзоны гена tubb2 у F.hepatica из российских популяций (2,6% и 3,7%). Изменения аминокислотного состава тубулина у российских образцов составили 2,4% по сравнению с сосальщиками из Великобритании (0,34%).

На основании суммарной нуклеотидной последовательности экзонов и интронов гена tubb2 построена дендрогамма генетических различий, отражающая дифференциацию российских популяций (рис.

6).

Рис. 6. Дендрограмма генетических различий между фасциолами из российских популяций, построенная на основании суммарной нуклеотидной последовательностей трех экзонов и двух интронов гена tubb2.

Среди фасциол российской части ареала можно выделить три хорошо дифференцированные группы. При сравнении суммарной последовательности только кодирующих участков гена tubb2 различия между выборками фасциол из трех областей Российской Федерации менее выражены. Однако популяции из России и Великобритании формируют два отдельных, далеко отстоящих друг от друга кластера.

Аналогичная дифференциация на две группы обнаружена нами и при сравнении аминокислотных последовательностей гена tubb2. Таким образом, мы впервые продемонстрировали пригодность этого гена для дифференциации географически разобщенных популяций печеночного сосальщика F.hepatica.

3. Обсуждение Строение и полиморфизм митохондриального генома. Показаны различия в строении и полиморфизме мт-геномов двух видов печеночных сосальщиков F.hepatica и F.gigantica. Подобные отличия у близких видов были обнаружены и среди шистосом S.haematobium и S.spindale (Littlewood e al., 2006), но не у описторхисов (Shekhovtsov et al., 2010). Межвидовой уровень полиморфизма в гене cox1 у F.hepatica и F.gigantica составляет 10,4 %, что сопоставимо с уровнем различий по тому же гену у E.revolutum и E.malyanum: 8 – 16 % (Saijunta et al., 2010). У изученных нами фасциол АТ-содержание составляет 63,6%. У других трематод этот показатель составляет от 59,4 % у O.viverrini, до 68,7 % у S.mansoni (Cai et al., 2012;

Le et al., 2002). Не найдено существенных различий в аминокислотном составе мт-белков у двух видов фасциол.

Генетическая дифференциация популяций. Обнаружены две линии фасциол при сравнении фрагментов мт-генов nad1 и cox (Semyenova et al., 2006) и cox3 и cob (Teofanova et al., 2011). Наши исследования, проведенные на более широкой выборке (n=61) и на полных последовательностях генов nad1 и cox1, подтверждают наличие двух генеалогических линий в популяциях F.hepatica. Исследование еще 29 мт-последовательностей из GenBank дало те же результаты. Мы предполагаем, что генеалогические линии могут быть приравнены к подвидам. Возможно, эти линии являются морфами F.hepatica, которые описал ранее Д.Ф.Синицын в 1915 году. Интересна показанная недавно генетическая дифференциация F.gigantica из Африки и Индии на две большие клады: в одну попали сосальщики из Танзании, в другую – из Индии (Walker et al., 2012). Авторы исследования утверждают, что это свидетельство существования криптических видов. Наши образцы F.gigantica попадают в кладу с индийскими образцами. Обнаружение подобной значительной генетической неоднородности F.gigantica вновь поднимает вопрос о существовании вида F.indica (Varma, 1953;

Tandon, 1968;

Гариев, 1970). Наличие генеалогических линий является для трематод и цестод распространенным явлением (Laoprom et al., 2009;

Liu et al., 2012;

Knapp et al., 2009).

Время дивергенции. Используя гипотезу молекулярных часов, мы рассчитали предполагаемое время дивергенции между видами F.hepatica и F.gigantica, а также между линиями внутри вида F.hepatica. Расчетное время возможной дивергенции видов F.gigantica и F.hepatica ~ 2,9 – 3,6 млн. лет назад, а генеалогических линий F.hepatica ~ 100 тыс. лет назад (при скорости мутаций 2 – 4 % на основание в миллион лет).

Молекулярные маркеры при изучении резистентности трематод к антигельминтикам. Для трематод имеются доказательства того, что их устойчивость к БЗ связана с белком тубулин-2 (Ryan et al., 2008).

Поэтому изучение общей структуры и полиморфизма гена tubb2 в разных географических популяциях фасциол можно рассматривать как необходимый этап для дальнейшего поиска чувствительных и устойчивых к БЗ фасциол. Возможно, резистентность может быть неоднородной у фасциол, принадлежащих к разным генетическим линиям.

Выводы Впервые получены и охарактеризованы кодирующие 1.

участки мт-генома F.gigantica из популяций Узбекистана и Дагестана, а также представителей вида F.hepatica из популяций России, Белоруссии, Армении, Эквадора.

Филогенетический анализ полных нуклеотидных и 2.

аминокислотных последовательностей мт-генов cox1, nad1 подтвердил наличие в популяциях Fasciola hepatica двух генеалогических линий, показанное ранее по отдельным участкам этих генов.

Обнаружены межвидовые различия в длине белок 3.

кодирующих участков мт-генома (у F.gigantica - 10062 п.н., у F.hepatica - 10065 п.н.), различия в последовательностях и вторичных структурах тРНК, а также в использовании старт- и стоп-кодонов четырех генов nad4, nad1, cox1, nad5.

Уровень дивергенции между нуклеотидными 4.

последовательностями F.hepatica и F.gigantica составляет 12,3 %, что примерно в десять раз больше уровня внутривидового полиморфизма у F.hepatica.

Изученные образцы фасциол из Узбекистана и Дагестана 5.

принадлежат к индо-азиатской, но не африканской ветви F.gigantica.

Впервые определена структура гена tubb2 у двух видов 6.

фасциол. Два вида сосальщиков не отличаются между собой по длине и структуре гена tubb2, содержащего 3 экзона (57 п.н., 468 п.н., п.н.) и 2 интрона (185 п.н. и 86 п.н.). Показана пригодность гена tubb для дифференциации географически разобщенных популяций печеночного сосальщика F.hepatica.

Практические предложения Классическим жидкофазным методом является фенол хлороформный метод (ФХ-метод) выделения нуклеиновых кислот (НК). Достоинством этого метода является довольно высокий выход ДНК, а к недостаткам можно отнести длительность, трудоемкость, использование агрессивных органических растворителей и недостаточную чистоту ДНК. Концентрация экстрагированной ДНК составляет 2,0 – 2,3 мкг/мкл при чистоте OD 260/280 нм = 1,4-2,0.

Одним из новых методов является выделение ДНК с помощью набора реагентов Diatom DNA Prep 100 (производитель ООО «Лаборатория ИзоГен», Москва). От ФХ-метода данный способ отличатся иным принципом действия, а потому быстротой (0,5 – 1,5 часа на одну пробу) и отсутствием токсичных реагентов. Концентрация экстрагированной ДНК составляет 0,12 – 0,17 мкг/мкл при чистоте OD 260/280 нм = 1,6 2,0. Результаты исследований использованы при составлении методических положений «Способы выделения ДНК из тканей печеночных сосальщиков для последующего использования в ПЦР», одобренных секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН от 22 марта 2012 года (протокол №1).

Список работ, опубликованных по теме диссертации Гуляев А. С. Полиморфизм митохондриальных генов nad1 и 1.

cox1 в популяциях печеночного сосальщика Fasciola hepatica из Евразии и Латинской Америки / Васильев В. А., Лопаткин А. А., Корчагина Е. В., Мовсесян С. О., Горохов В. В., Архипов И. А., Москвин А. С., Виллавинценсио А. Ф., Семёнова С. К. // Материалы международной научной конференции «Биоразнообразие и экология паразитов наземных и водных ценозов», посвященной 130-летию со дня рождения академика К.И. Скрябина (9 – 11 декабря 2008 года), Москва.

С. 52 – 55.

Гуляев А. С. Изучение полиморфизма и экзон-интронной 2.

структуры гена тубулина-2 печёночных сосальщиков Fasciola hepatica и других трематод / Васильев В. А., Архипов И. А., Семёнова С. К. // Материалы III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (24 – 29 мая 2010), Нижний Новгород. С. 91 – 92.

Гуляев А. С. Изучение полиморфизма и экзон-интронной 3.

структуры гена тубулина-2 печёночных сосальщиков Fasciola hepatica и Fasciola gigantica / Васильев В.А., Филимонов Н.Ю., Архипов И.А., Семёнова С.К. // Материалы международной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологии» (30 ноября – 3 декабря 2010), Москва. С. 95 – 98.

Гуляев А.С. Дифференциация географических популяций 4.

печеночного сосальщика Fasciola hepatica на основании полиморфизма гена тубулина-2 (tubb2) / Васильев В. А., Филимонов Н.Ю., Семенова С. К., Архипов И. А. // Российский паразитологический журнал. 2011, №2. С. 10 – 16.

Гуляев А. С. Проблема устойчивости Fasciola hepatica к 5.

бензимидазолам: опыт мировой науки / Семенова С. К., Архипов И. А.

// Российский паразитологический журнал. 2012, №1. С. 104 – 109.

Гуляев А. С. Способы выделения ДНК из тканей 6.

печеночных сосальщиков для последующего использования в ПЦР / Семенова С. К. // Российский паразитологический журнал. 2012, №3. С.

128 – 129.

Гуляев А. С. Генетическая дивергенция митохондриальных 7.

геномов возбудителей фасциолеза — печеночных сосальщиков Fasciola hepatica и F.gigantica // Материалы международной научной конференции «Ломоносов» (9 – 13 апреля, 2012), Москва. С. 74.

Гуляев А. С. Строение и организация митохондриальных 8.

геномов паразитических плоских червей / Семенова С. К,, Архипов И.

А. // Материалы научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (16 – 18 мая, 2012), Москва. С. 146 – 149.

9. Gulyaev A. S. Phylogeography and phylogenomics of liver fluke Fasciola hepatica (Platyhelminthes: Trematoda) / Lopatkin A. A., Vasilyev V. A., Korchagina E. V., Gorokhov V. V., Arkhipov I. A., Moskvin A. S., Movsessyan S. O., Ryskov A. P., Semyenova S. K. // Contributions to the 3rd Moscow International Conference “Molecular Phylogenetics (MolPhy 3)” (July 31 – August 4, 2012), Moscow. P. 60 – 61.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.