авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Молекулярногенетическое изучение разнообразия и микроэволюции yersinia pestis

На правах рукописи

ПЛАТОНОВ Михаил Евгеньевич Молекулярногенетическое изучение разнообразия и микроэволюции Yersinia pestis 03.02.03 – микробиология 03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оболенск - 2010 2

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Анисимов Андрей Павлович;

кандидат медицинских наук Дентовская Светлана Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич кандидат биологических наук, с.н.с. Степаншина Валентина Николаевна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «20» января 2011 г. в 11 часов на заседании диссертационно го совета Д 350.002.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «20» декабря 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Н.К. Фурсова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Чума – острое инфекционное заболевание, относящееся к группе особо опасных карантинных инфекций. Возбудитель чумы, Yersinia pestis, - самый опасный из бактериальных патогенов. Чума была причиной трех пандемий и привела к гибе ли более 200 миллионов человек. Эта природно-очаговая инфекция передается укусами кро вососущих насекомых – блох и циркулирует в популяциях диких грызунов, но при легочной форме может передаваться непосредственно от человека к человеку [Perry, Fetherston, 1997].

Помимо чумного микроба, род Yersinia включает в себя еще 14 видов [Souza et al., 2010], два из которых - Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, вызывают у человека заболевания желу дочно-кишечного тракта [Brubaker, 1991]. Данные молекулярно-биологических исследова ний указывают на то, что вид Y. pestis произошел от Y. pseudotuberculosis O:1b серотипа [Skurnik et al., 2000] в последние 1500-20000 лет [Achtman et al., 2004]. Природные очаги чу мы имеются на всех материках, кроме Австралии и Антарктиды, занимая 6-7 % территории земного шара [Perry, Fetherston, 1997]. На территории бывшего Советского Союза насчитыва ется 42 природных очага чумы, 11 из них - в Российской Федерации [Онищенко, Кутырев, 2004]. Следствием географической и физической разобщенности природных очагов, влияния различных биотических и абиотических факторов, явилась адаптация, в результате которой чумной микроб приспособился к циркуляции в популяциях более 200 видов диких грызунов и лагоморфов, используя около 120 видов блох в качестве переносчиков [Онищенко, Куты рев, 2004]. В процессе аллопатрического видообразования сформировались подвиды, разли чающиеся по своим питательным потребностям, способности ферментировать различные субстраты и вирулентности для чувствительных к ним млекопитающих. До недавнего вре мени вид Y. pestis подразделяли на шесть подвидов: pestis, altaica, caucasica, hissarica, talassica и ulegeica [Anisimov et al., 2004]. По биохимической активности внутривидовые группы Y. pestis делили на три биовара: antiqua, mediaevalis, orientalis [Devignat, 1951].

Для типирования Y. pestis применяют как фенотипические, так и генетические мето ды. В основу фенотипических методов положены питательные потребности, способность ферментировать различные субстраты, и вирулентность для различных видов животных. Хо тя фенотипические методы и позволяют различать подвиды и биовары Y. pestis, с их помо щью невозможно проводить дифференциацию на уровне штаммов. К тому же нестабиль ность проявления фенотипических признаков, их зависимость от условий эксперимента, а также наличие атипичных штаммов, существенно затрудняют интерпретацию результатов [Апарин, Голубинский, 1989;

Anisimov et al., 2004].

В связи с этим, решающую роль в типировании чумного микроба, играют молекулярно биологические методы. В разное время с этой целью использовали плазмидный скрининг [Ба лахонов, 1989;

Filippov et al., 1990], определение полиморфизма длин рестрикционных фраг ментов – RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) [Picard, 2000], риботипирование [Guiyoule et al., 1994], IS-типирование [Бобров, 1995;

Motin et al., 2002;

Torrea et al., 2006], и PCR-фингерпринт. К методам PCR-фингерпринта относятся случайно амплифицированные полиморфные ДНК - RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA) [Huang et al., 2000], повторяющиеся экстрагенны палиндромы – REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic se quences) [Kim et al., 2003] и повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности эн теробактерий ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequences) [Kingston J.J., et al., 2009]. Общими недостатками этих методов являются: низкая межлабораторная вос производимость, необходимость в большом количестве материала для исследования, слож ность использования полученных результатов для создания совместимых баз данных.





Доступность полной нуклеотидной последовательности геномов микроорганизмов [Parkhill et al., 2001] послужила толчком для развития новых современных молекулярно генетических методов. В настоящее время для генотипирования Y. pestis широко используют многолокусный анализ вариабельных тандемных повторов – MLVA (Multiple Locus Variable Number Tandem Repeats Analysis) [Klevytska et al., 2001;

Le Flche et al., 2001], DFR типирование – анализ отличающихся участков ДНК (Different Region), CRISPR-типирование (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – кластеризованные короткие па линдромные повторы, разделенные спейсерами) [Pourcel et al., 2005]. SNP-типирование – анализ полиморфизма единичных нуклеотидов (Single-Nucleotide Polymorphism) [Schork et al., 2000], полногеномный сиквенс [Eppinger et al., 2010]. Данные методы лишены перечис ленных выше недостатков и обладают высокой разрешающей способностью.

Активизация в конце XX века ряда природных очагов чумы Африки, Азии и Америки послужила причиной увеличения заболеваемости людей бубонной и легочной формами дан ной инфекции, что указывает на нестабильность эпидемиологической обстановки [Онищен ко и др., 1998]. Не меняется эта тенденция и в начале XXI века [Онищенко, Кутырев, 2004].

Возрастание числа эпидемических проявлений чумы, наряду с возможностью перемещения авиатранспортом инфицированных Y. pestis людей в течение нескольких часов с одного кон тинента на другой, а также возрастающая опасность международного терроризма свидетель ствуют об актуальности совершенствования молекулярно-эпидемиологических методов, на правленных на генетическую паспортизацию штаммов Y. pestis из различных природных очагов, необходимую для выявления источников заражения и проведения адекватных лечеб ных и санитарно-эпидемиологических мероприятий. В условиях сложившейся эпидемиче ской ситуации развитие и использование новых методов в клинической диагностике и эпи демиологических исследованиях приобретает особое значение. В качестве наиболее перспек тивных, следует выделить молекулярно-биологические методы, особенно комплексное соче тание нескольких методов [Shangkuan et al., 1997;

Sander et al., 1998], что позволит более точно выявлять звенья эпидемиологических цепочек распространения инфекции и своевре менно локализовать очаги чумы.

Изучение разнообразия и микроэволюции Y. pestis важно как для решения фундамен тальных задач медицинской микробиологии, таких как выявление механизмов происхожде ния и эволюции инфекционных болезней человека и животных, так и для разработки новых высокоспецифичных методов молекулярной эпидемиологии, а именно идентификации, гено и геномотипирования Y. pestis. Генотипирование – один из наиболее эффективных и относи тельно недорогих методов, применяемых для целей паспортизации природных очагов, эпи демиологического расследования случаев заболеваний и экспертизы актов биотерроризма.

Цель исследования - изучение генетического разнообразия и микроэволюции чумно го микроба из природных очагов Российской Федерации и сопредельных государств метода ми DFR- и MLVA-типирования.

Задачи исследования:

1. Создать пополняемый электронный каталог "геномных портретов" (DFR- и MLVA25-профилей) представительного набора штаммов Y. pestis, включающий данные, по лученные в нашей лаборатории, лабораториях коллабораторов: Gilles Vergnaud (Universit Paris-Sud, Institut de Gntique et Microbiologie, Orsay, France) и Ruifu Yang (Laboratory of Analytical Microbiology, State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing, China), а также информацию о штаммах с доступны ми в Интернете полными последовательностями геномов.

2. Провести DFR-типирование штаммов Y. pestis;

оценить дискриминирующую спо собность метода, корректность кластеризации внутривидовых групп и возможность исполь зования для оценки микроэволюции.

3. Провести многолокусный VNTR анализ штаммов Y. pestis;

оценить дискримини рующую способность метода, корректность кластеризации внутривидовых групп и возмож ность использования для оценки микроэволюции;

сравнить эффективность MLVA25- и DFR типирования.

4. Подготовить предложения по дополнению внутривидовой таксономии Y. pestis и привидению ее в соответствие с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий.

Научная новизна. Обнаружено 60 новых DFR-генотипов и 352 новых MLVA25 генотипов штаммов чумного микроба. Установлено, что на территории одного природного очага чумы может циркулировать несколько DFR-, MLVA25- и DFR/MLVA25-генотипов, входящих в единый генетический кластер. В то же время одинаковые DFR-типы могут вхо дить в состав разных MLVA25- и DFR/MLVA25-кластеров, что свидетельствует о возможно сти гомоплазии по DFR-профилям. Циркуляция филогенетически близких MLVA25- и DFR/MLVA25-генотипов на территориях смежных природных очагов свидетельствует о це лесообразности их объединения. Так, Присеванский горный (5) и Зангезуро-Карабахский горный (6) очаги должны быть объединены в Нагорно-Закавказский (5/6), Бозчельский рав нинно-предгорный (8) и Джейранчельский равнинно-предгорный (11) – в Бозчельско Джейранчельский равнинно-предгорный (8/11), а к Горно-алтайскому очагу (36) – присоеди нены соответствующие территории Монголии. Кластеризация на основе DFR- и MLVA профилей соответствует таковой при SNP-типировании, а сочетанный анализ результатов DFR- и MLVA-методов повышает их разрешающую способность и позволяет получать фи лограммы, свидетельствующие о следующем порядке дивергенции в ходе микроэволюции возбудителя чумы: Y. pseudotuberculosis Y. pestis bv. antiqua (африканская ветвь) Y. pestis subsp. angola Y. pestis subsp. caucasica Y. pestis bv. intermedium Y. pestis bv. antiqua (ази атская ветвь) Y. pestis bv. medievalis Y. pestis bv. orientalis Y. pestis subsp. ulegeica Y. pestis subspp. qinghaiensis, talassica, xilingolensis, hissarica и altaica.

Практическая значимость и внедрение результатов работы. В GeneBank депони ровано 8 последовательностей VNTR-локусов (международный уровень внедрения).

В коллекции микроорганизмов ГНЦ ПМБ депонирован набор из 10 штаммов Y. pestis - типовых для многолокусного VNTR анализа (федеральный уровень внедрения).

Создан постоянно пополняемый электронный каталог "геномных портретов" (DFR- и MLVA25, включающий на момент написания диссертации информацию о 601 штамме Y. pestis.

Установлено, что выделенные на территории Монголии штаммы подвида altaica вхо дят в состав двух разных ветвей кластера talassica/qinghaiensis/xilingolensis/hissarica/altaica, один из которых представлен штаммами близкими штаммам подвида altaica, циркулирую щим на территории Горного Алтая в России. Второй кластер представлен штаммами подоб ными штаммам подвида xilingolensis, циркулирующим в L очаге на территории Китая. Необ ходима проверка штаммов подвида altaica в коллекциях учреждений, проводящих работы с возбудителем чумы для определения их действительного таксономического положения.



Изучение штаммов Y. pestis методами DFR- и MLVA-типирования рекомендовано нами в качестве одного из дополнительных критериев внутривидовой классификации возбудителя чумы.

Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при со ставлении методических рекомендаций "Генотипирование штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного VNTR-анализа". Оболенск, 2009 (учрежденческий уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов Пущинского государст венного университета и аспирантов ГНЦ ПМБ, а также при обучении современным методам генотипирования специалистов противочумных учреждений.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный комплекс методических приемов (электронный каталог, включаю щий информацию о DFR- и MLVA25-генотипах 601 штамма Y. pestis, а также методические рекомендации по проведению молекулярного типирования методом MLVA25) позволяет оп ределять принадлежность штаммов чумного микроба к конкретным подвидам и биоварам, а также к природным очагам чумы: 1, 4, 5-7, 8/11, 9, 10, 31/33, 34, 36, 37, 38, 39, 40/M, 43, рас положенным на территории стран СНГ.

2. Сочетание универсальной вирулентности со способностью ферментировать рамно зу, а также DFR/MLVA25-профиль, занимающий промежуточное положение между таковы ми у представителей азиатской ветви bv. antiqua и кавказской группой штаммов bv. microtus, позволяет выделить штаммы, циркулирующие в очаге B Китая в новый внутривидовой так сон - биовар intermedium.

3. Сочетанное использование DFR/MLVA25-типирования позволяет предложить сле дующий порядок дивергенции в ходе микроэволюции возбудителя чумы:

Y. pseudotuberculosis Y. pestis bv. antiqua (африканская ветвь) Y. pestis subsp. angola Y. pestis subsp. caucasica Y. pestis bv. intermedium Y. pestis bv. antiqua (азиатская ветвь) Y. pestis bv. medievalis Y. pestis bv. orientalis Y. pestis subsp. ulegeica Y. pestis subspp.

qinghaiensis, talassica, xilingolensis, hissarica и altaica.

4. Несоответствие правилам Международного кодекса номенклатуры бактерий внут ривидовой таксономии чумного микроба требует переименования биовара microtus в подвид microtus, а входящих в него в настоящее время филогенетических групп, а именно подвидов altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis – в биовары altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы отдела особо опасных ин фекций (ЛМЧ) ГНЦ ПМБ по планам НИР в рамках проекта МНТЦ № 2426 (научный руково дитель - к.м.н. С.В. Дентовская);

проекта РФФИ № 08-04-00405-а (научный руководитель д.м.н., проф. А.П. Анисимов) и Госконтрактов № 119-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01890017743) и № 53-Д от 29.06.2010 г. с Роспотребнадзором (научный руководитель д.м.н., проф. А.П. Анисимов).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в дис сертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с В.В. Евсеевой (ЛМЧ ГНЦ ПМБ). На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали участие сотрудники ЛМЧ ГНЦ ПМБ Е.В. Чиркова и Т.В. Гапельченкова. Всем им автор вы ражает глубокую благодарность. Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы к.м.н. С.В. Дентовской (ЛМЧ ГНЦ ПМБ) и д.м.н., проф. А.П. Анисимова (ГНЦ ПМБ) за интересное и полезное обсуждение результатов на всех ее этапах.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены, доложе ны и обсуждены на: NIAID Research Conference (Opatija, Croatia, 2006);

VII-й Межгосударствен ной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Оболенск, 2006 г.);

9th International Symposium on Yersinia (Lexington, Kentucky, USA, 2006);

II Всероссийской научно практической конференции с международным участием "Инфекции, обусловленные иерсиния ми" (Санкт-Петербург, 2006);

научно-практической конференции "Современные аспекты эпиде миологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России" (Ставрополь, 2007);

9th Symposium of Analytical Microbiology (Beijing, People’s Republic of China, 2007);

NATO Science for Peace and Security Programme Advanced Research Workshop “Emerging and Endemic Pathogens: Advances in Surveillance, Detection, and Identification” (Тбилиси, Грузия, 2008);

научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно исследовательских учреждений Роспотребнадзора "Биологическая безопасность в современном мире" (Оболенск, 2009);

научно-практической конференции "Современные аспекты эпидемио логического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней", посвя щенной 75-летию Иркутского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (Иркутск, 2009);

научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора "Современные технологии обеспечения биологической безопасности" (Обо ленск, 2010);

10th International Symposium on Yersinia (Recife, Brazil, 2010);

International Symposium on Bacterial Evolution and Pathogenesis (Zhenjiang, Jiangsu province, China, 2010).

Публикации. Основное содержание работы

отражено в 9 научных публикациях (три статьи в международных рецензируемых журналах, реферируемых ISI).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машино писного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, заклю чения, выводов и списка литературы, включающего 49 работ отечественных и 112 работ за рубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 10 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования В работе использовано 176 штаммов Y. pestis, которые выращивали на агаре Хоттин гера с добавлением 1 % гемолизированной крови в течение 48 ч при температуре 28 °С. Ге номную ДНК выделяли в соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.1794 – 03 «Ор ганизация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроор ганизмами I-II групп патогенности» с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК из биопроб производства НПФ «Литех».

В филогенетическом анализе также использовали данные по DFR- и MLVA25-типам 403 штамма чумного микроба, предоставленные зарубежными коллабораторами: Gilles Vergnaud (Франция) и Ruifu Yang (Китай). Опубликованные полногеномные последовательно сти 22 штаммов чумного микроба, а так же штамма Y. pseudotuberculosis IP32953 использовали для генотипирования методами мультилокусного VNTR анализа и DFR-анализа in silico.

DFR-анализ штаммов Y. pestis проводили, как описано ранее [Zhou et al., 2004b;

Dai et al., 2005]. Полученные результаты вносили в базу данных программы Bionumerics 5.1. Для по строения дендрограммы использовали метод Neighbor-Joining с коэффициентом Dice для би нарных данных. При построении дерева в качестве корневого вида использовали штамм Y. pseudotuberculosis IP32953. Для того чтобы определить DFR-генотипы профили исследован ных штаммов сравнивали с профилями 32 геномоваров, выявленных ранее [Li et al., 2008].

MLVA25 типирование штаммов Y. pestis проводили, как описано ранее [Le Flche et al., 2001] в модификации [Li et al., 2009]. Полученные результаты вносили в базу данных про граммы Bionumerics 5.1. Кластерный анализ выполняли с использованием метода Neighbor Joining и категорического коэффициента. При построении дерева в качестве корневого вида использовали штамм Y. pseudotuberculosis IP32953.

Анализ и сравнение результатов полученных при использовании различных методов генотипирования проводили с помощью опции "composite data set" программы Bionumerics 5.1.

О дискриминирующей способности методов DFR- и MLVA25-типирования по отдельности, а также сочетанного анализа DFR/MLVA25 судили по индексу разнообразия (Din) E.H. Simpson’а [Simpson, 1949], рассчитанному, как было описано ранее [Hunter, Gaston, 1988].

Созданный и постоянно пополняемый электронный каталог штаммов Y. pestis и их ге нотипов представляет собой электронную таблицу в формате Microsoft Excel. Вся информа ция по одному штамму представлена в ячейках одной строки (возможно внесение до 256 па раметров): номер штамма, видовое название, время выделения, место выделения/природный очаг, источник выделения/основной хозяин, подвид, биовар, а затем следуют ячейки с гено типами. При введении в таблицу данных генотипирования в первую ячейку вносят номер ге нотипа, а в последующие ячейки, число которых соответствует количеству анализируемых локусов, нумерические данные результатов исследований: для DFR-типирования – "1" или "0" при наличии или отсутствии амплификата, соответственно, а для MLVA – количество тандемных повторов в VNTR-локусе или "0" при отсутсвии амплификата. Таблица Microsoft Excel может быть импортирована в программу Bionumerics 5.1 в соответствии с рекоменда циями разработчиков (www.applied-maths.com).

Результаты исследования На основании анализа DFR-профилей 235 штаммов Y. pestis1, одного штамма Y. pseudotuberculosis и с учетом данных о ранее описанных 32 геномоварах2 [Li et al., 2008] нам удалось подразделить все исследованные к настоящему моменту изоляты на 92 DFR-типа (Din = 0,687) (рис. 1). Согласно полученным результатам, на территориях стран СНГ и в Мон голии циркулируют как минимум 52 геномовара. Большинство геномоваров вошли в состав трех кластеров: A, B и C (по Y. Li et al. [2008]), соответствующих основным ветвям, 1, 2 и 0, дендрограмм, построенных M. Achtman et al. [2004] на основании данных SNP- и IS100 типирования (рис. 2). В нашем исследовании вне кластеров остался африканский "полевочий" штамм subsp. angola – Angola, что может свидетельствовать как о его относительно древнем происхождении, так и об отсутствии среди анализируемых изолятов других филогенетически близких ему штаммов. Как и в публикации наших китайских коллег [Li et al., 2008], все штам мы биовара orientalis (24 штамма в составе 10 геномоваров) вошли в состав кластера A/1, все штаммы биовара medievalis (67 штаммов в составе 28 геномоваров) – в кластер B/2, а предста вители биовара microtus (неосновные подвиды Y. pestis [Li et al., 2009]) (84 штамма в составе 26 геномоваров), за исключением геномовара 85, представленного штаммом Angola, - в кла стер C/0. Штаммы биовара antiqua (58 штаммов в составе 27 геномоваров) распределились по различным ветвям кластеров A/1, B/2 и C/0.

В состав кластера B/2 входят две основные ветви (рис. 1). Одна из ветвей соответству ет ветви 2.ANT на рис. 2 и представлена в основном геномоварами: 10-13, 17, 26-28, 58, 62, циркулирующими на территориях Китая и Монголии, геномоваром 19 - основным DFR типом в граничащем с Китаем и Монголией природном очаге 38 и минорным для очага 1, Монголии, Китая и Непала, а также минорными геномоварами 57 и 59 природного очага 1.

Вторая ветвь соответствует ветви 2.MED на рис. 2 и образована, в основном, DFR-типами, характерными для природных очагов стран СНГ. Она включает геномовар 15 - основной DFR-тип штаммов биовара medievalis, циркулирующих в природных очагах Средней Азии.

DFR-профили 165 штаммов определены в настоящем исследовании экспериментально, ана логичные данные о 48 штаммах взяты из работы [Li et al., 2008], а DFR-профили 22 штаммов получены в результате анализа полногеномных нуклеотидных последовательностей, доступ ных в Интернете.

В работе [Li et al., 2008] первый геномовар включает два "подгеномовара": 1a и 1b.

Рисунок 1. NJ-дендрограмма и DFR-профили 92 геномоваров Y. pestis "gv" – геномовар;

"bv" – биовар;

"ANT" – antiqua (заглавные буквы обозначают, что геномо вар описан ранее);

"INT" - intermedium3;

"med" - medievalis;

"mic" - microtus;

"ori" - orientalis;

"ssp" – подвид (обозначены первой буквой названий, а в случае subsp. angola3 – двумя пер выми буквами);

"no" – количество штаммов, проанализированных в нашей работе;

"?" – нет данных.

Аргументация по необходимости введения во внутривидовую классификацию новых так сонов приведена далее.

Рисунок 2. Дендрограмма микроэволюции 21 штамма Y. pestis по данным SNP типиро вания [Derbise et al., 2010] Все изученные нами штаммы биовара orientalis вошли в состав кластера A/1 и были вы делены за пределами СНГ, Монголии и Китая. В этот же кластер вошли штаммы биовара antiqua, циркулирующие на территории Монголии (геномовар 01b (минорный DFR-тип для ки тайских очагов B1, C, D, G и K2) – четыре штамма, геномовар 62 – один штамм) и стран СНГ в природных очагах: 31 (основной для соседнего китайского очага A [Li et al., 2008] геномовар – один штамм), 33 (геномовар 60, отличающийся от геномовара 04 отсутствием DFR18, – один штамм) и 37 (геномовар 61 – девять штаммов, геномовар 01b – один штамм). В состав этого кла стера входят и штаммы геномовара 03 биовара intermedium, циркулирующие в китайском очаге B3. Кластер включает две основные ветви, одна из которых (DFR-типы: 07-09, 32-35, 56, 86-89) соответствует ветви 1.ORI на рис. 2, а остальные геномовары в составе второй ветви - 1.ANT.

Кластер C/0 формировали две основные ветви (рис. 1), одна из которых включала ге номовар 90 (ветвь 0.PE2 на рис. 2), а вторая DFR-типы 14 и 80 (ветвь 0.PE4 на рис. 2).

В 0.PE2 ветвь, кроме DFR-типа 90 входили геномовары: 24 (минорный геномовар штаммов bv. antiqua subsp. pestis из китайского очага C;

основной - для subsp. ulegeica (семь штаммов из Монголии) и минорный для subsp. caucasica (по одному штамму из очагов 5 и 7));

63, 67, 70, 71, 74, 72, 76 (по одному штамму subsp. caucasica из очагов 6, 7, 4, 4, 39, 39, 5, соответственно);

64 (по одному штамму subsp. caucasica из очагов 6 и 7) и основной для оча га 39 геномовар 73 (семь штаммов subsp. caucasica).

Ветвь 0.PE4 более разнообразна по входящим в нее подвидам. Сюда вошли геномова ры 62, 23, 30 основного подвида биовара antiqua из Монголии и Китая. Большинство входя щих в группу 0.PE4 штаммов биовара microtus обладало DFR-типом 14 - основным геномо варом китайских подвидов qinghaiensis и xilingolensis, который также оказался характерным для трех монгольских штаммов, относимых к подвиду altaica. В случае выявления близкого родства этих штаммов и с помощью других методов молекулярного типирования следует по ставить вопрос о тщательной проверке всех коллекционных штаммов подвида altaica, выде ленных в Монголии, на предмет их перевода в соответствующий внутривидовой таксон. Ге номовар 80 – основной для штаммов подвида altaica, выделенных в очаге 36 (12 штаммов) и в Монголии (один штамм). К этому же геномовару относится и единственный в нашем ис следовании представитель bv. talassica A-1820. Штамм Pestoides A относится к этому же DFR-типу и, вероятно, является представителем подвида altaica или talassica. Штаммы subsp.

caucasica геномовара 69 циркулируют в очагах 4 (два штамма), 5 (два штамма) и 7 (один штамм). Остальные входящие в ветвь 0.PE4 геномовары представлены одним - двумя штам мами подвидов hissarica, altaica, caucasica и ulegeica.

Маловероятно, что совпадение DFR-типов (03 и 24) у штаммов из географически изо лированных природных очагов и разных внутривидовых групп (рис. 1) связано с их заносом с одной территории на другую. Скорее это совпадение можно объяснить независимой утра той амплифицируемых локусов или участков "посадки" праймеров и даже ошибками, допу щенными при проведении коллекционной работы со штаммами. Верификация полученных нами результатов с помощью других методов мультилокусного генотипирования (MLVA, CRISPR-типирование и др.) поможет ответить на эти вопросы.

На основании анализа MLVA-профилей 601 штамма Y. pestis4 и одного штамма Y. pseudotuberculosis нам удалось подразделить все исследованные к настоящему моменту изоляты на 430 MLVA25-типов (Din = 0,993), причем 352 из них описаны впервые с нашим участием или непосредственно нами. На территориях стран СНГ и в Монголии циркулируют как минимум 119 MLVA25-типов (проанализировано 139 и 23 штамма, соответственно).

На начальном этапе нашей работы был создан совместный с китайскими и француз скими коллегами электронный каталог [Li et al., 2009] предложенных C. Pourcel et al. [2004] профилей 25 VNTR-маркеров Y. pestis, включающий данные о генотипировании 383 штам мов из природных очагов Китая, 38 изолятов из СНГ и Монголии [Li et al., 2009], а также ра нее опубликованные данные о 180 штаммах из французской коллекции штаммов чумного микроба [Pourcel et al., 2004]. Глобальная кластеризация Y. pestis, полученная нами с помо щью MLVA (рис. 3), соответствует данным предыдущих исследований.

MLVA25-профили 176 штаммов определены в нашей лаборатории, данные о 22 штаммах получены в результате анализа полногеномных нуклеотидных последовательностей, доступ ных в Интернете, а остальная информация взята из нашей совместной работы с зарубежными коллегами [Li et al., 2008].

Рисунок 3. NJ-дендрограмма MLVA25-типов Y. pestis Левая точка – "корневой вид" Y. pseudotuberculosis;

правая точка - штамм Angola;

стрелки штаммы Y. pestis subsp. pestis, с неожиданными генотипами.

Так, SNP анализ выявил две отличающиеся по данным молекулярного типирования группы bv. antiqua, представляющие две линии Y. pestis (1.ANT и 2.ANT), эволюционно связанные с ветвями bv. orientalis и bv. medievalis [Achtman et al., 2004]. В этих ранних исследованиях ли ния 1.ANT была представлена африканскими изолятами bv. antiqua. Аналогичная кластери зация bv. antiqua была проведена с помощью CRISPR-типирования [Pourcel et al., 2005]. Эти две ветви были классифицированы как азиатская и африканская, но настоящее исследование показывает, что оба кластера bv. antiqua циркулируют в азиатских природных очагах чумы.

Работа, начатая совместно с лабораториями G. Vergnaud и R. Yang [Li et al., 2009], по лучила продолжение в рамках федеральной целевой программы "Национальная система хими ческой и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)". Созданный в рамках международного сотрудничества электронный каталог [Li et al., 2009], включающий информацию о MLVA25-генотипах более 450 штаммов Y. pestis, а также методические мате риалы по проведению молекулярного типирования этим методом в 2009 г. были переданы на ми для практического использования в Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока и Ставропольский научно-исследовательский противо чумный институт. Совместно был определен перечень штаммов для дальнейшего исследова ния, и часть из них была передана в ГНЦ ПМБ для проведения генотипирования в нашей ла боратории. Значительное увеличение количества анализируемых штаммов из регионов Кавка за и Горного Алтая дало более полную картину о биоразнообразии чумного микроба, цирку лирующего в природных очагах, расположенных на этих территориях. Так, увеличение числа изолятов из очагов 4-7 с семи до 24 и включение в исследование девяти штаммов из очага позволило выявить в составе кластера subsp. caucasica три независимые ветви (рис. 4.А), соот ветствующие природным очагам 39 (Дагестан), 4 (Армения и Грузия) и группе очагов 5- (Азербайджан и Армения). Полученные данные свидетельствуют, что очаги 5, 6 и прилегаю щую к ним часть очага 7 можно рассматривать как единый природный очаг чумы.

А Б Рисунок 4. Фрагменты NJ-дендрограммы MLVA25-типов штаммов Y. pestis (А) subsp.

caucasica (цифрами указаны номера природных очагов чумы) и (Б) subspp. talassica, qing haiensis, xilingolensis, hissarica и altaica Увеличение количества штаммов subsp. ulegeica с трех до десяти не изменило поло жения этой относительно автономной гомогенной группы относительно других ветвей денд рограммы.

Штаммы bv. microtus из очагов 34, 36, 40, L, M и изоляты subsp. altaica из Монголии образовывали единый кластер, в одну из ветвей которого входили подвиды talassica, qing haiensis, xilingolensis, а во вторую - hissarica и altaica (рис. 4.Б). Результаты MLVA подтвер ждают представленные в предыдущей главе данные о принадлежности штаммов I-3088, I 3132 и I-3134 не к подвиду altaica, а к xilingolensis.

При анализе штаммов биоваров antiqua и medievalis из природных очагов СНГ и Мон голии также подтверждена приуроченность определенных MLVA25-типов к конкретным природным очагам чумы.

Построение достоверных деревьев филогенеза отдельных видов требует сочетанного использования информации о многих локусах/генах, полученной с помощью различных тех нологий (MLVA, SNP-, IS-, DFR-типирование и т.д.), и подбора аналитических методов, даю щих близкие результаты кластеризации для различных технологий генотипирования [Heled, Drummond, 2010]. В результате использования опции "composite data sets" программы Bionumerics 5.10 мы получили очень “простую” и логичную дендрограмму-филограмму (рис. 5), в которой, в отличие от DFR-, MLVA- и SNP-дендрограмм нет проникновения генети ческих групп одного биовара в ветви, сформированные представителями других биоваров. По данным сочетанного DFR/MLVA25-типирования (Din = 0,996) наиболее древними представи телями вида является группа изолятов биовара antiqua из Центральной Африки, за ними следу ет уникальный штамм 797 того же биовара, но выделенный по данным паспорта в среднеази атском очаге 25, в котором циркулируют штаммы bv. medievalis. Скорее всего, этот штамм был занесен на территорию Туркменистана с приграничных территорий Ирана или Афгани стана. Наиболее филогенетически близок к штамму 797 штамм Angola (bv. microtus subsp. an gola), а затем следуют представители subsp. caucasica, азиатская ветвь биовара antiqua и т.д.

(рис. 5). Вероятно, что проведение сочетанного анализа результатов генотипирования в фор мате DFR/MLVA/CRISPR/MLST/SNP позволит построить филограмму, приближающуюся по достоверности к результатам анализа данных полногеномного секвенирования.

Что же касается практического использования исследованных методов молекулярного типирования и созданного в ходе этого исследования электронного каталога DFR- и MLVA25 генотипов, то его можно продемонстрировать на примере внутривидовой идентификации штаммов Pestoides A и Pestoides F. После передачи группы штаммов из СССР в США их пас порта были утрачены, а затем присвоены новые наименования. Результаты MLVA25 типирования (DFR/MLVA25-типирования) однозначно свидетельствуют о том, что штамм Pestoides A был выделен в Горно-алтайском очаге 36 или на граничащей с ним территории Монголии, а штамм Pestoides F – в группе очагов Закавказского нагорья - 04-07.

Рисунок 5. NJ-дендрограмма DFR/MLVA25-типов Y. pestis Суммируя результаты экспериментальной части нашей работы, следует отметить, что DFR-типирование не во всех случаях позволяет дифференцировать изоляты из разных природ ных очагов. Кластеризация возбудителя чумы на основе MLVA согласуется с классификацией на основе DFR-типирования, но обладает большей разрешающей способностью. Сочетанный анализ результатов повышает филогенетическую достоверность генерируемых дендрограмм.

R. Devignat [1951] предложил деление вида Y. pestis на три биовара: antiqua, medievalis и orientalis, включающих эпидемически значимые изоляты – клоны штаммов с универсаль ной вирулентностью, послуживших причиной трех пандемий чумы. Позднее для эндемич ных штаммов, циркулирующих в полевочьих очагах степей Ксилин Гол и Куингхай Тибетского плато, китайскими исследователями был предложен четвертый биовар microtus [Zhou et al., 2004c], в который мы предложили включить штаммы всех внутривидовых групп, характеризующиеся способностью ферментировать рамнозу в сочетании с авирулентностью для морских свинок и людей [Cui et al., 2008]. Изначально биовар microtus включал неразли чимые с помощью фенотипических признаков штаммы из китайских очагов L и M [Zhou et al., 2004c], по своим свойствам близкие, но не идентичные российским неосновным подви дам (табл. 1) [Anisimov et al., 2004]. Проведенное нами ранее CRISPR-типирование [Cui et al., 2008] и представленные в настоящей диссертации результаты MLVA-типирования не только позволили разделить на два отдельных подкластера китайские полевочьи штаммы из очагов L и M, но и показали их близкое филогенетическое родство с изолятами подвидов altaica, hissarica и talassica (рис. 4.Б). Мы предложили нашим китайским и французским коллегам по аналогии с отечественными неосновными подвидами классифицировать изоляты из очага L как subsp. xilingolensis, а из M – qinghaiensis, а также отнести наиболее древний по данным MLVA25-типирования штамм Angola к subsp. angola. Предложение было принято и допол нения к классификации опубликованы [Cui et al., 2008].

Кроме того, результаты DFR/MLVA25-типирования в сочетании с данными о биологи ческих свойствах (вирулентности в отношении разных видов животных, ферментативных ак тивностей, частоты мутаций к Pgm фенотипу;

табл. 1) служит основанием для выделения фи логенетической группы рамнозо-положительных штаммов с универсальной вирулентностью из очага B Северного Тянь-Шаня в отдельный таксон, bv. intermedium, название которого от ражает промежуточные биологические свойства и промежуточное положение на дендрограм ме (рис. 5). Наше предложение о введении нового таксона было опубликовано [Li et al., 2009].

Принятая в практической работе внутривидовая таксономия чумного микроба, наибо лее полно описанная нами в публикации [Li et al., 2009], не соответствует правилам Междуна родного кодекса номенклатуры бактерий (МКНБ) [Lapage et al., 1992]. Так, в состав основного подвида Y. pestis входят четыре биовара: antiqua, medievalis, orientalis и intermedium, а все не основные подвиды: altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingo lensis, напортив, включены в состав одного биовара - microtus. Однако согласно правилам МКНБ внутривидовые таксоны - это подвиды, имеющие тринарное название (например, Photorhabdus luminescens subsp. caribbeanensis, где caribbeanensis – название подвида). Кроме того, ввиду нестабильности отдельных признаков бактерий, в их систематике применяют не предусмотренное МКНБ понятие - «вариант» (например, биовары – варианты по биологиче ским признакам;

фаговары – по устойчивости к бактериофагам и т.д.). Естественно, что таксон может входить в таксон более высокого ранга, но не может быть частью непредусмотренной МКНБ внутривидовой группы штаммов. Для приведения внутривидовой таксономии чумного микроба в соответствие с правилами МКНБ необходимо переименование биовара microtus в подвид, а входящих в него филогенетических групп - в биовары (табл. 1).

Таблица 1. Предлагаемая внутривидовая таксономия Y. pestis Виру- Частота лент- мутаций Фер от Pgm+ к Подвид ность мента- Район циркуля Pgm– фе Биовар Основные хозяева для ция ции мор- нотипу за рамнозы ских 10 гене свинок раций (%) ?а angola + Ангола ? caucasica + - Закавказское наго- Microtus arvalis рье, горный Даге стан ulegeica + - Северо-восточная Microtus gregalis, Монголия, пустыня Alticola strelzovi, Гоби Ochotona pallasi pricei altaica + - Горный Алтай, Microtus gregalis, microtus Монголия Alticola strelzovi, Ochotona pallasi pricei hissarica + - Гиссарский хребет Microtus carruthersi xilingolensis + - Степи Ксилин Гол, Microtus brandti Китай qinghaiensis + - Куингхай- Microtus fuscus Тибетское плато, Китай talassica + - Таласский хребет Microtus gregalis, Marmota caudata intermedium + + Северный Тянь- Marmota baibacina, Шань, Китай Spermophilus undulatus antiqua + Центральная Азия Marmota spp. и центральная Аф рика pestis medievalis + Центральная Азия Citellus (Spermophilus) spp., Meriones spp., Rhombomys spp.

orientalis + Юго-восточная Rattus spp., Cynomys Азия, южные рай- spp., Spermophilus spp., оны Африки, Аме- Cavia spp., Peromyscus рика spp. и др.

П р и м е ч а н и я:

а ? - нет данных.

В данную таблицу в диссертации дополнительно включены данные о генотипах, характер ных для отдельных внутривидовых групп.

Выводы 1. Создан и постоянно пополняется электронный каталог штаммов Y. pestis и их MLVA25- и DFR-типов, включающий на момент написания диссертации информацию о штамме, представляющих все известные подвиды и биовары чумного микроба.

2. Выявлено 60 новых DFR-типов (геномоваров) Y. pestis (из 92, описанных к на стоящему времени). Установлено, что на территориях стран СНГ и в Монголии циркулируют как минимум 52 геномовара;

определено распределение DFR-типов Y. pestis по отдельным природным очагам чумы. Показано, что штаммы одного DFR-типа могут входить в состав разных подвидов и/или биоваров.

3. Выявлено 352 новых MLVA25-типов Y. pestis (из 430, описанных к настоящему времени). Установлено, что на территориях стран СНГ и в Монголии циркулируют как ми нимум 119 MLVA25-типов;

определено распределение MLVA25-типов Y. pestis по отдель ным природным очагам чумы. MLVA25-кластеры/подкластеры, включающие близкие гено типы, соответствуют определенным природным очагам. Кластеризация возбудителя чумы на основе MLVA (Din = 0,993) согласуется с классификацией на основе DFR-типирования (Din = 0,687), но обладает большей разрешающей способностью.

4. Установлено, что основные ветви дендрограмм, полученных на основе анализа DFR- и MLVA-профилей, соответствуют таковым при SNP-типировании, а сочетанный ана лиз результатов двух методов повышает их разрешающую способность (Din = 0,996) и позво ляет получать филограммы, свидетельствующие о порядке дивергенции внутривидовых групп в ходе микроэволюции возбудителя чумы.

5. Показана возможность определения географического происхождения и внут ривидовой принадлежности штаммов Y. pestis с не идентифицированными "родословными" на основе сравнения их MLVA- или MLVA/DFR-профилей с данными постоянно пополняе мого нами электронного каталога.

6. На основании анализа биологических свойств (вирулентности в отношении разных видов животных, ферментативных активностей, частоты мутаций к Pgm фенотипу), а также DFR- и MLVA-типирования предложены новые внутривидовые таксоны биовар in termedium, а также подвиды: angola, qinghaiensis и xilingolensis.

7. Предложен вариант приведения внутривидовой таксономии чумного микроба в соответствие с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий необходимо пе реименование биовара microtus в подвид, а входящих в него филогенетических групп - под видов altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis - в биовары.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в рецензируемых научных журналах из перечня ВАК, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты 1. Vergnaud G., Li Y., Gorg O., Song Y., Cui Y., Zhou D., Grissa I., Dentovskaya S.V., Platonov M.E., Rakin A., Balakhonov S.V., Neubauer H., Pourcel C., Anisimov A., Yang R. Analysis of the three Yersinia pestis CRISPR loci in combination with polymorphic tandem repeats typing provides new tools for phylogenetic studies and possibly for the investigation of ancient DNA //Adv. Exp. Med.

Biol. – 2007. - Vol. 603. - P.327-338. (9 цитирований по данным Web of Science® на 11.12.2010 г.).

2. Cui Y., Li Y., Gorge O., Platonov M.E., Yan Y., Guo Z., Pourcel C., Dentovskaya S.V., Balakhonov S.V., Wang X., Song Y., Anisimov A.P., Vergnaud G., Yang R. Insight into micro evolution of Yersinia pestis by clustered regularly interspaced short palindromic repeats // PLoS ONE.

– 2008. – Vol. 3. – e2652. (9 цитирований по данным Web of Science® на 11.12.2010 г.).

3. Li Y., Cui Y., Hauck Y., Platonov M.E., Dai E., Song Y., Guo Z., Pourcel C., Den tovskaya S.V., Anisimov A., Yang R., Vergnaud G. Genotyping and phylogenetic analysis of Yersinia pestis by MLVA: Insights into the worldwide expansion of Central Asia plague foci // PLoS ONE. – 2009. - Vol. 4. - e6000. (3 цитирования по данным Web of Science® на 11.12.2010 г.).

Список работ, опубликованных по теме диссертации в других научных изданиях 4. Dentovskaya S., Platonov M.E., Vergnaud G., Pourcel C., Balakhonov S., Anisimov A.

Multiple locus VNTR and DFR analysis of Yersinia pestis isolates from the FSU and Mongolian natural foci. Abstracts of the 2006 NIAID Research Conference (June 24-30, 2006, Opatija, Croatia), p. 16.

5. Дентовская С.В., Платонов М.Е., Шестопалов М.Ю., Романова И.Ф., Балахонов С.В., Анисимов А.П. Мультилокусное VNTR и DFR типирование изолятов Yersinia pestis из природных очагов СНГ и Монголии. Чрезвычайные ситуации международного значения в об щественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых го сударств: Материалы VII-й Межгосударственной научно-практической конференции госу дарств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Они щенко, В.В. Кутырева, И.А. Дятлова. Протвино: Изд-во А-ПРИНТ ЗАО, 2006. - С. 97.

6. Vergnaud G., Li Y., Gorg O., Song Y., Gui Y., Zhou D., Grissa I., Dentovskaya S.V., Platonov M.E., Rakin A., Balakhonov S.V., Pourcel C., Anisimov A., Yang R. Analysis of the three Yersinia pestis CRISPR loci in combination with polymorphic tandem repeats typing pro vide new tools for phylogenetic studies and possibly for the investigation of ancient DNA. Ab stracts of the 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA), S4:1. - American Society for Microbiology, Washington, D.C., 2006. P. 18- 7. Анисимов А.П., Pourcel C., Gorg O., Li Y., Cui Y., Song Y., Zhou D., Grissa I., Дентовская С.В., Платонов М.Е., Ракин А., Балахонов С.В., Калмантаев Т.А., Neubauer H., Yang R., Vergnaud G. Анализ трех CRISPR локусов - новый подход для филогенетических исследований Yersinia pestis. Материалы научно-практической конференции "современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России" (Ставрополь, 21-22 марта 2007 г.). - Ставрополь, 2007. – Ч. 1. – С. 22-24.

8. Анисимов А.П., Платонов М.Е., Евсеева В.В., Чиркова Е.В., Дентовская С.В., Балахонов С.В. Генотипирование и внутривидовая таксономия чумного микроба // Журнал инфекционной патологии. – 2009. – T. 16, № 3. – С. 64.

9. Платонов М.Е., Евсеева В.В., Чиркова Е.В., Гапельченкова Т.В., Дентовская С.В., Ефременко Д.В., Бабий А.М., Анисимов А.П. Молекулярно-генетическое изучение разнообразия и микроэволюции Yersinia pestis. Современные технологии обеспечения биологической безопасно сти: Материалы научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов на учно-исследовательских организаций Роспотребнадзора (25-27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. – Протвино: А-Принт ЗАО, 2010. – С. 291-294.

Благодарности Приношу свою искреннюю благодарность моим научным руководителям д.м.н., про фессору А.П. Анисимову и к.м.н С.В. Дентовской за помощь в формировании научной кон цепции работы.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соав торам - сотрудникам ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Иркутского научно исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока, Ставропольско го научно-исследовательского противочумного института, Universit Paris-Sud, Institut de Gntique et Microbiologie (Orsay, France) и Laboratory of Analytical Microbiology, State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology (Beijing, China), принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Благодарю директоров ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии - д.м.н., проф. И.А. Дятлова, Иркутского научно-исследовательский противочумный институт Сиби ри и Дальнего Востока - д.м.н., проф. С.В. Балахонова и Ставропольского научно исследовательского противочумного института - д.м.н., проф. А.Н. Куличенко за создание условий для проведения экспериментов, представленных в настоящей работе. Также благо дарю директора ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии - д.м.н., проф. И.А. Дят лова за предоставленную возможность защитить диссертацию на диссертационном совете Д 350.002.01 при ФГУН ГНЦ ПМБ.

Приношу искреннюю признательность всем рецензентам настоящей работы за выска занные замечания, заданные вопросы и сделанные поправки, которые, по возможности, были учтены и, в ряде случаев, помогли уточнить, а иногда и пересмотреть некоторые положения и формулировки.



 


Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.