авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Влияние нейротоксина мртр на биохимические и физиологические параметры мышей линии sam (senescence accelerated mice)

На правах рукописи

СОРОКИНА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ НЕЙРОТОКСИНА МРТР НА БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МЫШЕЙ ЛИНИИ SAM (Senescence Accelerated Mice) 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003 г.

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор А. А. БОЛДЫРЕВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н. Н. ЧЕРНОВ доктор биологических наук А. В. СЫРОЕЖКИН Ведущее учреждение: Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ

Защита состоится 8 апреля 2003 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр. 33, кор. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр., 33, кор. 1.

Автореферат разослан «5» марта 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук А. Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Окислительный стресс характеризуется нарушением внутриклеточного баланса между образованием активных форм кислорода (АФК) и состоянием тканевой антиоксидантной защиты. Кислородные радикалы атакуют белки, ДНК, липидные компоненты клеточных мембран, тем самым нарушая функции и целостность клеток. Повышенный уровень свободных радикалов рассматривается как один из факторов развития многих нейродегенеративных заболеваний, а также процесса старения [Carney and Carney, 1994;

Halliwell and Gutteridge, 1999].

Для исследования окислительного стресса применяются различные подходы, позволяющие выяснять молекулярные механизмы этого процесса как in vitro, так и in vivo. Один из таких подходов – использование линии животных, для метаболизма которых характерен повышенный стационарный уровень АФК, приводящих к ускоренному накоплению старческих признаков и уменьшению продолжительности жизни. Эта линия, выведенная путем близкородственного скрещивания из линии AKR/J [Takeda et al., 1985], носит название SAMP (Senescence Accelerated Mice Prone, Strain 1, SAMP1). Характерной особенностью животных этой линии является то, что они нормально развиваются до 4-месячного возраста, после чего наступает стадия ускоренного накопления старческих признаков. Контролем к данной линии является линия SAMR1 (Resistant).

Мыши указанной линии могут являться удобной моделью для инициации ряда нейродегенеративных заболеваний, в основе которых лежит свободнорадикальное повреждение тканей. Индукция окислительного стресса химическими агентами у животных с изначально нарушенным балансом АФК может представлять интерес для создания новых моделей нейродегенеративных заболеваний. Одним из таких заболеваний является паркинсонизм, в развитии которого окислительный стресс играет ведущую роль. Лекарственные препараты, которые применяются в клинике для лечения паркинсонизма, недостаточно эффективны, и вызывают побочные эффекты при их длительном применении. Это обстоятельство требует создания новых экспериментальных моделей паркинсонизма, которые были бы близки к неврологическому процессу, протекающему у человека, и позволяли установить основные биохимические реакции, которые лежат в основе окислительного стресса.

Некоторые симптомы паркинсонизма можно обеспечить введением в организм животных нейротоксина МРТР (N-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин), который избирательно вмешивается в метаболизм дофаминергических структур мозга, однако высокие дозы нейротоксина, которые необходимы для отчетливого выявления признаков заболевания, приводят к смерти животных и затрудняют биохимические исследования.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось изучение особенностей окислительного стресса на модели МРТР-индуцированного паркинсонизма у мышей линии SAMР1 и выяснение возможности снижения токсического действия нейротоксина МРТР путем коррекции дефицита антиоксидантной защиты.

Исходя из цели исследования, были сформулированы и решены следующие задачи:

1. Исследовать параметры окислительного стресса в клетках головного и костного мозга мышей линии SAMP1 и SAMR 2. Охарактеризовать физиологическое состояние и особенности обмена АФК в мозге мышей линий SAMP1 и SAMR1 после введения МРТР.

3. Использовать гидрофильный антиоксидант карнозин на модели МРТР-индуцированного паркинсонизма для защиты организма от факторов окислительного стресса и сравнить действие карнозина с действием селегилина, который применяется в лекарственной терапии паркинсонизма.

Научная новизна и практическая ценность работы. Продемонстрирован более высокий уровень активных форм кислорода в клетках костного мозга и в нейронах головного мозга мышей линии SAMP1, чем в соответствующих клетках контрольных животных линии SAMR1. Этот факт находится в соответствии с большим процентом хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей линии SAMP1 относительно контроля (клетки костного мозга SAMR1 того же возраста). Показано, что генерации АФК и накопление возрастных нарушений у мышей линии SAMP1 коррелирует с ростом активности моноаминоаксидазы В (МАО В) и снижением активности супероксиддисмутазы (СОД) в мозге животных.

Сделано заключение, что МАО В и СОД являются ключевыми ферментами, принимающими участие в формировании окислительного стресса. Обнаружено, что в стриатуме мозга мышей линии SAMP1 существенно снижено содержание биогенных аминов, что находится в полном соответствии с изменением физиологических характеристик этих животных.

Внутрибрюшинное введение нейротоксина МРТР мышам линии SAMP приводит к развитию неврологической симптоматики и изменению ряда физиологических и биохимических параметров, характерных для паркинсонизма.

При введении МРТР наблюдается кратковременный тремор, снижается двигательная активность, повышается мышечная ригидность, в митохондриальной фракции мозга увеличивается активность МАО В и подавляется активность СОД, активируются процессы окисления белков и липидов. При этом введение МРТР мышам линии SAMP1 вызывает более выраженные проявления окислительного стресса по сравнению с контрольной линией SAMR1. Таким образом, нами впервые показана существенная роль окислительного стресса для развития признаков паркинсонизма у мышей линии SAMP1.

В работе продемонстрировано защитное действие карнозина на модели МРТР–индуцированного паркинсонизма, по некоторым показателям превышающее действие ингибитора МАО В селегилина, используемого в клинике для лечения паркинсонизма. Карнозин и селегилин препятствовали росту карбонильных групп белков и липидных гидроперекисей. Животные, получавшие карнозин, были более устойчивы к токсическому действию МРТР по сравнению с животными, получавшими селегилин: предотвращалось как подавление активности СОД, так и рост МАО В. Таким образом, как карнозин, так и селегилин подавляют окислительный стресс в тканях мозга, снимая один из важных патогенетических факторов в развитии экспериментального паркинсонизма, но карнозин обеспечивает более выраженную защиту животных от окислительного стресса, чем ингибитор МАО В селегилин.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на ХХХ ежегодном собрании Нейрохимического общества США (Новый Орлеан, США, 2000), на Х Международной конференции “The New Frontiers of Neurochemistry and Biophysics on Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases” (Флоренция, Италия, 2001), на IX Международном симпозиуме “Pharmacology of Cerebral Ishemia” (Марбург, Германия, 2002) и на заседании кафедры биохимии биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Апробация работы состоялась на межлабораторном семинаре Института биохимии им. А. Н. Баха РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на стр. печатного текста, содержит 20 рисунков и 9 таблиц. Список литературы включает 193 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Физиологические методы Животные. В экспериментах использовали мышей линий SAMP1 и SAMR1, содержащихся в стандартных условиях вивария. В качестве контроля использовали животных линии SAMR1. Животных обеих исследуемых линий разбивали на сходные по физиологическим параметрам группы на основании тестирования в норковой камере, что сводило к минимуму исходные различия в их поведении.

Каждая исследуемая группа животных состояла из 7-8 особей (без разделения по половому признаку).

Протокол физиологического эксперимента. Для усиления окислительного стресса нейротоксин МРТР (фирмы “Sigma”) вводили животным ежедневно внутрибрюшинно в течение 8 дней в разовой дозе 30 мг/кг веса. Мышей подвергали декапитации на 10 день эксперимента. После забоя животных мозг быстро извлекали и замораживали в жидком азоте.

В каждой серии экспериментов животные разбивали на 4 группы. Трем группам вводили МРТР описанным выше способом;

первая группа получала только МРТР, второй группе животных за 30 мин до введения МРТР вводили карнозин в течение 8 дней (внутрибрюшинно в концентрации 100 мг/кг массы тела), третьей группе за 30 мин до введения МРТР также в течение 8 дней вводили селегилин (подкожно в дозе 2 мг/кг массы тела). В качестве контроля использовали группу животных, которым вместо МРТР вводили физиологический раствор. Выбранные концентрации карнозина и селегилина соответствовали эффективным концентрациям этих соединений, используемым в ранее проводимых экспериментах in vivo [Галлант и соавт., 2000;

Singh A. and Kulkarni S., 2002].

Физиологическое состояние животных тестировали в норковой камере размером 400400 мм с 16 секторами. Тестирование проводили дважды: до начала эксперимента (для разделения животных на равноценные группы) и по его окончании на 8 день (после последнего введения МРТР), используя 3 параметра:

вертикальная и горизонтальная двигательная активность (число стоек и количество пройденных квадратов, соответственно), исследовательская активность (число заглядываний в норки) и груминг (количество “умываний”) [Makanjuola et al., 1977]. Кроме этих показателей измеряли ригидность мышц туловища, используя симптом «горбатости», выраженность которого зависела от степени мышечной ригидности и определялась по укорочению расстояния от шеи до основания хвоста, L (чем сильнее ригидность, тем меньше величина L). Этот параметр также измеряли в первый (до введения MPTP) и последний день эксперимента.

Биохимические методы Препараты для анализа. Для биохимических исследований использовали ткани мозга (кора больших полушарий, стриатум и мозжечок), а также клетки, выделенные из костного мозга мышей линий SAMP1 и SAMR1.

Выделение митохондриальной фракции из мозга мышей. Тканевые гомогенаты, приготовленные из расчета 1 г ткани на 9 мл холодного 0,2 М К/Nа фосфатного буфера (рН 7,4), центрифугировали в течение 15 мин при 300 g (4оC) для осаждения крупных обломков клеток. Полученный супернатант центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин для осаждения мембранной фракции, после чего осадок суспендировали в 0,5 мл того же буфера. Гомогенат разделяли на порции и хранили при – 80оС.

Выделение нейронов из мозжечка мышей. В опытах использовали мышей в возрасте 12 дней [Булыгина и соавт., 2002]. Ткань измельчали на холоду и для разрушения межклеточных контактов в течение 30 мин (при 33°С) подвергали действию 0,34% диспазы II, приготовленной на растворе Тироде, содержащем: мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозу, 10 мМ Hepes (рН 7, при 25°С). После отмывания от диспазы II раствором Тироде кусочки ткани взмучивали и суспензию клеток отделяли от остального материала фильтрованием через нейлоновое сито с размером пор 50 мкм. Клетки выдерживали 30 мин в растворе Тироде (37оС), после чего использовали в эксперименте.

Хемилюминесцентный анализ АФК. Для хемилюминесцентного анализа клеток использовали раствор Хенкса. Регистрацию люминесцентного сигнала проводили на хемилюминометре LKB 1251 (Швеция) при 37оС в присутствии люминесцентного зонда люминола (10-5 М) [Владимиров и Шерстнев, 1989]. Клетки костного мозга и нейроны активировали добавлением 1 мкМ форболмиристатацетата (ФМА). Измерения проводили при длине волны 425 нм.

Хромосомные аберрации измеряли в метафазных пластинках костного мозга животных, приготавливая и обрабатывая препараты, как описано в литературе [Дурнев и Середенин, 1999].

Активность моноаминооксидазы В определяли, используя бензиламин в качестве субстрата, в среде, содержащей 0,2 М K/Na-фосфатный буфер (рН 7,4).

Реакцию начинали добавлением бензиламина. Образовавшийся в ходе реакции бензальдегид определяли спектрофотометрически при длине волны 241 нм [Минеева и Стволинский, 1996].

Супероксиддисмутазную активность измеряли по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия при генерации супероксидного анион радикала в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой при 560 нм.

Реакционная смесь, инкубируемая при 25оС, содержала 50 мМ Na/K фосфатный буфер (рН 7,8);

0,1 мМ ЭДТА;

0,1 мМ ксантин и 25 мкМ нитросиний тетразолий. За условную единицу активности СОД принимали количество митохондрий, необходимое для 50% подавления восстановления нитросинего тетразолия в условиях проведения реакции, представляя активность как количество единиц СОД на мг белка митохондрий [Misra and Fridovich, 1972].

Окисленность белков гомогената или митохондриальной фракции мозга оценивали по взаимодействию карбонильных групп белков с динитрофенилгидразином, DNP (10 мМ в 2М HCl). Белок осаждали 40% ТХУ, осадок отмывали 3 раза 2,5 мл раствора этанол/этилацетата, конечный осадок растворяли в 6М гуанидине HCl, измерения проводили при длине волны 375 нм [Buss et al., 1997].

Для оценки окисляемости липидного материала мозга использовали Fe2+ индуцированную хемилюминесценцию. На регистрируемой хемилюминесцентной кривой по амплитуде быстрой вспышки хемилюминесценции (h) судили об исходном уровне липидных гидроперекисей в исследуемой мембранной фракции мозга. Латентный период () отражал устойчивость мембранных липидов к Fe2+ индуцированному окислению, пропорциональную эффективности системы антиоксидантной защиты мембранных структур, а величина V (измеряемая как угол наклона кривой возгорания хемилюминесценции) соответствовала скорости окисления липидного материала [Vladimirov Yu., 1996;

Федорова и соавт., 1999].

При составлении пробы к 100 мкл исследуемого образца добавляли 800 мкл буфера (60 мМ KH2PO4 и 105 мМ KCl, рН 7,45), реакцию инициировали введением в среду 2,5 мМ FeSO4, величину хемилюминесценции измеряли на приборе LKB (Швеция).

Определение концентрации биогенных аминов. Выделенную область стриатума замораживали в жидком азоте и взвешивали. Образцы размельчали в ручном гомогенизаторе в 20 объемах 0,1 М НClO4 с добавлением внутреннего стандарта (диоксибензиламина, ДОБА) в количестве 0,5 нмоль/мл. Пробы центрифугировали при 9 000 g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость в.

количестве 20 мкл наносили на аналитическую колонку Ultrasphere, 5 мкм, 4,6 мм, неподвижную фазу составлял RP-18 ODS (октадецилсилан). Разделение происходило на термостатируемой колонке при (23±1)oС с использованием в качестве подвижной фазы 0,1 М цитрат-фосфатного буфера, содержащего 1,1 мМ октансульфоната натрия, 0,1 мМ ЭДТА и 9% ацетонитрила (рН 3,7). Измерения проводили на стеклоуглеродном электроде при потенциале +0,8В против Аg/AgCl электрода сравнения. В качестве стандарта использовали раствор, содержащий дофамин и норадреналин (в концентрации 0,5 мкМ) [Мирошниченко, 1988;

Кудрин, 1988].

Статистическую обработку результатов биохимических исследований проводили по критерию Стьюдента, физиологических параметров - по непараметрическому критерию Манна-Уитни (U-тест).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Исследование параметров окислительного стресса в тканях мышей линии SAMP Уровень АФК в нейронах и клетках костного мозга. В опытах использованы клетки костного мозга и нейроны, как наиболее чувствительные к действию АФК клетки, в которых можно значительно раньше наблюдать изменения метаболических процессов по сравнению с другими тканями. Измеряя хемилюминесценцию клеток мышей двух исследуемых линий, мы обнаружили, что стационарный уровень свечения АФК в нейронах и клетках костного мозга у SAMP1 в два раза выше, чем у контрольных животных SAMR1 (Рис. 1А, 2А).

Добавление ФМА вызывает усиление хемилюминесценции и в нейронах, и в суспензии клеток костного мозга мышей обеих линий, при этом максимальная интенсивность ответа на ФМА клеток SAMP1 существенно выше, чем клеток SAMR1 (Рис. 1Б, 2Б). Обнаруженное нами резкое возрастание продукции АФК в клетках костного мозга линии SAMP1 оказалось в полном соответствии со значительным повышением количества хромосомных аберраций в этих же структурах. К 8-месячному возрасту процент хромосомных аберраций у SAMP оказался почти вдвое большим, чем у контроля (клетки костного мозга SAMR1), где он оставался на уровне, присущем молодым животным.

250 Хемилюминесценция, мВ Хемилюминесценция, мВ 0 SAMR1 SAMP1 SAMR1 SAMP А Б Рис. 1. Уровень АФК в нейронах мозжечка 12-дневных мышей линий SAMR1 и SAMP1: А - исходный уровень АФК, Б – уровень АФК через 8 мин после добавления ФМА Хемилюминесценция, мВ 600 SAMR Хемилюминесценция, мВ 40 SAMP 10 0 0 1 2 4 6 7 8 SAMR1 SAMP1 Время, мин А Б Рис. 2. Продукция АФК клетками костного мозга мышей 8-месячного возраста линий SAMP1 и SAMR1: А - исходный уровень АФК;

Б – генерация АФК в клетках костного мозга мышей в ответ на добавление ФМА Таким образом, мы показали, что повышенный уровень продукции АФК характерен для клеток как старых (8-месячных), так и молодых (12-дневных) животных линии SAMP1. Этот факт соответствует представлениям о том, что в основе ускоренного процесса старения мышей линии SAMP1 лежит дисбаланс между образованием и нейтрализацией АФК в их тканях.

Факторы окислительного стресса. Повышенная продукция свободных радикалов в тканях может быть связана либо с высокой активностью АФК продуцирующих систем, например, активностью моноаминооксидаз (наибольший интерес представляет моноаминооксидаза В, МАО В), либо со снижением эффективности антиоксидантной защиты, утилизирующей АФК (для которой активность супероксиддисмутазы является наиболее важным показателем, указывающим на состояние антиоксидантной защиты мозга [Halliwell, Gutteridge, 1999]). По этой причине в митохондриальной фракции мозга мышей линии SAMP было проведено измерение активности МАО В и СОД.

Активность МАО В у мышей линии SAMP1 в возрасте 8 месяцев оказалась почти в два раза выше, а активность СОД существенно ниже, чем у мышей контрольной линии SAMR1 (Рис. 3, А и Б).

150 ед. активности/мг белка нмоль/мг белка в час 90 0 SAMR1 SAMP1 SAMR1 SAMP А Б Рис. 3. Активность МАО B (А) и СОД (Б) в митохондриальной фракции мозга 8-месячных мышей исследуемых линий Таким образом, оба параметра изменяются так, что объясняют причину повышенного стационарного уровня АФК в мозге SAMP1.

Из общих соображений можно полагать, что изменения активности ферментов МАО В и СОД могут быть запрограммированы генетически и индуцированы свободнорадикальной атакой [Raha and Robinson, 2000]. Возрастное снижение активности СОД объясняют изменениями экспрессии данного гена, которое может происходить в результате действия АФК на молекулу ДНК [Chang C.et al., 1997;

Niu C. et al., 1998].

Таким образом, в исследуемой нами ситуации как окислительное повреждение СОД, так и активация МАО В могут считаться основными генетически обусловленными факторами окислительного стресса, которые приводят к стабильному возрастанию уровня АФК в мозге. Ожидаемым результатом таких изменений должно быть накопление дефектов в клеточных белках и липидах у мышей линии SAMP1.

Важным показателем развития окислительного стресса и причиной повреждения клеток является процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ). Для оценки устойчивости клеточных структур мозга к окислению мы измерили кинетику Fe2+-индуцируемой хемилюминесценции гомогенатов мозга мышей двух исследуемых линий. Было обнаружено (Табл. 1), что для SAMP1 характерна более высокая амплитуда начальной вспышки хемилюминесценции h, соответствующая повышенному стационарному уровню липидных гидроперекисей по сравнению с аналогичным показателем для SAMR1. Продолжительность латентного периода у SAMP1 была существенно ниже по сравнению с контрольными животными, что свидетельствует о меньшей устойчивости мембран мозга к окислению, то есть об определенном дефиците антиоксидантной защиты в мозге. При этом скорость окисления липидов V оказалась практически одинаковой.

Уровень карбонильных групп белков, измеренных в митохондриальной фракции (1,5±0,02 нмоль/мг белка) и в гомогенате мозга (0,60±0,02 нмоль/мг белка) мышей SAMP1 и SAMR1 был одинаков у обеих групп животных, хотя следует отметить, что накопление карбонилов гораздо выше во фракции митохондрий, чем в целом гомогенате. Таким образом, повышенный уровень АФК у мышей линии SAMP1 приводит к повреждению ДНК и окислительной модификации липидной фазы, белки еще не подвергаются повреждению.

Таблица 1. Характеристика окисляемости мембран мозга мышей линий SAMR1 и SAMP1 в возрасте 8 месяцев (*- Р 0,05 различия между SAMP1 и SAMR1) Группы Гидроперекиси Латентный Скорость животных липидов период окисления (h, мВ) (V, отн. ед.) (, сек) SAMR1 84,0±9,1 177,0±5,7 1,10±0, SAMP1 115,0±6,0* 130,0±9,0* 1,24±0, Нами также было показано, что в стриатуме мышей линии SAMP значительно снижен уровень дофамина (на 92%) и норадреналина (на 38%) по сравнению с контрольной линией SAMR1, что соответствовало значительному снижению двигательной и исследовательской активности животных, обнаруженному при физиологических измерениях в норковой камере.

Обнаруженные нами биохимические и физиологические изменения мышей линии SAMP1 от SAMR1 указывают на то, что ускоренный процесс старения у SAMP1 действительно обусловлен повышенным уровнем АФК в тканях. Мы предположили, что по этой причине у животных данной линии можно более легко, чем у нормальных животных, индуцировать нейродегенеративные заболевания, в развитие которых вовлекаются свободнорадикальные процессы и нарушения тканевой антиоксидантной защиты. В качестве фактора усиления окислительного стресса у исследованных животных мы использовали нейротоксин МРТР, вызывающий симптомы паркинсонизма у приматов и грызунов [Burns et al., 1983].

Мы исходили из предположения, что комбинация возрастных факторов и дефектов системы антиоксидантной защиты, вызываемых МРТР, может привести к более выраженным нейродегенеративным проявлениям его действия и позволит рассматривать эту модель как новый подход в исследовании этого заболевания.

II. Влияние МРТР на физиологические и биохимические параметры мышей линии SAM Результаты физиологических исследований. Непосредственно после введения МРТР у всех исследуемых животных выявлялся кратковременный тремор и наблюдалось усиление ранее отмеченных физиологических различий между животными линии SAMR1 и SAMP1. Двигательная активность у SAMR1 снижалась в среднем на 39%, а у SAMP1 на 68%. Кроме того, у животных линии SAMP воздействие МРТР приводило к значительному снижению веса по сравнению с SAMR1 (на 35%) и увеличению ригидности (на 20%). Груминговая активность усиливалась у SAMP1 под воздействием нейротоксина, а у SAMR1 не наблюдалось изменений в этом параметре.

Физиологические параметры определяются активностью нескольких медиаторных систем мозга. Полученные результаты позволяют предположить, что наблюдаемые при введении МРТР повреждения затрагивают дофаминергическую систему мозга (область черной субстанции), что характерно для паркинсонизма [Sikiric et al., 2000]. Более того, действие МРТР на животных линии SAMP приводит к более выраженным эффектам, чем в случае SAMR1. Это, вероятно, отражает усиление дисбаланса прооксидантной и антиоксидантной систем у SAMP1, выявляющееся в тех отделах мозга, которые повреждаются МРТР.

Исходное состояние окислительного стресса делает SAMP1 более восприимчивыми к MPTP, поскольку в основе действия этого нейротоксина лежат свободнорадикальные механизмы и, таким образом, его введение усиливает состояние окислительного стресса.

Снижение двигательной функции, увеличение ригидности и мышечный тремор считаются в литературе необходимыми физиологическими свидетельствами развития МРТР-индуцированного паркинсонизма [Sedelis et al., 2000]. Наши данные находятся в соответствии с этими утверждениями и позволяют считать, что эффект МРТР на животных линии SAMР1 при выбранном протоколе введения нейротоксина, приводит к отчетливой индукции паркинсонизма у животных линии SAMP1.

Результаты биохимических исследований. Существенным фактором при МРТР-индуцированном паркинсонизме является нарушение обмена биогенных аминов в мозге [Goldstein, 1991]. Как мы обнаружили, в стриатуме SAMP изначально снижен уровень как дофамина, так и норадреналина по сравнению со стриатумом контрольной линии SAMR1. Введение МРТР приводило к существенному снижению уровня дофамина в стриатуме у SAMR1, (что уравнивали SAMR1 и SAMP1 по этому показателю), в то же время концентрация дофамина у SAMP1 оставалась такой же низкой, что и до введения MPTP (Табл. 2).

Таблица 2. Изменение уровня катехоламинов в стриатуме 8-месячных мышей линий SAMR1 и SAMP1 под действием нейротоксина МРТР (P0,05 характеризует достоверные отличия по отношению к животным этой же линии, получавших физиологический раствор (*), или к животным линии SAMR1 (#) Группы животных Дофамин, Норадреналин, Норадреналин/ нмоль/г ткани Нмоль/г ткани Дофамин 9, SAMR1 0,27±0,20 2,5±0, 5, SAMR1+MPTP 0,052±0,07* 0,31±0,16* 85,71# SAMP1 0,021±0,01# 1,8±0,50# 4,71* SAMP1+MPTP 0,07±0,03 0,33±0,1* Мы предполагаем, что в связи с повышенной продукцией свободных радикалов, к 8 месяцам жизни мышей SAMP1 в дофаминергических структурах (в частности, стриатуме) головного мозга уже интенсивно протекают нейродегенеративные процессы, что негативно сказывается на уровне дофамина.

Это объясняет его исходно низкий уровень у этой группы животных.

Уровень норадреналина в мозге исследуемых животных (как у быстростареющих, так и у контрольных) также снижается при введении МРТР.

Учитывая сниженный уровень дофамина, этот факт следует считать закономерным, поскольку основным путем образования норадреналина являются превращения дофамина под действием фермента дофамин--гидроксилазы. Соотношение норадреналин/дофамин в исследуемой области мозга после воздействия МРТР падало как у SAMP1, так и у SAMR1, причем у первых этот процесс был гораздо более выражен, что, вероятно, связано с исходно низкой концентрацией дофамина.

Снижение этого соотношения также свидетельствует о нарушении метаболизма биогенных аминов в исследуемой ткани [Stvolinsky et al., 2001].

В регуляции обмена дофамина играют роль не только ферменты его синтеза, но и белки, связывающие катехоламины и защищающие их от аутоокисления [Modi et al., 1996]. Существенную роль в обмене биогенных аминов играет также МАО В, которая представляет основной путь деградации дофамина [Riederer et al., 1989]. Как нами было ранее установлено, активность этого фермента исходно более высока в митохондриях мозга SAMP1, чем SAMR1. После введения МРТР наблюдался рост активности МАО В у SAMP1 по сравнению с SAMR1, у которых не было отмечено значимых изменений в активности данного фермента (Рис. 4 А). Поскольку МАО В является ферментом, способным метаболизировать МРТР и превращать его в МРP+ радикал [Vyas et. al., 1986], можно полагать, что повышенная активность данного фермента в мозге SAMP1 будет способствовать усиленной метаболизации нейротоксина МРТР.

58 контроль контроль ед.активности/ мг белка нмоль/мг белка в час 60 МРТР МРТР 100 85 88 80 30 0 SAMR1 SAMP1 SAMR1 SAMP А Б Рис. 4. Активность МАО B (А) и СОД (Б) в митохондриальной фракции мозга 8-месячных мышей до и после введения МРТР После введения нейротоксина МРТР животным линии SAMR1 активность СОД снижалась на 50% (Рис. 4, Б). В случае SAMP1 она снижалась в меньшей степени, однако, вследствие существенных исходных различий в активности этого фермента, активность СОД у SAMP1 после введения МРТР оставалась на более низком уровне, чем в мозге контрольных животных (Рис. 4, Б).

Таким образом, мы обнаружили, что антиоксидантная система в мозге мышей линии SAMP1 существенно истощена, и введение МРТР снижает этот параметр в еще большей степени. Полученные данные позволяют предположить, что введение МРТР животным приводит к еще более выраженному свободнорадикальному повреждению тканей.

При измерении процессов ПОЛ мы обнаружили, что введение МРТР не приводит к изменению уровня предобразованных гидроперекисей и скорости окисления у SAMR1, что, по-видимому, связано с наличием у этих животных выраженной антиоксидантной системы, предотвращающей образование окисленных продуктов. В противоположность этому, в мозге SAMP1 уровень гидроперекисей оказывается, увеличен (на 16%), устойчивость к окислению снижена (на 71%), а скорость окисления липидного материала увеличена (в 2 раза). Все эти факты указывают на истощение системы антиоксидантной защиты в мозге SAMP1.

Уровень окисленных белков, измеренный в митохондриальной фракции и в гомогенате мозга мышей SAMP1 и SAMR1, до введения мышам МРТР был одинаков. Введение МРТР индуцировало накопление белковых карбонилов в обоих случаях, но этот параметр возрастал гораздо существеннее у мышей с ускоренным темпом старения (Табл. 3). Вызывает интерес то обстоятельство, что уровень белковых карбонилов гораздо выше во фракции митохондрий, чем в целом гомогенате, позволяя предполагать, что митохондриальные белки повреждаются в первую очередь. Это наблюдение также соответствует представлениям о характере вовлечения МРТР в генерацию свободных радикалов [Kopin et al., 1987].

Необходимо подчеркнуть, что мишенью МРР+-радикала в клетке в первую очередь являются митохондрии, что и обусловливает большее повреждение белков митохондриальной фракции.

Таблица 3. Эффект МРТР на уровень окисленных белков в мозге 8-месячных мышей линий SAMR1 и SAMP1 (нмоль/ мг белка, *- Р 0,05 различия между SAMP1 и SAMR1 животными) Группы До введения После введения животных МРТР МРТР Гомогенат мозга SAMR1 0,62±0,02 0,77±0, SAMP1 0,58±0,04 1,04±0,05 * Митохондриальная фракция мозга SAMR1 1,5±0,02 1,6±0, SAMP1 1,5±0,01 3,1±0,01* Таким образом, мы обнаружили, что состояние антиоксидантной системы истощено у мышей линии SAMP1, и введение МРТР в еще большей степени повреждает эту систему, что находится в соответствии с известной способностью этого нейротоксина стимулировать продукцию свободных радикалов. Полученные нами данные указывают на то, что введение МРТР мышам с ускоренным темпом старения вызывает более выраженное проявление симптомов паркинсонизма по сравнению с контрольной линией и позволяет использовать эту модель для дальнейшего исследования этого заболевания.

III. Эффекты карнозина и селегилина при паркинсонизме, вызванном введением МРТР мышам линий SAM Поскольку окислительный стресс является одним из факторов, способствующих развитию паркинсонизма, в качестве дополнительной терапии этого заболевания могло бы быть применение антиоксидантов, снимающих отрицательные последствия окислительного стресса. В литературе описаны попытки использовать природные антиоксиданты витамины С и Е в качестве препаратов, способных облегчать состояние пациентов [Gilgun-Sherki et al., 2001]. Однако эффективность их действия была ограниченной. Витамины уменьшали нейротоксичность МРТР у мышей только при длительном применении и при высоких действующих дозах. В своей работе мы оценили возможность использования природного антиоксиданта карнозина для защиты от окислительного стресса. Защитное действие карнозина при окислительном повреждении нейронов показано в различных экспериментальных моделях как in vitro, так и in vivo. Так, инкубация индивидуальных нейронов с карнозином уменьшает стационарный уровень внутриклеточных АФК как в норме, так и при действии экзайтотоксических соединений [Boldyrev et al., 1999]. Карнозин способен отсрочить или предотвратить изменения, связанные с ишемическим повреждением мозга [Stvolinsky et al., 1999;

Федорова и соавт., 2002]. В качестве препарата сравнения мы использовали селегилин, ингибитор МАО В, применяющийся для лекарственной терапии паркинсонизма.

В наших экспериментах карнозин или селегилин вводили животным одновременно с инъекцией МРТР. Введение карнозина существенно препятствовало как угнетению вертикальной двигательной активности, так и развитию ригидности, индуцируемым МРТР. Селегилин не только не препятствовал (как карнозин) подавлению вертикальной активности под влиянием МРТР, но даже несколько стимулировал ее. Он также не препятствовал развитию ригидности, индуцированному МРТР. Таким образом, полученные результаты физиологических исследований указывают на отличия в действии карнозина и селегилина.

Измерение биохимических параметров дали более ясное представление о происходящих в мозге исследуемых животных изменениях. Как видно из Рис. 5, активность МАО В повышается у животных с МРТР-индуцированным паркинсонизмом, при этом как карнозин, так и селегилин препятствует этому повышению. Эффект карнозина оказывается гораздо более выраженным, чем эффект селегилина.

При введении МРТР животным линии SAMP1 активность СОД в митохондриях мозга подавляется на 30%. При совместном введении МРТР и карнозина активность СОД сохраняется на уровне контроля, а при введении МРТР и селегилина даже существенно превышает его.

Рис. 5. Влияние карнозина и * селегилина на активность МАО В нмоль/мг белка в час в митохондриальной фракции мозга исследуемых линий мышей 8-месячного возраста: группа (1) # получала МРТР, группа (2) получала карнозин и МРТР, группа (3) получала селегилин и МРТР и группа (4) - физиологический раствор.

Достоверность различий Р0,05: * по сравнению с контролем, # - по сравнению с группой 1.

1 2 3 * нмоль/мг белка Рис. 6. Влияние карнозина и селегилина на уровень карбонильных групп белков в митохондриальной фракции мозга исследуемых мышей 8-месячного возраста (обозначения как на Рис. 5).

1 2 3 По ряду других параметров действие карнозина и селегилина оказалось неразличимым. Так, количество карбонильных групп белков в митохондриях мозга увеличивается при введении МРТР, при этом карнозин и селегилин действуют сходным образом, препятствуя их росту и оставляя этот параметр на уровне, присущем контролю (Рис. 6). Одинаково влияют эти вещества и на окисляемость липидных компонентов митохондрий мозга. Уровень гидроперекисей, увеличивающийся при введении МРТР, и резистентность липидов к окислению, уменьшающаяся при действии МРТР, нормализуются при введении как карнозина, так и селегилина (Таблица 4).

Таблица 4. Параметры Fe2+-индуцируемой хемилюминесценции мембран мозга мышей линии SAMP1 8-месячного возраста, содержащихся в различных условиях (P0,05 достоверность * - по сравнению с SAMP1, #- по сравнению с SAMP1+MPTP) Исследуемые Гидроперекиси Латентный животные липидов период (, сек) (h, мВ) SAMP1+MPTP 127,0±15,3 * 115±2,5 * SAMP1+MPTP+ 75,0±5,3# 123,0±11,0# карнозин SAMP1+MPTP+ 85,0±6,0# 120,0±15,2# селегилин SAMP1 95,0±7,0 126,0±5, Таким образом, введение как карнозина, так и селегилина позволяет компенсировать дефицит антиоксидантной защиты мозга в результате подавления активности МАО В и/или активации основного антиоксидантного фермента – СОД.

Механизм их действия, безусловно, различен, но результатом их действия в обоих случаях может быть снижение уровня клеточных АФК и, как следствие, - снижение токсического действия МРТР. При этом по ряду параметров в наших экспериментах карнозин оказывается эффективнее селегилина. Таким образом, как карнозин, так и селегилин подавляют окислительный стресс в тканях мозга, снимая один из важных патогенетических факторов в развитии экспериментального паркинсонизма.

ВЫВОДЫ 1. Клетки костного мозга и изолированные нейроны мышей линии SAMP характеризуются повышенной генерацией АФК. В митохондриальной фракции мозга этих мышей увеличена активность МАО В, снижена активность СОД, повышен уровень гидроперекисей и ослаблена устойчивость мембран к окислению по сравнению с контрольной группой SAMR1. Содержание дофамина и норадреналина в стриатуме у SAMP1 понижено по сравнению с таковым у SAMR1.

2. Введение животным нейротоксина МРТР приводит к изменению физиологических параметров, характерных для паркинсонизма: снижается двигательная активность, наблюдается кратковременный тремор и повышается мышечная ригидность.

3. Введение МРТР снижает содержание дофамина в стриатуме SAMR1, в то время как в стриатуме SAMP1 его содержание не изменяется. Концентрация норадреналина снижается в мозге обеих групп животных примерно в равной степени. У SAMP1 увеличивается активность МАО В, подавляется СОД, активируютя процессы перекисного окисления липидов.

4. Мыши линии SAMP1 более чувствительны к нейротоксину МРТР как по физиологическим, так и по биохимическим показателям по сравнению с контрольной линией SAMR1.

5. Животные, получавшие карнозин или селегилин, более устойчивы к токсическому действию МРТР. Как карнозин, так и селегилин препятствовали росту активности МАО Б, снижению активности СОД, подавляли накопление карбонильных групп белков и липидных гидроперекисей.

6. Как карнозин, так и селегилин подавляют окислительный стресс в тканях мозга SAMP1, снимая один из важных патогенетических факторов в развитии экспериментального паркинсонизма.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Е. Сорокина, И. Озерова, Е. Булыгина, А. Болдырев. Характеристика Na/K АТФазы мозга мышей линии SAM.// Нейрохимия, 1999, том 16 (4), стр. 322-327.

2. А. Болдырев, М. Юнева, Е. Сорокина, Г. Крамаренко, Т. Федорова, Г.

Коновалова, В. Ланкин. Антиоксидантная система в тканях мышей линии SAM (Senescence Accelerated Mice).// Биохимия, 2001, том 66 (10), стр. 1157-1163.

3. S. Stvolinskii, E. Sorokina, N. Bastrikova, T. Fedorova, A. Boldyrev. Effect of MPTP on Senescence Accelerated Mice.// Annual Reports on SAM Studies (Japan), 2001, v.

17 (7), pp. 103-104.

4. E. Sorokina, N. Guseva, A. Kulakova, A. Boldyrev. Generation of reactive oxygen species and measurement of their damaging action in bone cell of Senescence Accelerated Mice.// Annual Reports on SAM Studies (Japan), 2001, v.17 (7), pp. 105 106.

5. E. Sorokina, N. Bastrikova,, V. Kazey, T. Fedorova, A. Boldyrev. MPTP effects in vitro and in vivo on some biochemical parameters in SAM brain. // Annual Reports on SAM Studies (Japan), 2002, v.18 (7), pp. 115-116.

6. Н. Бастрикова, Е. Сорокина, В. Казей, Т. Федорова, С. Стволинский, А.

Болдырев. Модель паркинсонизма, вызываемого введением нейротоксина МРТР быстростареющим мышам (Senescence Accelerated Mice, SAM).// Нейрохимия, 2002, т. 19 (4), стр. 247-253.

7. Е. Cорокина, Н. Бастрикова, Т. Федорова, С. Стволинский. Эффекты карнозина и селегилина при паркинсонизме вызванном введением МРТР у мышей линии SAM (Senescence Accelerated Mice).// Нейрохимия, 2003, т. 20 (2), 138-142.

8. N. Bastrikova, E. Sorokina, V. Kazey, T. Fedorova, A. Boldyrev. MPTP-induced changes in Senescence Accelerated Mice.// J. Soc. Phys. Chem. (Yugoslavia, Belgrade), 2003, v. 3, pp. 000-000.

9. A. Boldyrev, E. Sorokina, D. Carpenter, Y. Oyama. Characterization of the antioxidant enzyme system in tissues of senescence accelerated mice.// Abstracts on the 30th Annual Meeting of Soc. Neurosci., New Orleans, LA, USA, 2000, № 11-1.

10. E. Sorokina, N. Bastrikova, S. Stvolinsky, G. Kramarenko, A. Boldyrev. MPTP treated Senescence Accelerated Mice (SAM) as a novel approach to study Parkinson Disease.// Abstracts on the 10th Int. Symp. “The New Frontiers of Neurochem. Biophys. on Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases”, p. 106, Firenze, Italy. 2001.

11. E. Sorokina. Role of oxidative stress in PD development in Senescence Accelerated Mice (SAMP line).// Abstracts on the 9th Int. Symp. on Pharmacology of Cerebral Ischemia, Marburg, Germany. 2002, №16.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.