авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Елена вячеславовна функциональная интерпретация единичных нуклеотидных замен в интроне 2 гена k-ras мыши, связанных с развитием рака легких

На правах рукописи

УДК 575.224.22:577.214 Антонцева Елена Вячеславовна ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В ИНТРОНЕ 2 ГЕНА K-ras МЫШИ, СВЯЗАННЫХ С РАЗВИТИЕМ РАКА ЛЕГКИХ 03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК 2006

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный консультант: доктор биологических наук Т.И. Меркулова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Т.М. Хлебодарова Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск кандидат химических наук А.А. Бондарь Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится « » 2006 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, 90, Проспект академика Лаврентьева, 10, т/ф (3832)331278;

e-mail:

dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «» 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Груздев А.Д.

Актуальность темы. Ген K-ras является одной из наиболее перспективных моделей для изучения механизмов наследственной предрасположенности к развитию опухолей легких, поскольку он идентифицирован как ген, детерминирующий чувствительность к пульмоноканцерогенезу, и у человека и у экспериментальных животных. У мышей получено множество инбредных линий, различающихся по чувствительности к спонтанному и химически индуцированному раку легких. В результате генотипирования большого числа таких линий была установлена связь между единичными нуклеотидными заменами (Single nucleotide polymorphisms, SNPs) в интроне 2 гена K-ras и предрасположенностью к развитию опухолей легких. Показано, что у чувствительных к пульмоноканцерогенезу линий (A, GR, ICR) в позициях 288 и 296 п.н. относительно старта трансляции располагаются нуклеотиды C и A, у резистентных линий (AKR, DD, PT, UT, C3H, C57BL) - G и C, а у линии с промежуточным фенотипом (СВА)- С и С.

Стремительно возрастающий в последние годы интерес к выявлению и исследованию SNPs в различных генах вызван тем, что они часто оказываются связанными с разнообразными фенотипическими проявлениями, включающими предрасположенность ко многим заболеваниям. При этом наиболее интенсивно изучаются SNPs, расположенные в кодирующих районах генов, что обусловлено относительной простотой их интерпретации, в особенности, в тех случаях, когда SNPs приводят к заменам аминокислот. Начинают развиваться и работы по исследованию потенциально регуляторных SNP, расположенных в промоторных районах генов. Среди SNPs, расположенных в интронах, наиболее изученными являются варианты, влияющие на сплайсинг мРНК.

Расположенные в интронах SNPs, способные хотя бы потенциально влиять на интенсивность экспрессии генов, остаются почти не исследованными.

Поскольку имеются уже достаточно много данных об энхансерах, сайленсерах и отдельных регуляторных элементах, расположенных в интронах генов, логично предполагать, что SNPs в интронах также могут затрагивать регуляторные районы. В связи с этим изучение молекулярных механизмов, посредством которых SNPs в интроне могут оказывать влияние на фенотипические признаки, представляется весьма актуальным и перспективным направлением.

Ген K-ras является одним из наиболее известных протоонкогенов, мутации в котором (как спонтанные, так и индуцированные химическими канцерогенами) локализованы почти исключительно в трех «горячих» точках – кодонах 12, 13 и 61. Подобную направленность мутагенеза связывают, главным образом, с особенностями локальной структуры ДНК в местах предпочтительного возникновения мутаций. Однако такое объяснение является далеко не всеобъемлющим. Например, при анализе мутаций, затрагивающих кодоны 12, 13 и 61 гена K-ras, в опухолях легких у гибридных мышей, полученных скрещиванием чувствительных и резистентных линий, было показано, что мутация происходит только в «чувствительном» аллеле этого гена, несмотря на полную идентичность нуклеотидной последовательности обоих аллелей в местах образования мутаций. Известен также феномен тканевой специфичности направленного мутагенеза. Например, под действием канцерогена уретана в печени и коже возникают мутации в 61-м кодоне гена H-ras, а в легких - в 61-м кодоне гена K-ras. Такие закономерности дают основание думать об участии еще каких-то механизмов в обеспечении избирательности мутационного процесса. В частности, поскольку для гена K-ras установлено, что чувствительность мышей разных линий к развитию рака легких коррелирует с SNP в его втором интроне, можно предполагать, что эти нуклеотидные замены могут приводить к специфическим, характерным только для чувствительного аллеля изменениям в структуре хроматина и/или конформации ДНК в районе 12-го и 13-го кодонов (экзон 1), что может способствать образованию аддуктов ДНК-канцероген и в последующем мутаций именно в этих позициях. Так как известно, что в формировании и/или поддержании определенной структуры хроматина участвуют транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК, можно думать, что сопряженные с чувствительностью к пульмоноканцерогенезу SNP затрагивают сайты связывания таких белков.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов, посредством которых единичные нуклеотидные замены во втором интроне протоонкогена K-ras могут влиять на формирование чувствительности к спонтанному и индуцированному раку легких у мышей, а также выяснение механизма высокой избирательности возникновения мутаций в кодоне 12 этого гена.

Задачи работы включали:

1) изучение влияния сопряженных с развитием рака легких мононуклеотдных замен в позициях 288 и 296 п.н. интрона 2 К-ras у M.

musculus на связывание с ядерными белками и идентификацию транскрипционных факторов, взаимодействующих с полиморфным районом;

2) изучение влияния замены в позиции 311 п.н. интрона 2 К-ras, отличающей мышей устойчивого к пульмоноканцерогенезу вида M. spretus от чувствительных линий M.musculus, на связывание с транскрипционными факторами и их идентификацию;

3) изучение влияния различных вариантов SNP на картину связывания ядерных белков с потенциальным композиционным элементом в начале интрона 2 гена K-ras, охватывающим область расположения всех трех сопряженных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен;

4) идентификацию белков экстракта ядер клеток легких, взаимодействующих с областью первого кодирующего экзона гена K-ras мыши, включающей кодоны 12 и 13, которые являются «горячими» точками возникновения мутаций в гене K-ras;

5) после того как нами были получены данные о том, что с областью локализации кодонов 12 и 13 гена K-ras мыши и с районом расположения связанных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен взаимодействуют транскрипционные факторы NF-Y и GATA-6, была поставлена также задача определения влияния пульмоноканцерогенов на активность этих факторов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что сопряженные с предрасположенностью к развитию рака легких у мышей SNPs во втором интроне гена K-ras являются потенциально регуляторными. Установлено, что СА вариант полиморфизма в позициях 288 и 296 п.н., характерный для чувствительных линий мышей вида M.musculus, соответствует комплексному сайту связывания транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6, а в случае "устойчивого" GС и "промежуточного" СС вариантов этот сайт оказывается разрушенным.

Показано также, что в результате замены СТ в позиции 311 п.н. у мышей M.spretus, устойчивых к пульмоноканцерогенезу, происходит повреждение сайта связывания NF-Y и это отличает их от мышей чувствительных линий M.musculus. Полученные данные предполагают существование трех гаплотипов, определяющих предрасположенность к пульмоноканцерогенезу: двух устойчивых - GCС и CAT и одного чувствительного - CAC.

Впервые продемонстрировано, что горячая точка мутагенеза в протоонкогене К-ras - область кодонов 12 и 13 - является сложным сайтом связывания белков NF-Y и GATA-6. Получены оригинальные данные о том, что под действием пульмоноканцерогенов 3-метилхолантрена (3-МХ) и нитрозоэтилмочевины (НЭМ) происходит усиление связывания факторов NF-Y и GATA-6 с районом кодонов 12 и 13 и областью полиморфизма в начале интрона 2 гена К-ras, что является новым свидетельством вовлеченности регуляторных систем клетки в механизм действия химических канцерогенов.

Полученные результаты открывают новые перспективы для изучения молекулярных механизмов сайт-направленных генных мутаций, а также для развития представлений о роли регуляторных систем клетки в инициации и развитии канцерогенного процесса. Полученные данные также имеют значение для выяснения молекулярных основ генетической предрасположенности к пульмоноканцерогенезу.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторных семинарах ИЦиГ, на 7-ой Пущинской школе конференции молодых ученых (Пущино, 2003) и на международных конференциях: “Физико-химическая биология” (Новосибирск, 2006);

“Genomics, proteomics, bioinformatics and nanotechnologies for medicine” (Novosibirsk, 2006);

“Genome Sequencing & Biology” (New York, 2001);

“Mathematics and Engineering Techniques in Medicine and Biological Sciences” (Las Vegas, 2001).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.

Диссертация изложена на 108 страницах, содержит 21 рисунок. В списке литературы приводится 141 работа.

Работа проводилась при финансовой поддержке грантов РФФИ №№ 01-04-49860 и 04-04-48136.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали 0,5-3 месячных мышей устойчивых к пульмоноканцерогенезу линий C57BL/6J, С3H/A, AKR, DD и чувствительных линий ICR, A/He, GR разведения вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Геномная ДНК мышей M.spretus была любезно предоставлена Евгенией Пак (NIH, USA). Связывание ядерных белков с участками гена K-ras и ДНК-связывающую активность факторов транскрипции в экстрактах ядер изучали методом задержки ДНК-пробы в геле. Двуцепочечные олигонуклеотиды, используемые в качестве ДНК проб были синтезированы зав. сектором химии нуклеиновых кислот В.Ф.

Кобзевым, ИЦиГ СО РАН. Фрагменты длиной 84 п.н. были получены с помощью метода ПЦР с праймеров KE-Up и KE-Low. Экстракты ядер получали согласно (Gorski et al., 1986) в модификации (Shapiro et al., 1988).

Идентификацию факторов транскрипции осуществляли с использованием специфических антител “Santa Cruz Biotechnology Inc.”. Содержание факторов транскрипции в ядерных экстрактах оценивали методом Вестерн блот гибридизации, для визуализации результатов использовали ECL систему фирмы “Amersham”.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Изучение связывания ядерных белков с районом локализации сопряженых с развитием рака легких однонуклеотидных замен в интроне 2 гена K-ras мыши.

Предрасположенность мышей к раку легких определяется тремя генетическими локусами, имеющими общее название Pas (pulmonary adenoma susceptibility). Известно, что локус Pas1 расположен на хромосоме 6 и включает ген К-ras. Исследования на трансгенных мышах показали, что наличие мутаций в кодонах 12, 13 и 61 протоонкогена K-ras приводит к трансформации клеток и развитию различных опухолей, включая опухоли легких. Кроме того, известно, что различная чувствительность инбредных линий мышей к развитию аденом легкого сопряжена с однонуклеотидными заменами (SNPs), в начале интрона 2 ген K-ras в позициях 288 и 296 п.н.

относительно старта трансляции. Так у мышей чувствительных линий в указанных позициях стоят нуклеотиды C и A, соответственно, у резистентных линий - G и C, а у линий с промежуточным фенотипом - С и С (Chen et al., 1994;

Тимофеева и др., 2002).

Мы предположили, что наблюдаемые нуклеотидные замены могут затрагивать участок связывания какого-либо регуляторного белка. Для проверки этого предположения, олигонуклеотиды, соответствующие трём аллельным состояниям участка от 278 до 307 п.н. относительно стартового кодона гена K-ras мыши (CA, CC и GC олигонуклеотиды, Рис. 1А), были использованы в экспериментах по задержке в геле белками ядерного экстракта легких мыши. Оказалось, что картина связывания в случае СА варианта SNPs существенно отличается от таковой для GC и CC вариантов наличием мощной полосы задержки, соответствующей комплексу СА олигонуклеотида с неким белком/белками (Рис. 1Б).

СА: 5’-cagtGTGCAAGAAA CTCCACTT ATCATGAGAGCT-3’ А) GС: 5’-cagtGTGCAAGAAA GTCCACTT CTCATGAGAGCT-3’ СС: 5’-cagtGTGCAAGAAA CTCCACTT CTCATGAGAGCT-3’ Б) CA CC GC Рис. 1. А) Последовательности олигонуклеотидов, охватывающих область от 278 до 307 п.н. интрона гена K-ras и воспроизводящих " чувствительный" СА, "промежуточный " СС и "устойчивый " GС аллели.

Мононуклеотидные замены подчеркнуты.

Б) Связывание белков экстракта ядер клеток легких мышей с олигонуклеотидами CA (1, 2), CC (3, 4) и GC ( 5, 6). 1, 3, 5- свободный зонд;

2, 4,6- связывание б е л ко в э кс т р а кт а я д е р к л е то к л е г к о г о с олигонуклеотидами. 1 2 3 4 5 С помощью компьютерного метода распознавания сайтов связывания факторов транскрипции Пономаренко М.П. из лаборатории теоретической генетики ИЦиГ СО РАН, было сделано предположение, что СА вариант SNP приводит к образованию сайта связывания транскрипционного фактора семейства GATA. В результате экспериментов по задержке ДНК-пробы в геле в присутствии конкурентных олигонуклеотидов, соответствующих природным сайтам связывания белков GAТA и Ets (контроль), а также антител против GATA-6 (основного представителя семейства GAТA в легких) мы полностью подтвердили данное предположение (Рис. 2). Таким образом, "чувствительный" СА вариант SNP интрона 2 гена K-ras соответствует сайту связывания фактора транскрипции GATA-6, а в случае "устойчивого" GС и "промежуточного" СС вариантов этот сайт разрушен.

конкуренты Антитела к GATA- TA Ets Рис. 2. Иде нтификация белка, образующего GA комплекс с олигонуклеотидом СА. 1 - подвижность свободного зонда в геле;

2 - связывание зонда с белками экстракта ядер клеток легких;

3, 4, 5 связывание после инкубации экстракта ядер с антителами к белку GATA-6 (2, 3 и 4 мкг антител соответственно);

6 - связывание в присутствии 100х избытка олигонуклеотида GATA;

7 - связывание в присутствии 100х избытка олигонуклеотида Ets.

1 2 3 4 5 6 Поскольку GATA-6 является ключевым фактором в дифференцировке легочной ткани и тканеспецифической регуляции экспрессии генов в легких можно думать, что наблюдаемые различия в связывании этого фактора с разными аллельными состояниями интрона гена K-ras имеют отношение к формированию чувствительного или устойчивого к пульмоноканцерогенезу фенотипа. Однако, обнаружение "чувствительного" СА варианта SNP в интроне 2 гена K-ras у мышей другого вида - M.spretus, устойчивых к пульмоноканцерогенезу, поставило под сомнение саму мысль об участии этого полиморфизма в формировании предрасположенности к канцерогенезу в легких (Manenti et al., 1995). Но мы обратили внимание, что у M.spretus в непосредственной близости от уже известных SNPs в позициях 288 п.н. и 296 п.н., приводящих к появлению или исчезновению сайта связывания фактора GATA6, имеется ещё одна мононуклеотидная замена С (M.musculus) Т (M.spretus) в позиции 311 п.н., характерная для этого вида. Мы предположили, что эта замена также может затрагивать сайт связывания какого-то фактора транскрипции, и таким образом может быть связана с устойчивостью к раку легких M.spretus. Методом задержки ДНК-зонда в геле было показано, что замена С (олигонуклеотид 311-mus) Т (олигонуклеотид 311-spret) в позиции 311 п.н. интрона 2 гена K-Ras, приводит к ослаблению наименее подвижной полосы задержки (Рис. 3Б), т.е. SNP, характерный для М.spretus, ухудшает сайт связывания некого транскрипционного фактора.

В результате компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей для олигонуклеотидов 311-mus и 311-spret с помощью пакета программ TESS в качестве кандидатов на связывание с этим участком были отобраны транскрипционные факторы NF1, LKLF и NF-Y.

Из рисунка 3 Б видно, что добавление к реакционной смеси в качестве конкурентной ДНК олигонуклеотидов соответствующих известным сайтам связывания NF1 и LKLF в 100х избытке не меняет картины связывания. В то время как уже 50х избыток олигонуклеотида, содержащего сайт связывания фактора NF-Y приводит к существенному ослаблению полосы, различающей картины связывания для 311-mus и 311-spret. Эксперименты с использованием антител к NF-Y подтвердили, что верхняя полоса задержки действительно соответствует комплексу транскрипционного фактора NF-Y с олигонуклеотидами 311-mus/311-spret. Таким образом, наличие Т в позиции 311 п.н. у М.spretus приводит к заметному ослаблению сайта связывания NF-Y, по сравнению с M.musculus.

311-mus: 5'-cagtTCATGAGAGCTCAC CACAGAGAAAGAAAGT-3’ А) 311-spret: 5'-cagtTCATGAGAGCTCAC TACAGAGAAAGAAAGT-3’ Р и с. 3. А ) П о с л е д о в а т е л ь н о с т и Б) олигонуклеотидов, охватывающих область от 297 до 326 п.н. интрона 2 гена K-ras мышей Антитела кNF-Y LF - в и д а M. m u scu lu s и в и д а M.s pret us. 50x NF -Y LK NF Мононуклеотидные замены подчеркнуты.

Б) Идентификация белка, образующего комплекс с олигонуклеотидами 311-mus (1, 2, 3, 7, 8, 9) и 311-spret (4, 5, 6). 1, 4, 7 связывание соответствующих олигонуклеотидов с белками экстракта ядер клеток лег ки х;

2, 5- св я зыв ан и е в присутствии 50х избытка олигонуклеотида NF-Y;

3, 6 - связывание после инкубации экстракта ядер с антителами к белку NF-Y,8, 12 3 456 7 8 9- связывание в присутствии 100х избытков олигонуклеотидов LKLF и Nf1. 311-mus 311- mus 311-spret Вследствие близкого расположения выявленных нами в начале интрона 2 гена K-ras сайтов связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y, мы предположили, что они образуют более сложную регуляторную единицу - композиционный элемент. В пользу такого предположения свидетельствует также обнаружение подобных регуляторных единиц, образованных сайтами связывания NF-Y и GATA-6, в других генах (Peng, Jahroudi, 2003).

Для исследования предполагаемого регуляторного элемента с геномной ДНК мышей чувствительной линии ICR и устойчивой линии DD вида M.musculus, а также устойчивого вида M.spretus методом ПЦР с праймеров КЕ-Up и КЕ-Low (рис. 4А) были амплифицированы последовательности длиной 84 п.н. (далее ICR, DD и SPRET) охватывающие область расположения этих сайтов. Оказалось, что при задержке таких фрагментов в геле белками ядерного экстракта во всех трех случаях наблюдаются разные картины связывания (Рис. 4Б), т.е. наличие SNPs, отличающих чувствительных животных от устойчивых, влияет на формирование белковых комплексов с этим районом. Видно, что при использовании ампликона SPRET происходит исчезновение полосы 5, наблюдаемой в случае ICR и DD, и появление двух других– 7 и 8. Кроме того, меняется интенсивность ряда других полос. С помощью программы Gel-pro 4.0 мы оценили интенсивность полос, присутствующих во всех трех случаях. За единицу была взята интенсивность полосы 1 в соответствующей дорожке. В случае фрагмента DD происходит усиление комплексов со 2-го по 6-ой по сравнению с ICR в 1,5-2,2 раза в зависимости от полосы. Заметим, что в случае ампликона SPRET интенсивность комплексов 2, 3, 4 и 6 также ослаблена по сравнению с таковой в случае DD и напоминает ICR вариант. Сходство этих полос задержки в картине связывания между SPRET и ICR может быть объяснено наличием у них СА варианта SNPs в позициях 288 и 296 п.н.

Наиболее показательным является эффект однонуклеотидной замены в 311 позиции, отличающей мышей вида M.spretus от M.musculus. Ранее, при исследовании влияния этой замены на связывание с белками ядерного экстракта легких в составе олигонуклеотидов 311-mus и 311-spret (длиной 30 п.н.), были получены данные лишь об ухудшении связывания последнего с фактором транскрипции NF-Y (Рис. 3Б). В случае же более длинных фрагментов отличия становятся радикальными (одна полоса исчезает, появляются две новых). Следовательно, можно полагать, что значительно более существенное изменение в картине связывания в случае ампликона SPRET (длиной 84 п.н.) является результатом сложного взаимодействия факторов транскрипции, как с последовательностью ДНК, так и друг с другом. Это служит косвенным доказательством наличия в данном районе композиционного регуляторного элемента.

12 3 4 5 6 1 2 3 45 - + - + - + Антитела к NF-Y - + - + - + Рис. 4. С вязывание белков экстракта ядер клеток легких с ампликонами SPRET (1, 2 ), ICR (3, 4 ) и DD (5, 6 ) и влияние антител к NF-Y. А) и Б) р а з н о е в р е мя э кс п о зи ц и и с рентгеновской пленкой. 1, 3, 4 связывание фрагментов с ядерными SPRET ICR SPRET ICR DD DD белками;

2, 4, 6 - связывание при Б) А) добавлении антител к NF-Y.

Эксперименты с использованием антител к NF-Y показали, что комплекс 2 образован этим белком (Рис. 4). Представляется удивительным, что этот комплекс не ослаблен в случае ампликона SPRET, тогда как ранее при использовании коротких фрагментов ДНК интрона 2 гена K-ras (297/ п.н.) (Рис. 3Б), нами были получены данные о повреждении NF-Y сайта у M.

spretus. В связи с этим мы предположили, что в составе длинных фрагментов имеется еще один, возможно более сильный, сайт связывания данного транскрипционного фактора. Этот дополнительный NF-Y сайт был экспериментально найден в составе СА олигонуклеотида (278/307 п.н.) (Рис.

5), где, как оказалось, он перекрывается с сайтом связывания GATA-6 (Рис.

2). Поскольку добавление антител как к GATA-6, так и к NF-Y приводит к полному исчезновению комплекса, представляется вероятным, что связывание этих транскрипционных факторов с районом от 278 до 307 п.н.

интрона 2 гена K-ras мыши носит взаимозависимый характер.

Полученные данные позволяют предполагать, что у мышей чувствительных линий M.musculus в интроне 2 имеется регуляторный композиционный элемент, образованный двумя NF-Y сайтами и одним сайтом для GATA-6, а связанные с устойчивостью к пульмоноканцерогенезу SNPs разрушают его различные компоненты.

Рис. 5. Идентификация сайта связывания транскрипционного фактора NF-Y внутри олигонуклеотида СА. 1- связывание олигонуклеотида СА с белками ядерного экстракта легких;

связывание с экстрактом в присутствии антител к NF-Y;

3- в п ри сут ств и и 50х и з б ытк а оли гон ук леоти д а, соответствующего сайту связывания NF-Y.

1 2 Это находит отражение в существенном усложнении картин связывания ядерных белков с более длинными участками интрона (ампликонами) (Рис. 4), по сравнению с олигонуклеотидами, входящими в их состав (Рис. 1Б, 3Б). Так, последовательности ампликонов ICR и DD, как и последовательности ранее исследованных олигонуклеотидов (СА и GC, п.н.), отличаются лишь двумя мононуклеотидными заменами, соответствующими позициям 288 и 296 п.н. в интроне 2 гена K-ras. Однако, если СА олигонуклеотид в отличие от GC олигонуклеотида образует мощную дополнительную полосу задержки за счет связывания с GATA-6 и NF-Y, то включающий этот олигонуклеотид более протяженный фрагмент ICR, напротив, характеризуется выраженным ослаблением полос задержки по сравнению с DD (Рис. 1Б и Рис. 4). Однонуклеотидная замена в позиции 311 п.н., отличающая мышей устойчивого вида M. spretus от мышей устойчивых и чувствительных линии M. musculus, при исследовании в составе олигонуклеотидов 311-mus и 311-spret приводит к существенному ослаблению сайта NF-Y, тогда как в ампликона SPRET такого ослабления не заметно (Рис. 3Б и Рис. 4). Известно, что в результате связывания фактора транскрипции NF-Y с ДНК происходит изгиб двойной спирали на 60-800 в зависимости от фланкирующей последовательности (Liberati et al., 1998).

Такие изменения в конформации ДНК могут влиять на доступность сайтов для других белков ядерного экстракта. Наличие же двух рядом расположенных сайтов связывания NF-Y в случае ICR может приводить 1) к компенсаторному эффекту за счет двойного изгибания ДНК, 2) механическим затруднениям в посадке этих факторов.

Таким образом, комбинация нуклеотидных замен C (288п.н.), A ( п.н.) и C (311 п.н.) в интроне 2 гена K-ras у мышей предрасположенных к пульмоноканцерогенезу линий вида M. musculus формирует потенциальный композиционный элемент, содержащий два сайта связывания NF-Y и один сайт связывания GATA-6. SNPs, присущие устойчивым линиям M. musculus (G 288 п.н. и С 296 п.н) или устойчивому виду M. spretus (Т 311 п.н.) разрушают различные компоненты этого композиционного элемента: GATA 6 сайт у M. musculus и NF-Y сайт у M. Spretus (Рис. 9). Связывающиеся с выявленными сайтами факторы транскрипции, по видимому, находятся в сложной системе взаимодействий (как синергических, так и антагонистических) между собой, а также с другими белками, которые могут взаимодействовать с данным районом. По-видимому, любое изменение в связывании индивидуальных факторов транскрипции в этом регуляторном узле может приводить к существенным изменениям в этих взаимодействиях, что находит косвенное отражение в связи различных SNPs в районе от 278 до 307 п.н. интрона 2 гена K-ras мыши с чувствительностью/устойчивостью к пульмоноканцерогенезу. Видимо, в данном случае можно говорить о существовании трех гаплотипов: двух устойчивых GCС и CAT и одного чувствительного к развитию рака легких CAC.

Идентификация транскрипционных факторов, взаимодействующих с областью 12-ого кодона гена K-ras мыши.

У мышей, как и у человека, мутации гена K-ras наблюдаются преимущественно в кодонах 12, 13 и 61, причём как в спонтанных, так и химически индуцированных опухолях, включая опухоли лёгких.

Предполагается, что избирательность образования аддуктов ДНК-канцероген в кодоне 12 может быть связана как с особенностями первичной структуры ДНК в районе расположения этого кодона и/или ее модификациями, так и с особенностями локальной структуры хроматина в этом районе. В то же время известно, что в формировании и/или поддержании определенной структуры хроматина участвуют транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК.

В связи с этим нами была проверена возможность связывания каких либо ядерных белков с районом расположения кодона 12 в экзоне 1 гена K ras. Был синтезирован олигонуклеотид 12 длиной 30 п.н., соответствующий району 12 и 13 кодонов (Рис. 6А). Методом задержки ДНК пробы в геле было показано, что некий белок/белки ядерного экстракта легкого мыши образует/ют комплекс с 12-mus олигонуклеотидом (Рис. 6Б).

В результате компьютерного анализа последовательности ДНК 1-ого экзона гена K-ras, были отобраны несколько белков- кандидатов на связывание с исследуемым районом GATA, NF-Y, LKLF, Ets. Использование синтетических двуцепочечных олигонуклеотидов, соответствующих известным сайтам связывания этих белков, в качестве конкурентов в опытах по задержке ДНК-пробы в геле позволило предположить, что комплекс образуется как минимум двумя белками: NF-Y и представителем семейства GATA. Эксперименты с использованием специфических антител против NF Y и GATA6 (основного представителя семейства GATA в легких) полностью подтвердили это предположение (Рис. 6Б). Так как добавление и тех и других антител приводило к практически полному исчезновению комплекса, представляется вероятным кооперативное связывание транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 с районом расположения кодона 12 гена K-ras мыши.

А) 12: 5'cagtTGGTGGTTGGAGCT GGTGGCGTAGGCAAGA G3’ Б) Антитела Антитела к NF-Y к GATA- - + - + Рис. 6. А) П оследовательность олигонук леотида, охватывающего область от 20 до 50 п.н. экзона 1 гена K-ras мыши (кодон 12 подчеркнут). Б) Идентификация белков образующих комплексы с олигонуклеотидом 12 с помощью специфических антител. 1,3-связывание с экстрактом, 2- связывание с экстрактом в присутствии антител к NF-Y, 4- в присутствии антител к GATA-6. 12 Согласно последним данным избирательность образования аддуктов в кодоне 12 гена K-ras при обработке различными канцерогенами обусловлена как особенностями первичной структуры ДНК в районе расположения этого кодона, так и с ее неустановленными пока модификациями, которые имеют место в составе нативного хроматина. Известно, что и NF-Y и представители семейства GATA способны инициировать процессы разрушения или ремоделирования нуклеосом. Поэтому представляется вероятным, что связывание этих факторов с местом расположения горячей точки мутагенеза в гене K-ras и районом полиморфизма вызывает локальное изменение структуры хроматина, что может играть определенную роль в обеспечении доступности ДНК как для реакционно-способных канцерогенных соединений, так и для модифицирующих ферментов, и таким образом вносить свой вклад в механизм избирательности аддуктообразования.

Влияние легочных канцерогенов 3-метилхолантрена и нитрозоэтилмочевины на ДНК-связывающиую активность транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y.

Известно, что NF-Y является одним из ключевых регуляторов клеточного цикла, а GATA-6 входит в число основных факторов, контролирующих онтогенез легочной ткани. Показано, что как недостаточная, так и избыточная экспрессия GATA-6 приводит к серьезным нарушениям морфогенеза легких. В связи с этим можно предполагать, что связывание транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 с местом расположения горячей точки мутагенеза в экзоне 1 гене K-ras и районом полиморфизма в начале интрона 2 может быть вовлечено в события, инициирующие развитие опухолей в этом органе. Опираясь на такое предположение, мы изучили влияние сильных легочных канцерогенов 3 метилхолантрена (3-МХ) и нитрозоэтилмочевины (НЭМ) на активность этих факторов и их способность взаимодействовать с районами кодона 12 и SNPs в начале интрона 2.

Оказалось, что после введения канцерогена 3-МХ мышам линии ICR, высокочувствительной к пульмоноканцерогенезу, в экстрактах ядер легких заметно увеличивалась ДНК-связывающая активность и GATA-6 и NF-Y (Рис. 7А) и, соответственно, их взаимодействие с олигонуклеотидами, воспроизводящими области локализации кодона 12 и СА варианта полиморфизма гена K-ras мыши. Существенно более сильное влияние канцерогена на связывание NF-Y и GATA-6 с районами кодона 12 и SNP в интроне 2 по сравнению с олигонуклеотидами, соответствующими сайтам связывания этих транскрипционных факторов, указывает на их кооперативное взаимодействие с этими районами. Наблюдаемый эффект является специфическим, так как под действием 3-МХ не наблюдалось изменения ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора SRF, который в данном случае может рассматриваться в качестве внутреннего контроля. При введении 3-МХ мышам линии С57BL/6J, устойчивой к развитию опухолей легкого, увеличения активности NF-Y и GATA-6 не наблюдалось (Рис. 7Б).

Аналогичные результаты были получены на двух других линиях мышей, контрастных по чувствительности к развитию рака легкого, - A/He и C3H/A. Введение другого пульмоноканцерогена - НЭМ также приводило к увеличению ДНК-связывающей активности факторов NF-Y и GATA-6 в легких мышей линий, чувствительных к развитию опухолей легких (ICR, A/He), но не устойчивых линий (C57BL/6J, C3H/A).

12 34 5678 9 10 1 2 34 5 6 7 8 9 3’-МХ - + - + - + - + - + 3’-МХ - + - + - + - + - + Б) А) 12 CA GATA NF-Y SRE 12 CA GATA NF-Y SRE Рис. 7. Связывание белков экстракта ядер легких мышей чувствительной к развитию рака легких линии ICR (А) и мышей устойчивых к развитию рака легких линии C57BL (Б), получивших 3-МХ с олигонуклеотидами 12 ( 1, 2), СА (3, 4 ) GATA (5, 6 ), NF-Y (7, 8 ), SRE (9, 10 ). 1, 3, 5, 7, 9 контроль;

2, 4, 6, 8, под действием канцерогена.

С помощью Вестерн-блот гибридизации мы показали, что наблюдаемый эффект не связан с изменением концентрации транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 в ядерных экстрактах после введения животным пульмоноканцерогенов (Рис. 8). Поэтому можно предполагать, что увеличение их ДНК-связывающей активности под действием канцерогена в легких мышей чувствительных линий обусловлено какими-то модификациями этих белков, а не увеличением их концентрации.

Рис. 8. Вестерн блот гибридизация с антителами к NF-Y GATA- Антитела NF-Y (1, 2, 3, 4 ) и GATA-6 (5, 6, 7, 8 ). 1, 2, 5, 6 экстракт ядер легкого мышей линии ICR,3, 4, 7, 8 - Линии мышей ICR С57BL ICR С57BL - +- + - + - + экстракт ядер легкого мышей линии C57BL/6J. 3’-MX 1, 3, 5, 7 -контрольные животные, 2, 4, 6, 8 - 1 2 3 4 5 6 7 обработанные пульмоноканцерогеном3'-МХ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В современной молекулярной генетике уделяется большое внимание выявлению и изучению однонуклеотидных замен (SNPs). Завершение программы по секвенированию генома человека предоставило новые возможности в исследовании вариаций генома человека для понимания причин, лежащих в основе наследуемых заболеваний и лекарственной устойчивости.

Интерес к изучению протоонкогена K-ras у мышей вызван тем, что мутации в нем наблюдаются в тех же кодонах в спонтанных и химически индуцированных опухолях легкого, селезёнки и прямой кишки, что и у человека.

Устойчивые линии M.musculus --- GATA - 288 296 GC C 1 Нами впервые было показано, что район горячей NF-Y и мутагенеза -- точк кодонов Чувствительныегена M.musculusмыши- является местом кооперативного 12 и 13 линии K-ras связывания транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6. Было показано 288 296 также, что у мышей чувствительных линий M.musРис. 9. Предполагаемые culus в начале интрона CA C 1 композиционные элементы в имеется регуляторный композиционный элемент, образованный двумя NF-Y районах кодона 12 и сайтами и одним сайтом для GATA-6, а связанные с устойчивостью к полиморфизма в начале пульмоноканцерогенезуM.spretus разрушают его различные компоненты: GATA Устойчивый вид SNPs интрона 2 гена K-ras мышей 288 296 6 cайт у мышей устойчивых линий M.musculus и NF-Y сайт у вида M.spretus CA T 1 вида M.musculus и вида (Рис. 9).

M.spretus.

Из литературы известно, что наличие чувствительного к пульмоноканцерогенезу варианта полиморфизма в интроне 2 гена K-ras оказывает цис-эффект на образование или фиксацию мутаций в кодонах 12 и 61. Вероятнее всего, именно различия в связывании транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 с различными аллельными состояниями интрона гена K-ras мыши, лежат в основе событий, приводящих к формированию чувствительного или устойчивого к развитию рака легких фенотипа. Мы предполагаем, что, в результате наблюдаемых различий в связывании идентифицированных нами факторов с областью расположения SNPs изменяется архитектоника хроматина в данном районе гена, тем более, что транскрипционному фактору NF-Y свойственно изгибать нить ДНК на 60- в зависимости от фланкирующей последовательности. Изменения в структуре хроматина могут открывать кодон 12 действию кацерогенов или нарушать работу ферментов репарации в данном районе, и таким образом способствовать возникновению мутаций. Это предположение поддерживают полученные нами данные об увеличении ДНК-связывающей активности факторов NF-Y и GATA-6 и усилении их связывания с районами кодонов 12,13 и точкового полморфизма в начале интрона 2 гена K-ras в условиях in vitro после введения легочных канцерогенов нитрозэтилмочевины и 3 метилхолантрена мышам чувствительных линий.

Таким образом, SNPs в начале интрона 2 гена K-ras обладают выраженным регуляторным потенциалом и требуют дальнейшего всестороннего изучения.

ВЫВОДЫ 1. Показано, что SNPs в интроне 2 гена K-ras в позициях 288 и 296 п.н., сопряженные с предрасположенностью мышей M.musculus к раку легких, формируют комплексный сайт связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y. Взаимодействие GATA-6 и NF-Y с районом локализации SNPs (278/307 п.н.) носит взаимозависимый характер.

2. Мононуклеотидная замена в позиции 311 п.н. интрона 2 гена K-ras, отличающая чувствительные к развитию рака линии мышей вида M.musculus от мышей устойчивого вида M.spretus, приводит к ухудшению выявленного нами дополнительного сайта связывания NF-Y.

3. Набор SNP C (288п.н.), A (296 п.н.) и C (311 п.н.) в интроне 2 гена K-Ras у мышей чувствительных к раку легких линий M. Musculus формирует потенциальный композиционный элемент, включающий два NF-Y сайта и один сайт GATA-6. Мононуклеотидные замены, характерные для устойчивых линий, элиминируют различные компоненты этого композиционного элемента: GATA-6 сайт у M.Musculus и NF-Y сайт у M.Spretus.

4. Район экзона 1 гена K-Ras (от 20 до 50 п.н.), включающий кодон (горячая точка мутагенеза), также содержит комплексный сайт связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y.

5. Показано, что при введении легочных канцерогенов 3-метилхолантрена и нитрозоэтилмочевины животным происходит увеличение ДНК связывающей активности NF-Y и GATA-6, а также усиление их связывания с обоими выявленными нами GATA-6/NF-Y комплексными сайтами в условиях in vitro. Эффект канцерогенов наблюдается у мышей чувствительных к развитию рака легких линий ICR, GR и A/He, но не у резистентных линий C57BL и C3H.

6. Происходящее под действием пульмоноканцерогенов увеличение ДНК связывающей активности NF-Y и GATA-6 не связано с изменением концентрации транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 в ядерных экстрактах, что предполагает какие-то модификации этих белков.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.В. Горшкова (Антонцева), В.И. Каледин, В.Ф. Кобзев, Т.И.

Меркулова. SNP в начале интрона 2 гена K-ras мыши, ассоциированные сразвитием рака легких, влияют на связывание с факторами транскрипции. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед, 2006, №6, с.681-684.

2. Е.В. Горшкова (Антонцева), В.И. Каледин, В.Ф. Кобзев, Т.И.

Меркулова. Область кодона 12 гена K-ras является местом связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y in vitro. // Биохимия, 2005, т.70, №10, с.1432-1437.

3. Ponomarenko JV, Merkulova TI, Orlova GV, Fokin ON, Gorshkova (Antontceva) EV, Frolov AS, Valuev VP, Ponomarenko MP. rSNP_Guide: a database system for analysis of transcription factor binding to DNA with variations: application to genome annotation. // Nucleic Acids Res, 2003, V.31(1), p.118-121.

4. О.А. Тимофеева, Е.В. Горшкова (Антонцева), З.Б. Левашова, В.Ф.

Кобзев, М.Л. Филипенко, В.И. Каледин, Т.И. Меркулова. Aссоциированный с чувствительностью к канцергенезу в легких точковый полиморфизм в интроне 2 гена К-ras влияет на связывание с фактором GATA-6, но не на уровень экспрессии гена. // Мол биол. 2002, том 36, №5, c.817-824.

5. Julia Ponomarenko, Tatyana Merkulova, Galina Orlova, Oleg Fokin, Elena Gorshkova (Antontceva), Mikhail Ponomarenko. Mining DNA sequences to predict sites which mutations cause genetic diseases. // Knowlege-Based Systems, 2002, V.15, p.225-233.

6. Ponomarenko JV, Orlova GV, Merkulova TI, Gorshkova (Antontceva) EV, Fokin ON, Vasiliev GV, Frolov AS, Ponomarenko MP. rSNP_Guide: an integrated database-tools system for studying SNPs and site-directed mutations in transcription factor binding sites. // Hum Mutat, 2002, V.20(4), p.239-248.

7. Е.В. Горшкова (Антонцева), Т.И. Меркулова, В.И. Каледин.

Единичные нуклеотидные замены в интроне 2 гена K-ras мыши, сопряженные с развитием рака легких, влияют на связывание факторов транскрипции. // Международная конференция “Физико-химическая биология”, 2006, с.24-25.

8. Gorshkova (Antontceva) E.V., Medkulova T.I., Kaledin V.I. Functional interpretation of pulmonary carcinogenesis susceptibility-associated SNP in K-Ras intron 2. // 3rd International conference “Genomics, proteomics, bioinformatics and nanotechnologies for medicine”, 2006, p.105.

9. Горшкова (Антонцева) Е.В., Меркулова Т.И. Единичные нуклеотидные замены в интроне 2 гена K-ras мыши, ассоциированные с развитием рака легких. // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2003, с.322.

10. Julia Ponomarenko, Galina Orlova, Tatyana Merkulova, Elena Gorshkova (Antontceva), Mikhail Ponomarenko. Predicting the transcription factor binding site-candidate which presence/absence in SNP alleles could explain the SNP related influence of genome sequence alterations on disease susceptibility/resistance. // Genome Sequencing & Biology, 2001, p.194.

11. J. Ponomarenko, T. Merkulova, O. Fokin, M. Ponomarenko, G. Orlova, E.

Gorshkova (Antontceva). By taking into account gel mobility shift assay data, knowledge discovery of regulatory protein binding site-candidate may explain disease penetration. // Proceedings of the International Conference of Mathematics and Engineering Techniques in Medicine and Biological Sciences, 2001, p.47-53.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.