авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (фгуп госниигенетика). научный консу

На правах рукописи

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»).

Научный консультант: доктор биологических наук

, профессор Носиков Валерий Вячеславович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ЧЕРНЫШЕВА АНА Асанов Алий Юрьевич ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С кандидат физико-математических наук ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К САХАРНОМУ ДИАБЕТУ ТИПА 1, Казаченко Константин Юрьевич НА ХРОМОСОМАХ 1, 2, 5 И

Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии, Российский Кардиологический Научно производственный Комплекс МЗ РФ 03.00.03 - Молекулярная биология

Защита состоится «»_200 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу : 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд,1.

АВТОРЕФЕРАТ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Реферат разослан «» 200 г.

Ученый секретарь Москва – Диссертационного совета, кандидат биологических наук Заиграева Г.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

исследователей в области генетики СД типа 1 является поиск генов и полиморфных маркеров, предрасполагающих к заболеванию, в конкретных Актуальность проблемы. Сахарный диабет (СД) типа 1 является одним этнических группах.

из наиболее распространенных и тяжелых наследственных заболеваний человека. Как правило, при наличии генетической предрасположенности он При реализации подхода генетического картирования, часто используе развивается в раннем возрасте и вызывает тяжелые осложнения, такие как мого в исследованиях полигенных, многофакторных наследственных заболе поражения кровеносных сосудов, почечную недостаточность, слепоту, ваний, поиск генов-кандидатов начинают не с функций, а с хромосомной гангрены. локализации. Для этого проводится детальное картирование участков Лечение уже развившегося сахарного диабета типа 1 со сцепления на всех хромосомах человека с использованием групп сформировавшимся фенотипом требует огромных материальных ресурсов. С полиморфных маркеров и семей с наличием заболевания у сибсов. Затем в другой стороны, при своевременной профилактике заболевания у пациентов участках, показавших максимальное сцепление с сахарным диабетом типа 1, с повышенным генетическим риском можно, как минимум, значительно изучают функции конкретных генов и исследуют ассоциацию с заболеванием отсрочить появление симптомов сахарного диабета и снизить опасность полиморфных маркеров в этих генах.

развития осложнений. Поэтому в настоящее время одним из наиболее Установление ассоциации генов с заболеванием необходимо для прогрессивных подходов является разработка стратегии ранней диагностики, понимания природы процессов, приводящих к сахарному диабету типа 1, и прогнозирования и превентивной терапии заболевания с использованием для оценки его индивидуального и популяционного генетического риска.

генетических маркеров.

Цель работы. Целью данной работы являлся поиск полиморфных мар Наследование сахарного диабета типа 1 имеет полигенный характер. керов, ассоциированных с генетической предрасположенностью к сахарному По-видимому, существует несколько десятков генов, продукты которых прямо диабету типа 1, на хромосомах 1q42, 2q31-33, 2q35, 5q31.1-33.1 и 16q22-24.

или косвенно вовлечены в его патогенез. В отличие от моногенных Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

синдромов, сочетающихся с различными нарушениями углеводного обмена, 1. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа при аутоиммунном сахарном диабете типа 1 причина заболевания лежит не в группы полиморфных маркеров в хромосомной области 1q42 с мутациях отдельных генов. Генетическая предрасположенность к СД типа использованием семей с наличием заболевания у сибсов.

связана с наследованием определенных аллелей обычных “здоровых” генов.

2. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа Иногда эти аллели, которые определяют предрасположенность к СД типа 1 и группы микросателлитных полиморфных маркеров в хромосомной области сцеплены с заболеванием, называют этиологическими мутациями или вари 16q22-24.

антами. Часто этиологические варианты широко распространены в 3. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа популяции, но при этом каждый из них сам по себе не приводит к развитию группы микросателлитных полиморфных маркеров в хромосомных областях заболевания. Только наличие определенной комбинации этиологических 2q31-33 и 2q35.

вариантов в генах, предрасполагающих к заболеванию, может приводить к 4. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа физиологическим нарушениям, находящим свое выражение в развитии СД однонуклеотидного полиморфного маркера в гене IL12B в хромосомной типа 1. Частоты встречаемости этих вариантов в разных этнических группах области 5q31.1-33.1.

существенно различаются, соответственно различается и популяционный риск, связанный с каждым из них. Поэтому первоочередной задачей 3 5. При наличии ассоциации проанализировать функции генов в областях 1q42 Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов:

и 16q22-24, определить гены, которые по своим функциям могут быть введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, задействованы в развитии СД типа 1. результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы Научная новизна работы В данной работе впервые была изучена диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и содержат ассоциация полиморфных маркеров в хромосомных областях 1q42, 2q31-33, таблицы и 9 рисунков.

2q35, 5q31.1-33.1 и 16q22-24 с сахарным диабетом типа 1 у пациентов из СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

городских популяций России. Обнаружена статистически достоверная ассоциация с СД типа 1 в областях 1q42 и 2q35. 1. Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в Проводились исследования функций генов в хромосомной области 1q42 в хромосомной области 1q42 c сахарным диабетом (СД) типа 1.

связи с их возможным участием в развитии сахарного диабета типа 1. На роль Группа пациентов была сформирована из 35 семей с конкордантными по генов-кандидатов предложены гены TAF5L, ABCB10 и KIAA0133, связанные с заболеванию парами сибсов и 72 семей с дискордантными парами сибсов, предрасположенностью к СД типа 1.

представляющих городское население Москвы и Самары. Семьи содержали Практическая ценность работы. Изучение ассоциации полиморфных двух родителей и как минимум двух сибсов. В работе использовалась геномная маркеров с сахарным диабетом типа 1 позволит оценить относительный ДНК, выделенная из цельной крови.

(популяционный) и абсолютный (индивидуальный) риск развития заболевания Одним из значимых локусов по вкладу в семейный риск развития в популяциях России, прогнозировать его развитие и прогрессирование заболевания является 1q42, расположенный на хромосоме 1. Он был задолго до клинического проявления и, наконец, правильно формировать обнаружен во второй работе по полному геномному поиску (Сoncannon et al, группы риска. Эти исследования также могут способствовать наиболее 1998). Проведенные ранее другими авторами исследования позволили эффективному проведению профилактики сахарного диабета (мониторинг лиц выделить в хромосомной области 1q42 небольшую область сцепления с СД группы риска, использование иммуномодуляторов и/или иммуносупрессоров, типа 1 размером около 250 т.п.н (Ewens et al, 2002). В этой области по данным превентивной инсулинотерапии и др.), а также обучению лиц, уже заболевших NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) к настоящему времени обнаружены три сильно СД, самоконтролю уровня глюкозы в крови, проведению интенсивной сцепленных гена: TAF5L, ABCB10 и KIAA0133.

инсулинотерапии и т.д.

В настоящем исследовании была поставлена задача исследовать Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на сцепление и ассоциацию хромосомной области 1q42 c сахарным диабетом заседании Секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП “ГосНИИ типа 1 в городских популяциях больных г. Москвы и г. Самары. Нами были генетика” от 14 февраля 2007 г. Результаты настоящей работы докладывались выбраны 6 полиморфных маркеров, суммарно перекрывающих область длиной на Третьем Российском Диабетологическом Конгрессе (2004 г.), на V-ом около 4,5 м.п.н. Из них в интервале 1,5 м.п.н. находятся 5 маркеров, и только Съезде Российского общества медицинских генетиков (2005 г.), на V-ом маркер D1S1644 удален от остальных на 3 м.п.н. (Табл. 1). Аллели и генотипы Всероссийском конгрессе эндокринологов “Высокие медицинские технологии в каждого из этих полиморфных маркеров были определены во всей группе из эндокринологии” (2006 г.) и 43-ем Ежегодном Конгрессе Европейской 107 семей с СД типа 1. Для идентификации аллелей использовалось разделе Ассоциации по изучению диабета (EASD – 2007 г.).

ние в полиакриламидном геле амплифицированных фрагментов ДНК, Публикации. По материалам работы опубликовано 6 печатных работ, содержащих внутри себя полиморфный маркер.

включая 3 статьи, а также материалы докладов и сообщений на конференциях.

5 1.1. Сцепление полиморфных маркеров D1S1644, D1S1617, D1S2847, Таблица 1.

Характеристика полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной D1S1668, D1S103 и D1S225 c сахарным диабетом типа 1.

области 1q42.

Оценка сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 проводилась Расстояние от Тип Число Длины только на ядерных семьях с конкордантными парами сибсов. Для каждого Маркер 1q-ter, м.п.н. полиморфизма аллелей фрагментов, п.н. аллеля вычислялся LOD-балл, характеризующий вероятность совместного D1S1644 222,82 STR 4-нукл. 5 265 - 281 наследования или отсутствия наследования этого аллеля обоими сибсами D1S1617 226,01 STR 3-нукл. 5 118 - 130 одновременно (Risch, 1990). Эта величина отражает корреляцию между D1S2847 226,17 STR 2-нукл. 6 156 - 166 идентичными по происхождению сибсами. Наличие корреляции свидетельст D1S1668 226,99 STR 4-нукл. 4 179 - 191 вует о сцеплении полиморфного маркера с заболеванием. Максимальный LOD D1S103 227,14 STR 2-нукл. 5 82 - балл (MLS) вычислялся как максимум значений LOD по всем аллелям.

D1S225 227,47 STR 2-нукл. 7 111 - Значение MLS соответствует десятичному логарифму отношения шансов за и На рис. 1 показан пример разделения амплифицированных фрагментов против сцепления полиморфного маркера с заболеванием.

ДНК для локуса D1S2847. Для определения размеров фрагментов ДНК нами Результаты проведенного исследования приведены в виде кривой сцепле проводилось их сравнение с аллельными “лестницами”, специально разраба- ния, на которой по оси абсцисс отложена хромосомная локализация полиморф тываемыми для каждого из маркеров в отдельности. ного маркера в м.п.н., а по оси ординат – величина MLS (рис. 2).

MLS D1S 3, D1S 3, 3, D1S D1S 2, 2, 2, 2, D1S 1, 1, 1 D1S Рисунок 1. Пример разделения амплифицированных фрагментов ДНК, 0, соответствующих определенным аллелям полиморфного маркера 222, 226, 226, 226, 227, 227, Mbp D1S2847 в 10% полиакриламидном геле. На дорожке 4 – аллельная м.п.н.

“лестница”, содержащая аллели 156 - 166. Генотипы по остальным дорож Рисунок 2. Кривая сцепления с СД типа 1 в области 1q42 по данным кам следующие: 1 - 158/166;

2 – 164/166;

3 – 162/166;

5 - 158/164;

6 - 156/156.

о 6-ти полиморфных маркерах. Приведена локализация маркеров и значения MLS.

7 Обращает на себя внимание классический характер кривой в виде N – это число аллелей полиморфного маркера. Необходимость введения дан колокола. Максимум находится вблизи полиморфных маркеров D1S2847 ной поправки обусловлена тем фактом, что данные для разных аллелей не (MLS = 3,69) и D1S1617 (MLS = 3,42), что соответствует значимому сцеплению являются независимыми.

(MLS 3,5). Предположительное сцепление (MLS 2,2) показано и для марке- Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным ров D1S1668 (MLS = 2,70), D1S103 (MLS = 2,30) и D1S225 (MLS = 2,53). Таким диабетом типа 1 в хромосомной области 1q42 провели альтернативное образом, сразу пять маркеров в хромосомной области 1q42 сцеплены с исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сахарным диабетом типа 1. сибсам (TDT), показывающее наличие или отсутствие ассоциации с Расположение области максимального сцепления при исследовании в заболеванием. Тест проводился на всех типах семей для каждого из двух российских городских популяциях полностью соответствует данным для полиморфных маркеров. В таблице 2 приведены результаты как собственно других этнических групп. Действительно, наиболее часто упоминаемым в связи теста TDT, так и объединенного теста S-TDT + TDT только для полиморфных со сцеплением с СД типа 1 в работах по геномному поиску является маркеров, показавших ассоциацию с заболеванием.

Таблица 2.

полиморфный маркер D1S1617 (Concannon et al, 1998;

Ewens et al, 2002), Передача в семьях c СД типа 1 больным сибсам аллелей полиморфных который находится на расстоянии 160 т.п.н. от полиморфного маркера маркеров D1S2847 и D1S1617, а также результаты объединенного теста D1S2847. Таким образом, области максимального сцепления полностью TDT и S-TDT.

перекрываются.

Объединенный Аллель TDT-тест тест 1.2. Ассоциация полиморфных маркеров D1S1644, D1S1617, D1S2847, Передается Не передается pc Z’ pc D1S1668, D1S103 и D1S225 c сахарным диабетом типа 1.

D1S Для оценки ассоциации с заболеванием использовался метод 118 30 неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам - TDT 121 15 2 124 50 (Spielman et al, 1993). Вычислялась величина, которая является мерой 127 47 24 7,451 0,025 2,611 0, различий между числом сибсов, которым передается аллель, и числом сибсов, 130 18 которым он не передается. Модификация метода неравновесной передачи D1S аллелей, S-TDT, основана на оценке различий передачи аллелей в сибсовых 156 23 парах (Spielman et al, 1998). Здесь различия вычислялись между частотами 158 12 передачи аллелей здоровым и больным сибсам. Тест S-TDT в чистом виде не 160 18 проводился, вместо него проводился объединенный тест, сочетающий в себе 162 59 23 15,805 0,0005 3,905 0, 164 16 результаты как TDT, так и S-TDT (Spielman et al, 1998). Величина Z’, 166 0 рассчитываемая в объединенном тесте, является мерой относительного риска Статистически значимая ассоциация с СД типа 1 обнаружена для тех же развития заболевания в случае наличия у пробанда определенного аллеля маркеров D1S1617 и D1S2847, для которых было показано сцепление с полиморфного маркера.

заболеванием. Так, аллель 127 полиморфного маркера D1S1617 и аллель В исследованиях полиморфных маркеров с числом аллелей больше двух, полиморфного маркера D2S2847 передаются чаще больным детям (табл.2), вводилась поправка Бонферрони на число множественных сравнений.

что свидетельствует о предрасполагающем характере данных аллелей.

Значения достоверности p дополнительно умножались на величину (N-1), где 9 Для аллелей всех остальных маркеров уровень значимости pc 0,05 не Ген ABCB10 входит в большую семью генов, кодирующих интегральные был достигнут, хотя в некоторых случаях и для них существует слабая белки мембран, продукты всех этих генов используют АТФ в качестве тенденция к неравновесной передаче в семьях больных СД типа 1. Таким источника энергии и осуществляют перенос через мембраны ионов и образом, тест на ассоциацию (TDT) полностью подтвердил данные теста на различных низкомолекулярных соединений. Эти белки очень консервативны и сцепление о том, что расположенные друг от друга на расстоянии 160 т.п.н. встречаются в клетках как прокариотов, так и эукариотов. Белок ABCB полиморфные маркеры D1S1617 и D1S2847 связаны с сахарным диабетом относится к подсемейству MDR/TAP, члены которого ответственны за типа 1 в российских семьях. устойчивость к лекарствам. Продукт гена ABCB10 расположен на внутренней Принимая во внимание тот факт, что определенный нами интервал мембране митохондрий и предполагается, что его функцией является перенос максимального сцепления в точности совпадает с таковым в других этнических соединений, необходимых для синтеза гема (Solomon et al., 2004).

группах, правомерно сделать предположение о том, что предрасположенность Об ассоциации генов, кодирующих белки данного семейства с СД типа к СД типа 1 в области 1q42 во всех этих группах вызвана полиморфным никаких сведений нет. Однако, было установлено что рецептор сульфонил маркером в одном и том же гене. мочевины, который является одним из двух компонентов калиевых каналов (ABCC8), участвующих в секреции инсулина из -клеток при СД типа 2, Исследования связи конкретных генов в хромосомной области 1q42 с СД типа 1 проводились на группе больных Европы и Северной Америки (Ewens et относится к этому же семейству белков.

al., 2002). Эти исследования показали ассоциацию некоторых полиморфных Продукт гена TAF5L входит в состав комплекса PCAF, состоящего из маркеров в генах KIAA0133, TAF5L и CAPN9. В данной работе были рассмот- полипептидов и осуществляющего ацетилирование гистонов. TAF5L, также как рены гены, локализация которых в этой области была подтверждено и другие белки семейства TAF, играет важную роль в процессе транскрипции в экспериментально (рис. 3). целом. Кроме того, эти белки являются коактиваторами транскрипции, участвуют как в узнавании промоторных последовательностей, так и во взаимодействии с другими факторами транскрипции, что облегчает формирование транскрипционного комплекса и инициацию транскрипции.

ABCB10 KIAA Изучение ассоциации однонуклеотидных полиморфных маркеров гена TAF5L с TAF5L СД типа 1 в популяции больных Европы и Северной Америки уже проводилось и один маркер дал значимое отклонение (р = 0,0006) в популяции больных по сравнению с здоровыми индивидами (Ewens et al., 2002).

0 50 100 150 200 т.п.н.

Ген KIAA0133 кодирует продукт, функции которого еще пока недостаточно D1S1617 D1S изучены, но предполагается, что этот белок похож на белки, связывающие ламин, которые в свою очередь, участвуют в процессах связывания хроматина с ядерной мембраной, а также в процессах синтеза ДНК, транскрипции и Рисунок 3. Карта хромосомной области 1q42 с указанием апоптоза. Для населения Европы и Северной Америки уже показано значимое полиморфных маркеров, показавших сцепление с СД типа 1 в отклонение (р = 0,04) в популяции больных СД типа 1 по сравнению со настоящей работе (D1S1617 и D1S2847) и в работах других авторов.

здоровыми особями для одного из однонуклеотидных полиморфных маркеров Кроме того, показаны гены, существование которых подтверждено в гене KIAA0133 (Ewens et al., 2002).

экспериментально.

11 На первом этапе работы были проанализированы 6 однонуклеотидных По результатам как теста TDT, так и объединенного теста, не было полиморфных маркеров, расположенных в данных трех генах. Среди них два обнаружено никаких значимых различий в частотах передачи аллелей однонуклеотидных полиморфных маркера, T150G и A301G расположены в полиморфных маркеров A301G в гене ABCB10, G248T в гене TAF5L и G778T экзоне гена ABCB10 и один в интроне этого же гена. Маркеры A454G и G248T в гене KIAA0133 в семьях с СД типа 1. Таким образом, ассоциация с СД типа расположены в экзоне гена TAF5L, а маркер G778T в экзоне гена KIAA0133. 1 у данных полиморфных маркеров отсутствует.

Однако, два однонуклеотидных полиморфных маркера в гене ABCB10 (в 1 2 3 4 5 6 7 8 интроне и в экзоне T150G) оказались неполиморфными в популяции г. Москвы и не использовались в дальнейшем исследовании.

Данные обо всех полиморфных маркерах были получены из баз данных dbSNP и UniSTS Национального центра биоинформатики (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov). В случае каждого из этих четырех маркеров (A301G, A454G, G248T и G778T) были идентифицированы аллели и генотипы во всех 107 семьях больных СД типа 1.

1.3. Изучение ассоциации однонуклеотидных полиморфных маркеров A301G, A454G, G248T и G778T c СД типа 1.

Рисунок 4. Пример разделения в 10% полиакриламидном геле алле Для идентификации аллелей однонуклеотидных полиморфных маркеров лей полиморфного маркера A454G после амплификации и использовали метод амплификации фрагментов ДНК, содержащих внутри себя расщепления рестриктазой Hin6I. Длины фрагментов: аллель A – полиморфные маркеры с последующим расщеплением этих фрагментов п.н., аллель G – 61 п.н. Генотипы по дорожкам: 1, 2, 4, 7,8 - A/G;

3, 6 рестриктазами, узнающими последовательность одного из аллелей. Разделе A/A;

5 - G/G. Изображение сканировано.

ние образующихся фрагментов ДНК проводили в 10% полиакриламидном геле.

Для полиморфного маркера A454G в гене TAF5L, напротив, ассоциация с Аллели полиморфного маркера A301G определяли с помощью рестрик СД типа 1 была обнаружена (табл. 3). Аллель A данного маркера достоверно тазы BstSFI, расщепляющей амплифицированный фрагмент длиной 533 п.н.

чаще передается больным детям (75 семей против 47, 2 =3,509, p = 0,061).

Фрагмент, содержащий аллель G, оставался нерасщепленным, в то время как Объединенный тест также подтверждает наличие ассоциации (Z’ = 2,034, p = фрагмент, содержащий аллель A, расщеплялся на фрагменты длиной 203 и 0,021).

330 п.н. (рис. 4). Аналогичным образом, амплифицированный фрагмент ДНК Таблица 3.

длиной 91 п.н., содержащий аллель A полиморфного маркера A454G, Передача в семьях c СД типа 1 больным сибсам аллелей расщеплялся рестриктазой Hin6I на фрагменты длиной 61 и 30 п.н., а в случае полиморфного маркера A454G, а также результаты объединенного полиморфного маркера G248T рестриктаза BstFNI расщепляла фрагмент, теста TDT и S-TDT.

содержащий аллель G, на фрагменты длиной 201 и 110 п.н. Для определения Объединенный аллелей полиморфного маркера G778T использовалась рестриктаза BsoMAI. TDT Аллели тест (TDT+S-TDT) Фрагмент длиной 311 п.н., содержащий аллель T, она расщепляла на две части Передается Не передается P Z’ p A 67 с длинами 201 и 110 п.н., а фрагмент, содержащий аллель G, не расщепляла. 3,509 0,061 2,034 0, G 47 13 Таким образом, аллель A полиморфного маркера A454G в гене TAF5L является фактором повышенного риска развития СД типа 1 в исследуемых Аллели и генотипы каждого из полиморфных маркеров были определены нами городских популяциях России. Однако этот факт не может быть во всей группе из 107 семей с СД типа 1. Для идентификации аллелей безусловным свидетельством роли самого гена TAF5L в патогенезе данного использовалось разделение в полиакриламидном геле амплифицированнных заболевания. Возможно, что маркер A454G находится в неравновесии по фрагментов ДНК, содержащих внутри себя полиморфный маркер. На рис. сцеплению с другим пока неизвестным полиморфным маркером, показан пример такого разделения для локуса D16S3098.

локализованном в одном из соседних генов в той же хромосомной области. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2. Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в хромосомной области 16q22-24 с СД типа 1.

Область сцепления в районе 16q22-24 была обнаружена в первых работах по геномному поиску (Mein et al, 1998). Область максимального сцепления окружает полиморфный динуклеотидный маркер D16S3098 и ее размер составляет примерно 2,0 м.п.н. Однако, все последующие исследования не смогли подтвердить тот факт, что данный локус вовлечен в формирование предрасположенности к сахарному диабету типа 1 (Concannon et al., 1998, Kristiansen et al., 1999).

В настоящем исследовании была поставлена задача изучить сцепление и ассоциацию локуса 16q22-24, используя для анализа семьи русского происхождения. Нами были отобраны 5 полиморфных маркеров, суммарно перекрывающих область длиной около 6,5 м.п.н. Из них в интервале 3,0 м.п.н.

Рисунок 5. Пример разделения амплифицированных аллелей полиморф находятся 4 маркера, и только маркер D16S3118 удален от остальных на 3, ного маркера D16S750 в 10% полиакриламидном геле. На дорожках 5 и м.п.н. (табл. 4).

13 – маркер pBR322/MspI, с аллелями 110 и 121 п.н. Генотипы по Таблица 4.

остальным дорожкам следующие : 1 - 109/113;

2 – 113/117;

3 – 113/117;

4 Характеристика полиморфных маркеров, расположенных в 109/113;

6 – 113/113;

7 – 109/113;

8, 9, 10, 11 – 113/113, 12 - 109/113.

хромосомной области 16q22-24.

Расстояние от Тип Число Длина Маркер 2.1. Сцепление полиморфных маркеров D16S3118, D16S750, D16S3073, 16q-ter, т.п.н. полиморфизма аллелей фрагментов, п.н.

D16S3118 76112 STR 2-нукл. 7 109 - 127 D16S3098 и D16S422 c сахарным диабетом типа 1.

D16S750 79438 STR 4-нукл. 3 109 - Результаты исследования приводятся в виде кривой сцепления, на D16S3073 79732 STR 2-нукл. 6 172 - которой по оси абсцисс отложена хромосомная локализация полиморфного D16S3098 81228 STR 2-нукл. 5 157 - маркера в м.п.н., а по оси ординат – величина MLS (рис. 6). Обращает на себя D16S422 82691 STR 2-нукл. 13 188 - внимание классический характер кривой в виде колокола. Максимум находится вблизи полиморфного маркера D16S750 (MLS = 1,68), что не соответствует 15 предположительному сцеплению (MLS 2,2). Таким образом, ни один из больных СД типа 1. Таким образом, тест на ассоциацию (TDT) полностью маркеров в хромосомной области 16q22-24 не сцеплен с сахарным диабетом подтвердил данные теста на сцепление о том, что локус 16q22-24 не связан с типа 1. сахарным диабетом типа 1 в российских семьях.

MLS 1, 3. Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в D16S 1, хромосомной области 2q31-33 с СД типа 1.

1, Локус IDDM7 в хромосомной области 2q31-33 был обнаружен в первых 1, D16S работах по геномному поиску (Davies et al, 1994). Область сцепления окружает D16S 1, полиморфный динуклеотидный маркер D2S152. Результаты полученные в 1,28 D16S 1, разных этнических группах очень гетерогенны - от сильной ассоциации данного 1, маркера с сахарным диабетом типа 1 (Copeman et al., 1995), через слабую 0, ассоциацию (Luo et al., 1995), до ее полного отсутствия (Buhler et al., 1997). В D16S проведенных работах были получены данные свидетельствующие о том, что 0, 0, полиморфный маркер Ala45Thr в гене NeuroD/Beta2, который кодирует белок 0, участвующий в инициации транскрипции гена инсулина, ассоциирован с сахарным диабетом типа 1 (Iwata et al., 1999), но в последующих работах было 0, показано что ассоциация данного полиморфного маркера не может объясняться неравновесием по сцеплению с IDDM7, а, возможно, является м.п.н.

76, 79, 79, 81, 82, Mbp отдельным локусом предрасположенности к сахарному диабету типа 1 (Hansen et al., 2000).

Рисунок 6. Кривая сцепления с СД типа 1 в области 16q22-24 по В настоящем исследовании была поставлена задача изучения сцепления данным о 5-ти полиморфных маркерах. Приведена локализация и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области маркеров и значения MLS.

2q31-33, используя для анализа семьи русского происхождения. Нами были отобраны два полиморфных маркера, суммарно перекрывающие область 2.2. Ассоциация полиморфных маркеров D16S3118, D16S750, D16S3073, длиной около 1,5 м.п.н. (табл. 5).

D16S3098 и D16S422 c сахарным диабетом типа 1.

Таблица 5.

Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным Характеристика полиморфных маркеров, расположенных в диабетом типа 1 в хромосомной области 16q22-24 провели альтернативное хромосомной области 2q31-33.

исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным Расстояние от Тип Число Длина сибсам (TDT), показывающее наличие или отсутствие ассоциации с Маркер 16q-ter, м.п.н. полиморфизма аллелей фрагментов, п.н.

заболеванием. Тест проводился на всех типах семей для каждого из D2S152 188,00 STR 2-нукл. 9 269 - полиморфных маркеров.

D2S1775 189,50 STR 4-нукл. 6 115 - Статистически значимая ассоциация не была обнаружена ни для одного Аллели и генотипы каждого из полиморфных маркеров были определены из исследованных полиморфных маркеров, хотя в некоторых случаях во всей группе из 107 семей с СД типа 1. Для идентификации аллелей существует слабая тенденция к неравновесной передаче аллелей в семьях 17 использовалось разделение в полиакриламидном геле амплифицированных Таблица 6.

фрагментов ДНК, содержащих внутри себя полиморфный маркер. На рис. Результаты анализа сцепления маркеров D2S152 и D2S1775 в показан пример такого разделения для локуса D2S1775.

хромосомной области 2q31-33 в семьях больных русского происхождения 1 2 3 4 5 Маркер MLS pc D2S152 2,41 0, D2S1775 1,14 NS 3.2. Ассоциация полиморфных маркеров D2S152 и D2S1775 c сахарным диабетом типа 1.

Для проверки полученных нами результатов о наличии сцепления с сахарным диабетом типа 1 в хромосомной области 2q31-33 нами было проведено альтернативное исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам (TDT). Тест проводился на всех типах семей для каждого из двух полиморфных маркеров.

Рисунок 7. Пример электрофоретического разделения аллелей Статистически значимая ассоциация не была показана ни для одного из полиморфного микросателлитного маркера D2S1775 в 10% ПААГ. На исследованных полиморфных маркеров, хотя в некоторых случаях существует дорожке 4 - аллельная "лестница" с аллелями 115, 119, 123, 127, 131 и слабая тенденция к неравновесной передаче аллелей в семьях больных СД 135 п.н. Генотипы по остальным дорожкам следующие: 1 - 127/127;

2 типа 1. Таким образом, тест на ассоциацию (TDT) не подтвердил данные теста 119/127;

3 - 127/127;

5 - 115/115;

6 - 123/127.

на сцепление о том, что локус 2q31-33 связан с сахарным диабетом типа 1 в российских семьях.

3.1. Сцепление полиморфных маркеров D2S152 и D2S1775 c сахарным диабетом типа 1.

4. Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в Оценка сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 проводилась хромосомной области 2q35 с СД типа 1.

только на ядерных семьях с конкордантными парами сибсов. Результаты Одним из значимых локусов по вкладу в семейный риск развития исследования приводятся в таблице 6. Максимальное значение LOD-балла в заболевания является локус IDDM13, расположенный в хромосомной области данном исследовании было получено для маркера D2S152 (MLS = 2,41), что 2q35. В ряде исследований была обнаружена ассоциация полиморфных соответствует предположительному сцеплению. Для маркера D2S микросателлитных маркеров D2S137 (Fu et al., 1998), D2S157 (Esposito et al., максимальный LOD-балл был равен 1,41, что ниже порога значимого 1998), D2S164 и D2S1471 (Larsen et al., 1999), расположенных в области 2q35.

сцепления (табл. 6).

В этом районе расположен ген IA-2, кодирующий аутоантиген, ген NRAMP1, Таким образом, можно сделать вывод, что маркер D2S152, кодирующий белок необходимый для нормальной функции макрофагов, ген расположенный в хромосомной области 2q31-33, слабо сцеплен с сахарным белка - транспортера ABCB12, а также гены белка, связывающего подобные диабетом типа 1 в семьях больных русского происхождения.

инсулину факторы роста 2 и 5 - IGFBP2 и IGFBP5, соответственно. Однако, ни 19 для одного из этих генов не было найдено подтверждения того что они могут сцепления. Таким образом, один из маркеров (D2S137), расположенный в быть возможными генами-кандидатами для IDDM13 (Esposito et al. 1998, Annilo хромосомной области 2q35, достоверно сцеплен с сахарным диабетом типа 1.

et al. 2002, Owerbach et al., 1997).

В настоящем исследовании была поставлена задача изучения сцепления MLS 3, и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в локусе 2q35, D2S137 3, используя для анализа семьи русского происхождения. Нами были отобраны 5 полиморфных маркеров, суммарно перекрывающих область длиной около 2, м.п.н. Из них в интервале 4 м.п.н. находятся 4 маркера, и только маркер D2S157 удален от остальных на 6 м.п.н. (табл. 7). Аллели и генотипы каждого D2S D2S из полиморфных маркеров были определены во всей группе из 107 семей с СД D2S143 1, 1, типа 1. Для идентификации аллелей использовалось разделение в 1, полиакриламидном геле амплифицированных фрагментов ДНК, содержащих 1, 0, внутри себя полиморфный маркер. Таблица 7. D2S 0, Характеристика полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области 2q35.

216, 216, 217, 220, Расстояние от Тип Число Длина Mbp м.п.н.

Маркер 211, 16q-ter, м.п.н. полиморфизма аллелей фрагментов, п.н.

D2S157 211,03 STR 2-нукл. 10 103 - Рисунок 8. Кривая сцепления с СД типа 1 в области 2q35 по данным D2S143 216,21 STR 2-нукл. 7 109 - о 5 полиморфных маркерах. Приведена локализация маркеров и D2S137 216,64 STR 2-нукл. 9 142 - значения MLS.

D2S301 217,71 STR 2-нукл. 6 224 - D2S164 220,83 STR 2-нукл. 8 265 - 4.2. Ассоциация полиморфных маркеров D2S157, D2143, D2S137, D2S301 и D2S164 c сахарным диабетом типа 1.

4.1. Сцепление полиморфных маркеров D16S3118, D16S750, D16S3073, Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным D16S3098 и D16S422 c сахарным диабетом типа 1. диабетом типа 1 в хромосомной области 2q35 нами было проведено альтернативное исследование неравновесной передачи аллелей от родителей Оценка сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 проводилась к больным сибсам (TDT), показывающее наличие или отсутствие ассоциации с только на ядерных семьях с конкордантными парами сибсов. Результаты заболеванием. Тест проводился на всех типах семей для каждого из исследования приводятся на рис. 8. Максимальное значение LOD-балла в полиморфных маркеров.

данном исследовании было получено для полиморфного маркера D2S137 (MLS Статистически значимая ассоциация была обнаружена только в случае = 3,18), что соответствует предположительному сцеплению (MLS 2,2).

полиморфного маркера D2S137, для которого ранее было показано Остальные проанализированные маркеры не показали предположительного предположительное сцепление. В табл. 8 приведены результаты как 21 собственно теста TDT, так и объединенного теста S-TDT + TDT только для (Adorini, 2001). Ген IL12B, кодирует субъединицу р40 интерлейкина 12 (IL-12), полиморфного маркера D2S137, показавшего ассоциацию с заболеванием. который является одним из ключевых цитокинов, необходимых для развития и созревания Th-1 клеток. Подтверждение того, что полиморфный маркер Таблица 8.

C1159A действительно ассоциирован с сахарным диабетом типа 1 было Передача в семьях c СД типа 1 больным сибсам аллелей полиморфного маркера D2S137, а также результаты объединенного теста TDT и S-TDT. получено при анализе популяций больных Австралии и Великобритании (Morahan et al., 2001). Аллель А преимущественно передавался больным Объединенный TDT-тест тест сибсам. Однако, эти данные в последствии не были подтверждены при Аллель Передается Не передается изучении 795 семей с дискордантными парами сибсов из Европы и Америки и больным больным pc Z’ pc 337 семей с конкордантными парами сибсов датского происхождения (Bergholdt сибсам сибсам et al., 2004).

142 6 В настоящем исследовании была поставлена задача изучения сцепления 144 0 и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в локусе IDDM18 в 146 16 хромосомной области 5q31.1-33.1, используя для анализа семьи русского 148 25 происхождения. Нами были отобраны 2 полиморфных маркера - один в 3' 150 31 нетранслируемой области гена IL12B и один на расстоянии 540 т.п.н.

152 46 19 11,215 0,0064 3,225 0, 154 8 6 дистально от этого гена (табл. 9).

156 10 23 Таблица 9.

158 7 9 Характеристика полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области 5q31.1-33.1.

Статистически значимая ассоциация с СД типа 1 обнаружена для того же маркера D2S137, для которого было показано сцепление с заболеванием. Так, Расстояние от Тип Число Длина Маркер 5q-ter, м.п.н. полиморфизма аллелей фрагментов, п.н.

аллель 152 полиморфного маркера D2S137 передается чаще больным детям D5S2060 158,13 STR 2-нукл. 11 108 - (табл. 8), что свидетельствует о предрасполагающем характере данного С1159А 158,67 SNP 2 аллеля.

Аллели и генотипы каждого из полиморфных маркеров были определены Для аллелей всех остальных маркеров уровень значимости pc 0,05 не во всей группе из 107 семей с СД типа 1. Аллели полиморфного маркера был достигнут, хотя в некоторых случаях и для них существует слабая C1159A определяли после обработки рестриктазой TaqI, расщепляющей тенденция к неравновесной передаче в семьях больных СД типа 1.

амплифицированный фрагмент ДНК длиной 323 п.н. Фрагмент, содержащий Таким образом, тест на ассоциацию (TDT) полностью подтвердил данные аллель A, оставался нерасщепленным, в то время как фрагмент, содержащий теста на сцепление о том, что полиморфный маркер D2S137 связан с аллель C, расщеплялся на фрагменты 185 и 138 п.н.

сахарным диабетом типа 1 в российских семьях.

5.1. Сцепление полиморфных маркеров D5S2060 и С1159А c сахарным 5. Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в диабетом типа 1.

хромосомной области 5q31.1-33.1 с СД типа 1.

Оценка сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 проводилась Локус IDDM18 в хромосомной области 5q31.1-33.1 был обнаружен только на ядерных семьях с конкордантными парами сибсов. Результаты сравнительно недавно, в работах с использованием мышей линии NOD 23 исследования приводятся в табл. 10. Максимальное значение LOD-балла в высказано предположение о возможной роли генов TAF5L, ABCB10 и данном исследовании было получено для маркера D5S2060 (MLS = 1,58), что KIAA0133 в патогенезе сахарного диабета типа 1. Проведен анализ не соответствует предположительному сцеплению (MLS 2,2). Для маркера сцепления и ассоциации однонуклеотидных полиморфных маркеров, C1159A максимальный LOD-балл был равен 0,31 (табл. 10). расположенных в этих генах. Для полиморфного маркера A454G в экзоне Таблица 10. гена TAF5L, получена значимая ассоциация с заболеванием, по данным о Результаты анализа сцепления в хромосомной области 5q31.1-33.1. всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов. Аллель А этого маркера чаще передавался больным сибсам, что говорит о том что данный аллель Маркер MLS pc или аллель который с ним находится в неравновесии по сцеплению, D5S2060 1,58 NS является фактором повышенного риска развития заболевания.

C1159A 0,31 NS 3. Проанализированы сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа Таким образом, маркеры D5S2060 и С1159А в хромосомной области пяти полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в области 5q31.1-33.1 не сцеплены с сахарным диабетом типа 1 в семьях больных 16q22-24, в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1. Сцепление и русского происхождения.

ассоциация с заболеванием в хромосомной области 16q22-24 не 5.2. Ассоциация полиморфных маркеров D5S2060 и С1159А c сахарным обнаружены, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у диабетом типа 1. сибсов.

4. Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 двух Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной диабетом типа 1 в хромосомной области 5q31.1-33.1 провели альтернативное области 2q31-33 (IDDM7) в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1.

исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным Обнаружено слабое сцепление с сахарным диабетом типа 1 полиморфного сибсам (TDT), показывающее наличие или отсутствие ассоциации с микросателлитного маркера D2S152. Не показано положительной заболеванием. Тест проводился на всех типах семей для каждого из двух ассоциации данного маркера, по данным о всех 107 семьях с наличием полиморфных маркеров.

заболевания у сибсов.

Статистически значимая ассоциация не была показана ни для одного из 5. Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 пяти исследуемых полиморфных маркеров.

полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной Таким образом, тест на ассоциацию (TDT) подтвердил данные о том, что области 2q35 (IDDM13) в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1.

локус 5q31.1-33.1 не связан с сахарным диабетом типа 1 в российских семьях.

Обнаружено сцепление с сахарным диабетом типа 1 полиморфного микросателлитного маркера D2S137. Показана положительная ассоциация ВЫВОДЫ аллеля 152 данного маркера с сахарным диабетом типа 1, по данным о всех 1. Изучена передача в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 107 семьях с наличием заболевания у сибсов. Данный аллель является аллелей полиморфных маркеров D1S1644, D1S1617, D1S2847, D1S1668, фактором повышенного риска развития патологии.

D1S103 и D1S225, расположенных в хромосомной области 1q42. Показано 6. Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа наличие высоко достоверной ассоциации с заболеванием для полиморфного микросателлитного маркера D5S2060 и однонуклеотидного полиморфных маркеров D1S1617 и D1S2847.

маркера C1159A в 3'-нетранслируемой области гена IL12B, расположенных 2. Исходя из результатов, полученных при анализе сцепления и ассоциации в хромосомной области 5q31.1-33.1 (IDDM18). Сцепление и ассоциация с полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области 1q42, 25 заболеванием в данной хромосомной области не обнаружены, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Чернышева, А., Зильберман, Л.И., Савостьянов, К.В., Цитлидзе, Н.М., Кураева, Т.Л., Петеркова, В.А., Дедов И.И., Носиков, В.В. (2007) Ассоциация хромосомной области 5q31.1-q33.1 (IDDM18) с сахарным диабетом типа 1 среди русских, проживающих в г. Москве. Сахарный диабет, (2), 6-8.

2. Chistiakov, D.A., Chernisheva, A., Savost'anov, K.V., Turakulov, R.I., Kuraeva, T.L., Dedov, I.I., Nosikov, V.V. (2005) Lack of association between genetic markers on chromosome 16q22-q24 and type 1 diabetes in Russian affected families. Croat. Med. J., 46(4), 670-677.

3. Chistiakov, D.A., Chernisheva, A., Savost'anov, K.V., Turakulov, R.I., Kuraeva, T.L., Dedov, I.I., Nosikov, V.V. (2005) The TAF5L gene on chromosome 1q42 is associated with type 1 diabetes in Russian affected patients. Autoimmunity, 38(4), 283-293.

4. Носиков, В.В., Кураева, Т.Л., Серегин Ю.А., Зильберман Л.И., Савостьянов К.В., Титович Е.В., Чернышева А., Петеркова В.А., Дедов И.И. Геномика сахарного диабета типа 1. Материалы Третьего Российского Диабетологического Конгресса, стр.43, г. Москва, Россия (24 - 27 мая 2004 г.).

5. Носиков, В.В., Кураева, Т.Л., Серегин, Ю.А., Зильберман, Л.И., Савостья нов, К.В., Титович, Е.В., Чернышева, А., Петеркова, В.А., Дедов, И.И.

Геномика сахарного диабета типа 1. Материалы V Съезда Российского общества медицинских генетиков, стр. 241, г. Уфа, Россия (24 - 27 мая 2005). Медицинская генетика, 4(5), 241 (2005).

6. Носиков, В.В., Кураева, Т.Л., Чернышева, А., Зильберман, Л.И., Савостья нов, К.В., Цитлидзе, Н.М., Петеркова, В.А., Дедов И.И. Молекулярная генетика сахарного диабета типа 1: достижения и перспективы. Мате риалы V Всероссийского конгресса эндокринологов “Высокие медицинские технологии в эндокринологии”, стр. 40, Москва, Россия (30 октября – ноября 2006 г.).

27

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.