авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Разработка и использование препаратов растительного происхождения в технологиях создания гриппозных вакцин

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Мазуркова Наталья Алексеевна РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ТЕХНОЛОГИЯХ СОЗДАНИЯ ГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

КОЛЬЦОВО – 2013

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Научные консультанты:

Трошкова Галина Павловна, доктор биологических наук, профессор Рябчикова Елена Ивановна, доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Белявская Валентина Александровна доктор биологических наук, профессор, ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», зав. сектором отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо опасных инфекций Гуляева Людмила Федоровна доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «НИИ молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН, зав. лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза Киселева Ирина Васильевна доктор биологических наук, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, зав. лабораторией вакцинных штаммов Ведущая организация Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, РАСХН, г. Щелково, Московская область

Защита состоится «01» марта 2013 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, 630599;

тел: (383) 336-74-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан « » ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Трошкова Галина Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. случаев гриппа и других ОРВИ (Stohr K., 2002). Cубтип вируса гриппа А/H5N1 (грипп птиц, «птичий грипп») обладает наиболее высоким пандемическим потенциалом из 15 известных (Chang S. et al., 2007). Полагают, что его генетическая реассортация с сезонным вирусом гриппа человека может привести к появлению высоко патогенного пандемического варианта (Octaviani CP. et al., 2011).

Важной частью противоэпидемических мероприятий по ограничению распространения гриппа и снижению смертности является вакцинопрофилактика, осуществляемая с помощью живых и инактивированных вакцин. В настоящее время оба типа гриппозных вакцин в России производятся на развивающихся куриных эмбрионах. Этот субстрат далеко не идеален:

помимо возможной контаминации инфекционными агентами, получение куриных эмбрионов и, соответственно, вакцин на их основе, может быть блокировано при вспышке гриппа птиц. В этих условиях альтернативой может стать использование в качестве субстрата перевиваемых линий клеток (ПЛК*), позволяющее развернуть быстрое и масштабное изготовление культуральных вакцин (Merten O.W., 2002;

Genzel Y. et al., 2009). ВОЗ с 1995 г. рекомендует разрабатывать и производить гриппозные вакцины с использованием в качестве субстрата ПЛК, аттестованных в соответствии с международными требованиями (WHO, 1995, 2005). В России имеется аттестованный в соответствии с требованиями ВОЗ банк клеточной линии MDCK (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») (Радаева И.Ф. и др., 2005).

Важнейшей характеристикой вакцинных препаратов является безопасность, повысить которую можно, исключив, или ограничив использование компонентов животного происхождения в производстве вакцин (Ulmer J.B. et al., 2006).

*Список сокращений – на обороте автореферата.

Государственные агентства, контролирующие производство фармацевтической продукции в Европе (European Medicine Evaluation Agency, EMEA) и США (Food and Drug Administration, FDA) призвали ведущие фармацевтические компании исключить или ограничить использование компонентов животного происхождения в производстве вакцин (Castle P. et al., 1999). Это подчеркивает актуальность разработки технологий, позволяющих заместить компоненты животного и человеческого происхождения продуктами растительной природы. Ряд исследователей разрабатывает среды для культур клеток млекопитающих, свободные от животных компонентов. Так, при производстве культуральных гриппозных вакцин перевиваемые линии клеток выращивают в бессывороточных питательных средах: MDCK – в средах MDSS и MDSS2N (Франция) (Merten O.W., 2002), EpiSerf (Gibco) (Голландия) (Brands R. et al., 1996;

Palache AM. et al., 1999), UltraMDCK (BioWHITTAKER);

Vero – в среде EM (Axell Biotechnologies) (Австрия) (Kistner O., 1998, 1999, 2001).

В России в настоящее время не существует отечественных бессывороточных и малосывороточных культуральных питательных сред для клеток MDCK и Vero – субстрата гриппозных вакцин, а импортные дороги, и их использование нерентабельно. Следовательно, разработка отечественных культуральных сред, не содержащих сыворотку, или содержащих ее сниженные концентрации, является крайне актуальной. Наибольший интерес для культуральных технологий гриппозных вакцин, которые должны быть не только рентабельны, но и отвечать все более жестким критериям биологической безопасности, могут представлять среды на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья. Стоимость вакцинного препарата также важна для обеспечения вакциной против гриппа всего населения (Позиция ВОЗ, 2005), и она может быть значительно снижена при применении отечественных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов доступного растительного сырья.





Замена препаратов животного происхождения (сыворотки и трипсина в составе питательных сред, желатина (желатозы) в составе стабилизатора для ЖГВ) на растительные продукты является еще одной возможностью повышения безопасности гриппозных культуральных вакцин.

Безопасность гриппозных вакцин может быть также повышена за счет использования синтетических пептидов, соответствующих консервативным аминокислотным (АК) последовательностям сайтов гемагглютинина, которые вызывают иммунный ответ. Такие вакцины могут обеспечить защиту от всех типов вируса гриппа, включая пандемические штаммы, и их разработка рекомендована ВОЗ (WHO, Geneva, 1997).

Цель исследования. Цель настоящей работы – разработать и апробировать препараты на основе материалов растительного происхождения для получения эффективных и безопасных культуральных и пептидных гриппозных вакцин.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать бессывороточные и малосывороточные питательные среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием растительного протеолитического фермента бромелаина.

2. Апробировать бессывороточные и малосывороточные питательные среды на основе ферментативных гидролизатов соевой и рисовой муки, полученных с помощью бромелаина и трипсина, для культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero и оценить их влияние на морфологические, пролиферативные и кариологические характеристики клеток, а также на чувствительность клеток к штаммам вируса гриппа, используемым для производства инактивированной и живой гриппозной вакцины.

3. Оценить возможность замены трипсина на растительные протеазы папаин и бромелаин в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья и определить оптимальные условия их применения для максимального накопления в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero штаммов вируса гриппа для производства инактивированной (субтипов A/H1N1, A/H3N2 и типа B) и живой вакцины (субтипа A/H5N2).

4. Провести сравнительное исследование ультраструктурных параметров репродукции вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в культурах клеток MDCK и Vero при культивировании в экспериментальных средах на основе растительных компонентов и контрольных средах и при замене трипсина на папаин и бромелаин.

5. Разработать и апробировать стабилизатор на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью бромелаина, в качестве средства сохранения в процессе лиофильного высушивания максимальной инфекционной активности выращенного в перевиваемой линии клеток MDCK вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2.

6. Определить оптимальные условия использования растительных препаратов (питательных сред, ферментов и стабилизатора) на основных стадиях разработки живой культуральной вакцины против вируса гриппа субтипа A/H5N2 в роллерах.

7. Оценить генетическую и фенотипическую стабильность вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2, выращенного на перевиваемой линии клеток MDCK с использованием растительных препаратов (питательных сред, ферментов и стабилизатора), а также его иммуногенность на экспериментальных моделях животных.

8. Оценить влияние растительного имуномодулятора Иммуномакс на иммунный ответ экспериментальных животных при иммунизации их синтетическими пептидами НА1 гемагглютинина вируса гриппа субтипа A/H3N2.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

- сконструирована культуральная малосывороточная питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью растительного протеолитического фермента бромелаина, и изучены ее физико химические свойства;

- доказана пригодность и перспективность применения разработанной питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки для наработки перевиваемых линий клеток MDCK и Vero и вируса гриппа;

- экспериментально обосновано применение растительных протеаз (папаина и бромелаина) в составе гидролизатных питательных сред и определены оптимальные биотехнологические условия их использования для накопления в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero вируса гриппа в производстве инактивированной и живой вакцины, позволяющие обеспечить выход вирусной массы, сравнимый с таковым при применении трипсина;

- экспериментально установлено, что использование экспериментальных сред на основе ферментативных растительных гидролизатов и растительных протеаз не влияет на морфогенез и репродуктивную активность вируса гриппа субтипа А/H5N2 при культивировании его в клетках MDCK и Vero;

экспериментально показано, что применение стабилизатора, сконструированного на основе ферментативного гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина, обеспечивает в процессе лиофильного высушивания максимальное сохранение инфекционной активности наработанного в клетках MDCK вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2;

- экспериментально показано, что использование растительных препаратов не влияет на генетическую стабильность вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2 и на параметры иммунного ответа при введении этого штамма лабораторным животным;

экспериментально показано, что применение растительного иммуномодулятора Иммуномакс в качестве адъюванта усиливает иммунный ответ на синтетические пептиды из вариабельного и консервативного сайтов НА1 гемагглютинина вируса гриппа A/H3N2.

Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены патентами РФ (№ 2330885, № 2377295).

Практическая значимость работы. Экспериментально обосновано использование растительных препаратов (питательных сред, ферментов, стабилизатора) на основных стадиях роллерной технологии разработки безопасной и эффективной культуральной живой вакцины против гриппа субтипа A/H5N2.

Показаны экономические преимущества применения питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина, для создания и производства культуральных гриппозных вакцин.

Установленные параметры применения растительных препаратов при разработке и производстве культуральных гриппозных вакцин обеспечат повышение их безопасности.

Внедрение растительных препаратов в производство культуральных гриппозных вакцин позволит отказаться от дорогостоящих импортных компонентов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Экспериментальная питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью растительного протеолитического фермента бромелаина, содержащая сниженное количество (с 5-10 % до 2 и 3 %) сыворотки, пригодна для культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero, являющихся субстратом для культуральных гриппозных вакцин.

2. Использование растительных ферментов бромелаина и папаина в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои и риса позволяет получать высокие инфекционные титры вирусов гриппа (9,0-9, lg ТЦД50/мл) для производства инактивированной и живой вакцин в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero. Максимальное накопление вакцинных штаммов вируса гриппа для живой и инактивированной гриппозной вакцины в клеточных линиях и при MDCK Vero использовании растительных препаратов (сред и ферментов) зависит от множественности инфекции, вида и концентрации протеазы, адаптации штаммов вируса к клеткам. Для живой гриппозной вакцины критическим является время сбора «урожая» вируса.

3. Стабилизатор, содержащий 10 % сахарозы и 5 % соевого гидролизата, полученного с помощью бромелаина, обеспечивает сохранение инфекционной активности вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), выращенного в перевиваемой клеточной линии MDCK при использовании питательной среды на основе ферментативного гидролизата сои и в присутствии бромелаина, на стадии сублимационного высушивания и при хранении в течение 1 года.

4. Усовершенствование технологии приготовления живой культуральной гриппозной вакцины субтипа A/H5N2 с использованием растительных препаратов включает (1) наработку клеток MDCK в роллерах в малосывороточной (2 %) среде на основе ферментативного гидролизата сои, полученного с использованием бромелаина;

(2) накопление в присутствии 20 мкг/мл бромелаина холодоадаптированного вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в выращенных клетках;

(3) введение в культуральную вируссодержащую жидкость стабилизатора, содержащего 10 % сахарозы и 5 % соевого гидролизата, полученного с помощью бромелаина;

(4) сублимационное высушивание.

5. Сухие культуральные (MDCK) вакцинные образцы, содержащие штамм вируса гриппа субтипа полученные с использованием A/H5N2, растительных препаратов, генетически стабильны и иммуногенны для мышей. При двукратной интраназальной иммунизации животных они индуцируют выработку системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вариантам вируса гриппа птиц A/H5N1.

6. Применение растительного иммуномодулятора Иммуномакс обеспечивает усиление иммунного ответа у мышей при иммунизации синтетическими пептидами из вариабельного и консервативного сайтов тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), без дополнительного введения адъюванта Фрейнда.

Внедрение результатов работы. Разработаны и утверждены в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» СОП на основные стадии создания живой культуральной гриппозной вакцины субтипа A/H5N2 с использованием растительных препаратов: СОП № 3-007/01-12 «Получение ферментативного гидролизата соевой муки с использованием бромелаина», СОП № 3-006/01- «Выращивание клеток перевиваемых линий MDCK и Vero в роллерах в питательной среде на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина», СОП № 3-005/01-12 «Репродукция холодоадаптированного вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в присутствии бромелаина или папаина в перевиваемой клеточной линии MDCK, выращенной в роллерах в питательной среде на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина».

Разработаны технические условия «Ферментативный гидролизат соевой муки, полученный с помощью бромелаина, для научных исследований, сухой».

Результаты работы внедрены в практику преподавательской работы кафедры фармацевтической технологии и биотехнологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 7-й, 8-й и 9-й Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, Украина, 1999, 2000, 2001), Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию НИИ проблем биологической безопасности «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития» (Алматы, Казахстан, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирская область, Кольцово, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010.

Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010), Международной научно практической конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Варадеро, Куба, 2011), Международной научно-практической конференции «Новые технологии, инновации, изобретения» (Мальдивские острова, 2011), Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Рим-Флоренция, Италия, 2011), Международной научно-практической конференции «Инновационные медицинские технологии» (Москва-Париж, Россия-Франция, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 21 статья (16 статей – в журналах, рекомендованных ВАК), 2 патента и тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах текста, состоит из глав: «введение», «обзор литературы», «материалы и методы», «результаты и обсуждение», «заключение», «выводы» и списка литературы, который содержит 482 источника, из них 79 отечественных и 403 – иностранных. Диссертация включает 66 таблиц и 20 рисунков.

Личный вклад автора. Идея, тема и план диссертации сформулированы автором на основании многолетних исследований (1985-2011 г. г.). Основная часть результатов получена и представлена для опубликования автором самостоятельно, а также при участии д-ра мед. наук, проф. Подчерняевой Р.Я.

(исследования сред на клеточных линиях MDCK(II) и Vero(B)), д-ра мед. наук, проф. Исаевой Е.И. (вирусологические исследования на клеточных линиях MDCK(II) и Vero(B)), канд. мед. наук Михайловой Г.Р. (кариологический анализ), д-ра биол. наук, проф. Рябчиковой Е.И. (электронно-микроскопические исследования), д-ра биол. наук, проф. Трошковой Г.П. (получение гидролизатов с использованием трипсина), д-ра хим. наук Баратовой Л.А. (аминокислотный анализ), Скарнович М.О. (сублимационное высушивание образцов), канд. хим.

наук Самукова В.В (синтез пептидов). Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.

Автором лично или под ее руководством проведены: разработка оптимальных условий проведения гидролиза соевой муки с использованием бромелаина;

изучение ростовых свойств питательных сред на основе гидролизатов растительного сырья;

определение оптимальных условий роллерного культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero в экспериментальных питательных средах на основе гидролизатов растительного сырья;

определение оптимальных условий выращивания вакцинных штаммов вируса гриппа для производства живой и инактивированной гриппозной вакцины в роллерах в клетках MDCK и Vero при использовании растительных препаратов;

изучение иммуногенных и протективных свойств лиофильно высушенных культуральных вакцинных образцов, содержащих штамм вируса гриппа субтипа A/H5N2, полученных с использованием растительных препаратов;



а также изучение иммуногенности вакцинных конструкций на основе синтетических пептидов в экспериментах на животных. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка технологии приготовления питательной среды на основе соевого гидролизата Конструирование качественных питательных сред (ПС) относится к одному из главных технологических процессов в производстве культуральных вакцин.

Химический состав ПС, чистота входящих в нее компонентов оказывают значительное влияние на качество клеточных культур и, как следствие, на наработку вирусов. Поскольку сыворотка крови может содержать контаминанты клеточных культур, то проблема разработки бессывороточных ПС на основе использования ферментативных гидролизатов растительных белков имеет важное значение для клеточных технологий.

Производство ПС на основе ферментативных белковых гидролизатов – сложная многооперационная технология, включающая последовательные процессы предварительного выбора источника белка и протеолитического фермента, проведение гидролиза, очистку и высушивание полученного гидролизата, контроль его качества и дальнейшее приготовление на основе наработанного гидролизата стерильной питательной среды, а также контроль ее пригодности для культивирования клеток и вирусов. Изучение и оптимизация этих процессов необходимы для разработки культуральных вакцин на основе растительного сырья.

В ходе выполнения работы нами разработана малосывороточная питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки для ПЛК MDCK и Vero. При разработке технологии получения гидролизата сои была использована растительная протеаза бромелаин. Оптимальные параметры процесса гидролиза устанавливали, варьируя физико-химические параметры (температура, рН), связанные с максимумом активности фермента, определяя оптимальную продолжительность реакции и соотношение основных компонентов:

субстрат:вода и фермент:субстрат. Критерием завершения процесса гидролиза служило постоянство величины аминного азота. Были определены условия гидролиза с использованием бромелаина, приводящие к максимальному выходу целевого продукта. Отработана технология получения соевого гидролизата с использованием бромелаина и получены образцы гидролизата со стандартными физико-химическими характеристиками.

Аминокислотный состав соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, определен на аминокислотном анализаторе «Мультихром» в НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ. Суммарное количество аминокислот в гидролизате соевой муки, полученном с помощью бромелаина, составило 541,32 мг/г, в нем преобладают моноаминодикарбоновые АК: глутаминовая и аспарагиновая кислоты. Вдвое меньше в гидролизате содержание алифатических кислот (аргинин, лейцин, лизин, пролин и серин), наименьшее - серосодержащих АК: цистина и метионина. Отсутствуют глутамин и гетероциклическая АК триптофан. АК состав гидролизата учитывали при конструировании сбалансированного состава питательной среды для культур клеток MDCK и Vero. При конструировании питательной среды была определена концентрация ферментативного гидролизата (от 1,25 до 3,2 г/л), обеспечивающая содержание аминного азота в пределах 120±40 мг/л, что соответствует содержанию такового в традиционных синтетических питательных средах (199 М - 80 мг/л, Игла МЕМ - 180±30 мг/л, RPMI-1640 – 200±40мг/л, F-12 - 130±30 мг/л по каталогу «Gibco Invitrogen Corporation»).

Сконструированная ПС для культивирования клеток MDCK и Vero включает в себя сбалансированный солевой раствор Хенкса, источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов в виде растительного гидролизата, дополнительно введенные аминокислоты (L-глутамин, L-цистин, L-триптофан, L-метионин), глюкозу и некоторые витамины (табл. 1).

Таблица Состав питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина № Наименование компонента Допустимые Оптимальные п/п пределы изменения количества (мг/л) (мг/л) (М±m) (n=10) гидролизат соевой муки 1. 1250,0-3200,0 3000,00±0, 100,00 – 300, 2. L-глутамин 292,00±0, 10,00±0, 3. L-триптофан 5,00-10, 15,00±0, 4. L-метионин 15,00-20, 5. L-цистин 10,00 - 40,00 28,00±0, холин хлорид 6. 1,00 - 3,00 1,00±0, фолиевая кислота 1,00±0, 7. 0,20 - 1, никотинамид 1,00±0, 8. 0,20 - 1, кальция пантотенат 9. 0,25 - 1,10 1,00±0, пиридоксаль гидрохлорид 1,00±0, 10. 0,20 - 1, тиамин гидрохлорид 1,00±0, 11. 0,20 - 1, мио-инозитол 2,00±0, 13. 0,20 - 2, рибофлавин 0,10±0, 14. 0,02 - 0, глюкоза 1000,00±0, 15. 1000,00-3000, сбалансированный солевой до 1 л 1л 16.

раствор Хенкса Примечаниe: М – среднее арифметическое;

m – ошибка среднего;

n – число опытов.

Все исследованные физико-химические показатели среды были в пределах значений, характерных для синтетических питательных сред (199М, Игла, Игла МЕМ, RPMI-1640).

Пригодность среды для культивирования клеток линий MDCK и Vero была изучена в сравнительных исследованиях пролиферативных, морфологических и кариологических характеристик клеток, выращенных в сконструированной среде и в ранее разработанных нами средах на основе гидролизатов сои и риса, полученных с помощью трипсина (Трошкова Г.П. и др., 2006), а также в контрольных синтетических средах при разных концентрациях сыворотки крови плодов коровы (СКПК). Использовали клеточные линии MDCK и Vero, полученные из российских коллекций культур клеток (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», пгт Кольцово Новосибирской области) (обозначены MDCK(I) и Vero(I)) и (Института вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗСР РФ, Москва) (обозначены MDCK (II) и Vero(B)).

Пролиферативная активность клеток - необходимая характеристика любых клеточных линий, культивируемых в питательных средах и используемых в качестве субстрата для приготовления иммунобиологических препаратов. Для изучения возможного влияния гидролизатных сред на клетки MDCK и Vero данный параметр оценивали при культивировании в течение 10 пассажей в экспериментальных и контрольных питательных средах в культуральных флаконах. Использование ПС на основе растительных гидролизатов с 3 % сыворотки обеспечивает в течение 10-и пассажей достоверно (р0,05) более высокую пролиферативную активность клеток культуры Vero(B), чем контрольная среда DМЕМ с 3 % сыворотки, а среда с 2 % сыворотки достоверно (р0,05) более высокую пролиферацию клеток культуры MDCK(II) по сравнению с контрольными средами SFM4 MegaVir и DMEM, содержащими 2 % СКПК. Использование питательных сред на основе гидролизатов рисовой и соевой муки с 2 % сыворотки обеспечивает наработку клеток культуры MDCK(I) с пролиферативными параметрами, аналогичными таковым при использовании контрольной среды Stem Alpha.MDCK, что существенно позволит снизить затраты на их культивирование. Аналогичные результаты были получены при культивировании обеих клеточных линий в экспериментальных средах в роллерах (табл. 2).

Таблица Ростовые характеристики клеток MDCK и Vero из разных коллекций при культивировании в роллерах в экспериментальных и контрольной средах Количество Индекс Концентрация клеток ПЛК Питательная среда пролиферации (кл/см2) сыворотки (%) (М±m) (n=6) (М±m)(n=6) DMEM (контроль) 1,90±0,01 5,8±0, Соевый гидролизат 1,90±0,01 5,8±0, Vero(I) (бромелаин) Соевый гидролизат 1,80±0,02 5,5±0, (трипсин) Рисовый 1,75±0,01 5,5±0, гидролизат (трипсин) DMEM (контроль) 1,75±0,06 5,5±0, Соевый гидролизат 1,60±0,01 5,0±0, MDCK(I) (бромелаин) Соевый гидролизат 1,65±0,05 5,2±0, (трипсин) Рисовый 1,55±0,03 5,0±0, гидролизат (трипсин) DMEM (контроль) 1,50±0,03 5,0±0, Vero(B) Соевый гидролизат 1,60±0,05 5,3±0, (бромелаин) DMEM (контроль) 1,50±0,02 5,0±0, MDCK(II) Соевый гидролизат 1,47±0,01 4,9±0, (бромелаин) Примечание: М – среднее арифметическое;

m – ошибка среднего;

n – число опытов.

Важной характеристикой при оценке ростовых свойств питательных сред является морфология клеток. Морфология клеток культур Vero и MDCK при культивировании в экспериментальных питательных средах не отличалась от таковой при использовании среды DМЕМ. Клетки формировали отчетливый ровный монослой через 48-72 ч, сохраняли типичную фибробластоидную (Vero) и эпителиоидную (MDCK) форму, в цитоплазме не отмечалось признаков вакуолизации. Ультраструктура клеток линий MDCK и Vero при культивировании на экспериментальных средах также не отличалась от таковых при использовании контрольной среды. В клетках MDCK не наблюдалось признаков дистрофических изменений, они содержали крупное ядро, отчетливое ядрышко и «нормальный» набор органоидов, в том числе большое количество эндосомальных структур, видимых в инвертированном микроскопе как вакуоли.

Клетки Vero имели среднюю электронную плотность, крупные ядра с хорошо выраженным ядрышком, узкие цистерны ЭПР, небольшой аппарат Гольджи, лизосомальные структуры были представлены мелкими электронно-плотными лизосомами и миелино-подобными фигурами.

При культивировании в экспериментальных средах не наблюдалось признаков дистрофических изменений органоидов и появления жировых включений. Таким образом, использование питательных сред на основе гидролизатов рисовой и соевой муки не вызывает изменений морфологических параметров клеток культур Vero и MDCK по сравнению с таковыми при использовании контрольных синтетических сред.

Кариологические параметры входят в набор основных характеристик перевиваемых линий клеток, они определяют видовую принадлежность клеток, постоянство хромосомного набора при длительном культивировании, наличие маркерных хромосом.

Кариологические характеристики, согласно требованиям ВОЗ, используют при аттестации культур-продуцентов иммунобиологических препаратов (Грачев В.П. и др., 2008). Возможные изменения кариотипа клеток MDCK(II) изучали при культивировании в питательных средах на основе растительных гидролизатов и в контрольной среде в течение 10 пассажей, на протяжении которых клетки MDCK(II) имели стабильный кариотип. Модальное число хромосом для всех препаратов составляло 77-78, что соответствует нормальному кариотипу собаки, 2n=78 (Reiman N. et al., 1996). Пределы изменчивости по числу хромосом – 67-83. При просмотре 1000 метафазных пластинок каждого препарата доля полиплоидных клеток составляла 1 % в контроле (культивирование клеток в течение 10 пассажей в среде SFM MegaVir) и 0 %, 0,3 % и 0,6 % для клеток, культивированных в течение пассажей в средах на основе соевых гидролизатов, полученных с помощью бромелаина и трипсина, и трипсинового гидролизата риса, соответственно.

Дифференциальное окрашивание показало, что кариотип клеток MDCK(II) во всех препаратах характеризуется присутствием нормальных акроцентрических хромосом и 1-3 маркерных хромосом с медианной или субмедианной центромерой. Таким образом, кариологические характеристики клеток MDCK(II) не претерпевают заметных изменений в течение 10 пассажей в экспериментальных питательных средах.

Анализ кариотипа клеток Vero(В) показал, что линия гиподиплоидная (2n=60), при культивировании в контрольной среде (DMEM) число хромосом колеблется от 49 до 58. Количество клеток с околополиплоидным числом хромосом (108-110) составляет 3 %. Модальный класс в контроле (в начале и в конце периода культивирования) составляют клетки с 54-55 хромосомами ( %), что не отличается от наблюдаемого в опыте для клеток Vero(В), культивируемых в среде на основе соевого гидролизата, полученного с помощью бромелаина (54-55 (65 %)). Аналогичны были и пределы изменчивости по числу хромосом – 49-58. В подавляющем числе опытных клеток, культивируемых в течение 10 пассажей в экспериментальных средах на основе трипсиновых гидролизатов сои и риса, количество хромосом составило 57-58 (62 % и 61 % - при использовании в составе среды соевого и рисового гидролизата, соответственно), что незначительно превышает контрольный уровень. Пределы изменчивости по числу хромосом были 51-60. При анализе 1000 метафазных пластинок каждого препарата полиплоиды не обнаружены.

Дифференциальное окрашивание выявило во всех клетках линии Vero(В) и в опыте, и в контроле, характерные маркерные хромосомы (одна длинная метацентрическая хромосома и 3 хромосомы с дополнительными С-полосами), которые являются стабильными перестройками для данной линии. Таким образом, ПЛК Vero(В) при культивировании в экспериментальных средах в течение 10 пассажей сохраняет кариотип, свойственный донору линии – обезьяне (Новохатский А.С. и др., 1985).

Обязательным требованием безопасности культуральных вакцин является отсутствие контаминации клеток бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. В ПЛК MDCK(II) и Vero(B), культивируемых в течение 40 пассажей в экспериментальных и контрольных питательных средах, не выявлены контаминанты, регламентированные РД 42-28-10-89.

Разработанные рецептуры питательных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки, полученных с помощью трипсина и бромелаина, могут применяться для культивирования ПЛК MDCK и Vero, используемых, в частности, в качестве клеточного субстрата для культуральных гриппозных вакцин. Среды обеспечивают наработку клеток культур с кариологическими, морфологическими и пролиферативными параметрами, аналогичными таковым при использовании сред Stem Alpha.MDCK и SFM MegaVir (клетки MDCK) и DМЕМ (клетки Vero).

Оценка возможности использования растительных препаратов для выращивания вакцинных штаммов вируса гриппа в клеточных линиях MDCK и Vero Использование ПЛК для разработки вакцин требует контроля безопасности препаратов, так как они могут накапливать микроорганизмы из питательных сред, сывороток и трипсина в процессе пассирования. Технология получения вакцин на ПЛК должна сводить к минимуму данный риск путем исключения или уменьшения компонентов животного происхождения по всей технологической цепи. Использование в технологии приготовления культуральной гриппозной вакцины ПС на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья и замена фермента животного происхождения (трипсина) на растительные протеазы позволит сделать такую вакцину более безопасной. Репродукцию штаммов вируса гриппа А (A/Solomon Islands/03/06 (H1N1) и A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)) и В (B/Malaysia/2506/2004) для производства ИГВ изучали на клетках MDCK и Vero, выращенных в питательных средах на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки, полученных с использованием трипсина и бромелаина. Репродуктивная активность штаммов вирусов гриппа А и В была сравнима на клетках линий MDCK(I) и Vero(I) (данные не приведены), выращенных в экспериментальных средах на основе ферментативных гидролизатов риса и сои с пониженной до 2 и 3 %, соответственно, концентрацией СКПК, и в обычно применяемой для выращивания клеток синтетической среде с концентрацией 5 % СКПК (табл. 3).

Таблица Репродукция вакцинных штаммов гриппа А и В на клетках MDCK(I) при культивировании в экспериментальных питательных средах на основе соевых ферментативных гидролизатов Штамм Ростовая среда Титр вируса через 3 суток (+ СКПК, %) после инфекции (lg ТЦД50/мл) (М±m) (n=5) Гидролизат сои (трипсин) (5) 9,00±0, A/Solomon 8,70 ±0, Гидролизат сои (трипсин) (2) Islands/03/ Гидролизат сои (бромелаин) (5) 9,50±0, (H1N1) Гидролизат сои (бромелаин) (2) 9,10±0, 9,30±0, DMEM (5) 7,20±0, DMEM (2) Гидролизат сои (трипсин) (5) 8,80±0, A/Wisconsin Гидролизат сои (трипсин) (2) 8,30±0,02* /67/ Гидролизат сои (бромелаин) (5) 9,10±0, (H3N2) Гидролизат сои (бромелаин) (2) 9,00±0, 9,20±0, DMEM (5) 5,80±0, DMEM (2) Гидролизат сои (трипсин) (5) 8,50±0, B/Malaysia Гидролизат сои (трипсин) (2) 8,10±0, /2506/ Гидролизат сои (бромелаин) (5) 9,00±0, Гидролизат сои (бромелаин) (2) 8,90±0, 8,50±0, DMEM (5) 5,70±0, DMEM (2) Примечания: М - среднее арифметическое;

m - ошибка среднего;

n - число опытов;

*, - отличия от соответствующих показателей при DMEM+5 % СКПК по t-критерию Стьюдента при р0,05.

Изучали репродуктивную активность и ростовые характеристики холодоадаптированного рессортантного вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), используемого в отечественной технологии производства аллантоисной интраназальной ЖГВ против вируса гриппа птиц (Миронов А.Н. и др., 2009) на клеточных линиях MDCK(I) и Vero(I) при использовании питательных сред на основе ферментативных растительных гидролизатов и контрольной среды Stem Alpha.MDCK при внесении во все среды 2, 3 и 5 % СКПК. Репродукцию штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в присутствии трипсина изучали на клеточной культуре MDCK(I), выращенной в экспериментальных питательных средах на основе гидролизата рисовой муки (получен с помощью трипсина) и гидролизатов соевой муки (получены с помощью трипсина и бромелаина), и в контрольной среде Stem Alpha.MDCK в присутствии 5 % СКПК. Значения инфекционного и гемагглютинирующего титров в опыте и контроле были практически одинаковы (табл. 4).

Уменьшение концентрации сыворотки до 2 % в составе экспериментальных ростовых питательных сред не снижало репродуктивную активность реассортанта на клетках MDCK(I) по сравнению с использованием 5 % СКПК.

Таким образом, при получении вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 с использованием клеточной культуры MDCK(I) можно заменить дорогостоящую импортную питательную среду Stem Alpha.MDCK на разработанные нами среды на основе растительных ферментативных гидролизатов, содержащие сниженную концентрацию (2 %) СКПК.

Аналогичные исследования репродукции штамма А/17/утка/Потсдам/86/ на клетках Vero(I) показали возможность замены синтетической среды DMEM с 5 % сыворотки на экспериментальные среды с 3 % СКПК (см. табл. 4).

Для формирования инфекционных вирионов вируса гриппа необходимо протеолитическое расщепление предшественника вирусного гемагглютинина (Byassard D. et al., 1997), осуществляемое протеазами клетки-хозяина (Steinhauer D. et al., 1998). Специфичность этих протеаз достаточно высока, поэтому расщепление гемагглютинина вируса гриппа человека происходит в ограниченном наборе клеток-хозяев, а для расщепления гемагглютинина этих вирусов в клетках нечеловеческого происхождения необходимо добавление трипсина (Klenk HD. et al., 1975) или подобных ему протеаз.

Таблица Репродукция вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в присутствии трипсина на клетках MDCK(I) и Vero(I) c использованием сред на основе растительных гидролизатов Клеточная Ростовая Содержание Титр вируса гриппа через 3 сут линия питательная сыворотки после инфицирования клеток среда Инфекционный, Обратный (%) lg ТЦД50/мл, титр в РГА (X±m) (n=10) 9,60±0, MDCK(I) Stem 5 9,45±0, Alpha.MDCK 3 (контроль) 9,50±0, 2 Гидролизат риса 9,35±0, 5 (трипсин) 9,25±0, 3 9,30±0, 2 Гидролизат сои 9,25±0, 5 (трипсин) 9,10±0, 3 9,20±0, 2 Гидролизат сои 9,55±0, 5 (бромелаин) 9,50±0, 3 9,50±0, 2 8,50±0, Vero(I) DMEM 5 (контроль) Гидролизат риса 8,50±0, 5 (трипсин) 8,70±0, 3 Гидролизат сои 8,45±0, 5 (трипсин) 7,90±0,09* 3 9,20±0, Гидролизат сои 5 (бромелаин) 8,90±0, 3 Примечания: М - среднее арифметическое;

m - ошибка среднего;

n - число опытов;

*, - отличия от показателя в контроле по t-критерию Стьюдента при р0,05.

В наших экспериментах трипсин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота, был заменен на растительный протеолитический фермент класса гидролаз – папаин, имеющий широкую субстратную специфичность и расщепляющий практически любые пептидные связи, за исключением образованных остатками пролина (Levison SW. et al., 2000). Мы применили также другой растительный протеолитический фермент класса гидролаз, бромелаин, использовавшийся для извлечения гемагглютинина из частиц рекомбинантного штамма вируса гриппа Х-31(H3N2) (Skehel J.J. et al., 1975;

Мукажанова Г.Н. и др., 1981) и вируса гриппа A/PR/8/34(H1N1) (Смирнова Ю.А., 2009).

В предварительных экспериментах были определены оптимальные концентрации растительных протеаз (4 и 20 мкг/мл среды для папаина и бромелаина, соответственно) в составе питательных сред для репродукции вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в клетках MDCK(I) и Vero(I). При использовании папаина максимальные значения инфекционного титра реассортанта А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в клеточных линиях MDCK(I) и Vero(I), выращенных в экспериментальных на основе гидролизатов соевой и рисовой муки и контрольных средах, были достоверно ниже (на 0,5-1, lg) соответствующих значений титров, полученных при использовании трипсина. Замена трипсина на папаин приводила также к снижению (в 2 раза) и гемагглютинирующих титров как на клетках MDCK(I), (табл. 5), так и на клетках Vero(I) (данные не приведены). Максимальный выход реассортанта, выращенного в присутствии папаина на клетках MDCK(I) и Vero(I) с использованием питательных сред на основе гидролизатов соевой и рисовой муки, был в 3-10 раз меньше, чем в присутствии трипсина (см. табл. 5). Однако этот уровень биологической активности вируса является достаточным для обеспечения необходимой дозы в составе ЖГВ, которая по технической документации для вируса гриппа типа А соответствует 6,5 lg ЭИД50/0,2мл.

Замена трипсина на бромелаин при культивировании вируса А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) на клетках MDCK(I) и Vero(I), выращенных в экспериментальных и контрольных питательных средах, не привела к снижению инфекционных титров реассортанта (см. табл. 5). Значения гемагглютинирующих титров вируса на клетках MDCK(I) и Vero(I) не различались в опыте с бромелаином и в контроле с трипсином (см. табл. 5).

Таким образом, растительные ферменты папаин и бромелаин могут быть использованы вместо фермента животного происхождения трипсина при наработке вакцинного реассортанта А/17/утка/Потсдам/86/92 на ПЛК MDCK(I) и Vero(I), обеспечивая достаточно высокую продукцию вируса.

Таблица Репродукция вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) на клеточной линии MDCK (I) с использованием сред различного состава Ростовая Фермент в Титр вируса гриппа через 3 сут после питательная поддерживающей инфицирования клеток среда среде Инфекционный, lg Обратный ТЦД50/мл, (М±m)(n=10) титр в РГА Трипсин 9,50±0, Stem Alpha.MDCK + 2 % СКПК Папаин 8,50±0,07 Бромелаин 9,30±0,05 Без фермента 5,50±0,14 Гидролизат риса Трипсин 9,30±0,08 (трипсин) Папаин 8,60±0,06 + 2 % СКПК Бромелаин 9,40±0,11 Без фермента 5,80±0,06 Гидролизат сои Трипсин 9,20±0,07 (трипсин) Папаин 8,50±0,09 + 2 % СКПК Бромелаин 9,40±0,12 Без фермента 5,00±0,09 Гидролизат сои Трипсин 9,50±0,07 (бромелаин) Папаин 8,70±0,11 + 2 % СКПК Бромелаин 9,50±0,01 Без фермента 6,00±0,05 Примечания: М - среднее арифметическое;

m - ошибка среднего;

n - число опытов;

различия от соответствующих показателей с трипсином по t-критерию Стьюдента при р0,05.

Сравнительное исследование ультраструктурных параметров репродукции вируса гриппа (H5N2) не выявило различий A/17/утка/Потсдам/86/ морфогенеза вируса в разных экспериментальных системах, когда для культивирования клеток MDCK(I) и Vero(I) использовали разработанные автором экспериментальные среды на основе растительных компонентов. Не было также выявлено отличий от контроля, когда клетки культивировали на стандартных питательных средах. Не выявлено и различий ультраструктурных параметров морфогенеза вируса гриппа A/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) при культивировании клеток Vero(I) и MDCK(I) на экспериментальных и контрольных средах при замене трипсина на папаин и бромелаин.

Аттенуированный холодоадаптированный мастер-штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), на основе которого получен холодоадаптированный реассортант А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), содержит в генах 10 мутаций, 8 из которых привели к замещению аминокислот в белках PB1, PB2, PA, M1, M2 и NS2 (Ghendon Y., 1998). Используемый в данном исследовании штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) унаследовал от мастер штамма 7 генов, кодирующих 6 внутренних белков вириона и нейраминидазу.

Необходимо было изучить возможное влияние растительных компонентов в составе питательных сред на генетические и фенотипические признаки данного штамма, для чего изучали признаки стабильности ca+25 и ts-40 штамма А/H5N2, полученного на клеточных линиях MDCK(I) и Vero(I) при использовании растительных протеаз и питательных сред на основе растительных гидролизатов. Исследование фенотипической стабильности в процессе двух пассажей холодоадаптированного реассортанта при 33 °С в присутствии папаина или бромелаина в монослойных культурах клеток MDCK(I) и Vero(I), выращенных в экспериментальных питательных средах на основе растительных гидролизатов, не выявило изменений ts-40- и ca+25- фенотипа вируса: во всех случаях холодоадаптированный реассортант не размножался при 40 °С, но сохранял способность к репродукции при 25 °С (табл. 6).

Анализ стабильности мутаций, приведших к замене аминокислот в отдельных генах холодоадаптированного реассортанта, проводили путем сравнения нуклеотидных последовательностей соответствующих участков генома культурального вируса (выращенного на клетках MDCK(I) и Vero(I) при использовании растительных протеаз и экспериментальных питательных сред на основе растительных гидролизатов) и исходного аллантоисного холодоадаптированного реассортанта. Структура генов PB1, PB2, PA, M и NS аллантоисного и культурального холодоадаптированного реассортанта была идентична структуре исходных генов, что позволяет сделать вывод о стабильности мутаций, приводящих к замене АК в сегментах PB1, PB2, PA, M и NS данного вируса, выращенного на клетках MDCK(I) и Vero(I) при использовании растительных протеаз и питательных сред на основе гидролизатов рисовой и соевой муки (см. табл. 6).

Таблица Фенотипическая и генетическая стабильность образцов вакцинного штамма A/17/утка/Потсдам/86/92, полученных на клетках MDCK(I) при использовании растительных протеаз и питательных сред на основе гидролизатов риса и сои ts-40- ca+25 Ростовая Фермент в Основные мутации в генах питательная поддержи- фенотип фенотип вакцинного штамма, характерные для среда вающей штамма-прародителя среде А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) PB2- PB1- PA- PA- M- NS 1459• 819• 107• 1045• 969• 798• Трипсин Stem T T C T A A + + Alpha.MDCK Папаин T T C T A A + + +2 % СКПК Бромелаин T T C T A A + + Гидролизат Трипсин T T C T A A + + риса (трипсин) Папаин T T C T A A + + +2 % СКПК Бромелаин T T C T A A + + Гидролизат сои Трипсин T T C T A A + + (трипсин) Папаин T T C T A A + + +2 % СКПК Бромелаин T T C T A A + + Гидролизат сои Трипсин T T C T A A + + (бромелаин) Папаин T T C T A A + + +2 % СКПК Бромелаин T T C T A A + + Исследование репродукции вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Утка/Потсдам/86/92 (H5N2) на клетках Vero(I) и MDCK(I), выращенных в экспериментальных питательных средах, показало, что штамм способен в присутствии трипсина хорошо размножаться, достигая титров, совпадающих с максимальными титрами вируса, выращенного на тех же культурах клеток при использовании контрольных питательных сред. Замена фермента животного происхождения трипсина на растительные протеазы папаин или бромелаин при культивировании вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) на клеточных культурах Vero(I) и MDCK(I), выращенных в присутствии питательных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки, практически не влияет на уровень репродукции вируса при замене трипсина на бромелаин, и приводит к незначительному снижению урожая при использовании папаина.

Изучение ca+25 и ts-40-признаков у вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92, выращенного в присутствии растительной протеазы (папаина или бромелаина) на клетках Vero(I) и MDCK(I), культивируемых в питательных средах на основе растительных гидролизатов, выявило стабильность этих признаков.

Изучение особенностей культивирования вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в роллерах на клеточной линии MDCK с использованием растительных препаратов Технология изготовления культуральных ЖГВ включает этапы наработки клеточного субстрата, получения на клеточном субстрате вирусного материала с высоким титром, его стабилизацию и сублимационное высушивание, каждый из этапов должен быть оптимизирован.

Линии клеток MDCK(I), адаптированные к росту в роллерах в малосывороточных питательных средах на основе растительных гидролизатов, оценивали на предмет их способности продуцировать вакцинный штамм вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) в титрах, достаточных для коммерческой наработки. Выход вируса был исследован в зависимости от условий процесса его размножения, таких как множественность инфекции, вид и концентрация протеазы в поддерживающей среде и время сбора урожая.

Множественность заражения в диапазоне от 0,01 до 1,0 ТЦД50/кл. не влияла на значения инфекционной активности, но влияла на динамику накопления вируса в максимальных титрах. Так, при множественности заражения 0,3 ТЦД50/клетку максимальные урожаи инфекционного вируса для вакцинного штамма в клетках MDCK(I) были получены в присутствии трипсина или бромелаина через 48 ч, дальнейшее культивирование штамма приводило к снижению инфекционных титров, которые через 96 ч после заражения составили 5,9-6,5 lg (рис. 1 А, Б, В).

Следовательно, для производства культуральных ЖГВ необходимо определить Рис. 1. Динамика накопления вируса гриппа A/H5N2 в присутствии различных протеаз при культивировании в клетках MDCK (I), выращенных в экспериментальных и контрольных питательных средах оптимальное время сбора максимального урожая активного вируса для каждого используемого вакцинного штамма.

Полученные результаты показывают, что клетки MDCK(I) активно растут в роллерах в ПС, содержащих гидролизаты риса и сои, полученные с помощью трипсина и бромелаина, при пониженном до 2 % содержании СКПК.

Выращенные таким образом клетки при культивировании в упомянутых средах без сыворотки, в присутствии 4 мкг/мл папаина или 20 мкг/мл бромелаина, эффективно поддерживают продукцию штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 при множественности инфекции от 0,01 до 1,0 ТЦД50/кл.

Для обоснования рекомендаций по практическому применению папаина, бромелаина и ПС на основе растительных гидролизатов при получении вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) на клетках MDCK(I) в роллерах была проверена его фенотипическая и генетическая стабильность при репродукции в присутствии этих препаратов. Структура генов PB1, PB2, PA, M и NS реассортанта была идентична структуре исходных генов, что позволяет сделать вывод о стабильности мутаций, приводящих к замене АК в сегментах PB1, PB2, PA, M и NS генома реассортанта при культивировании на роллерах с использованием растительных препаратов. Культивирование реассортанта в данных условиях не изменяло также и его ts-40- и ca+25- фенотип.

Изучение возможности использования растительных компонентов в составе защитных сред при сублимационном высушивании полученного в перевиваемых клеточных линиях вакцинного штамма вируса гриппа A/17/утка/Потсдам/86/ Одним из факторов, влияющим на качество гриппозной вакцины, является состав защитной среды, используемой при сублимационном высушивании штамма. В данной работе в качестве стабилизаторов для культуральных вакцинных гриппозных образцов были использованы пять различных защитных сред, которые, за исключением сахарозо-желатиновой среды (САЖ), не содержат компонентов животного происхождения. Лиофильное высушивание вакцинных образцов проводили на адсорбционно-криогенном аппарате для сублимационного высушивания биологических материалов, разработанном в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Онищенко Г.Г. и др., 2006). Лучшими защитными свойствами обладал стабилизатор, состоящий из смеси 10 % сахарозы и 5 % ферментативного гидролизата соевой муки (Стабилизатор № 5). Снижение титра образцов с этим стабилизатором составляло 0,5-0,65 lg, что было ниже, чем при использовании САЖ (0,6-0,95 lg). Проверка стабильности образцов через различное время хранения, а также тесты на термостабильность (экспозиция образцов при 37 С в течение 7 сут) подтвердили эффективность защитного состава на основе смеси сахарозы и гидролизата соевой муки для лиофилизации культуральных вакцинных образцов (табл. 7 и 8).

Таблица Биологическая активность сухих культуральных (MDCK) вакцинных образцов, содержащих штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), через различные промежутки времени хранения при температуре 8±2 °С Ростовая Фермент Стабили- Специфическая активность образцов питате- в поддер- затор (lg ТЦД50/мл, М±m, n=3) через … месяцев:

льная живаю- 0 3 6 9 среда щей среде Трипсин САЖ DMEM 8,00 7,80 7,35 7,05 7, ±0,07 ±0,08 ±0,11* ±0,12* ±0,06* ПССБ Бромелаин САЖ 8,50 8,20 7,85 7,65 7, ±0,05 ±0,11 ±0,07* ±0,14* ±0,12* Бромелаин Стабили- 8,80 8,70 8,55 8,40 8, затор ±0,02 ±0,11 ±0,14 ±0,09 ±0,07* № Примечание: М - среднее арифметическое;

m - ошибка среднего;

n - число опытов;

* отличия от соответствующих показателей в начальных точках (0 месяцев) хранения образцов по t-критерию Стьюдента при р0,05.

Использование предложенного стабилизатора, содержащего 10 % сахарозы и 5 % гидролизата соевой муки, полученного с помощью бромелаина, позволяет более эффективно, по сравнению с другими стабилизаторами, проводить высушивание с максимальным сохранением инфекционного титра вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), входящего в состав культуральных вакцинных образцов, наработанных с использованием растительных препаратов. В качестве белкового носителя в стабилизаторе использованы только компоненты растительной природы, что существенно с точки зрения безопасности вакцинного препарата.

Основные этапы предлагаемой нами роллерной технологии приготовления культуральной (MDCK) ЖГВ субтипа A/H5N2 базируются на использовании препаратов растительного происхождения: питательных сред, ферментов и стабилизатора. Проведенное исследование показало, что Таблица Инфекционность культуральных вакцинных образцов, содержащих штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), после лиофильного высушивания и термодеградации Специфическая активность образцов (lg ТЦД50/мл, М±m, n=4) Ростовая Вирус- Вирус- Лиофильно Лиофильно Фермент в Культура питательная содержащая содержащая высушенный высушенный поддерживающей клеток среда жидкость жидкость с вакцинный вакцинный среде на основе добавлением образец образец после стабилизатора термоде градации Гидролизата риса, Папаин 8,50±0,11 8,30±0,07** 7,70±0,11** 6,50±0, полученного трипсином Бромелаин 9,30±0,07 9,00±0,05** 8,30±0,07 7,50±0, Гидролизата сои, Папаин 8,60±0,05 8,50±0,11** 7,50±0,05** 6,40±0, полученного трипсином Бромелаин 9,20±0,06 9,10±0,07** 8,20±0,06 7,40±0, MDCK (I) Гидролизата сои, Папаин 8,40±0,05 8,20±0,06** 7,25±0,06** 6,20±0, полученного бромелаином Бромелаин 9,30±0,12 9,30±0,08** 8,50±0,05 7,50±0, Трипсин 9,50±0,06 9,30±0,05** 8,00±0, DMEM 7,10±0, Гидролизата риса, Папаин 7,80±0,09 7,70±0,06** 6,70±0,05 5,90±0, полученного трипсином Бромелаин 9,30±0,07 9,30±0,05** 8,40±0,06 7,50±0, 6,30±0,09** Гидролизата сои, Папаин 7,50±0,09 7,40±0,06** 5,20±0, полученного трипсином Бромелаин 8,90±0,06 8,90±0,07** 8,00±0,06 7,00±0, Vero(I) Гидролизата сои, Папаин 8,00±0,06 7,90±0,05** 7,00±0,06** 5,90±0, полученного бромелаином Бромелаин 9,10±0,06 9,10±0,07** 8,10±0,06 7,30±0, Трипсин 8,50±0,06 8,40±0,07** 7,30±0,06** 6,20±0, DMEM Примечания: М - среднее арифметическое;

m - ошибка среднего;

n - число опытов;

- в качестве стабилизатора использовали САЖ;

по t критерию Стьюдента: - отличия от соответствующих показателей вируссодержащей жидкости с добавлением стабилизатора при р0,05;

** - отличия от соответствующих показателей лиофильно высушенных образцов после термодеградации при р0,05.

генетические и фенотипические признаки реассортантного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) не изменяются при культивировании в клетках MDCK(I) с использованием растительных препаратов. Однако, известно, что вирусы гриппа могут антигенно отличаться даже в случае полной идентичности АК состава НА, в частности, вследствие различных путей гликозилирования при культивировании в различных системах (Kaverin N.V. et al., 1995;

Katinger D. et al., 2004). Это обстоятельство определило необходимость изучения иммуногенных свойств вакцинного штамма вируса гриппа.

Изучение иммуногенности и протективной активности на лабораторных животных сухих вакцинных образцов, содержащих штамм вируса гриппа A/17/утка/Потсдам/86/92, приготовленных с использованием растительных препаратов Иммуногенность экспериментальных культуральных образцов, содержащих штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), оценивали в соответствии со схемой применения аллантоисной вакцины «Ультрагривак», ранее апробированной нами при проведении ее клинических испытаний. Двукратная с интервалом 10 и 21 сут в дозе 6,5 lg ТЦД50/0,05 мл иммунизация мышей линии CBA образцами, полученными в культуре клеток MDCK(I) в разных условиях, приводила к образованию специфических к гомологичному штамму антител (табл. 9).

Наибольшие титры антител в сыворотке отмечены при введении образцов, наработанных в присутствии бромелаина на клетках MDCK(I), выращенных в ПС с соевой гидролизатной основой. Они были сопоставимы с титрами при иммунизации мышей вакциной «Ультрагривак (см. табл. 9). При использовании и вакцины «Ультрагривак», и экспериментальных образцов, предпочтительнее схема иммунизации с 10-суточным интервалом.

Интересно, что полученные сыворотки обнаруживали активность в РТГА не только с гомологичным вирусом, но и с вирусами гриппа птиц субтипа H5N (штаммы А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 и A/Сhicken/Kurgan/05/2005). Титры антител в этом случае были ниже, чем полученные при использовании в РТГА гомологичного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (A/H5N2), однако они были сравнимы с титрами, выявленными при введении мышам аллантоисной вакцины «Ультрагривак», с данными вирусами (см. табл. 9).

A/H5N Таблица Иммуногенная активность культуральных (MDCK) вакцинных образцов, содержащих штамм A/17/утка/Потсдам/86/92, в опытах на мышах, иммунизированных двукратно с интервалом 10 и 21 сут, в РТГА Условия получения Среднегеометрические титры АТ в сыворотках мышей, иммунизированных экспериментальных образцов экспериментальными образцами, со штаммами вируса гриппа (М±Sm, n=6) Питательная среда Фермент А/17/Утка/Потсдам/86/92 А/Chicken/Suzdalka/Nov- A/Сhicken/Kurgan/05/ на основе (H5N2) 11/2005 (H5N1) (H5N1) 10 сут 21 сут 10 сут 21 сут 10 сут 21 сут Гидролизата риса, Папаин 14,3* 11,3* 10,1* 9,0* 11,3 10, полученного (6,1-33,4) (5,3-24,3) (4,2-24,3) (5,2-15,5) (5,3-24,3) (5,6-18,3) трипсином Бромелаин 64,0* 22,6 22,6 12,7 18,0 16, (33,4-122,7) (15,2-33,7) (10,6-48,5) (7,0-23,0) (10,4-31,1) (8,3-30,7) Гидролизата сои, Папаин 20,2* 22,6 12,7* 9,0* 11,3 8, полученного (13,8-29,3) (10,5-48,5) (7,0-23,0) (5,2-15,5) (7,6-16,9) (4,2-15,3) трипсином Бромелаин 161,3 80,4 28,5 18,0 14,3 14, (66,8-389,2) (33,3-193,7) (12,2-66,7) (7,7-42,0) (7,0-29,1) (10,6-19,2) Гидролизата сои, Папаин 22,6* 22,6 14,3* 9,0* 11,3 10, полученного (10,5-48,5) (6,8-74,8) (7,0-29,1) (6,7-12,1) (4,6-27,6) (6,9-14,7) бромелаином Бромелаин 162,5 80,6 32,0 28,5 14,3 14, (65,7-394,5) (33,4-194,6) (12,8-80,3) (16,5-49,3) (6,1-33,4) (8,2-24,6) Трипсин DMEM 57,0* 32,0 14,3* 14,3 14,3 10, (33,0-98,6) (16,7-61,3) (8,2-24,6) (7,0-29,1) (7,0-29,1) (4,8-21,4) Вакцина гриппозная «Ультрагривак» 181,0 64,0 32,0 25,4 14,3 14, (60,1-545,5) (16,1-254,4) (10,4-98,8) (12,0-53,8) (4,1-49,9) (8,2-24,6) Контроль (плацебо) 2,8* 2,8* 3,2* 2,8* 2,8* 2,6* (1,5-5,2) (1,9-4,2) (1,8-5,8) (1,6-5,4) (1,5-5,5) (1,4-4,2) Примечание: М - среднее арифметическое;

Sm - стандартное отклонение;

n - число опытов;

* - отличия от соответствующих показателей, полученных для вакцины «Ультрагривак», по U-критерию Манна-Уитни при р0,05.

Таблица Иммуногенная активность культуральных (MDCK(I)) вакцинных образцов, содержащих реассортант A/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), в опытах на мышах, иммунизированных двукратно с интервалом 10 сут, по данным в РН Ростовая Среднегеометрические титры АТ в сыворотках мышей, питательная иммунизированных экспериментальными образцами, со среда на основе штаммами вируса гриппа (М±Sm) (n=6) А/17/утка/Потсдам А/Chicken/Suzdalka/ A/Сhicken/Kurgan /86/92 (H5N2) Nov-11/2005(H5N1) /05/2005 (H5N1) Гидролизата 22,6 10,1 6, риса (трипсин) (9,3-55,2) (4,8-21,4) (4,4-9,2) Гидролизата сои 40,3 10,1 10, (трипсин) (16,7-97,3) (3,4-30,1) (6,9-14,7) Гидролизата сои 40,3 10,1 10, (бромелаин) (27,7-58,7) (6,9-14,7) (4,6-24,1) Вакцина 40,3 10,1 10, гриппозная (22,3-73,0) (6,9-14,7) (3,7-27,2) «Ультрагривак» 3,2 2, Контроль 2, (плацебо) (1,5-5,2) (1,5-6,7) (1,9-4,2) Примечания: М - среднее арифметическое;

Sm - стандартное отклонение;

n – число опытов;

*Гидролизат получен с помощью трипсина;

- отличия от показателей, полученных для вакцины «Ультрагривак», по U-критерию Манна-Уитни при р0,05.

Двукратная с интервалом 10 сут в дозе 6,5 lg ТЦД50/0,05 мл иммунизация мышей культуральными вакцинными образцами, полученными в разных условиях, вызывала образование специфических к гомологичному штамму антител, выявляемых в реакции нейтрализации (табл. 10). Как и в РТГА, наибольшие титры антител в сыворотках мышей были обнаружены при введении им экспериментальных образцов, наработанных в присутствии бромелаина на клетках MDCK(I), выращенных в питательных средах на основе соевых гидролизатов. Титры нейтрализующих антител к вирусам субтипа H5N (А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 и A/Сhicken/Kurgan/05/2005) были ниже в 2- раза по сравнению с титрами при использовании гомологичного вируса, но были сравнимы с титрами, выявленными при иммунизации мышей аллантоисной вакциной «Ультрагривак (см. табл. 10).

Двукратное интраназальное введение культуральных вакцинных образцов, содержащих штамм А/17/утка/Потсдам/86/92, с интервалом в 10 сут в дозе 106, ТЦД50 обеспечивало защиту мышей от заражения вирулентным вирусом гриппа птиц A/Сhicken/Kurgan/05/2005(H5N1) в дозе 25 ЛД50 в 71,0-86,7%, что сравнимо с показателями для аллантоисной вакцины «Ультрагривак» (табл. 11).

По показателю средней продолжительности жизни при заражении мышей ЛД50 вируса гриппа значения в группах животных, иммунизированных культуральными образцами и вакциной «Ультрагривак», были сравнимы и достоверно выше, чем в контрольной группе (см. табл. 11).

Изучение изменений иммунного ответа на пептид-белковые конъюгаты под влиянием пептидогликана растительного происхождения Иммуномакс на лабораторных животных.

Универсальные синтетические гриппозные вакцины преимущественно конструируются на основе консервативных последовательностей NP, М2е и НА, так как такие вакцины могут обеспечить перекрстную защиту против многих субтипов вируса гриппа А (Lanying Dua. et al., 2010). Рассматриваются также «родовые» вакцины на основе HA, содержащие консервативные области белка (Palese P., 2006). У НА каждого субтипа есть несколько протяженных консервативных районов в тяжелой (НА1) и легкой (НА2) субъединицах, в которых практически не наблюдается АК замен в процессе дрейфовой эволюции подтипа. Одним из наиболее интересных районов является С-конец НА1, образующий часть «ножки» НА, где для сохранения структурных напряжений необходима высокая консервативность АК.

В работе исследованы иммуногенные свойства конъюгата синтетического пептида, представляющего консервативную последовательность 15 последних С-концевых АК остатков НА1 гемагглютинина субтипа A/H3N2, с бычьим сывороточным альбумином (БСА), а также конъюгат пептида из области антигенного сайта А с БСА (табл. 12).

Таблица Показатели выживаемости мышей, иммунизированных экспериментальными культуральными вакцинными образцами, содержащими штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), и вакциной «Ультрагривак», и контрольных после заражения ЛД50 вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) Количество погибших животных на … сутки после заражения Число СПЖ Доля Характеристика образцов выжив- (сут) выжи Клеточная Среда ших M±Sm вших, линия живот- КЗ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ных к (%) 14 сут ПСРТ (n=30) 0 0 0 0 0 0 2 3 1 0 0 0 0 12,77±2,53* 80, MDCK(I) ПССТ (n=30) 0 0 0 0 0 0 0 4 1 0 0 0 0 13,03±2,20* 83, ПССБ (n=30) 0 0 0 0 0 0 0 3 1 0 0 0 0 13,23±1,99* 86, ПСРТ (n=31) 0 0 0 0 0 0 3 4 2 0 0 0 0 12,17±2,88* 71, Vero(I) ПССТ (n=30) 0 0 0 0 0 0 1 3 3 0 0 0 0 12,67±2,48* 76, ПССБ (n=30) 0 0 0 0 0 0 2 4 2 0 0 0 0 12,40±2,72* 73, Вакцина гриппозная 0 0 0 0 0 0 1 2 1 0 0 0 0 13,20±2,09* 86, «Ультрагривак» (n=30) Контроль (плацебо) (n=30) 0 0 0 0 0 1 5 14 10 0 0 0 0 0 8,10±0,80 Примечания: М - среднее арифметическое;

Sm – стандартное отклонение;

n-число животных в группе;

- отличие от контроля по критерию 2;

* - отличие от контроля по U-критерию Манна-Уитни при p0,05.

Таблица Влияние пептидогликана растительного происхождения Иммуномакс на активность антипептидных сывороток в реакции нейтрализации (М±m, n=6) Сыворотка Титры вирусов (lg ТЦД50/мл) в присутствии сывороток против A/PR/8/34 A/Aichi/2/68 А/Англия/42 А/ПортЧалмерс (H1N1) (H3N2) /72 (H3N2) /1/73 (H3N2) Нормальная 8,50±0,11 7,80±0,05 5,20±0,06 4,50±0, БСА+ адъювант 8,30±0,12 7,50±0,09 5,00±0,05 4,00±0, Фрейнда Иммуномакс 7,80±0,11 7,10±0,06 4,40±0,06 4,00±0, БСА+Иммуномакс 7,50±0,05 6,70±0,06 4,20±0,07 3,30±0, 3,50±0,07 4,50±0, 8,50±0,12 4,00±0, (136-147)-БСА+ адъювант Фрейнда 2,00±0, 7,70±0,06 3,90±0,06 3,40±0, (136-147)-БСА+ Иммуномакс 4,50±0,12 2,50±0, 8,20±0,05 2,00±0, (314-328)-БСА+ адъювант Фрейнда 3,25±0,05 1,70±0, 7,80±0,11 1,50±0, (314-328)-БСА+ Иммуномакс 3,00±0,11 2,35±0,12 1,75±0, 8,30±0, (136-147)-БСА+ (314-328)-БСА+ адъювант Фрейнда 1,75±0,12 1,60±0, 7,85±0,09 1,00±0, (136-147)-БСА+ (314-328)-БСА+ Иммуномакс 0 1,00±0,13 1,20±0, 8,0±0, A/Aichi/2/ Примечания: М - среднее арифметическое;

m - ошибка среднего;

n - число опытов;

отличия от соответствующих показателей при БСА+Иммуномакс, - отличия от соответствующих показателей с Иммуномаксом по t - критерию Стьюдента при р0,05.

В связи с тем, что большинство синтетических антигенов являются слабыми иммуногенами по сравнению с более сложными природными, для повышения иммунного ответа на пептидные конъюгаты в работе использовали иммуномодулятор Иммуномакс, представляющий собой кислый пептидогликан растительного происхождения, обладающий иммуноадъювантным эффектом.

Двукратное внутрибрюшинное введение Иммуномакса в дозах 20 и 5 мкг одновременно с первичной и вторичной иммунизацией животных конъюгатами без адъюванта Фрейнда вызывало достоверное повышение нейтрализующего эффекта сывороток, полученных на конъюгаты в сочетании с адъювантом Фрейнда (см. табл. 12). При введении в пептидный препарат Иммуномакса достоверно возрастали доля выживших мышей, зараженных вирусом гриппа A/Aichi/2/68, (табл. 13) и средняя продолжительность их жизни (табл. 14).

Таблица Влияние Иммуномакса на устойчивость мышей, иммунизированных пептид белковыми конъюгатами, к заражению вирусом гриппа A/Aichi/2/ (по % выживаемости) (М±m, n=6) Выживаемость мышей (%) после введения иммуногена и:

Иммуномакс при введении 0,9 %-ный Иммуноген раствор NaCl внутрибрюшинно внутримышечно внутрикожно двукратно двукратно однократно Контроль (неиммунные 8,05±0,35 8,10±1,41 7,85±1, 1,67±1, мыши) Контроль 2 2,18±0,59 8,67±1,47 8,50±1,45 8,25±1, (БСА) 30,00±0,87 45,00±1,05 44,07±1,25 41,96±1, (136-147)-БСА 15,00±1,37 27,50±1,09 28,40±1,96 26,05±0, (314-328)-БСА Смесь:

35,00±2,83 55,00±2,15 50,50±0,89 49,13±1, (136-147)-БСА и (314-328)-БСА Примечания: М-среднее арифметическое;

m- ошибка среднего;

n- число опытов;

отличия от соответствующих показателей при БСА, - отличия от соответствующих показателей без Иммуномакса по t-критерию Стьюдента при p0,05.

Использование в экспериментах на мышах других схем введения Иммуномакса с синтетическими антигенами, а именно: двукратное внутримышечное введение препарата в дозах 40 и 1 мкг при первичной и повторной иммунизации конъюгатами пептид-БСА, соответственно, или однократное внутрикожное введение препарата после повторной иммунизации пептидами за 24 ч до заражения вирусом гриппа, также приводило к достоверному повышению устойчивости животных к гриппозной инфекции по сравнению с использованием конъюгатов, сочетано введенных с адъювантом Фрейнда (см. табл. 13 и 14). При однократном внутрикожном введении Иммуномакса для достижения защитного эффекта, аналогичного таковому при использовании двукратного внутрибрюшинного или внутримышечного введения, потребовалась уменьшенная в 2,5 и 4,1 раза, соответственно, доза Иммуномакса (10 мкг на мышь). Более выраженный эффект при всех способах введения Иммуномакса наблюдался при иммунизации животных смесью двух конъюгатов: (136-147)- БСА и (314-328)-БСА совместно с препаратом, по сравнению с применением одного конъюгата (см. табл. 12, 13 и 14).

Таблица Усиление защиты мышей, иммунизированных конъюгатами пептид-БСА, от гриппозной инфекции под влиянием Иммуномакса (М±m, n=6) Средняя продолжительность жизни (сутки) после введения иммуногена и:

Иммуноген Иммуномакс при введении:

0,9 %-й раствор внутрибрюшин внутримышечно внутрикожно NaCl но двукратно двукратно однократно Контроль (неиммунные 6,25±0,43 8,15±0,52 8,05±0,56 7,55±0, мыши) Контроль 2 6,45±0,43 8,54±0,77 8,13±0,09 7,85±0, (БСА) 10,40±0,12 12,40±0,36 11,95±0,12 11,65±0, (136-147)-БСА 9,00±0,12 11,14±0,72 10,75±0,13 10,40±0, (314-328)-БСА Смесь:

11,08±0,52 13,10±0,79 12,65±0,07 12,25±0, (136-147)-БСА и (314-328)-БСА Примечания: М - среднее арифметическое;

m - ошибка среднего;

n - число опытов;

отличия от соответствующих показателей с БСА, - отличия от соответствующих показателей с Иммуномаксом по t - критерию Стьюдента при p0,05.

В целом эксперименты на мышах демонстрируют отчетливый иммунноадъювантный эффект Иммуномакса при сочетанном применении с синтетическими пептидами, конъюгированными с БСА, позволяющий заменить им адъювант Фрейнда, обычно используемый в экспериментах на животных.

Использование нетоксичного растительного иммуномодулятора Иммуномакс позволяет уменьшить дозу иммуноадъюванта и сократить число иммунизаций конъюгатами. Так, для достижения выраженного иммунологического ответа на пептиды в опытах с Иммуномаксом требовалось только две иммунизации, тогда как для обеспечения такого же уровня иммунологической активности пептидов, введенных с адъювантом Фрейнда, необходимы три иммунизации. Иммуномакс может быть использован для совершенствования вакцинопрофилактики гриппа с помощью синтетических пептидов.

ВЫВОДЫ 1. Разработана питательная среда на основе гидролизата сои, полученного с использованием растительной протеазы бромелаина, с низким содержанием сыворотки (2 % и 3 %), для перевиваемых линий клеток MDCK и Vero, являющихся субстратом культуральной гриппозной вакцины.

2. Показана пригодность питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои и риса, полученных с помощью трипсина и бромелаина, для наработки перевиваемых линий клеток MDCK и Vero. Использование экспериментальных сред не приводит к изменению пролиферативных, морфологических и кариологических характеристик культур клеток, а также их чувствительности к штаммам вируса гриппа, используемым для производства инактивированной и живой гриппозной вакцины по сравнению с контролем.

3. Установлена возможность замены трипсина на растительные протеазы папаин и бромелаин в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои и риса, и определены оптимальные условия их применения для максимального накопления в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero штаммов вируса гриппа, используемых для производства инактивированной и живой гриппозной вакцины.

4. Показано, что использование экспериментальных сред на основе ферментативных растительных гидролизатов и растительных протеаз не влияет на морфогенез и репродуктивную активность вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) при культивировании его в клетках MDCK и Vero.

5. Разработан стабилизатор, содержащий 10 % сахарозы и 5 % гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина, и показана возможность его использования для сохранения в процессе лиофильного высушивания и в течение 1 года хранения максимального инфекционного титра выращенного в перевиваемой линии клеток MDCK холодоадаптированного вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2).

6. Впервые определены технологические приемы использования растительных препаратов (питательная среда на основе гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина;

растительная протеаза бромелаин;

стабилизатор на основе сахарозы и гидролизата сои) на основных стадиях разработки живой культуральной гриппозной вакцины субтипа A/H5N2 в роллерах.

7. Установлено, что использование растительных препаратов при получении лиофильно высушенных образцов вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2 не влияет на его генетическую и фенотипическую стабильность, а также на иммуногенность для лабораторных животных. Штамм индуцирует образование системных и секреторных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вариантам вируса гриппа птиц A/H5N1.

8. Растительный иммуномодулятор Иммуномакс при сочетанном использовании с синтетическими пептидами из вариабельного и консервативного сайтов тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа A/H3N усиливает иммунный ответ на пептиды у лабораторных животных, показаны его адъювантные свойства.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК:

1. Мазуркова Н.А., Исаева Е.И., Подчерняева Р.Я. Пептидное картирование моноклональных антител к тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа H3N // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2006. - № 4. – С.

19-23.

2. Онищенко Г.Г., Мазуркова Н.А., Трошкова Г.П., Радаева И.Ф., Мартынец Л.Д., Сумкина Т.П., Ким И.И., Нечаева Е.А., Дроздов И.Г. Оптимизация технологии производства живой культуральной противогриппозной вакцины с использованием питательной среды на основе гидролизатов белков растительного происхождения // Биотехнология. - 2007. - № 3. - С. 31-37.

3. Мазуркова Н.А., Трошкова Г.П., Радаева И.Ф., Нечаева Е.А., Дроздов И.Г.

Использование растительной протеазы при разработке живой культуральной гриппозной вакцины // Биотехнология. – 2008. - № 3. – С. 63-69.

4. Мазуркова Н.А., Трошкова Г.П., Сумкина Т.П., Колокольцова Т.Д., Скарнович М.О., Кабанов А.С., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н. Сравнительный анализ репродукции штаммов вируса гриппа в перспективных для производства культуральных вакцин клеточных линиях при использовании питательной среды на основе гидролизата белков рисовой муки // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2008. - № 4. - С. 234-238.

5. Мазуркова Н.А., Рябчикова Е.И., Трошкова Г.П., Гетманова Т.Н., Сумкина Т.П., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н. Изучение морфологических и пролиферативных характеристик клеток Vero и MDCK при культивировании в питательных средах на основе гидролизатов растительных белков // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2009. - № 2. – С. 117-120.

6. Данлыбаева Г.А., Мазуркова Н.А., Матюшина Р.О., Трошкова Г.П., Подчерняева Р.Я. Питательная среда на основе гидролизата рисовой муки для культивирования клеток и определение чувствительности к вирусам гриппа // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2009. - № 2. – С. 113-116.

7. Мазуркова Н.А., Дешева Ю.А., Рябчикова Е.И., Терновой В.А., Трошкова Г.П. Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н., Руденко Л.Г. Репродукция холодоадаптированного вакцинного штамма вируса гриппа H5N2 в клеточных культурах MDCK и Vero при использовании растительных протеаз и питательных сред на основе гидролизатов рисовой и соевой муки // Биотехнология. - 2010. - № 1. - С. 68-76.

8. Мазуркова Н.А., Рындюк Н.Н., Шишкина Л.Н., Терновой В.А., Туманов Ю.В., Булычев Л.Е., Скарнович М.О., Кабанов А.С., Панченко С.Г., Алейников Р.П., Ильина Т.Н., Кузубов В.И., Мельников С.Я., Миронов А.Н., Коровкин С.А., Сергеев А.Н., Дроздов И.Г. Результаты клинических испытаний реактогенности, безопасности и иммуногенности гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Ультрагривак» (тип A/H5N2) // Вестник РАМН. - 2010 - №. 3. - С. 15 - 20.

9. Исаева Е.И., Мазуркова Н.А., Скарнович М.О., Трошкова Г.П., Шишкина Л.Н., Подчерняева Р.Я. Оптимизация роллерного культивирования вакцинных штаммов вирусов гриппа А и В в культурах клеток MDCK и Vero при использовании компонентов растительного происхождения // Биотехнология. 2010. - № 6. - С. 21-27.

(Isaeva E.I., Mazurkova N.A., Skarnovich M.O., Troshkova G.P., Shishkina L.N., and Podchernyayeva R.Ya. Optimization of Roller Culturing of Influenza Virus Vaccine Strains in MDCK and Vero Cell Cultures using Plant Origin Components // Applied Biochemistry and Microbiology. – 2011. – V. 47. - № 8. – P. 737-743).

10. Исаева Е.И., Мазуркова Н.А., Подчерняева Р.Я. Иммуногенность синтетических фрагментов из области вариабельных и консервативного сайтов тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа H3N2 // Биотехнология. - 2011. № 1. - С. 14-22.

(Isaeva E.I., Mazurkova N.A., Podchernyayeva R.Ya. Immunogenicity of Synthetic Fragments Corresponding to Variable and Concervative Sites of H3N2 Influenza Virus Hemagglutinin Heavy Chain //Applied Biochemistry and Microbiology. – 2011. – V. 47. - № 8. – P. 723-729).

11. Михайлова Г.Р., Мазуркова Н.А., Подчерняева Р.Я., Рябчикова Е.И., Трошкова Г.П., Шишкина Л.Н. Морфологическая и кариологическая характеристики клеток MDCK и Vero(В) при культивировании в питательных средах на основе растительных гидролизатов // Вопросы вирусологии. - 2011. № 2. - С. 9-14.

12. Мазуркова Н.А., Трошкова Г.П., Шишкина Л.Н., Ставский Е.А., Дроздов И.Г.

Создание питательной среды на основе гидролизата сои, полученного с использованием бромелаина, для клеток MDCK и Vero и оценка в них ростовых свойств вакцинных штаммов вируса гриппа // ЖМЭИ. – 2011. - № 1.

– С. 86-90.

13. Мазуркова Н.А., Дешева Ю.А., Шишкина Л.Н., Ставский Е.А., Руденко Л.Г.

Использование растительных компонентов в роллерном культивировании вакцинного реассортантного штамма вируса гриппа H5N2 // ЖМЭИ. – 2011. № 2. – С. 88-92.

14. Мазуркова Н.А., Дешева Ю.А., Шишкина Л.Н., Ставский Е.А., Руденко Л.Г.

Иммуногенность образцов вакцинного штамма вируса гриппа H5N2, полученных при роллерном культивировании в средах с растительными компонентами // ЖМЭИ. – 2011. - № 3. – С. 48-52.

15. Шишкина Л.Н., Мазуркова Н.А., Терновой В.А., Булычев Л.Е., Туманов Ю.В., Скарнович М.О., Кабанов А.С., Рындюк Н.Н., Кузубов В.И., Миронов А.Н., Ставский Е.А., Дроздов И.Г. Оценка иммуногенности и безопасности гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Ультрагривак» при двукратной иммунизации // ЖМЭИ. – 2011. - № 4. – С. 92-96.

16. Исаева Е.И., Мазуркова Н.А., Подчерняева Р.Я. Сравнительное изучение иммуногенности культуральных и пептидных противогриппозных вакцин // ЖМЭИ. – 2011. - № 5. – С. 44-50.

Патенты:

1. Сандахчиев Л. С., Нечаева Е. А., Вараксин Н. А., Рябичева Т. Г., Мазуркова Н. А., Гендон Ю. З., Маркушин С. Г., Акопова И. И., Коптяева И. Б. Способ получения живой культуральной вакцины против вируса гриппа // Патент РФ № 2330885, опубл. в БИ № 22 от 10.08.2008.

2. Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д., Сумкина Т.П., Мазуркова Н.А. Питательная среда для культивирования клеток млекопитающих // Патент РФ № 2377295, опубл. в БИ № 36 от 27.12.2009.

Статьи в журналахи других изданиях:



Pages:   || 2 |
 


Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.