авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Роль мембранных рецепторов в сигнальных механизмах в клетках нейрональной природы

На правах рукописи

КУЛИКОВ Андрей Валентинович РОЛЬ МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ В СИГНАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМАХ В КЛЕТКАХ НЕЙРОНАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007

Работа выполнена в ГУ НИИ неврологии РАМН (г. Москва).

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Ланкин Вадим Зиновьевич доктор биологических наук профессор Гомазков Олег Александрович

Ведущая организация:

Институт биохимии РАН им А.Н. Баха

Защита диссертации состоится 20 апреля 2007 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, г. Москва, ул. Миклухо Маклая, д.

Автореферат разослан «_» _ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203. доктор биологических наук, профессор Лукашева Е.В.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Na/K-насос и глутаматные рецепторы представляют собой две стороны обеспечения функций глутаматергической нейрональной клетки. Первый поддерживает асимметричное распределение ионов натрия и калия по обе стороны нейрональной мембраны, создавая основу для генерации потенциала возбуждения, а вторые являются инициаторами процесса возбуждения, реализующего ионные градиенты. Накоплен ряд данных, свидетельствующих о том, что Na/K-ATФаза выступает как рецептор кардиотонических стероидов (КТС) типа уабаина, включаясь в сигнальные каскады клетки (McConkey et al, 2000;

Saunders & Scheiner-Bobis G., 2004;

Kometiani et al, 2005). В свою очередь, глутаматные рецепторы влияют на активность Na/K-ATФазы (Boldyrev et al, 2002).

КТС синтезируются в организме в небольших количествах, которые способны действовать на изоформы Na/K-ATФазы чувствительного типа (2 и 3), запускают сигнальные механизмы без изменения ионного гомеостаза клетки (Scheiner-Bobis & Schoner, 2002). Эти сигнальные механизмы реализуются в активации транскрипционных факторов NF-B и AP-1, экспрессии генов и синтезе белка (Peng et al, 1996;

Huang et al, 1997). В настоящей работе мы исследовали взаимодействие Na/K-ATФазы и глутаматных рецепторов в клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y и в нейронах мышей SAMP1, характеризующихся повышенным уровнем активных форм кислорода (АФК), что соответствует состоянию тканевого окислительного стресса (Takeda (ed), 1998, Болдырев с соавт, 2003).

Цель работы: Изучение участия Na/K-АТФазы, глутаматных рецепторов NMDA-класса и метаботропных рецепторов в проведении внутриклеточных сигналов;

выяснение их роли в регуляции клеточного метаболизма и значения для жизнеспособности нейрональной клетки, а также нахождение новых особенностей механизмов взаимодействия этих систем.

Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) Определение изоформного состава Na/K-АТФазы и субъединиц NMDA рецепторов в клетках нейробластомы SH-SY5Y.

2) Оценка влияния Na/K-АТФазы и NMDA-рецепторов на внутриклеточный уровень ионов кальция и АФК в клетках нейробластомы SH-SY5Y.

3) Выявление внутриклеточных белков-посредников, участвующих в механизмах клеточной сигнализации, реализующихся при участии Na/K-АТФазы и NMDA рецепторов в клетках нейробластомы SH-SY5Y.

4) Оценка жизнеспособности клеток нейробластомы SH-SY5Y при блокаде Na/K ATФазы уабаином и действии токсических концентраций NMDA.

5) Определение типа клеточной смерти (некроз или апоптоз) при ингибировании Na/K-АТФазы уабаином на клеточной линии РС-3.

6) Сопоставление уровня АФК и темпов гибели нейронов мозжечка быстростареющих мышей линии SAMP (Senescence Accelerated Mice) при активации глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов.

Научная и практическая новизна работы. Представленные данные показывают, что Na/K-АТФаза вовлекается в систему внутриклеточной сигнализации нейробластомы SH-SY5Y в качестве регулятора клеточного метаболизма и жизнеспособности этих клеток. В клеточной культуре нейробластомы SH-SY5Y присутствуют все 3 типа изоформ Na/K-АТФазы. При ингибировании АТФазы уабаином наблюдается увеличение уровня АФК и внутриклеточных ионов кальция, которые, вероятно, участвуют в передаче сигналов в качестве вторичных мессенджеров. На клетках нервного происхождения впервые получены данные об активации Na/K-АТФазой сигнальных путей с участием протеинкиназ p42/44 MAPK и PKB. Впервые обнаружено, что действие уабаина приводит к фосфорилированию белка Bad, что приводит к подавлению его проапоптозного действия. Одновременно выявлена активация ряда внутриклеточных посредников, участвующих в развитии апоптоза в этих клетках – снижается доля активных (фосфорилированных) белков Bcl-2 и Bcl-xL, подавляющих выход цитохрома С из митохондрий;

в цитоплазме появляется цитохром C, активируется каспаза 3 и белок р53. Два противоположных пути регуляции характеризуются различной чувствительностью к уабаину: первый выявляется при низких, а второй – при высоких (1 мкМ и выше) концентрациях этого лиганда.

Показано, что в клетках нейробластомы SH-SY5Y присутствует NR субъединица NMDA-рецепторов, но инкубация клеток с NMDA не приводит к увеличению уровня АФК и ионов Ca2+. Тем не менее, в этих условиях активируются p42/44 MAPK и PKB киназы. Возможно, что именно NR субъединица NMDA-рецепторов ответственна за их сигнальную функцию.

Данные, полученные на мышах линии SAMP, демонстрируют регулирующее действие метаботропных глутаматных рецепторов на NMDA-рецепторы, выражающееся в том, что метаботропные рецепторы I группы ослабляют, а III группы усиливают токсическое действие NMDA.

Обнаруженные закономерности помогают уточнить молекулярные механизмы сигнальной функции Na/K-АТФазы и рецепторов глутаматергической системы в нервных клетках.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на 10-м Международном симпозиуме по фармакологии церебральной ишемии (Марбург, Германия, июль 2004), на экологической конференции в РУДН (Москва, май 2004), на 20 съезде Международного нейрохимического сообщества (Инсбрук, Австрия, август 2005), на физиологической конференции в Университете им. Юстуса Либиха (Гиссен, Германия, март 2006), на 5-м симпозиуме европейских нейрохимических сообществ (Вена, Австрия, июль 2006), на лабораторном семинаре в институте неврологии РАМН (Москва, сентябрь 2006), на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ им М.В. Ломоносова (Москва, октябрь 2006).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 4 тезисных сообщения.

Объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного свойствам Na/K-ATФазы и рецепторов глутаматергической системы, описания материалов и используемых методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы (264 ссылки). Общий объем работы – 143 страницы, в том числе 43 рисунка и 6 таблиц.

Общее содержание работы Материалы и методы исследования В качестве объекта исследования в работе использовались культуры клеток нейробластомы SH-SY5Y (ATCC, USA) и карциномы простаты РС-3, поддерживающиеся согласно протоколу производителя, и первичная культура нейронов, выделенных из мозжечка быстростареющих мышей линии SAMP, получаемая обработкой диспазой (Oyama et al, 1996;

Болдырев, 2000). Выделение мРНК и полимеразную цепную реакцию для определения изоформ Na/K-АТФазы и субъединиц NMDA-рецепторов проводили с помощью набора QIAGEN RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany) согласно протоколу производителя. Определение количества белка для Вестерн-блота производили с помощью специального набора BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, USA). Электрофорез в полиакриламидном геле и вестерн блоттинг проводили по стандартной процедуре.

Для специфического окрашивания белков использовали антитела фирмы “Cell Signaling” (Germany). Определение уровня внутриклеточного кальция, АФК и типа клеточной смерти проводили методом проточной цитометрии на приборе FACSCalibur (BD Biosciences, USA), результаты анализировали с помощью программы WinMDI 2.7 (Scripps Institute, LaJolla, USA). В качестве маркеров использовали специфические флуоресцентные зонды – Fluo-3-AM (Calbiochem, Schwalbach, Germany) для определения внутриклеточного кальция, DCF-DA (Invitrogen, Germany) для определения уровня АФК;

для определения типа клеточной смерти применяли комбинированное окрашивание клеток PI (некрозные клетки) и аннексином V FITC (апоптозные клетки) (Invitrogen, Germany).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Statistica, GraphPadPrism 4.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. УЧАСТИЕ Nа/K–АТФазы В СИГНАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМАХ КЛЕТОК НЕЙРОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА SH-SY5Y Определение изоформного состава Na/K–АТФазы в клетках нейробластомы SH-SY5Y В возбудимых тканях Na/K–АТФаза экспрессируется в виде нескольких изоформ, различающихся по чувствительности к переносимым ионам, АФК, а также к гормонам и гормоноподобным соединениям, например, к уабаину (Huang et al, 1992;

Urayama et al, 1989).

600 bp 500 bp 400 bp a1 a2 a3 a1 a2 a3 GAPDH 40 PCR 36 PCR циклов циклов Рис. 1. Изоформный состав Na/K–АТФазы в клетках нейробластомы SH-SY5Y Исходя из этого, мы решили выяснить, какие изоформы фермента экспрессируются в клетках нейробластомы SH-SY5Y. Из клеток была выделена ДНК, и с помощью реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (rt PCR) было показано, что в данной клеточной культуре присутствуют все 3 изоформы фермента (Рис. 1).

Изоформы Na/K–АТФазы различаются по содержанию и локализации сульфгидрильных групп в первичной структуре. Изоформа 1 относительно резистентна к уабаину и более устойчива к свободнорадикальному окислению, она взаимодействует с этим гликозидом при его концентрации свыше 10-6 М;

(2+3) изоформы, чувствительные к уабаину (взаимодействуют с этим лигандом при его концентрации 10-9-10-6 М), содержат более доступные для модификации SH-группы и окисляются АФК в первую очередь (Atterwill et al, 1984;

Болдырев, 1996;

Xie et al, 1999). Специфичная для нейрональных клеток изоформа 3 является доминирующей, 2-изоформа слабо представлена в клетках нейробластомы SH SY5Y (ее содержание составляет около 10 % от уровня 1).

Уабаин увеличивает уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейробластомы SH-SY5Y Уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейробластомы SH-SY5Y в наших опытах определялся после 30 мин ингибирования Na/K–АТФазы различными концентрациями уабаина. Максимальная его концентрация составляла 10-5 М, при этом ингибировались и чувствительные и резистентные изоформы Na/K–АТФазы. Уабаин в концентрациях 10-5 - 10-6 М вызывал достоверное увеличение уровня внутриклеточного кальция (на 25-30% от исходного уровня), при концентрации уабаина 10-7-10-8 М отличия от контроля были недостоверны (Рис. 2).

Для оценки роли внеклеточного кальция в регистрируемом эффекте мы вводили в среду инкубации 1 мМ кальциевого хелатора ЭГТА. Совместное присутствие уабаина и ЭГТА не приводило к повышению ионов кальция внутри клеток, следовательно, кальциевый сигнал в присутствии уабаина был обусловлен поступлением этого иона из внеклеточного пространства. Вероятно, подавление Na/K–АТФазы уабаином приводило к накоплению ионов натрия в клетках и активировало работу Na/Ca-обменника. Исходя из того, что выявление этого эффекта (достоверность отличий от контроля) обнаруживалось при высоких концентрациях уабаина, можно предположить, что за эффект ответственны резистентные изоформы Na/K-ATФазы.

Уровень внутриклеточного кальция, % * * 120 EGTA * * Контроль 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM EGTA 1 мкМ EGTA 1 мкМ EGTA 1 мкМ + + уабаин 1 уабаин * - Звездочкой помечены данные, достоверно отличающиеся от контроля мкМ мкМ Рис. 2. Влияние уабаина на уровень внутриклеточного кальция (измерено по флуоресценции Fluo-3-AM) Ингибирование Na/K–АТФазы уабаином вызывает и рост внутриклеточного уровня активных форм кислорода (АФК). Видно, что за 30 мин инкубации уабаин вызывает рост уровня АФК концентрационно-зависимым способом, статистически достоверные отличия от контроля отмечены начиная с концентрации 100 нМ, то есть при концентрации, не вызывающей роста уровня ионов кальция внутри клетки. Максимальное увеличение уровня АФК наблюдалось при действии 10 мкМ уабаина и составляло 50% от контроля. В присутствии кальциевого хелатора ЭГТА изменения уровня АФК были пропорциональны исходным, таким образом, генерация свободных радикалов исследуемыми клетками в присутствии уабаина имеет Са-независимую природу.

* EGTA * Уровень АФК, % * * Контроль 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM EGTA 1 EGTA 1 EGTA мкМ мкМ + мкМ + уабаин 1 уабаин * - Звездочкой помечены данные, достоверно отличающ иеся от контроля мкМ 10 мкМ Рис. 3: Влияние уабаина на уровень АФК в клетках SH-SY5Y (измерено по флуоресценции DCF-DA) Согласно многочисленным данным литературы (Xie Z. & Askari A., 2002) АФК способны активировать в нейронах различные тирозинкиназы и стимулировать «нисходящие» сигнальные системы, включающие p42/44 MAPK и фосфолипазу С (PLC). Активация PLC приводит к увеличению уровня кальция, как из внутриклеточного пула, так и из внешнего пространства клетки (Kamata & Hirata, 1998;

Mikoshiba, 1997). Можно заключить, что сигнальные механизмы Na/K– АТФазы на клетках нейробластомы SH-SY5Y реализуются с помощью как ионов кальция, так и АФК, причем их продукция может регулировать активность внутриклеточных белков, участвующих в сигнальных каскадах.

Активация уабаином внутриклеточных белков-посредников в клетках SH SY5Y Активацию (фосфорилирование) белков, являющихся внутриклеточными передатчиками сигнала, мы измеряли методом вестерн-блоттинга, детектируя искомые белки по связыванию со специфическими антителами. Таким способом определялось общее количество нужных белков, а также отдельно их фосфорилированная фракция. Мы изучали вовлеченность белков-посредников в реализацию сигнальных механизмов с участием Na/K–АТФазы, инкубируя клетки с разными концентрациями уабаина в течение 30 мин, а также 6 ч и 24 ч. Через мин инкубации активации внутриклеточных посредников не происходило, тогда как через 6 ч инкубации выявлялось уабаин-зависимое фосфорилирование ряда сигнальных белков, свидетельствующее о сигнальных свойствах Na/K–АТФазы.

Каждый эксперимент имел не менее 3 повторов, данные на графиках представлены в виде means ± SEM;

* = p 0,05.

Активация уабаином р42/44 MAPK (Erk1/2) протеинкиназы.

Активация р42/44 MAPK киназы ассоциируется с ранними стадиями передачи сигнала и является ключевым событием в пролиферации и дифференцировке клеток (Davis, 1993). Мы установили, что под действием уабаина за 6 ч и 24 ч инкубации происходит активация р42/44 MAPK киназы, наиболее изученного внутриклеточного регулятора. Рис. 4-А демонстрирует детекцию на нитроцеллюлозной мембране суммарного белка (общая р42/44 MAPK), на Рис. 4-Б представлен сигнал фосфорилированной фракции р42/44 MAPK.

Общая р42/44 MAPK A 44 kDa 42 kDa Уабаин Контроль 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM Б Фосфо р42/44 MAPK % * * 44 kDa 42 kDa * Уабаин Контроль 15010 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM Контроль 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM В Рис. 4. р42/44 MAP киназа в клетках нейробластомы SH-SY5Y. A – Общая р42/44 MAPK, Б – фосфо р42/44 MAPK, В – зависимость интенсивности сигнала фосфо р42/44 MAPK на мембране от концентрации уабаина в процентах к контролю (для всех значений means ± SEM;

*=p0,05, n = 3;

время инкубации 6час).

На Рис. 4-В представлен сигнал фосфо- р42/44 MAPK в численном выражении, полученном при анализе фотографий мембраны с помощью компьютерной программы Total Lab. График отображает отношение числового значения интенсивности фосфо- р42/44 MAPK к значению общей р42/44 MAPK. При неизменности сигнала р42/44 MAPK для всех проб, сигнал ее фосфорилированной фракции растет в соответствии с ростом концентрации уабаина в пробе.

Достоверный рост этого сигнала наблюдается при концентрациях уабаина 100 нМ и выше, при этом максимально сигнал увеличился почти в 3,5 раза.

Активация протеинкиназы В (PKB, Akt киназы) под действием уабаина.

Через 6 часов инкубации с уабаином в клетках нейробластомы SH-SY5Y обнаруживается активация протеинкиназы В, происходящая дозо-зависимым образом. Известно, что РКВ играет важную роль в процессах внутриклеточной сигнализации, активируя пути «выживаемости» и препятствуя апоптозной гибели клетки. Обнаруженное нами увеличение сигнала фосфорилированной фракции PKB было не столь значительно, как для р42/44 MAPK - максимальный рост активной РКВ составил 20-30% от контрольного уровня, и выявлялся при более высоких концентрациях уабаина, чем в случае р42/44 MAPK (Рис. 5).

% * * Контроль 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM Рис. 5: PKB в клетках нейробластомы SH-SY5Y. A – общая PKB, B – фосфо PKB (Ser473), С – график зависимости интенсивности сигнала фосфо PKB на мембране от концентрации уабаина. На графике для всех значений n = 3;

means ± SEM;

*=p0,05. Время инкубации час.

Активация уабаином про- и антиапоптозных белков.

На ряде биологических моделей показано, что ингибирование Na/K–АТФазы вызывает апоптоз (Викторов и соавт., 1996). Мы решили оценить участие сигнальных механизмов Na/K–АТФазы в принятии клеткой решения о жизни или смерти на модели нейробластомы SH-SY5Y в присутствии разных концентраций уабаина. Принятие клеткой решения об апоптозной гибели основывается на смещении баланса про- и антиапоптозных сигнальных белков. В то время как участие p42/44 MAPK (Saunders et al, 2004;

Kometiani et al, 2005) и PKB (Zhou et al, 2001) в сигнальных механизмах Na/K–АТФазы описано на различных клеточных культурах, участие белков, связанных с развитием апоптоза ранее не исследовалось.

Белок Bad в нормальном состоянии клетки находится в неактивной фосфорилированной форме. При стимуляции апоптоза Bad дефосфорилируется и связывается на внешней митохондриальной мембране с белком Bcl-xL, тем самым ингибируя его антиапоптозное действие (снимая его блокирующее действие на выход цитохрома С из митохондрий) (Zha et al, 1996, 1997). После связывания Bad с митохонриальной мембраной цитохром С выходит в цитоплазму, связывается в апоптосомный комплекс с адаптерным белком Apaf-1, который и индуцирует активацию каспазного каскада. Таким образом, белки Bcl-2 и Bcl-xL относятся к антиапоптозным, а белки Bad, цитохром С и каспазы к проапоптозным.

Мы показали, что в клетках нейробластомы SH-SY5Y под действием уабаина происходит фосфорилирование белка Bad (Рис. 6), и этот эффект достоверно проявляется при концентрациях уабаина 100 нМ и выше. Максимально при 10 мкМ фосфорилирование Bad увеличивается в 2,5 раза.

% * * * Контроль 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM Рис. 6: Зависимость интенсивности сигнала фосфо-Bad на мембране от концентрации уабаина. На графике для всех значений n = 3;

means ± SEM;

*=p0,05. Время инкубации час.

Параллельно с появлением фосфорилированного Bad мы обнаружили вызванное уабаином снижение фосфорилированной фракции антиапоптозных белков Bcl-2 и Bcl-xL (Рис. 7), что обычно наблюдается при активировании апоптозной клеточной гибели. Характерно, что эффект уабаина на эти белки проявляется при большей концентрации, чем на белок Bad.

Bcl-2 Bcl-xL % % 100 * * 80 * * 60 40 Контроль 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM Контроль 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM Рис. 7: Детектирование белков Bcl-2 и Bcl-xL методом вестерн-блоттинга при воздействии уабаина в клетках SH-SY5Y (для всех приведенных данных n = 3;

means ± SEM;

* = p0,05;

время инкубации 6 час).

Механизм защиты от клеточной смерти с участием белков Bcl-2 и Bcl-xL до конца не понятен. Тем не менее было показано, что Bcl-xL предотвращает развитие апоптоза, взаимодействуя с белком Bak и препятствуя формированию пор во внешней митохон-дриальной мембране и освобождению проапоптогенных факторов типа цитохрома С (Willis et al, 2005;

Ramirez-Ortega et al, 2006). По этой причине мы сочли целесооб-разным измерить уровень цитохрома С в цитозольной фракции исследуемых клеток.

Мы обнаружили, что снижение фосфорилированной фракции Bcl-2 и Bcl-xL сопровождается появлением цитохрома С в цитозоле (Рис. 8), вероятно, вследствие образования пор во внешней митохондриальной мембране свободными белками Bak и Bax. Данные литературы показывают, что различные КТС (уабаин, строфантин, дигоксин) могут вызывать высвобождение цитохрома с и в культуре клеток HeLa (Ramirez-Ortega et al, 2006).

* * % к контролю * Контроль 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM Рис. 8: Детектирование цитохрома С методом вестерн-блоттинга в клетках SH-SY5Y.

График зависимости интенсивности сигнала от конц уабаина после 6 час инкубации (n = 3;

means ± SEM;

* = p0,05).

Было показано, что при действии уабаина происходит активация каспазы 3, главного исполнителя программы апоптоза (Рис. 9). Известно, что каспазы активируются каскадным способом и поэтому оценка активности какой-либо из них, например, каспазы-3 или каспазы-9, может служить доказательством того, что клетка вступила в апоптоз (Earnshaw et al, 1999).

* к * нтро ю л %к ко Контроль 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM уабаин Рис 9: Зависимость интенсивности сигнала каспазы- от концентрации уабаина в клетках SH-SY5Y.

Кроме этого мы показали увеличение фосфорилированной фракции белка р53 в положении Ser15 в ответ на 6-часовую аппликацию уабаина (Рис. 10).

* * * %к контролю 0 нM 10 нM 100 нM 1 мкM 10 мкM уабаин Рис. 10: Зависимость интенсивности сигнала белка Р от концентрации уабаина в клетках SH-SY5Y.

Белок р53 в активном состоянии индицирует каскад программируемой клеточной смерти (Gottlieb & Oren, 1998;

el-Deiry, 1998) и фосфорилирование р53 в положении Ser15 играет ключевую роль в вызываемой этим белком апоптозной гибели (Lai et al, 2005). Одним из следствий активации р53 является изменение экспрессии регулируемых им генов, таких как Bax, Bcl-2 и др., контролирующих апоптоз, и p21WAF1, GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage-induced), экспрессия которых приводит к остановке клеточного цикла. В результате клетка, в которой уже произошли или только могут произойти генетические изменения, либо гибнет в результате индукции апоптоза, либо останавливается в G1- или G2-, а иногда в S фазе клеточного цикла.

Мы видим, что после 6 часов инкубации с уабаином в клетках нейробластомы SH-SY5Y одновременно активируется и проапоптозный, и антиапоптозный пути.

Очень часто выбор клеткой пути выживания или смерти есть итог смещения равновесия альтернативных процессов, а во внутриклеточных механизмах это проявляется в смещении баланса сигнальных путей, ведущих к жизни или к смерти в ту или другую сторону. Поэтому оказывается, что один и тот же стимул может активировать противоположные механизмы смерти и жизнеустойчивости, и клетка выберет тот путь, сигналы которого будут преобладать.

Анализируя динамику появления активных белков при разных концентрациях уабаина, мы видим, что антиапоптозные белки, такие как р42/44 МАРК, Bad становятся активными уже при 100 нМ уабаина, тогда как проапоптозные белки Bcl-2, Bcl-xL, каспаза 3, Р53 становятся активными лишь при 1 мкМ, т.е. при концентрации, когда, по-видимому, включаются резистентные изоформы Na/K– АТФазы (Таблица 1). Поэтому можно предполагать, что чувствительные изоформы Na/K–АТФазы способствуют активации антиапоптозных белков, тогда как при более высоких концентрациях, включаются резистентные изоформы, и равновесие смещается в сторону апоптозного каскада, включаются каспазы, p53, цитохром C и клетка погибает.

Таблица 1: Роль чувствительных и резистентных изоформ Na/K-АТФазы в активации внутриклеточных сигнальных белков.

2 и 3 изоформы 1 изоформы Название белка (чувствительные) (резистентные) 100 нМ уабаина 1 мкМ уабаина MAPK + + PKB - + Bad + + Bcl-2 - + Bcl-xL - + цитохром С + + каспаза 3 - + Р53 - + Какой путь доминирует? Погибают ли клетки SH-SY5Y после инкубации с уабаином? Для выяснения этого вопроса мы измеряли уровень лактатдегидрогеназы (LDH) в остаточной культуральной среде через 6 часов инкубации клеток SH-SY5Y с различными концентрациями уабаина. Результаты измерения не выявили выхода этого фермента в среду, что позволяет сделать заключение, что через 6 часов инкубации с уабаином клетки SH-SY5Y не погибают. Однако, как мы видим, к этому моменту уже активируется ряд проапоптозных белков, в том числе каспазы.

При более длительной инкубации клеток SH-SY5Y с уабаином в культуре наблюдается снижение количества клеток. Это показано в эксперименте, где чашки Петри с клетками нейробластомы SH-SY5Y мы инкубировали с низкой (10 нМ) и высокой (1 мкМ) концентрациями уабаина в течение 3 суток – за это время количество клеток снизилось на 75% (Рис. 11).

Количество клеток, % 10 нМ уабаина 1 мкМ уабаина 0 30 60 90 120 150 180 Время преинкубации с уабаином, мин Рис 11: Временная зависимость изменения числа клеток в популяции при действии уабаина На Рис. 11 видно, что в среде с высоким содержанием уабаина количество клеток снижалось гораздо значительнее, чем в среде с низкой концентрацией уабаина. Через 3 суток инкубации при 10 нМ уабаина количество клеток снизилось на 20%, тогда как при высокой - на 75%. В этих опытах мы не исследовали вопрос о том, каким образом погибают клетки под влиянием уабаина – лизируются, агрегируют или умирают другим способам (например, вследствие апоптоза). Тем не менее, учитывая литературные данные, свидетельствующие, что уабаин может вызывать апоптозную гибель клеток (Викторов с соавт., 1996), мы предполагаем, что при длительной инкубации с уабаином в клетках нейробластомы SH-SY5Y проапоптозные белки начинают доминировать и они погибают по пути апоптоза.

На другой клеточной модели – линии карциномы простаты РС-3, с помощью флуоресцентных красителей пропидия иодида и аннексина V, мы выясняли, какой тип клеточной смерти преобладает при действии уабаина. Клетки РС- одновременно прокрашивались аннексином V (он реагирует на фосфатидилсерин, молекулы которого появляются на внешней стороне мембраны при апоптозе) и иодидом пропидия, который, как отмечено выше, является маркером некротических клеток. На проточном цитометре клетки отображались в координатах FL Annexin V vs FL PI (где FL – флуоресценция) (Рис. 12).

Клетки РС-3 инкубировали с различными концентрациями уабаина в течение суток, после чего проводили их прокрашивание флуоресцентными зондами. На Рис. 12 видно, что при низких концентрациях уабаина - до 1 мкМ, клеточной смерти не наблюдается, а при 1 мкМ и выше выявляется как апоптоз, так и некроз клеток. Тот факт, что низкие концентрации уабаина не вызывают клеточной гибели, а при этих концентрациях ингибитора уже подавляются чувствительные изоформы Na/K-ATФазы (и не задействованы резистентные изоформы) позволяет предполагать, что в клетках РС-3 причиной клеточной гибели является ингибирование уабаин-резистентной изоформы, которое наблюдается при действии высоких концентраций уабаина (свыше 1 мкМ).

Рис. 12: Определение типа клеточной смерти при действии различных концентраций уабаина в течение 48 часов в клетках РС-3 методом проточной цитометрии. В верхних квадратах изображены популяции клеток в координатах FS-SS, в нижних квадратах – в координатах PI-Annexin V.

Уабаин препятствует дифференцировке клеток нейробластомы SH-SY5Y под воздействием ретиноевой кислоты (РК).

Ретиноевая кислота используется как фактор дифференцировки клеток нейробластомы SH-SY5Y (Singh & Kaur, 1995;

Pizzi et al, 2002) наравне с такими агентами как нейротрофические факторы (Kaplan et al, 1993), форболовые эфиры (Pahlman et al, 1995). При этом клетки SH-SY5Y дифференцируются в клетки, которые биохимически, ультраструктурно и электрофизиологически близки к нормальным нейронам (Abemayor & Sidell, 1989).

Мы решили выяснить, влияет ли ингибирование Na/K-ATФазы уабаином на формирование нейрональных отростков в клетках нейробластомы SH-SY5Y, формирующихся в присутствии ретиноевой кислоты (Рис. 13).

Рис. 13: Влияние уабаина на нейритогенез, вызванный действием ретиноевой кислоты.

Диаграмма А отражает коэффициент, равный величине нервных отростков, превышающих 50 мкм, поделенных на число измеряемых клеток (n = 50-65;

±SEM;

*=p0,01);

Б-Г – фотографии контроля (Б), инкубированных с РК (В) и инкубированных с РК и 1 мкМ уабаина (Г) клеток нейробластомы SH-SY5Y. Длина белого прямоугольника соответствует 50 мкм.

Действительно, по нашим данным, подтверждающим данные литературы, инкубация с 10 мкМ ретиноевой кислоты приводит к формированию отростков, похожих на аксоны нервных клеток. Присутствие 1 мкМ уабаина блокирует этот эффект, и формирование нейритов не происходит. Исходя из этого можно предполагать, что сигнальные механизмы Na/K-ATФазы связаны с процессами дифференцировки клеток нейробластомы SH-SY5Y.

2. СИГНАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ С УЧАСТИЕМ NMDA РЕЦЕПТОРОВ В КЛЕТКАХ НЕЙРОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА SH-SY5Y Структурно NMDA-рецепторы представляют собой лиганд-связывающий кальциевый канал, состоящий из четырех или пяти субъединиц, которые формируют гетеромерные комплексы (McBain & Mayer, 1994;

Cull-Candy et al, 2001). Субъединица NMDA-рецептора NR1 представлена наиболее широко и кооперируется с одной или несколькими субъединицами второго семейства, содержащего NR2A, NR2B, NR2C и NR2D. Функционально активные NMDA рецепторы требуют наличия и NR1, и NR2 субъединиц, так как NR1 субъединица содержит глицин-связывающий домен, а NR2 субъединица содержит глутамат связывающий сайт (Laube et al, 1997;

Dingledine et al, 1999). В некоторых случаях функционированию рецептора помогают еще дополнительные субъединицы, NR3A и NR3B (Das et al, 1998;

Nishi et al, 2001).

Экспрессия NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы SH-SY5Y. Данные об экспрессии субъединиц NMDA-рецепторов представлены на Рис 14. По нашим данным, в клетках присутствует только NR1 субъединица NMDA-рецепторов. И даже в присутствии ретиноевой кислоты, которую считают фактором дифференцировки (под ее воздействием у клеток нейробластомы появляются отростки, и они приобретают нейрональный фенотип) клеточных культур, обнаруживается только NR1 субъединица.

Рис. 14: Обнаружение субъединиц NMDA рецепторов в клетках нейробластомы SH-SY5Y в контроле и при инкубации с ретиноевой кислотой (10 мкМ, 5 дней).

Вероятно, что NMDA-рецепторы в этих клетках структурно не достроены и могут быть нефункциональны (Pizzi et al, 2002). Эта гипотеза подтверждается нашими данными, полученными с помощью проточной цитометрии, согласно которым воздействие NMDA не приводит к росту уровня ионов кальция и активных форм кислорода (Рис. 15), как это многократно показано на нормальных нейронах.

Уровень АФК при действии NMDA Уровень Са2+ при действии NMDA 90 % к контролю ю трол %к кон 10 0 Контроль ND MA ND MA ND MA NDMA MK-801 NDMA NDMA Контроль ND MA ND MA ND MA NDMA 100 мкМ 250 кM 500 мкM 1000 мкM 10 мкM 250 мкM 500 мкM 100 мкM 250 мкM 500 мкM 1000 мкM +M K-801 + MK- 10 мкM 10 мкM Рис. 15: Уровень внутриклеточного кальция и активных форм кислорода под действием NMDA в клетках нейробластомы SH-SY5Y.

Мы отмечаем даже дозо-зависимое снижение уровня АФК от концентрации NMDA, что нельзя объяснить, исходя из данных о функционировании интактных NMDA-рецепторов. Нельзя исключить, что в этих клетках существуют иные, кроме NMDA-рецепторов, мишени для NMDA, однако факты, свидетельствующие об этой возможности, отсутствуют.

Активация p42/44 MAPK (ERK1/2) и PKB под действием NMDA.

Не смотря на отсутствие типичного ответа клеток на NMDA (в наших опытах не наблюдается ни кальциевого сигнала, ни накопления АФК), мы обнаружили, что действие NMDA на клетках нейробластомы SH-SY5Y приводит к активации p42/ MAPK и PKB киназ (Рис 16 и 17).

Активация p42/44 MAPK, PKB и других киназ под воздействием NMDA описана в литературе для различных объектов – многочисленные данные получены на изолированных нейронах (Zhu et al, 2002;

Stepulak et al, 2005). Это позволяет нам предполагать, что активация p42/44 MAPK и PKB в клетках нейробластомы SH SY5Y, вызванная NMDA реализуется все же через NMDA-рецепторы – через NR субъединицу. Мы предполагаем, что именно NR1 субъединица обеспечивает сигнальные свойства NMDA-рецепторов и активацию внутриклеточных киназ.

Таким образом, даже в нефункциональном состоянии, NMDA-рецепторы могут воздействовать на внутриклеточные сигнальные системы.

Рис. 16: Активация p42/44 MAP киназы под воздействием NMDA в клетках SH-SY5Y.

Рис. 17: Активация протеинкиназы В (РКВ) под воздействием NMDA в клетках SH-SY5Y.

3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИОНОТРОПНЫХ И МЕТАБОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В НЕЙРОНАХ МЫШЕЙ ЛИНИИ SAMP Ионотропные глутаматные рецепторы связаны с ионными каналами и определяют электрическую активность нейронов, а метаботропные глутаматные рецепторы связаны с различными G-белками, и их активация приводит к модификации клеточного метаболизма посредством включения внутриклеточных сигнальных каскадов (Pin et al, 2002). Поскольку метаботропные рецепторы способны менять активность G-белков, а через них регулировать реакции с участием внутриклеточных протеинкиназ, в последнее время получила широкое распространение гипотеза о способности реакционных каскадов, запускаемых метаботропными рецепторами, регулировать активность ионотропных рецепторов (Ашмарин с соавт, 1996). Особенный интерес представляют взаимодействия между различными метаботропными рецепторами и ионотропными рецепторами NMDA класса, поскольку последние вовлекаются в развитие окислительного стресса и связанных с ним патологий головного мозга.

Мы решили оценить развитие окислительного стресса, вызванного NMDA и влияние на него метаботропных рецепторов различных групп в глутаматергических нейронах мышей линии SAMP. Линия мышей SAMP характеризуется ускоренным накоплением старческих признаков и укороченным временем жизни вследствие постоянно поддерживаемого в их тканях состояния окислительного стресса (Takeda et al, 1994), таким образом, по нашим предположениям, эти животные должны иметь повышенную чувствительность к окислительному стрессу, вызываемому NMDA и на них более четко можно будет оценить действие метаботропных рецепторов.

* % к контролю * Контроль NMDA 100 NMDA 250 NMDA 500 MK-801 10 MK-801 мкМ мкМ мкМ мкМ мкМ + NMDA мкМ Рис. 18: Уровень АФК при действии NMDA и его антагониста MK- на изолированные нейроны мышей SAMP Мы показали, что для нейронов мозжечка мышей SAMP1 характерно дозо зависимое возрастание уровня АФК, вызванное инкубацией с NMDA.

Действительно, как мы и предполагали, у этих животных хорошо выражены эффекты NMDA, видимо из-за их повышенной чувствительности к активным формам кислорода.

На Рис. 19-А представлено сравнение действия исследуемых лигандов, взятых в концентрациях, считающихся оптимальными для глутаматергических нейронов крыс (Boldyrev et al, 2003).

А Б 220 * % к контролю % к контролю 160 * 120 100 * 60 Контроль NMDA L-AP4 3-HPG 250 мкМ 10 мкМ + 250 мкМ + 0 NMDA NMDA 250 мкМ 250 мкМ Контроль L-AP4 10 мкМ 3-HPG 250 мкМ Рис. 19: А - уровень АФК при активации агонистов I и III групп метаботропных глутаматных рецепторов 3-HPG и L-AP4, Б – действие 3-HPG и L-AP4 на фоне окислительного стресса, вызванного NMDA (250 мкМ).

Видно, что не только NMDA, но и L-AP4 вызывает повышение уровня свободных радикалов в клетках, измеряемого по флуоресценции DCF, хотя эффект L-AP4 выражен слабее, чем таковой NMDA. В то же время, 3-HPG снижал стационарный уровень АФК. Следовательно, в нейронах мозжечка SAMP1 как ионотропные, так и метаботропные рецепторы включены в регуляцию уровня свободных радикалов и могут как увеличивать, так и уменьшать уровень АФК в зависимости от сигнальных путей, которые активируются при этом в нейроне.

С целью проверки взаимодействия между рецепторами в нейрональных клетках мозжечка SAMP1, мы провели измерение АФК при одновременной активации рецепторов разных классов (Рис. 19-Б). Оказалось, что активация mGluR III L-AP не влияет на уровень АФК, продуцируемый в присутствии NMDA, но активация mGluR I 3-HPG снижает эффект NMDA, направленный на рост свободных радикалов. Возможно, что отсутствие синергизма между mGluR III и ионотропными рецепторами, обнаруженного для нейронов крыс линии Wistar (Boldyrev A., 2003) отражает нарушения глутаматергической регуляции и связано с исходно более высокой продукцией АФК в нейронах SAMP1. В то же время, ограничение продукции АФК при активации mGluR I воспроизводится в исследуемых нейронах. Таким образом, этот принцип ограничения продукции АФК, по-видимому, является общим при регуляции окислительного стресса в глутаматергической системе, который присутствует и у мышей SAMP.

Аналогичные механизмы могут реализоваться и при развитии нейродегенераций, в основе которых лежит стойкое повышение внутриклеточного уровня АФК. В этом случае эффективным способом восстановления нормального уровня свободных радикалов может быть применение фармакологических препаратов, вызывающих избирательную активацию mGluR I.

Выводы 1) В клетках нейробластомы SH-SY5Y присутствуют как уабаин-резистентная (1), так и уабаин чувствительные (2+3) изоформы Na/K–АТФазы;

как те, так и другие включаются в реализацию внутриклеточных сигналов.

2) Действие уабаина на Na/K–АТФазу нейробластомы приводит к увеличению уровня внутриклеточного кальция и активных форм кислорода, причем эти процессы происходят независимо друг от друга.

3) При ингибировании Na/K–АТФазы уабаином наблюдается воздействие как на проапоптозные, так и на антиапоптозные белки. Происходит фосфорилирование белка Bad (антиапоптозное действие). В то же время обнаружено снижение фосфорилированных Bcl-2 и Bcl-xL, увеличение фосфорилирования цитохрома C, каспазы 3 и белка P53 (проапоптозное действие). Проапоптозные белки активируются при высоких концентрациях уабаина, когда в работу включаются уабаин-резистентные изоформы Na/K–АТФазы.

4) Уабаин-чувствительные изоформы Na/K–АТФазы участвуют в активации p42/ MAPK и PKB в клетках нейробластомы SH-SY5Y.

5) Действие уабаина приводит к апоптозной и некротической гибели клеток линии РС-3.

6) В клетках нейробластомы SH-SY5Y экспрессируется NR1 субъединица NMDA рецепторов, связывание NMDA c которой приводит к активации белков p42/ MAPK и PKB, что говорит об общности сигнальных путей, активируемых NMDA-рецепторами и Na/K-АТФазой.

7) Изолированные нейроны быстростареющих мышей SAMP демонстрируют концентрационно-зависимое увеличение уровня АФК в ответ на действие NMDA, причем этот эффект снимается в присутствии МК-801 и регулируется агонистами глутаматных метаботропных рецепторов.

Публикации по теме диссертации 1) Kulikov A.V., Stvolinsky S.L., Boldyrev A.A. 3-Nitropropionic acid neurotoxicity enhances oxidative stress in SAMP1 animals (Senescence Accelerated Mice Prone, strain 1) // Ann. Rep. SAM Studies – 2004 – 7 (17-18) p.103-104.

2) Kulikov A.V. Study of the 3-nitropropionic acid (3-NPA) neurotoxicity on SAMP1-animals (Senescence Accelerated Mice Prone, strain 1). // in Materials of 10th Int. Symp. Pharmacol. Cerebral Ischemia, 25th-28th of July 2004 in Marburg (Germany), p.32.

Куликов А.В., Беляев М.С. Возможности терапевтического примнения 3) карнозина и мексидола в условиях 3-НПК индуцированной хореи Гентингтона на быстростареющих мышах линии SAMP1 // сборник «Актуальные проблемы экологии и природопользования» Москва, Изд. РУДН, Вып. 6. ч. 1, с. 22-25. 2004.

4) Kulikov A.V. Analysis of the 3-nitropropionic acid (3-NPA) induced neurotoxicity in the brain of rats and Senescence Accelerated Mice Prone (SAMP). // J. Neurochem.

Vol. 94, suppl. 2, p.226 (P408). 2005.

Куликов А.В., Болдырев А.А. Глутаматные рецепторы регулируют уровень 5) активных форм кислорода в нейронах быстростареющих мышей SAMP // Доклады Академии Наук, том 407, №6, с. 832-834. 2006.

Федорова Т.Н., Маклецова М.Г., Куликов А.В., Степанова М.С., Болдырев 6) А.А. Карнозин защищает от окислительного стресса, вызванного пренатальной гипоксией // Доклады Академии Наук, том 408, №16, с. 1-4. 2006.

7) Kulikov A., Eva A., Kirch U., Boldyrev A., Scheiner-Bobis G. Ouabain acting on the Na+/K+-ATPase induces signal cascades and apoptosis in neuroblastoma SH-SY5Y cells // in Materials of 5th Forum of European Neuroscience, 8th-12th of July 2006 in Vienna (Austria).

Болдырев А.А., Булыгина Е.Р., Казей В.И., Куликов А.В., Махро А.В., 8) Соколова Н.А., Степанова М.С. Молекулярные механизмы экзайтотоксичности глутамата // в материалах конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности центральной нервной системы» Пенза 25 27 сентября 2006 г. С. 38-40.

Куликов Андрей Валентинович (Российская Федерация) «Роль мембранных рецепторов в сигнальных механизмах в клетках нейрональной природы» В работе исследованы сигнальные механизмы с участием Na/K-ATФазы и глутаматных рецепторов NMDA-класса на клеточной культуре нейробластомы SH-SY5Y и взаимодействие NMDA-рецепторов с метаботропными глутаматными рецепторами различных групп на изолированных нейронах быстростареющих мышей SAMP.

Показано, что кратковременное ингибирование Na/K-ATФазы уабаином ведет к росту ионизированного кальция и уровня активных форм кислорода. При более длительной инкубации выявлялось фосфорилирование сигнальных белков p42/44 MAPK и PKB, а также белка Bad, что свидетельствует о включении антиапоптозных путей. Одновременно обнаруживалась активация и ряда проапоптозных белков - Bcl-2, Bcl-xL, каспазы 3, цитохрома C, р53. Таким образом, при стимуляции SH-SY5Y клеток уабаином активировались как проапоптозные, так и антиапоптозные факторы. На этом этапе смертности клеток не было обнаружено. Однако апоптозная гибель клеток выявлялась позднее – через 2-4 суток инкубации, что показано также на культуре РС-3.

В клетках нейробластомы SH-SY5Y обнаружена только NR1 субъединица NMDA рецепторов, и не выявлено роста уровня ионов кальция и АФК в ответ на аппликацию NMDA из чего делается вывод, что в этих клетках NMDA-рецепторы не функционируют как ионные каналы. Однако под воздействием NMDA наблюдается активация p42/44 MAPK и PKB киназ, следовательно, NR1 субъединица NMDA-рецепторов вовлекается в проведение сигнальных стимулов.

На нейронах быстростареющих мышей SAMP, характеризующихся повышенной чувствительностью к окислительному стрессу, показан дозо-зависимый рост АФК при воздействии NMDA, который блокируется антагонистом NMDA-рецепторов MK-801. Агонист III группы метаботропных глутаматных рецепторов L-AP4 способствует развитию окислительного стресса и усиливает токсическое действие NMDA, в то время как агонист I группы метаботропных рецепторов 3-HPG защищает нейроны от окислительного стресса, вызванного NMDA.

Kulikov Andrey (Russian Federation) The role of membrane-bound receptors in signal transduction mechanisms in the cells of neuronal origin We have shown that Na/K-ATPase, a membrane-bound enzyme, which provides the asymmetric distribution of Na+ and K+ ions across cellular membrane, involves in specific signaling mechanisms on SH-SY5Y neuroblastoma cells being secondary to its ion pumping function. Incubation of SH-SY5Y neuroblastoma cells with ouabain results into increase in cytosolic [Ca2+] and ROS levels, which are independent of each other.

It was shown that short-term inhibition of Na/K-ATPase leads to increase of [Ca2+] and ROS levels.

Incubation of the cells with ouabain, in a concentration-dependent manner induces a number of anti apoptotic signalling cascades including p42/44 MAPK, PKB activation (phosphorylation) and phosphorylation of pro-apoptotic protein Bad, that means induction of anti-apoptotic pathways.

Phosphorylation of Bad has not previously been noted in the literature. In parallel with induction of the anti-apoptotic pathways, we’ve detected an ouabain-induced activation of proapoptotic proteins - down regulation of the proteins Bcl-2 and Bcl-xL, appearance of cytochrome C in the cytosol, activation caspase-3 and P53. Thus, inhibition of Na/K-ATPase by ouabain results in induction both anti- and proapoptotic pathways. We have also found out a decline in cell number (cell death) 4 days after a 3-h pulse of ouabain treatment and both apoptotic and necrotic cell death of PC-3 cells after 48 hours incubation with ouabain.

Using PCR method we’ve found NR1 subunit as the only representative of NMDA-receptor complex in neuroblastoma SH-SY5Y cells. We have also shown no increase in cytosolic [Ca2+] and ROS levels, and come to conclusion that NMDA-receptors in these cells are not functioning as ionic channels. As a result of NMDA treatment, we’ve disclosed p42/44 MAPK and PKB activation in neuroblastoma SH-SY5Y cells and supposed that even non functional NMDA-receptors can provide signalling mechanisms via NR1 subunit.

We’ve observed a concentration-dependent ROS activation after NMDA treatment of isolated neurons from ccerebellum of Senescence Accelerated Mice (SAMP), which are more sensitive to oxidative stress than ordinary mice. L-AP4, a group III metabotropic glutamate receptor’s agonist, has elevated NMDA-induced excitotoxicity, whereas 3-HPG, a group I metabotropic glutamate receptor’s agonist, has decreased this parameter and protected neurons from oxidative stress.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.