авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Криоконсервация клеток морских беспозвоночных и увеличение их пролиферативной активности

0 1

На правах рукописи

КИСЕЛЕВ КОНСТАНТИН ВАДИМОВИЧ КРИОКОНСЕРВАЦИЯ КЛЕТОК МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И УВЕЛИЧЕНИЕ ИХ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ 03.00.23 – биотехнология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2004 2 3

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Дальне-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. За последние 10 лет было описано более 5000 восточного государственного университета МО РФ и в группе биоин химических соединений из морских организмов, причем многие из этих женерии Биолого-почвенного института ДВО РАН природных биоактивных метаболитов обладают высоким фарма Научные руководители: доктор биологических наук, профессор кологическим потенциалом. Особый интерес среди данных организмов Костецкий Эдуард Яковлевич;

привлекают губки, иглокожие, моллюски и другие морские беспо доктор биологических наук, звоночные, которые представляют собой источник ценных биологиче ст.н.с. Одинцова Нелли Адольфовна ски активных веществ, многие из которых не встречаются в наземных

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, организмах (Ireland et al., 1988). В частности плоский морской еж ст.н.с. Попов Александр Михайлович;

Scaphechinus mirabilis содержит нафтохиноидные пигменты, главным из кандидат биологических наук которых является эхинохром (Nishibori, 1957). Препарат Гистохром®, Рыбин Вячеслав Григорьевич созданный на его основе, обладает уникальными терапевтическими

Ведущая организация: ФГУП Тихоокеанский научно свойствами (Еляков и др., 1999).

исследовательский рыбохозяйственный Некоторые виды морских беспозвоночных имеют обширную центр сырьевую базу, другие являются редкими. В любом варианте, в свете

Защита состоится «15» июня 2004 г. в 10 часов на заседании дис современных тенденций сохранения биоразнообразия, было бы заман сертационного совета К 005.003.01 при Биолого-почвенном институте чиво разработать технологии промышленного культивирования клеток ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-лет Влади этих животных с целью получения биологически активных веществ.

востоку, 159. факс: (4232) 310- Продукция биологически активных веществ in vitro может стать аль тернативой химическому синтезу или аквакультуре, но при условии,

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной биб что клетки в культуре будут обладать высоким потенциалом роста. До лиотеке ДВО РАН.

сих пор в мировой практике, несмотря на многочисленные исследова ния, получено лишь две культуры из тканей морских беспозвоночных и

Автореферат разослан «7» мая 2004 г.

низших позвоночных: из тканей кораллов (Frank et al., 1994) и асцидий (Rinkevich, Rabinowitz, 1994). Низкая пролиферативная активность кле

Ученый секретарь ток морских беспозвоночных в условиях искусственного культивирова диссертационного совета, ния препятствует получению постоянных клеточных культур. Пробле кандидат биологических наук Музарок Т.И.

4 му получения клеточной линии можно решить путем вывода клеток 3. Получить трансгенные культуры морских ежей и доказать экс морских беспозвоночных из состояния дифференцировки, изменив экс- прессию в них гена активатора транскрипции gal4.

прессию генов ростовых факторов, но до сих пор в мировой практике 4. Исследовать влияние гена gal4 на эмбриональное развитие мор эта проблема не нашла своего решения. Поэтому актуальность даль- ских ежей и пролиферативную активность клеток в первичных культу нейших широких и углубленных исследований особенностей культиви- рах.

рования клеток морских беспозвоночных не вызывает сомнений. Научная новизна. Впервые показано, что существует корреляция Наиболее перспективным источником получения делящихся кле- между криопротекторными свойствами липидов и температурами их ток морских беспозвоночных является эмбриональный материал, но его фазовых переходов. Активатор транскрипции ген gal4 способен эф получение носит сезонный характер. Это существенно снижает интен- фективно встраиваться в ДНК и экспрессироваться в эмбриональных сивность исследований. Поэтому важным направлением нашей работы клетках морских ежей. Экспрессия гена gal4 приводит к появлению де стала разработка методов криоконсервации для создания постоянного дифференцированных клеток, которые обладают повышенным по источника клеток этих животных. тенциалом роста по сравнению с контрольными клетками.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась Практическая значимость. Практическая значимость работы свя разработка научных основ криоконсервирования клеток и получения зана с разработкой новых эффективных криопротекторов, использо клеточных культур морских беспозвоночных. Предлагается стимули- вание которых при замораживании клеток морских беспозвоночных ровать скорость деления клеток морских беспозвоночных через изме- дает возможность значительно увеличить количество жизнеспособных нение уровня экспрессии факторов роста. Для этой цели мы использо- клеток. Также в разработке приемов получения культур клеток морских вали транскрипционный активатор транскрипции, ген gal4. беспозвоночных. Запатентован новый способ увеличения проли Для достижения поставленной цели были поставлены следующие феративной активности клеток морских ежей, основанный на получе задачи: нии трансгенных культур клеток, в которых идет экспрессия гена 1. Разработать методы криоконсервации клеточных культур мор- транскрипционного активатора gal4 (Патент РФ № 2205873).

ских беспозвоночных путем подбора оптимальных криопротекторов. Апробация работы. Результаты исследований представлены на пер Оценить жизнеспособность и провести анализ уровня синтеза РНК в вом международном симпозиуме "Генетический криобанк для ак клетках морских ежей и моллюсков после замораживания и оттаивания вакультуры, редких и исчезающих видов рыб и других гидробионтов" в присутствии разных криопротекторов. (Пущино, 2000), конференции молодых ученых Биолого-почвенного 2. Найти эффективный способ переноса чужеродных генов в клет- института ДВО РАН (2001), годичных научных конференциях Инсти ки морских ежей. тута биологии моря ДВО РАН (2001, 2002), всероссийской школе 6 конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, (Odintsova, Khomenko, 1991). Для криоконсервации клеток морских 2002), и первом всероссийском съезде общества клеточной биологии беспозвоночных мы использовали двухэтапный способ замораживания, (Санкт-Петербург, 2003). Данная работа выполнена при финансовой как наиболее простой и достаточно эффективный (Odintsova, Tsal, поддержке НОЦ ДВГУ за счет средств фонда US CRDF (проект VL- 1995). В качестве криопротекторов использовали 10 %-ный раствор 003) и Министерства Образования РФ (А03-2.12-524) и президиума ДМСО, содержащий 0,2 % трегалозу в комбинации с общими липид ДВО РАН (04-3-Г-06-023 и 04-3-А-06-047). ными экстрактами морских беспозвоночных. Сразу после оттаивания на Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. водяной бане клетки отмывали от криопротекторов и добавляли L-15*.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 91 странице Температуры фазовых переходов тестированных общих липидных экс машинописного текста, содержит 5 таблиц и 21 рисунок. Работа со- трактов были определены на дифференциальном сканирующем кало стоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов риметре ДСК-2М (Odintsova et al., 2001). Трансгенные эмбрионы и эм исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения бриональные клетки морских ежей получали методом ПЭГ и выводов. Список литературы содержит 148 наименований. индуцируемого переноса (Bulgakov et al., 2002). Для получения первич ных клеточных культур из морских ежей, их эмбрионы были диссоции МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальное исследование проводилось на морской биоло- рованы в 0,25 % растворе коллагеназы на СМFSS (получена из печени гической станции "Восток" Института Биологии моря ДВО РАН летом краба Paralithodes camtschatica в ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток, Рос сия) в течение 20 минут при температуре 19 0С. Диссоциированные эм и осенью 2000-2002 г. Морские ежи (Scaphechinus mirabilis, Strongylo centrotus nudus, St. intermedius) и моллюски (Mizuchopecten yessoensis, брионы были промыты в стерильной морской воде. Далее клетки куль тивировали в среде L–15* в 24-луночных плато при 19 0С. Первичные Mytilus trossulus) были собраны в заливе Восток Японского моря. Не рест морских ежей стимулировали инъекцией 0,5 М KCl в область ари- клеточные культуры из тканей и эмбрионов моллюсков были получены стотелева фонаря. Нерест моллюсков стимулировали термическим шо- путем диссоциации 0,25 % раствором коллагенозы, в течение 2,5 часов при 12 0C для взрослых животных и 20-30 мин для личинок. Диссоции ком. В экспериментах мы использовали выделенную при помощи мето да щелочного лизиса (Маниатис и др., 1984) и очищенную плазмидную рованные клетки промывали несколько раз в морской воде. Затем оса ДНК (рМА563 и рМА564), любезно предоставленную доктором М. док клеток ресуспендировали в L-15*. ДНК выделяли из эмбрионо Пташне (Гарвардский университет, США). Липиды морских беспозво- нальных клеток морских ежей по методу, описанному ранее (Маниатис ночных были экстрагированы с помощью хлороформ-метанольной и др., 1984). Праймеры к гену цитоплазматического актина CyIIb мор процедуры (Folch, 1957). Липидные эмульсии были получены при по- ских ежей (Durica et al., 1988) и гену gal4 были подобраны на основе мощи ультразвуковой обработки на основе культуральной среды L-15* нуклеотидной последовательностей, взятых из генетического банка 8 (M35323 и NC_001148). Праймеры, прямой 5'-CAA CGG ATC CGG ежей возрастали жизнеспособность и уровень синтеза РНК. Лучшие TAT GGT GAA GGC-3' и обратный 5'-TCC AGA CGG AGG ATG GCG показатели для клеток моллюсков были в пробах, где в качестве крио TGG GGA-3', фланкировали фрагмент в 727 пар нуклеотидов гена акти- протекторов использовалось сочетание ДМСО и трегалозы с мидийны на CyIIb или 504 пар нуклеотидов, если в качестве матрицы использо- ми липидными экстрактами (рис. 1). Лучшие показатели для клеток вали кДНК, потому что выпадает одна интронная вставка. Праймеры, морских ежей были в пробах, где в качестве криопротекторов исполь прямой - 5'-TCC AAC CAG GTG ACA G-3' и обратный - 5'-CCT CGA зовалось сочетание ДМСО и трегалозы (рис. 2). Без криопротекторов GAA GAC CTT G-3', фланкировали фрагмент в 712 пар нуклеотидов основные показатели уровня синтеза РНК и жизнеспособность были гена gal4. Тотальную РНК выделяли при помощи набора «Yellow- минимальными.

Без ДМСО Число импульсов в минуту на млн. клеток Solve» (Clonogen, Санкт-Петербург, Россия) по методике производите ля. Для выделения фракции поли-(А)-РНК мы использовали набор на ДМСО основе олиго (дТ) целлюлозы. Проводили обратно-транскрипционную * * * * реакцию на наборе фирмы Силекс М (Москва, Россия). Оценка уровня синтеза ДНК и РНК была сделана по ранее описанной методике (Odintsova et al., 1999). Экстракцию нафтохиноновых пигментов прово 1 2 3 4 5 6 Рис. 1. Включение (С14)-уридина в клетках трохофоры мидии дили из клеток по методике Кольцовой (Koltsova et al., 1981), с неболь M. trossulus после замораживания-оттаивания в первичной культуре.

шими модификациями. Незамороженные клетки (1);

клетки, замороженные в присутствии: ДМСО (2), ДМСО + трегалозы (3), ДМСО + трегалозы + общего липидного экстракта из РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ тканей моллюска C. grayanus (4), трегалозы (5), трегалозы + общего липидного Криоконсервация клеток морских беспозвоночных экстракта из тканей моллюска C. grayanus (6), трегалозы + общего липидного экстракта из тканей морского ежа St. intermedius (7). * P 0,05;

** P 0, Морские беспозвоночные требуют особых, отличных от других жи вотных и растений, условий замораживания-оттаивания. Это заключе- ДМСО Без ДМСО Число импульсов в минуту на млн. клеток ние основано на анализе современной литературы и результатах нашей работы. Мы протестировали влияние различных криопротекторов как липидной, так и углеводной природы в сочетании с ДМСО на жизне- * способность и уровень синтеза РНК в клетках моллюсков и морских ежей в зависимости от различных клеточных типов и стадий эмбрио 1 2 3 4 5 6 нального развития. При использовании только определенных сочетаний Рис. 2. Включение (С )-уридина в клетках бластулы морских ежей St.

nudus после замораживания-оттаивания. Незамороженные клетки (1);

криопротекторов в экспериментах на клетках моллюсков и морских 10 клетки, замороженные в присутствии ДМСО (2), ДМСО + трегалоза Последнее выглядит наиболее правдоподобным, так как известно, что (3мг/мл) (3), ДМСО + трегалоза (3мг/мл) + общий липидный экстракт добавление фосфолипидов обеспечивает защиту против холодового из тканей St. intermedius (4), трегалозы (3мг/мл) (5), трегалозы (3мг/мл) + общего липидного экстракта из тканей St. intermedius (6), трегалозы шока сперматозоидов млекопитающих. При этом экзогенно добавлен (16 мг/мл) (7). * P 0,05;

** P 0, ные фосфолипиды не встраиваются в мембрану, состав мембран в ходе замораживания-оттаивания не изменяется. Криопротекторные свойства Преимущество сочетания трегалозы и ДМСО объясняется тем, что мидийных липидных экстрактов выше криопротекторных свойств ли трегалоза способна снизить токсический эффект ДМСО (Chen et al., пидных экстрактов иглокожих, так как значительная часть их термо 1993). ДМСО в высоких концентрациях токсичен для клеток. Однако граммы лежит в области от –60 0С до –15 0С (рис. 3). Причем при этих это вещество необходимо для успешной криоконсервации, т.к. в высо температурах почти все общие липидные экстракты, выделенные из ких концентрациях понижает температуру замерзания культуральной иглокожих, уже находятся в твердокристаллическом состоянии. Поэто среды, чем и объясняется его криопротекторное действие.

му можно говорить о корреляции между криопротекторными свойства Криопротекторные свойства мидийных липидных экстрактов суще ми липидных экстрактов и их термограммами.

ственно отличаются от таковых липидов, выделенных из тканей игло кожих: добавление мидийных липидных экстрактов повышало жизне C. grayanus способность и уровень синтеза РНК у клеток моллюсков. Эти резуль- A. amurensis S. indermedius таты коррелируют с данными термограмм, то есть с температурами фа зовых переходов кристалл – жидкий кристалл. А именно, чем ниже -80 -75 -70 -65 -60 -55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 температуры фазовых переходов кристалл – жидкий кристалл, тем Температура, C большими криопротекторными свойствами обладают липидные экс- Рис. 3. Термограммы общих липидных экстрактов из C.grayanus (- - -), S. intermedius (—) и A. amurensis (— - —) тракты (рис. 3).

Известно, что длительное хранение клеток при низких температурах не вызывает их повреждения, однако клетки разрушаются во время Итак, ДМСО с трегалозой проявляют наилучшие криопротекторные циклов замораживания-оттаивания. Наибольшая смертность на- свойства при замораживании-оттаивании клеток моллюсков и морских блюдается в области температур от –15 до –60 С, которые клетки про- ежей. Добавление в культуральную среду мидийного липидного экс ходят дважды: один раз во время замораживания и другой – во время тракта, по нашим данным, способно достоверно повысить жизнеспо оттаивания (Gao, Critser, 2000). Скорее всего, жидкокристаллические собность и уровень синтеза РНК в клетках моллюсков.

липиды способны восстанавливать области разрушения или препятст вовать повреждению мембраны во время замораживания-оттаивания.

12 чала репликации, 1-147 – N-концевой домен, I и II – первый и второй Влияние активатора транскрипции gal4 на рост и развитие эм участки гена gal4, связывающиеся с белком инициаторного комплекса брионов и эмбриональных клеток морских ежей Проблему получения клеточной культуры можно решить путем При обработке эмбрионов морских ежей плазмидой, содержащей ген вывода клеток морских беспозвоночных из состояния дифференци gal4, эмбриональное развитие замедлялось. На некоторых эмбрионах ровки, изменив экспрессию генов ростовых факторов. Для этой цели мы наблюдали образование скоплений клеток в виде опухолеподобных использовали ген gal4, входящий в состав галактозного оперона дрож структур (ОПС) (рис. 5).

жей. Белок Gal4 является активатором транскрипции эукариотических Б А генов. Он способен функционировать в различных гетерологичных сис темах, таких как дрозофилла, млекопитающие и растения, связываясь с последовательностью TGACA в промоторных участках генов и активи руя их экспрессию (Ma et al., 1988). Белки-активаторы транскрипции несут две функции в одной молекуле, т.е. содержат ДНК-связывающий Г В домен и участок, активирующий транскрипцию эукариотических генов (Ptashne, Gann, 1990). В работе использовали генно-инженерную конст рукцию, плазмиду pMA563 (рис. 4 А), содержащую функциональный ген gal4 (Ma, Ptashne, 1987), и в качестве контроля плазмиду pМА (рис. 4 Б), содержащую ген gal4R, лишенный участка, активирующего транскрипцию.

Рис. 5. Внешний вид и полутонкие срезы контрольных (А и Б) и обра ботанных функциональным геном gal4 (В и Г) эмбрионов плоского морского ежа, линейка 25 мкм (Одинцова и др., 2003) Трансформированные эмбрионы отстают по времени развития от контрольных. Через 60-80 часов после оплодотворения контрольные эмбрионы находились на стадии формирующегося плутеуса, в то время A Б как форма трансформированных эмбрионов была округлая, внешне на поминающая таковую бластулы (рис. 5). Форма ОПС разнообразна.

Рис. 4. Плазмидные конструкции, используемые в эксперименте: плаз мида с функциональным геном gal4 pМА563 (А) и плазмида pМА564 c Часто эти образования представлены группой клеток, рыхло располо геном gal4R (Б). Ар – ген устойчивости к ампициллину, ori – точка на 14 женных и содержащих большее количество межклеточного вещества Успешный перенос гена gal4 был доказан при помощи геноспе (рис. 5). Края ОПС неровные, ограниченные поверхностью самих кле- цифической ПЦР, а экспрессия при помощи ОТ-ПЦР (рис. 6). Важно ток. Диаметр образования меньше диаметра самого эмбриона в 2 и бо- отметить, что при выполнении ОТ-ПЦР необходимо быть уверенным в лее раз. отсутствии в пробе плазмидной ДНК и в качестве выделенной РНК.

Несмотря на сходство с ранней гаструлой, эмбрионы с ОПС име- Поэтому первоначально определяли экспрессию гена актина (CyIIb), ют ряд специфических особенностей: 1) происходит разрушение эпите- который постоянно экспрессируется в клетках морского ежа (рис. 6).

лиального слоя;

2) отмечено усиленное образование клеток мезенхимы;

3) бластоцель сжимается до небольшой полости в центре эмбриона. Ко личество эмбрионов с ОПС у плоского морского ежа было наибольшим при обработке плазмидной ДНК, содержащей ген gal4, через 15-20 ми нут после оплодотворения и достигало 24 %, что в 12 раз больше, чем при обработке геном gal4R (табл. 1).

Таблица 1. Влияние обработки плазмидой ДНК на эмбриональное Рис. 6. Доказательство присутствия мРНК гена gal4 и гена актина CyIIb развитие плоских морских ежей в трансфецированных эмбрионах плоского морского ежа методом ОТ Время после оплодотво- “Эмбрионы с ПЦР. Тотальная РНК выделена из эмбрионов плоского морского ежа Вид обработки рения ОПС” через 55 часов после обработки плазмидой рМА563 (дорожка 1), из 1,3 ±0, Без обработки контрольных необработанных эмбрионов (дорожка 2), М – синтети ПЭГ 2,1 ±0, ческий маркер 15-20 мин pMA564 2 ±0, pMA563 24±1,4** 1,9 ± Без обработки Наличие м-РНК в пробах эмбриональных клеток морских ежей, ПЭГ 3,3 ± 40-45 мин обработанных плазмидой с геном gal4, говорит об удачном переносе pMA564 5,8 ± pMA563 14 ±1* гена и его экспрессии. Поэтому появление эмбрионов с ОПС можно Без обработки отнести к активности гена gal4 в трансгенных эмбриональных клетках ПЭГ 6 часов pMA564 0 морских ежей.

1 ± 0,3** pMA Пролиферативная активность клеток морских ежей, транс * P 0,05;

** P 0, формированных геном gal Доказательство экспрессии гена gal Дальнейшие эксперименты проводили на первичных клеточных Дальнейшим важным шагом было доказательство успешного пе культурах морских ежей для более детального изучения влияния гена реноса и экспрессии гена gal4 в эмбриональных клетках морских ежей.

16 gal4 на деление клеток. Для этого ген gal4, либо его нефункциональный число импульсов в секунду на миллион клеток ** аналог gal4R, переносили в ДНК клеток первичных культур, полу- ** ченных со стадии бластулы, и исследовали характеристики их роста. Общее количество клеток в первичных культурах плоского морского ежа, после воздействия ДНК плазмиды рMA563, возросло в 4,4-4,6 раза, в течение 2-х месяцев культивирования. В клеточных культурах, обра- необработанные клетки рМА ботанных плазмидой рMA564 – в 2,7-2,9 раза (рис. 7). Эта разница ста тистически достоверна (P 0,01). В контрольных культурах рост клеток Рис. 8. Увеличение синтеза ДНК в первичных культурах эмбриональ был незначительным (рис. 7). Схожие результаты также получены на ных клеток плоского морского ежа после трансфекции гена gal4. Время культивирования трое суток. ** P 0, других видах морских ежей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 2, количество клеток на лунку (x 10) Морские беспозвоночные представляют собой источник ценных 2, биологически активных веществ. Разработка биотехнологий получения 1, воспроизводимого источника этих веществ представляется важной за 1, дачей. Уменьшение пролиферативной активности клеток морских бес 0, позвоночных в условиях искусственного культивирования препятствует 0, 1 7 14 21 28 35 42 49 получению постоянных клеточных культур. В данной работе описан время культивирования (сутки) Рис. 7. Динамика роста клеток в первичных культурах, полученных из подход, который позволяет преодолеть это естественное затруднение. В эмбрионов плоского морского ежа со стадии бластулы. 1 – клетки, об последующих исследованиях могут использоваться те или иные регуля работанные рМА563;

2 - клетки, обработанные рМА564;

3 – необрабо танные клетки торные гены, различные промоторы, либо гены, кодирующие факторы роста, специфичные для морских животных. Их эффективность будет Уровень синтеза ДНК в первичных культурах плоского морского повышаться, и несомненно, клеточные линии и штаммы будут получе ежа, экспрессирующих ген gal4, возрастал в 2,2-2,3 раза по сравнению с ны. Особенность настоящей работы заключается в том, что в ней впер таковым у нетрансгенных клеток (рис. 8). Аналогичные результаты по вые показана принципиальная возможность использования чужеродных лучены также на других видах морских ежей.

генов для увеличения пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных.

18 Методически, осуществить перенос трансгена оказалось не сложно. В этой связи особый интерес представляет изучение природы "опу Критическим фактором в осуществленном нами ПЭГ-переносе является холеподобных структур", которые образуются в результате трансфек состояние "компетентности" эмбрионов, которое зависит от времени, ции. Важным шагом в настоящей работе было установление того факта, которое прошло после их оплодотворения. Важными факторами явля- что эти структуры не являются описанными ранее обычными анома ется также концентрация эмбрионов и плазмидной ДНК. лиями развития эмбрионов, такими, которые наблюдаются при экзога По-видимому, появление опухолеподобных структур, описанных струляции. Однако пока не ясно, происходит ли злокачественная нами как результат трансфекции гена gal4, обусловлен экспрессией это- трансформация клеток. Клетки морских ежей в природных условиях не го гена. Наши исследования показали, что перенос чужеродной плаз- подвержены процессам злокачественной трансформации, и соот мидной ДНК сам по себе вызывает сходную морфологическую анома- ветственно морфология новообразований не описана. Понятно, что лию. Однако, сравнение результатов экспериментов с полноразмерным морские ежи, как и другие организмы, содержат протоонкогены. По геном gal4, и его аналогом, лишенным активаторных доменов, говорит видимому, отсутствие какого-либо эффекта протоонкогенов на клетки о том, что функциональный ген, несомненно, функционирует и вызыва- морских беспозвоночных можно объяснить отсутствием ферментов, ет неорганизованное деление клеток. необходимых для метаболической активации канцерогенов (Anderson, В ходе работы возникло много вопросов, которые ждут своего ис- 1978) либо существованием антионкогенов, например, специфичных следования. В последующих экспериментах важно будет установить, сульфолипидов у морских ежей (Sahara et al., 1997).

какова стабильность чужеродного белка в клетках морского ежа, оп- В практическом плане, мы считаем, что увеличение пролифератив ределить его мишень, какие сигнальные пути затронуты, стабильна ли ной активности клеток, достигнутое в результате экспрессии гена gal4, модификация этих путей в делящихся клетках. Полученные в ходе на- позволяет получать постоянные культуры клеток. Однако, все куль стоящей работы данные говорят о том, что поиск мишени гена gal4 туры, которые нормально развивались в течение довольно продолжи должен проводиться среди митогенных факторов, таких как эпидер- тельного времени (до 3 мес.), были потеряны в результате микробного мальный фактор роста. Теоретически, представляется вероятной сле- заражения. В этой связи, на первое место выходит необходимость раз дующая схема действия гена gal4. Белок, продукт гена, активирует экс- работки технологий, позволяющих избавиться от микроорганизмов.

прессию какого-либо митогенного фактора (или факторов), нарушая его Первые эксперименты такого рода, выполненные в градиенте перколла, своевременное выключение. Это приводит к нарушению диф- позволяют надеяться на успешность этого подхода.

ференциации клеток, увеличивает их пролиферативную активность. Важным аспектом работы явилась разработка методов криоконсер Другими словами, клетка продолжает делиться вместо того, чтобы спе- вирования клеток морских беспозвоночных. С успешным завершением циализироваться. этих экспериментов появилась возможность работать с эмбриональным 20 материалом в течение всего года, а не в течение двух месяцев, как это 2. Bulgakov V.P., Odintsova N.A., Plotnikov S.V., Kiselev K.V., Zacharov было ранее. E.V. and Zhuravlev Yu.N. Gal4-gene-dependent alterations of embryo de velopment and cell growth in a primary culture of the sea urchins // Mar.

ВЫВОДЫ 1. Разработан метод криоконсервации клеток морских беспозвоночных, Biotechnol. 2002. 4: 480-486.

который позволяет получать около 30 % жизнеспособных клеток мор- 3. Киселев К.В., Одинцова Н.А, Булгаков В.П., Кольцова Е.А., Яковлев ских ежей и моллюсков. К.В. Клетки морских ежей как возможные продуценты биологически 2. ДМСО (10 %) в сочетании с трегалозой (3 мг/мл) обладают наилуч- активных веществ // Вестник ДВО РАН. 2002. Т. 5. С. 101-104.

шими криопротекторными свойствами при замораживании-оттаивании 4. Киселев К.В., Одинцова Н.А., Плотников С.В., Булгаков В.П. Экс клеток моллюсков и морских ежей. Липидные экстракты с низкими прессия универсального активатора транскрипции эукариот gal4 в эм температурами фазовых переходов обладали эффективными криопро- брионах и первичных клеточных культурах морского ежа Scaphech текторными свойствами. inus mirabilis. В сборнике тезисов 6-ой пущинской школы-конференции 3. Разработана методика ПЭГ-индуцированной трансфекции эмбрионов молодых ученых «Биология – наука XXI века», 20-24 мая 2002 г., Пу и эмбриональных клеток морских ежей геном gal4. Показано, что ген щино, Россия, Том 1: 254-255.

встраивается в ДНК клеток морских ежей и экспрессируется там. 5. Одинцова Н.А., Киселев К.В., Булгаков В.П., Кольцова Е.А., Яковлев 4. Экспрессия гена gal4 приводит к нарушению эмбрионального раз- К.В. Влияние активатора транскрипции Gal4 на рост и развитие эм вития морских ежей и формированию опухолеподобных структур на брионов и эмбриональных клеток в первичных культурах плоского поверхности эмбрионов. морского ежа // Онтогенез. 2003. Т. 34, N 4. С. 267-272.

5. Экспрессия гена gal4 увеличивает число клеток и уровень синтеза 6. Одинцова Н.А., Киселев К.В., Плотников С.В., Булгаков В.П. Патент ДНК в первичной культуре морских ежей. Это позволило разработать РФ № 2205873. Способ увеличения пролиферативной активности кле МКИ7 С 12 N 5/10. Приоритет от новый для морской биотехнологии метод увеличения пролиферативной ток морских беспозвоночных.

активности клеток, который заключается в использовании генов- 04.04.2002 г. Опубл. 10.06.2003 г., Бюлл. № 16.

активаторов транскрипции. 7. Одинцова Н.А., Плотников С.В., Киселев К.В., Булгаков В.П. Ис пользование генов - активаторов транскрипции - новый перспективный СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ подход в области морской биотехнологии // Клеточные культуры: Ин ДИССЕРТАЦИИ 1. Odintsova Nelly, Kiselev Konstantin, Sanina Nina and Kostetsky Edward формационный бюллетень. 2003. Вып. 18. C. 3-8.

Cryopreservation of primary cell cultures of marine invertebrates // Cryo-lett.

2001. 22: 299-310.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.