Морфологические основы защитно-приспособительных реакций соединительной ткани кожи и тимуса при повреждающих и корригирующих воздействиях
На правах рукописи
Федорова Наталья Петровна МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗАЩИТНО-ПРИСПОСОБИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ КОЖИ И ТИМУСА ПРИ ПОВРЕЖДАЮЩИХ И КОРРИГИРУЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2009 2
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого»
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Прошина Лидия Григорьевна
Официальные оппоненты:
Заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Швалев Вадим Николаевич член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна
Ведущая организация:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова»
Защита состоится “ ” 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.08 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо Маклая, д.6.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.
Автореферат разослан “” 2009г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент О. Б. Саврова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Проблема адаптации организма к действию экстремальных факторов и сегодня остается одной из важнейших в биологии, физиологии и медицине, что объясняется увеличением воздействий на организм антропогенных и экологически неблагоприятных факторов.
Обезвоживание относится к числу наиболее актуальных проблем (Роле Б. Дж., 1984;
Боднар Я. Я., 1991;
Правоторов Г. В., 1996), что обусловлено рядом причин: физических, физиологических и социальных. Резкая потеря влаги (дегидратация) является стрессовым фактором, который часто действует на организм человека в естественных условиях и обстановке специфического производства, к тому же многие заболевания инфекционного характера и травмы сопровождаются резкой потерей жидкости, приводя к нарушению функционирования различных органов и систем (Виноградов В. В., 1977;
Малышев В. Д., 1984;
Смирнов А. В. с соавт., 2006). Функционирование организма в экстремальных условиях обезвоживания сопровождается развитием общего адаптационного синдрома (Казначеев В. П., 1980;
Горизонтов П. Д. с соавт., 1983;
Меерсон А.Н. с соавт., 1984;
Балонов М.И., Жеско Т. В., 1989;
Салей А. П., 2000;
Розенфельд А. С., 2004). Нарушение водного гомеостаза, приводит к морфофункциональным изменениям ряда органов и систем, в том числе тканей внутренней среды (Куприянов В. В., 1983;
Якимова Ю. А., 1993;
Судаков К. В., 2000;
Прошина Л. Г., 2004;
Панин Л. Е., 2007;
Воробьева Н. Ф., 2007, 2008) и органов иммунной системы (Акмаев И. Г., Гриневич В. В., 2003;
Капитонова М. Ю. с соавт., 2005;
Самусев Р. П. с соавт., 2006;
Singh N. еt al., 2005). В литературе отмечается высокая зависимость морфологии иммунной системы и, в частности, тимуса от условий существования организма (Сапин М. Р., Никитюк Д. Б., 2000;
Ерофеева Л. М., Сапин М. Р., 2000). Тимус – центральный орган иммуногенеза и от его состояния, и активности во многом зависит выраженность защитных реакций всего организма (Сапин М. Р., Этинген Л. Е., 1996;
Cempbelle P. A., 1993). Ряд авторов отмечает, что острое стрессовое воздействие приводит к комплексным структурно-функциональным сдвигам в иммунной и нейроэндокринных системах регуляции живого организма (Агеева В. А. с соавт., 2004.;
Смирнов А. В. с соавт., 2006;
Самусев Р. П. с соавт., 2006;
Persidsky Yuri, 2003).
Существование организма во внешней среде возможно благодаря эволюционно выработанным адаптивным реакциям, в которых непосредственное участие принимают ткани внутренней среды (Виноградов В. В., 1992;
Бахшинян М. З. с соавт., 1998;
Верба О. Ю. с соавт., 2003;
Волошин Н. А., 2005;
Арташян О. С. с соавт., 2006;
Жанаева С. Я. с соавт., 2007). Ткани внутренней среды, включающие соединительные ткани и кровь, наряду с другими системами организма обеспечивают гомеостаз, защитные, регулирующие функции организма (Виноградов В. В. с соавт., 1977;
Казначеев В. П., 1980;
Бахшинян М. З., 2004;
Новиков В. Д. с соавт., 2004;
Воробьева Н. Ф., 2007;
Панин Л. Е., 2007;
Persidsky Yuri, 2003;
Dale D. C., 2008).
Высказано мнение (Виноградов В. В., 1992;
Правоторов Г. В., 1996, Прошина Л. Г., 2004;
Воробьева Н. Ф., 2007) о системных реакциях соединительной ткани в адаптивных реакциях организма, а также значительной роли в них гистиоцитов соединительной ткани. Позже отмечено вовлечение в гомеостатические реакции и активация в них наряду с блуждающими и резидентных макрофагов различных компартментов при перегревании и гормональном дисбалансе (Юрина Н. А., Радостина А. И., 1990;
Воробьева Н. Ф., 2008;
Wright J. K., 2004;
Yancey P. G., 2007).
В настоящее время в литературе имеется ряд доказательств наличия взаимодействия между иммунной и эндокринной системами. Одним из кандидатов на роль посредников этих взаимоотношений, по мнению ряда авторов (Маянский А.Н.,1989;
Громыхина Н.Ю., 1993;
Jassar A. S., 2005;
Bukrinki M. et al., 2006), являются макрофаги, секретирующие такие ключевые иммунорегуляторные факторы, как интерлейкин – 1 (ИЛ-1), ИЛ-6 фактор некроза опухолей, лимфоцит активирующий фактор и др. (Cempbelle P. A., 1993;
Jassar A. S., 2005;
Daryadel A., 2006;
Joseph E., 2006;
Bo-Chin Chiu et al., 2007;
Nadine Lippuner, 2007).
Известно также, что макрофаги определяют резистентность организма неблагоприятным условиям, а эффективность такого сопротивления зависит от согласованных взаимодействий эффекторных клеток (моноцитов, макрофагов, лимфоцитов (Бахшинян М. З., 2004;
Bassoe C. F., 2000;
Qsterud B., 2003;
Brown N. J., 2004;
Yancey P. G., 2007).
Современная медицина располагает значительными фактическими данными, отражающими разные стороны адаптации организма к действию экстремальных факторов (Горизонтов П. Д. с соавт., 1983;
Соловьев М.О., 1993;
Юшков Б.Г. с соавт., 1999;
Сапин М. Р., 2000;
Судаков К. В., 2000). Достаточно хорошо исследована роль нервной системы, накоплены обширные данные, касающиеся эндокринной регуляции адаптивных реакций, в последние годы широко обсуждается роль иммунной системы в этих процессах (Струков А. И., 1990, Баринов Е. Х., 1992;
Фрейдлин И. С., 2000;
Persidsky Yuri et al., 2003).
Однако обращает на себя внимание чрезвычайная неравномерность и недостаточность в исследованиях, касающихся взаимодействия специфической и неспецифической защиты, корреляции реакции клеток соединительной ткани и органов иммуногенеза (Бабаева А.Г., 1995;
Сапин М. Р., 1996;
Юшков Б. Г., 2006, Cempbelle P.A., 1993;
Persidsky Yuri 2003;
Yancey P. G., 2007).
Защитные и адаптивные реакции всего организма обусловлены в определенной степени состоянием системы мононуклеарных фагоцитов, а также во многом зависят от состояния и активности тимуса. Известно, что тимус как центральный орган иммуногенеза реагирует на различные экологические, стрессовые и экстремальные факторы (Аминова Г. Г., 2000;
Петренко М. В., 2005;
Yakeler E., 2004;
Singh N., 2005;
Di Naro E., 2006).
Актуальность поставленной проблемы определяется углубленным исследованием и формированием целостного представления о значимости структурных преобразований вилочковой железы при обезвоживании как центрального органа иммунопоэза, способного усугублять состояние либо повысить резистентность организма к данной ситуации, воздействуя через эффекторные звенья (лимфоциты, моноциты, макрофаги), представленные в тканях внутренней среды (рыхлой соединительной ткани и крови) (Агеева В.
А., 2004;
Singh N., 2000;
Yakeler E., 2004;
Jassar A. S., 2005).
В работах последних лет (Балаболкин М. И., 2000;
Журавлев Ю. И., 2001;
Зенков Н. К., 2001;
Голиков А. П., 2003;
Беридзе М. З., 2005;
Воробьева Е. Н., 2005;
Випартене Д., 2006;
Власов А. П., 2007;
Long L. H., 2001;
Asmis R., 2005) подчеркивается, что стресс-обусловленные реакции сопровождаются повышением процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Современной и важной представляется возможность повышения сопротивляемости организма дегидратирующим факторам введением антиоксидантов и в условиях санации тканей внутренней среды (от токсических агентов ПОЛ) усилить эффективность работы защитно-компенсаторных механизмов в их морфологическом представлении – структур рыхлой волокнистой соединительной ткани и иммунокомпетентных клеток вилочковой железы (Betteridge D. J., 2000;
Medina F., 2007) Совокупность вышеизложенных позиций определила направление работы, а также цели и задачи.
Цель исследования Настоящее исследование предпринято с целью изучения морфологических основ защитно-приспособительных реакций рыхлой волокнистой соединительной ткани кожи и тимуса при повреждающих и корригирующих воздействиях.
Задачи исследования Основными задачами
нашей работы, которые определили выделение основных ее разделов, явились следующие:
1. Провести сравнительную оценку функциональной морфологии рыхлой неоформленной соединительной ткани кожи, периферической крови и тимуса в условиях физиологического гомеостаза и повреждающем воздействии (экспериментальном обезвоживании организма).
2. Изучить влияние антиоксидантов на функциональную морфологию рыхлой неоформленной соединительной ткани кожи, крови и тимуса, уровень продуктов ПОЛ в крови и активность антиоксидантных ферментов в ткани печени.
3. Исследовать целесообразность превентивного введения -токоферола при стресс-обусловленных воздействиях (дегидратация организма).
4. Выяснить рациональность использования антиоксиданта -Тф в качестве корригирующего фактора на морфофункциональные изменения рыхлой соединительной ткани кожи и тимуса в условиях кумуляции в организме токсических продуктов ПОЛ, вызванных повреждающим действием экспериментального обезвоживания.
5. Провести сравнительный анализ эффективности защитно компенсаторной перестройки рыхлой соединительной ткани кожи и тимуса при дегидратации и в условиях использования антиоксиданта.
Научная новизна диссертации. Впервые выявлено, что обезвоживание на ранних этапах (1 - 3-х суток) вызывает адаптивно-компенсаторные, в последующем (5-7 сутки) деструктивные изменения тимуса, что соответствует стадиям дегидратационного (окислительного) стресса. Ярко выраженные деструктивные изменения тимуса на 7–9 сутки приводят к дезадаптации организма. Впервые отмечено, что деструктивные изменения вилочковой железы при дегидратации на фоне введения антиоксиданта имеют менее выраженный характер, чем при обезвоживании и носят защитно приспособительный характер.
Впервые отмечено, что введение -токоферола при дегидратации снижает содержание токсических продуктов ПОЛ и выраженность повреждений структур рыхлой соединительной ткани кожи, структур тимуса и периферической крови, определяя возможность более эффективной работы защитно-компенсаторных механизмов и в том числе макрофагической и иммунной систем.
Использованный комплекс морфологических, биохимических и функциональных методов исследования позволил выявить морфогенез изменений клеток рыхлой соединительной ткани кожи (и в частности ее эффекторного звена - макрофагов) и тимуса в условиях нарушения водно солевого гомеостаза на фоне введения -токоферола.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты исследований необходимы для разработки положений о роли системы мононуклеарных фагоцитов в защитно-компенсаторных реакциях;
их взаимоотношениях с иммунокомпетентными клетками в поддержании постоянства внутренней среды организма при адаптации к неблагоприятным факторам среды.
Количественные параметры мононуклеарных фагоцитов могут быть взяты за основу в экспериментальной и теоретической гистологии, патофизиологии и биохимии в той их части, где объектом исследования является система мононуклеарных фагоцитов и соединительная ткань.
Показатели окислительно-восстановительного гомеостаза (ПОЛ-АОЗ) могут быть учтены при рассмотрении вопроса окислительного стресса как одного из патогенетических звеньев каскада морфофункциональных нарушений при обезвоживании. Результаты работы по применению препарата с антиоксидантным действием (-токоферол) могут быть использованы для обоснования мер патогенетического лечения состояний, сопровождающихся явлениями обезвоживания в клинической практике, а также при коррекции нарушений водно-солевого гомеостаза в процессе экологических и профессиональных воздействий.
Внедрение результатов работы в практику. Материалы по функциональной морфологии тимуса необходимо учитывать при исследовании и коррекции иммунного статуса в процессе дегидратации.
Фактические данные результатов исследования и теоретическое обобщение материала могут учитываться при лечении заболеваний, сопровождающихся обезвоживанием в клинических условиях. Сведения, полученные в процессе выполнения работы, могут быть использованы в научной работе биологических, экологических, гистофизиологических и др.
лабораторий, где предметом исследования является водно-солевой обмен, соединительная ткань, вилочковая железа. Теоретические аспекты, выводы, количественные параметры по гистофизиологии РСТ кожи и тимуса могут быть востребованы в педагогической работе естественнонаучных и медицинских кафедр университетов (биологии, молекулярной биологии, гистологии, анатомии, патофизиологии, патологической анатомии), что подтверждено соответствующими актами о внедрении.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного теста, состоит из введения, обзора литературы, главы описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы (173 отечественных и 110 зарубежных источников). Работа иллюстрирована 74 рисунками и 14 таблицами.
Основные положения выносимые на защиту:
1.Нарушение водно-солевого гомеостаза, вызванное в эксперименте повреждающим агентом дегидратацией, обуславливает общесистемную реакцию тканей внутренней среды организма (соединительной и крови), выражающуюся в увеличении интенсивности пролиферации клеток предшественников макрофагической системы моноцитов и последующим ростом всей популяции (численности) фагоцитов, а также значительной интенсификацией их метаболического ответа на 3 сутки исследования со снижением в последующие сроки.
2.Дегидратация организма крыс самцов линии Wistar приводит к появлению и росту в ходе эксперимента токсических метаболитов ПОЛ, с прямой корреляцией роста численности клеток макрофагической системы и обратной - с количеством иммунокомпетентных клеток крови и тимуса.
Выявленные разнонаправленные изменения в различных иерархических звеньях иммунной защиты нарушают структурные основы (лимфоциты, моноциты, макрофаги) защитно-приспособительных реакций организма.
3.Оптимизация параметров ПОЛ внутренней среды организма в условиях обезвоживания путем введения антиоксидантов рациональна и приводит к изменению динамики активации клеток макрофагической системы и повышению эффективности в работе данного исполнительного звена гомеостатических реакций.
4.Морфология вилочковой железы в процессе обезвоживания претерпевает характерную перестройку, которая на ранних этапах (1 - 3 сутки), очевидно, носит адаптивный характер. На 5-9 сутки происходят выраженные деструктивные изменения тимуса, оказывающие негативное влияние, как на возможности иммунокомпетентных клеток самого органа, так и РСТ кожи и периферической крови. Введение антиоксиданта снижает степень и величину дистрофических изменений в тимусе, уменьшает процент гибели лимфоцитов путем некроза, увеличивает количество созревающих клеток и позитивно влияет на функциональные возможности структур РСТК (макрофагов, моноцитов, лимфоцитов), обеспечивающих адаптивно-компенсаторные реакции организма.
Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались на: XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» - Москва, 12 –1 5 апреля 2006, секция «фундаментальная медицина»;
VIII конгрессе международной ассоциации морфологов - Орел, 15–17 сентября 2006;
VII Международной научно практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке» - Москва, 23– 26 ноября 2006;
6-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле». – Орел, 28– 9 марта, 2007;
конференции посвященной 100-летию Л. И.
Фалина – Москва 17–18 мая, 2007;
II международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2007» – С. Петербург 5–7 декабря, 2007;
XII научно-практической конференции сотрудников и студентов ИМО НовГУ – В.Новгород, апрель, 2008;
IX конгрессе МАМ – г. Бухара, республика Узбекистан 14–17 мая, 2008;
IX Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке» - Москва, 27–30 ноября 2008.
Апробация работы осуществлена на совместном заседании кафедр морфологии человека, нормальной физиологии, общей патологии, микробиологии, иммунологии и инфекционных болезней и проблемной комиссии Института медицинского образования Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого.
По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, 2 из которых в журналах, включенных в «Перечень ВАК РФ» 2006 года и 7 – в материалах научных конференций с международным участием. Все материалы, представленные в диссертации и опубликованные в печати, собраны, обработаны и проанализированы лично автором.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы. Опыты были выполнены на 296 взрослых самцах крыс линии Wistar с исходной массой тела 180-220 г. Условия содержания и кормления экспериментальных животных соответствовали «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально биологических клиник», утвержденным Приказом МЗ СССР № 1179 от 10.10. г. Экспериментальные исследования выполнялись в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123) (Страсбург, 18 марта 1986 года).
Контрольную группу животных (30 особей) содержали на обычном рационе вивария при свободном доступе к воде. Дегидратацию в экспериментальной группе животных вызывали использованием корма с влажностью не более 15% и полном лишении воды в течении 3 суток ( особей), 5 суток (25 особей), 7 суток (28 особей) и 9 суток (30 особей). Для оценки степени дегидратации при сухоядении исследовали динамику веса животных. Выделяли три степени дегидратации (Боднар Я. Я., 1991): легкая – дефицит воды 2-5% (3 суток);
средняя – дефицит воды более 5-10% (7 суток);
– сублетальная с потерей массы более 10% (9 суток).
С целью повышения антиоксидантного статуса был избран природный антиоксидант витамин Е ( -токоферол, “Serva” в дозе 50 мг/кг массы), Витамин Е вводили перорально, препарат растворяли в растительном масле и вводили на протяжении 3-6-9-15-20-30 суток (36 особей). Выбор дозы соответствовал литературным данным (Дорошкевич Н. А., Анцулевич С. Н., 1989;
Кайнова Г. М., и др., 1990;
Абрамченко В. В., 2001) и собственным предварительным исследованиям. Контрольным животным вводили равное количество растительного масла.
При постановке экспериментов с дегидратацией, с превентивным и последующим введением антиоксидантов животных переводили в режим сухоядения с седьмого дня введения препарата 3 суток + -токоферол ( особей), 5 суток (29 особей), 7 суток (28 особей) и 9 суток (34 особей).
Эвтаназию животных проводили краниоцервикальной дислокацией, предварительно анестезируя диэтиловым эфиром.
Морфологические исследования проводились с помощью светооптических методов. Светооптические препараты изучались на микроскопе МБИ – 15, XS-90. Исследовали тимус, рыхлую соединительную ткань кожи на полнослойных кусочках, а также тотальных пленочных препаратах.
Для каждой серии экспериментов на пленочных препаратах подсчитывали не менее 10 тысяч клеток (при выборе не менее одной тысячи клеток для каждого животного). Подсчитывали относительное содержание клеток: фибробластов, макрофагов, тучных и других клеток;
вычисляли макрофаг-фибробластический индекс (МФИ);
объемную плотность ядра и цитоплазмы макрофагов и фибробластов (проводили с использованием тест сетки Автандилова А.Г. 1990;
вычисляли ядерно-цитоплазматическое соотношение). Гистологические срезы кожи и тимуса окрашивали гематоксилином и эозином, ванн-Гизону. В препаратах кожи, оценивали соотношение структурных элементов РСТ сосочкового слоя. Для стереологического исследования использовали методы, основанные на подсчете числа точек тестовой системы, попавших на профиль исследуемой структуры (Стефанов С.Б., 1974;
Быков В.Л., 1979;
Непомнящих Л.М., 1980;
Автандилов Г.Г., 1990).
На срезах тимуса с помощью методов стереологического анализа измеряли площади коркового и мозгового вещества. Клеточный состав подсчитывался в поле зрения общей площадью 35 мкм2 раздельно для коркового и мозгового вещества. Подсчитывались большие, средние, малые лимфоциты, ретикулоэпителиальные, делящиеся и разрушающиеся клетки при увеличении микроскопа ок. 10, об. 90. Всего в каждом структурном компоненте тимуса подсчитывалось по 10 полей зрения. При дифференцировке лимфоцитов учитывался диаметр клеток (большие – более 9 мкм, средние – 7-8 мкм, малые – 5-6 мкм), а так же особенности распределения хроматина в ядрах клеток.
Данные, полученные в результате морфометрических исследований, записывали в протоколы, а средние величины и их ошибки заносили в сводные таблицы.
Для изучения динамики периферической крови, а также состояния макрофагов (моноцитов) сосудистого русла в мазках крови подсчитывали лейкоцитарную формулу. Мазок фиксировали метанолом и окрашивали азур эозином по Романовскому-Гимзе.
Для оценки состояния защитных реакций организма в моделируемой ситуации и степени вовлечения иммунокомпетентных клеток использовали метод проточной цитометрии1, исследовали состояния тимоцитов вилочковой железы: определяли витальность клеток, уровень апоптоза и некроза, пролиферативную активность.
Для получения представления о метаболической активности клеток СТ, особенно макрофагов участия их в жировом обмене использовали комплекс классических методов исследования цитохимической активности ряда окислительных и гидролитических ферментов (Пирс Э., 1962;
Лилли Р., 1969;
Лойда З., 1982). Активность фермента определили в фибробластах и макрофагах. В процессе исследования для оценки метаболической активности клеток была изучена активность следующих ферментов: НАД - диафоразы (НАД-д);
лактатдегидрогеназы (ЛДГ);
оксибутиратдегидрогеназы (ОБДГ);
неспецифической эстеразы (НЭ);
альфа-глицерофосфат-дегидрогеназы ( ГФДГ);
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и кислой фосфатазы (КФ).
Для оценки состояния ПОЛ в плазме крови и тканях животных определяли содержание диеновых конъюгатов (ДК) и ТБК-активные продукты по методу В.Г. Гаврилова и М.И. Мишкорудной (1983), в эритроцитах - по В.Н.
Ушкаловой и Г.Д.Кадочниковой (1987), в гомогенатах печени - по И.Д.Стальной (1977). Исследовали активность ферментов антиоксидантной системы (АОС) клеток организма в тканях печени: супероксиддисмутазы (СОД) (Beauchamp C., Fridovich I., 1971);
глутатионпероксидазы (ГП) определяли по методу Paglia D. E., Valentine W. (1967) в модификации В.З.
Ланкина и С.М.Гуревича (1976);
глутатион-S-трасферазную активность (ГТ) по методу Keen J. H., Yakoby W. B., 1978;
глутатионредуктазы (ГР) выявляли по методу Pinto E. R., Bartley W., 1969.
Приносим благодарность кандидату медицинских наук А.С.Александрову - заведующему централизованной цитологической лаборатории Новгородского областного клинического онкологического центра (г.В.Новгород) за предоставленною возможность выполнение фрагмента работы и профессору, д.м.н. заведующему кафедрой микробиологии, иммунологии и инфекционных болезней Г.С. Архипову за помощь при обсуждении данного материала.
Статистическая значимость различий средних показателей оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента при 95% доверительной вероятности (р0,05).
Собранные данные были обработаны с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel (2007 г), Statistica 6.0. Фотографии микропрепаратов выполнены со светового биологического микроскопа XS-90 цифровой камерой OLYMPUS модель E-510, объектив ZD-35 при увеличении Х 1.
Результаты и их обсуждение. Вмешательство внешних факторов в состояние гомеостаза приводит к адаптивной перестройке, в результате которой одна или несколько функциональных систем организма компенсируют дискоординацию для восстановления равновесия. При этом основные сдвиги в системах организма, регулирующих гомеостаз, возникают со стороны иммунных и эндокринных органов, преимущественно тимуса, гипофиза и надпочечников (Selye H., 1960). При стрессе наблюдаются выраженные морфофункциональные изменения в различных органах: мозге, сердечной мышце надпочечниках, различных железах внутренней секреции и др. Такие генерализованные по различным органам изменения при стрессе дают основание предполагать возможное участие в этом процессе соединительной ткани, которая, как известно, будучи производной мезенхимы, широко представлена в разных органах (Судаков К. В., 2000;
Розенфельд А. С., 2004).
Соединительная ткань кожи в норме характеризуется стабильным составом клеточных популяций. Содержание фибробластов на тотальных пленочных препаратах соединительной ткани кожи белой крысы линии Wistar составляет в среднем 71,6±0,2%;
макрофагов 25,7±0,3%;
тучных клеток – 0,70±0,02%;
на долю других клеток приходится 1,90±0,07%. Наши исследования совпадают с ранее полученными результатами (Виноградов В. В., 1989;
Прошина Л. Г., 1999;
Новиков В. Д., Правоторов Г. В., 2004;
Воробьева Н. Ф., 2007).
Величина МФИ у интактных животных составляет 360±5. На пленочных препаратах, окрашенных железным гематоксилином по Вейгерту в модификации Лили, границы макрофагов всегда четко очерчены (в отличие от фибробластов), что позволяет провести морфометрические измерения на уровне светового микроскопа. Ядерно-цитоплазматическое отношение макрофагов в норме составляет 0,27±0,03.
При характеристике метаболической активности клеток СТ имеет смысл сравнить макрофаги с фибробластами, так как они находятся в тесном взаимодействии друг с другом, и обуславливают через продукцию ряда факторов работу других клеточных элементов системы соединительной ткани.
Исследование ферментов в макрофагах и фибробластах определяют цитохимическую активность и общую функциональную деятельность клеток, а также участие макрофагов в обмене липидов. Критерием функциональной активности клетки может служить её общий метаболизм, определяемый по активности ферментов, связанных с основным путем окисления. Для макрофагов и фибробластов – это гликолиз (Маянский А. Н., 1989). Активность ЛДГ характеризует обмен углеводов по пути гликолиза, о доле участия пентозного пути судили по изменению активности Г-6-ФДГ.
Цитоплазматическая активность ОБДГ и а-ГФДГ служила показателем расщепления и синтеза липидов (Пирс Э., 1962). Исследование, НАД-д, НЭ дополняют эти сведения. Для характеристики активности клеток макрофагического ряда, а также - стабильности и проницаемости мембран исследовали содержание КФ. Среди популяции клеток соединительной ткани макрофаги являются метаболически самыми активными. Цитохимическая активность ОБДГ, Г-6-ФДГ, ЛДГ, а-ГФДГ в МФ в 2 раза выше, чем в фибробластах.
Гетерогенность клеток по цитохимической активности ферментов в условиях нормы может быть расценена как следствие, различной специализации среди макрофагов, существование пула активных клеток и малоактивных (резервных) и, различием фагоцитов по степени зрелости, что совпадает также с мнением ряда других авторов (Правоторов Г. В., Новиков В.
Д., 1996). В процессе созревания моноцита в макрофаг повышается активность Г-6-ФДГ, ЛДГ, -ГФДГ (Юрина Н. А., Радостина Н. И., 1990;
Wulff, 1967).
Известно также, что существует корреляция между уровнем ферментативной активности дегидрогеназ и фагоцитарной способностью макрофагов (Суханов А. Ф., Попонников В. А., 1974).
Эксперимент проводили в осенний период в условиях стабильной комнатной температуры (20-23 оС). С целью исключения влияния сезонных факторов на метаболическую активность клеток (Нагоев Б. С. и соавт., 2006).
Обезвоживание организма вызывает изменения в СТ, в частности, ее структурных элементах, чутко реагирующих на повреждающие факторы организма и включающиеся в защитно-приспособительные реакции (клетки и межклеточное вещество). Адекватно экстремальности воздействия возникают морфологические изменения в тимусе.
Функциональная полноценность липидных структур, регистрируемая процессами ПОЛ, является универсальным показателем стационарных химических превращений в клетках и организме, при воздействии разнообразных по своей природе патогенных факторов среды. В физиологических условиях в организме ПОЛ протекает в виде управляемой реакции, контролируемой АОС, т.е. системой поддержания гомеостаза (Владимирова Ю. А., 1972;
Абрамченко В. В., 2001).
Антиоксидантный потенциал организма на ранних этапах (3 суток обезвоживания) достаточно высок, в эти сроки сохраняется активность ферментов ГП и ГSТ на уровне контроля. Повышается антиоксидантный потенциал и за счет притока костно-мозговых предшественников макрофагов.
На 3 сутки в СТ намечается тенденция к увеличению количества макрофагов с низким ядерно-цитоплазматическим отношением, что коррелирует с выраженным моноцитозом периферической крови. Малодифференцированные макрофаги характеризуются более высокой активностью антиоксидантных ферментов, в частности пероксидазы (Маянский А. Н., Маянский Д. Н., 1989;
Правоторов Г. В., Новиков В. Д., 1996).
В процессе дегидратации на 7 сутки степень экстремальности эксперимента увеличивается, что сопровождается повышенным содержанием токсичных продуктов ПОЛ (рис.1).
Н ОЬ Л М Л /М е контрол М А в эр.
е е е Д 3 сут М А в эр Д 9сут М А в эр Д 7сут М А в эр.
Контрол М А в п азм лазм лазм лазм л Д3 сут М А в п Д 7сут М А в п Д 9сут М А в п Д Д ьД Д ьД Д Д Д Средний Min-Max Рис. 1. Влияние дегидратации на динамику МДА в крови крыс линии Wistar Важной составляющей среди ряда компонентов стрессорного повреждения мембранных структур, является накопление продуктов ПОЛ, возможно это, оказывается одной из причин, запускающих цепь адаптивных реакций. Одним из компонентов этих реакций является максимальная реализация функций фагоцитов СТ. Происходит значительное увеличение численности МФ (на 47,4% на 7 сутки водной депривации), МФИ возрастает почти в 2 раза (1,8 раза). При морфометрическом анализе макрофагов выявляется снижение их размеров: уменьшается площадь цитоплазмы на 33%, несколько снижается площадь ядра. Очевидно, это обусловлено увеличением в СТ числа молодых, более мелких клеток. Повышение ядерно цитоплазматического отношения на 7 сутки водного голодания ещё раз подчеркивает наполнение СТ молодыми клеточными элементами, однако на сутки водного голодания данный показатель свидетельствует о резком снижении функциональных возможностей клеточных элементов.
Водное голодание на 9 сутки определяется как тяжелая степень дегидратации с потерей влаги больше 10-15%. Анализ состава периферической крови демонстрирует снижение резистентности организма (снижение лимфоцитов на 6% и повышение нейтрофилов со сдвигом в сторону сегментноядерных на 10%). Численность макрофагов превышает уровень контрольных животных на 21%, однако резкое увеличение ядерно цитоплазматического отношения свидетельствует о функциональном истощении. Размеры клеток уменьшаются на 33%. Клеточные элементы СТ подвергаются деструктивным изменениям. Реакция СТ на обезвоживание и повышение ПОЛ выражается в изменении структур сосочкового слоя кожи.
Отмечается достоверное (на 2%) снижение процентного содержания клеток рыхлой волокнистой соединительной ткани сосочкового слоя дермы. Изучение межклеточного вещества рыхлой волокнистой соединительной ткани сосочкового слоя кожи выявило тенденцию к увеличению доли волокон и снижению основного аморфного вещества (ОАВ) в разные сроки исследования.
Значительные изменения проявляются на 7 и 9 сутки обезвоживания. В эти сроки волокнистые структуры составили 75,7±0,2% и 77,6±0,2% соответственно, что в 1,3 раза превышает контроль. Уровень содержания основного аморфного вещества снижается уже на 3 сутки обезвоживания на 7%. На 7 и 9 сутки экспериментальной дегидратации его объем падает на 14% и 16% соответственно.
При дегидратации изменяется липидный обмен. Нарушается фосфолипидный состав ряда органов, в частности легочной ткани (Журавлев Ю. И. 2001), повышается содержание эфирносвязанных жирных кислот, холестерина и фосфолипидов (Душкин М. И. 2006). Подобные изменения липидного обмена характерны для любых экстремальных ситуаций. При стрессе резко возрастает количество транспортных форм липидов, что трактуется как переключение организма с “углеводного” типа метаболизма на “липидный” (Панин Л.Е., 1983 2007). В нашей работе, очевидно, на липидный поток откликается СТ, повышением активности липолитических и гидролитических ферментов в макрофагах: возрастает активность ОБДГ, НЭ на 3 сутки эксперимента.
На 3 сутки отмечается повышение активности практически всех исследуемых ферментов как в макрофагах, так и фибробластах. Активность ОБДГ в макрофагах возросла на 26,9%, НЭ - на 23,8%, а КФ - на 116,5%.
Известно что, фагоциты способны, вырабатывая гидролитические ферменты (например, НЭ), расщеплять межклеточное вещество СТ, а фибробласты нарабатывать новые волокна и обновлять загруженные токсическими продуктами ПОЛ (Кожевников Ю.Н., 1985;
Климов А.Н., 1999;
Власов А.П, 2007;
Betteridge D.J., 2000). Увеличение активности КФ свидетельствует о возбуждении лизосомальных мембран (Покровский А.А., Тутальян В.А., 1976).
В развитии экспериментальной дегидратации, происходит падение активности практически всех исследуемых ферментов. На 3 сутки дегидратации отмечается высокая активность КФ, то на 5 и 7 сутки происходит снижение активности КФ, которая все еще превышает контрольный уровень, но стабильно снижается, на 9 сутки эксперимента активность КФ падает ниже контрольных значений. Падение активности КФ свидетельствует не только о деструкции лизосомальных мембран, но и плазматических. Известно, что продукты ПОЛ, как и сами активные радикалы усиливают проницаемость лизосомальных мембран (Абрамченко В. В., 2001).
Обращает на себя внимание четкая последовательность накопления метаболитов ПОЛ в плазме крови и ткани печени (первоначально увеличивается содержание ДК, затем МДА), которая по времени совпадала с началом снижения активности ГП и ГSТ.
9 сутки водной депривации определяются как тяжелая степень дегидратации с потерей влаги больше 10-15%. Снижение на 7 сутки и последующее увеличение ДК на поздних сроках можно расценивать как явление дезадаптации. В ткани печени наблюдается резкое падение собственных эндогенных антиоксидантных ферментных систем: СОД фермента, катализирующего реакцию диспропорционирования супероксидного радикала и таким образом снижающего его концентрацию в тканях (снижается на 30%). В 2 раза уменьшается ГР;
в 1,6 раза - ГSТ и 1,7 раза – ГП.
Водное голодание является стрессовой ситуацией, характеризующееся вовлечением в ответную реакцию всех звеньев организма, включая эндокринные и иммунные (Куприянов В. В. и соавт, 1979;
Тихомиров А. Н, Соколова Е. А., 1989;
Боднар Я. Я., 1990;
Сапин М. Р., Никитюк Д. Б., 2000).
Следует отметить, что вес тимуса – важный показатель его функциональной активности, который свидетельствует не только о функциональном состоянии органа, но и является отражением системного баланса всей лимфоидной системы (Агеева В. А., 2004). Известно, что адаптация организма сопровождается снижением массы тимуса в результате гибели дифференцированных лимфоцитов (Баринов Е. Х., 1992;
Бабаева А. Г., 1995;
Петренко М. В., 2005). При изучении динамики относительной массы тимуса, в условиях обезвоживания, выявлено падение данного показателя в 1,3 раза на сутки;
в 1,9 раза - на 5сутки, и в 2,3раза - на 9 сутки. Изучение морфологии тимуса проведенное на светооптическом уровне показало, что дегидратация вызывает выраженные деструктивные изменения в тимусе, уменьшение площади коркового вещества, а также повышение гибели клеточных элементов, причем с нарастанием некротических процессов.
Анализ структурных элементов тимуса в процессе дегидратации показал изменение клеточных характеристик тимуса. Увеличение доли малых лимфоцитов на 3 сутки обезвоживания можно расценивать, как первую стадию развития стресса и мобилизацию адаптационных возможностей организма. В эти сроки дегидратации наблюдается наибольшая метаболическая активность в макрофагах. Данный факт можно расценивать, как активацию выработки лимфоцит-активирующего фактора макрофагами, способствующего созреванию тимоцитов (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981). Наблюдается тесная корреляционная связь между метаболической активностью макрофагов и содержанием малых лимфоцитов в вилочковой железе r=0,95(рис.2).
Scatterplot: к-во малых тимоцитов vs. метаболическая активность МФ (Casewise MD deletion) метаболическая активность МФ = 7,3031 +,35675 * к-во малых тимоцитов Correlation: r =, м е та б о ли че с ка я а кти вн о с ть М Ф 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 95% confidence к-во малых тимоцитов Рис. 2. Линия регрессии зависимой переменной (к-во малых тимоцитов) от метаболической активности макрофагов Длительная дегидратация вызывает снижение и срыв адаптивных реакций МФ с истощением метаболического ответа, повышением ядерно цитоплазматических отношений и деструктивными изменениями структур СТ кожи и тимуса.
Динамика морфофункциональных изменений СТ кожи, периферической крови и тимуса при обезвоживании на фоне введения Тф. Если допустить, что интенсификация ПОЛ может провоцировать деструктивные процессы в соединительной ткани (организме) при дегидратации, то есть все основания надеяться, что своевременная стимуляция клеток СМФ и сопряженного с ней антиоксидантного потенциала может существенно повысить резистентность организма к дегидратации. В динамике обезвоживания организма происходит повышение ПОЛ с кумуляцией ДК, МДА и снижением эндогенной АОС. Существует два способа подавить действие свободных радикалов - снизить их образование и повысить эффективность антиоксидантной системы (Бурлакова Е. Б., 1992;
Dawn J, 2002). В нашей работе предлагается увеличить мощность антиоксидантной системы путем экзогенного введения -Токоферола.
Дегидратация на фоне поступления -Тф протекает с небольшим увеличением первичных и вторичных метаболитов ПОЛ. Введение -Тф при дегидратации сдвигает сроки накопления токсичных метаболитов ПОЛ (рис. 3).
Максимум накопления ДК происходит на 7 и 9 сутки (а не на 3 и 9 день), а МДА на 9 сутки, а не на 7 день, как это происходило в условиях водной депривации.
Дегидратация с протекторным введением -Тф демонстрирует более высокие показатели АО энзимов в ткани печени, чем это имело место в ситуации обезвоживания без препарата. То есть имеет место стресс-протективное влияние -Тф, выраженное в снижении скорости образования и накопления первичных и конечных метаболитов ПОЛ, а также позитивной индукцией ферментов АОС.
Ответная реакция соединительной ткани кожи и ее структурных элементов развертывается в более благоприятных условиях окружающей среды, что находит свое подтверждение в состоянии структур СТ кожи, тимуса, периферической крови.
Морфометрическое исследование сосочкового слоя кожи при дегидратации на фоне введения -Тф показало снижение объема этого слоя, как и при обезвоживании организма, однако имело менее выраженную интенсивность. В межклеточном веществе сохранялась тенденция к увеличению количества волокон и снижению объема основного аморфного вещества, но она была менее выражена чем при обезвоживании. Содержание волокон на 3 сутки дегидратации на фоне введения а-Тф составило 62,5±0,4%, на 7сутки – 72,8±0,2%, и на 9 сутки – 74,7±0,2%, это достоверно на 3% меньше чем в условиях обезвоживания организма.
45 40,7* 48,8* 35 14,3* 30,8* 71* усл.единицы 27,5* мкмоль/мл 30 30,9* КФ 42* 18,8 27,4* 20 ДК в эр 18,8* 14,3* 31* 15 23,8 0 й й ф ф ф ь ут ол не не -Т -Т -Т 3с 5д 9д тр +а +а +а Д н ут ут ут Д Д Ко 3с 5с 9с Д Д Д Рис. 3. Активность КФ макрофагов СТ и содержание ДК в эритроцитах крови при обезвоживании и на фоне введения -Тф Содержание макрофагов на фоне поступления препарата сопоставимо на сутки и опережает на 7 и 9 сутки их величины у животных в условиях обезвоживания. Реакция макрофагов, выраженная МФИ, на 3 сутки превышала на 22,7% крыс, не получавших -Тф. 7 сутки продемонстрировали более интенсивную реакцию макрофагов на дегидратацию у животных без протектора. Сниженное содержание метаболитов ПОЛ на фоне введения антиоксидантов «смягчает» ответную реакцию фагоцитов СТ и она становится «экономичней», так как тяжелая степень обезвоживания 9 суток на фоне введения препарата вновь показывала более яркий ответ (на 6% по сравнению с группой обезвоженных крыс без препарата). В данном случае очевидно, что на фоне введения -Тф структурные элементы СТ, обеспечивающие защитно адаптивные реакции работают более эффективно.
Поступление -Тф на 7 сутки обезвоживания стимулирует фибробласты (на 7%), популяция которых имеет тенденцию к увеличению и на 9 сутки.
Достаточно интересна динамика тучных клеток. Сухоядение на фоне протектора почти в 5 раз увеличило содержание тканевых базофилов. 7 сутки протекали сопоставимо, однако на 9 день их численность на фоне введения препарата вновь преобладала (в 4 раза). В данном случае -Тф оказывает индуктивное влияние практически на все элементы СТ и вовлекает их в общую системную реакцию на восстановление нарушенного гомеостаза.
Морфометрический анализ макрофагов также свидетельствует в пользу протективного влияния -Тф. Препарат положительно корригирует ядерно цитоплазматическое отношение (снижает) и позитивно отражается на размерах клеток. Площадь цитоплазмы макрофагов СТ животных, получавших витамин Е всегда превышает аналогичную без препарата, что свидетельствует о их более благоприятных функциональных возможностях.
Метаболическая активность макрофагов в условиях введения препарата подтверждает это предположение. Динамика активности ферментов в обеих ситуациях совпадает, но на фоне -Тф оказывается более интенсивной.
Исключение составляет КФ, активность которой снижается на фоне препарата и подтверждает мембраностабилизирующий эффект -Тф (рис.3.).
Необходимо особо отметить влияние -Тф на активность ОБДГ.
Дегидратация в течение 3 дней вызывала подъем этого фермента, активность которого, впрочем, как и у всех остальных падала с 7-го дня. Альфа-токоферол стимулировал активность ОБДГ на всех сроках обезвоживания, а интенсивность реакции превышала контрольные цифры не только на 3, но и на 7 сутки. -Тф повышали активность ОБДГ сутки обезвоживания с коррекцией макрофагов СТ кожи на 62% по сравнению с обезвоженными, и на 20% по сравнению с контрольными животными. Учитывая участие ОБДГ в метаболизме липидов (окисление), можно полагать интенсификацию обмена жиров в макрофагах СТ на фоне приема -Тф. Возможно, -Тф повышает фагоцитоз липидов и стимулирует внутриклеточный липолиз. Вероятно, также и то, что макрофаги выступают в роли «ловушек» при избыточном потоке липидов в организме при экстремальных ситуациях, какой является обезвоживание, что совпадает с мнением ряда авторов (Правоторов Г. В., Новиков В.Д., 1996;
Нагорнев В. А., и соавт., 2003). Сходная направленность наблюдается и в отношении энзима Г-6-ФДГ, данный показатель следует интерпретировать как повышение пентозо-фосфатного пути, индуцируемого препаратом в качестве компенсаторной реакции в условиях водной депривации.
Можно отметить общую позитивную направленность метаболизма энзимов в МФ кожи на повышение резистентности к обезвоживанию организма и мембранопротекторный эффект -токоферола. Описанная динамика активности ферментов (в условиях водного голодания на фоне приема -Тф), участвующих в жировом обмене может способствовать более щадящему использованию подкожно-жировой клетчатки, о чем свидетельствует динамика массы животного (рис.4).
Рис. 4. Динамика веса крыс линии Wistar при дегидратации (Д) на фоне введения -Тф (Д+ -Тф) Использование -токоферола выявило положительное влияние на состав лейкоцитарной формулу, индукцию моноцитов, повысило содержание лимфоцитов на 3,4% по сравнению с группой животных при дегидратации.
Анализ периферической крови делает правомочным заявление о повышении резистентности организма при обезвоживании на фоне приема -Тф.
Динамика структурных изменений в тимусе под влиянием обезвоживания на фоне введения -Тф характеризуется гибелью лимфоцитов, уменьшением их относительной плотности в корковом веществе долек органа, однако эти процессы менее выражены чем при дегидратации без превентивного введения антиоксиданта. Третьи сутки введения препарата при обезвоживании привело к увеличению малых лимфоцитов на 10% по сравнению с крысами в режиме сухоядения. По данным проточной цитометрии гибель лимфоцитов путем некроза и апоптоза в процессе обезвоживания на фоне введения витамина Е снижена в 1,5 раза (по сравнению с обезвоживанием без введения препарата), причем снижался процент гибели клеток путем некроза.
Выявленные изменения в тимусе при обезвоживании с корригирующим введением -Тф свидетельствуют о более выраженных адаптивно компенсаторных реакциях на 3 сутки и сниженных деструктивных изменениях органа в последующие сроки.
Таким образом, введение природного антиоксиданта -Тф снижает степень экстремальности ситуации, уменьшает накопление метаболитов ПОЛ, индуцирует эндогенную АОС организма. Степень экстремальности ситуации находится в прямой зависимости от накопления токсических продуктов ПОЛ, токоферол снижает их накопление и увеличивает продолжительность жизни при обезвоживании практически в два раза. Альфа-токоферол защищает от перекисного окисления липидов как путем перехвата, так и детоксикацией АФК, препарат усиливает АОС, стимулируя поступление прекурсоров макрофагов, так как молодые клетки (моноциты) обладают более высоким антиоксидантным потенциалом, чем резидентные макрофаги, в чем наше положение совпадает с мнением Сафронова И.Д. (1999) и Maeda H. (2005).
Оптимизация параметров внутренней среды организма путем введения Тф мобилизует и интегрирует структуры соединительной ткани кожи, тимуса и крови, преимущественно их клеточные элементы (макрофаги, моноциты, лимфоциты), разобщенные и подвергшиеся деструкции процессом дегидратации. В процессе обезвоживания организма с коррекцией его состояния антиоксидантом -Тф прослеживаются три основные фазы стресс-реакции:
первая фаза острой реакции и мобилизации (1-3 суток), сопровождающаяся повышением ДК плазмы крови, активности ферментов АОС, численности макрофагов СТ и их метаболической активности, моноцитов периферической крови, зрелых лимфоцитов вилочковой железы;
вторая – фаза компенсации (от до 5 суток), в которой сохранялись повышенное содержание ДК, повышенная активность ферментов АОС, происходило возвращение к контрольным цифрам количества моноцитов, повышалось содержание больших и средних лимфоцитов, при падении численности малых;
третья – фаза деструктивных изменений (от 7 до 9 суток). На поздних сроках обезвоживания (7-9 сутки) происходила максимальная кумуляция продуктов ПОЛ, имели место деструктивные изменения структур соединительной ткани кожи и тимуса.
Описанные явления подтверждают высказанное положение о том, что введение антиоксиданта не отменяет реакцию структур (макрофаги, моноциты, лимфоциты), активно откликающихся на изменения метаболического гомеостаза организма. Альфа-токоферол, повышая антиоксидантный статус организма и снижая содержание токсических продуктов ПОЛ уменьшает степень деструктивных изменений вилочковой железы, а также степень дезадаптивных влияний ее на эффекторные звенья гомеостаза СТ. Защитно приспособительные реакции СТ кожи и тимуса при коррекции повреждающих воздействий дегидратации препаратом с антиоксидантным эффектом развертываются в тесной интеграции структур, обеспечивающих резистентность организма к повреждающим факторам. На фоне введения -Тф отмечается синергизм в повышении численной плотности макрофагов соединительной ткани, моноцитов и лимфоцитов периферической крови.
Введение антиоксиданта при обезвоживании увеличивает количество созревающих клеток в вилочковой железе. Защитно-адаптивные реакции развертываются более эффективно, так как обеспечены большими функциональными (метаболической активностью макрофагов СТ, снижением ЯЦО макрофагов, большей сохранностью структур тимуса) возможностями задействованных структур.
ВЫВОДЫ 1. Дегидратация крыс линии Wistar приводит к падению массы тела: через трое суток на 14%, девять суток – 40,6%. Избранный режим воздействия является экстремальным: на 7 сутки обезвоживания процент летальности составляет 34%, на 9 – 68% и на 10-12 сутки погибают практически все животные.
2. Состав популяции клеток РСТК крыс линии Wistar в условиях нормы стабилен и составляет в среднем 71,6% фибробластов, 25,7% макрофагов, 0,7% тучных клеток, 1,9% лейкоцитов. Содержание указанных клеточных элементов имеет незначительный коэффициент вариации. Среди клеточных элементов соединительной ткани макрофаги являются функционально самыми активными: метаболически и динамически.
3. Дегидратация организма приводит к увеличению численности макрофагов на 46%, ядерно-цитоплазматического отношения (с 0,27 до 0,92 с 3 - 9 сутки обезвоживания), и уменьшению их размеров (в 1,5 раза).
Дегидратация модифицирует метаболизм клеточных элементов: на 3-й день происходит увеличение активности ферментов ОБДГ, НЭ, Г-6ФДГ, ЛДГ, -ГФДГ, НАД-д, КФ, на 5 и 7 день - цитохимическая активность снижается, за исключением КФ, которая снижается но превышает контрольные цифры.
4. Обезвоживание приводит к изменению соотношения волокон и основного аморфного вещества межклеточного матрикса в сторону уменьшения последнего в рыхлой соединительной ткани кожи крыс линии Wistar.
5. Дегидратация вызывает морфологическую перестройку тимуса с увеличением деструктивных изменений на 6–9 сутки, повышением гибели тимоцитов путем некроза. Динамика структурных изменений тимуса служит индикатором развивающегося стресса и дистресса и обоснует целесообразность заместительной терапии дефицита функций вилочковой железы.
6. Обезвоживание вызывает структурную перестройку вилочковой железы, которая отражает стадии общего адаптационного синдрома. К 1 - 3-им суткам возрастает содержание зрелых лимфоцитов (стадия мобилизации), на 3 – 5 сутки компенсаторно повышается содержание больших и средних лимфоцитов (стадия устойчивой резистентности), на 7–9 сутки происходит деструкция и массовая гибель лимфоцитов коркового и мозгового вещества. Возрастает процент клеток, подвергшихся некрозу (стадия истощения).
7. Обезвоживание организма сопровождается нарушением в системе ПОЛ АОС, накоплением токсических метаболитов и снижением активности антиоксидантных ферментов. Накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ характеризуется максимальным содержанием ДК на сутки водной депривации, последующим снижением их и накоплением на 5 сутки МДА, новым подъемом ДК и кумуляцией их и МДА на 7 сутки.
8. Снижение ПОЛ и повышение АОС введением природного антиоксиданта уменьшает степень экстремальности ситуации, усиливает устойчивость организма к дегидратации, что позволяет активизировать защитно приспособительные механизмы к повреждающим воздействиям, снизить процент летальности: на 5 сутки он составлял 14%, а на 9 - 39% (34% и 68% при обезвоживании).
9. Дегидратация с коррекцией состояния -Тф вызывает увеличение в лейкоцитарной формуле содержание лимфоцитов на 10%, повышение моноцитов на 8% и снижение нейтрофилов на 7%, что соответствует адаптивно-компенсаторной реакции и повышению резистентности организма к обезвоживанию.
10.Численная плотность макрофагов РСТК их метаболическая активность при дегидратации с превентивным введением антиоксиданта свидетельствуют об оптимизации параметров внутренней среды и демонстрируют большую эффективность функционирования эффекторных клеток тканевого гомеостаза.
11.Введение антиоксиданта -Тф при обезвоживании снижает степень и величину дистрофических изменений в тимусе, уменьшает процент гибели лимфоцитов путем некроза, увеличивает количество созревающих клеток и позитивно влияет на функциональные возможности структур вилочковой железы и РСТК (макрофагов, моноцитов, лимфоцитов), обеспечивающих адаптивно-компенсаторные реакции организма.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Морфометрическая и цитохимическая характеристика клеточных 1.
элементов соединительной ткани может быть использована для дальнейших разработок в экспериментальных исследованиях по соединительной ткани.
Результаты диссертации о позитивном влиянии -токоферола на 2.
структурные элементы СТ кожи, тимуса, периферической крови, обеспечивающие защитно-компенсаторные реакции в условиях дегидратации, необходимо учитывать при терапии заболеваний, сопровождающихся обезвоживанием.
Сведения, полученные в процессе выполнения работы, могут быть 3.
использованы в научной работе ряда лабораторий, предметом исследования которых являются экологические и профессиональные факторы обезвоживания, водно-солевой гомеостаз, соединительная ткань, вилочковая железа.
Теоретические аспекты, выводы, количественные параметры по 4.
гистофизиологии СТ и тимуса могут быть востребованы в педагогической работе естественнонаучных и медицинских кафедр университетов.
Фактические данные исследования, полученные в ходе выполнения 5.
диссертации о деструктивных изменениях вилочковой железы, сопровождающих процесс обезвоживания позволяют рекомендовать препараты заместительной терапии функции тимуса в условиях дегидратации, что наряду с комплексной терапией улучшат результаты лечения.
Материалы по функциональной морфологии тимуса необходимо 6.
учитывать при исследовании и коррекции иммунного статуса в процессе нарушения водно-солевого равновесия.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Григорьева, М.В. Морфология соединительной ткани при гормональном дисбалансе /М. В. Григорьева, Н.П. Божко, Л. Г.
Прошина // Клиническая медицина : межвуз. сб. стран СНГ. – Великий Новгород : Алматы, 2006. – Т. 12. – С. 185-189.
2. Григорьева, М.В. Структурные и метаболические изменения клеток соединительной ткани при экспериментальных воздействиях / М. В.
Григорьева, Н.П. Божко // Материалы XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов».
Т. IV – М.: Изд-во Моск. ун-та, 2006. – С. 495.
3. Григорьева, М.В. Состояние соединительной ткани при нарушении функции поджелудочной железы / М. В. Григорьева, Н.П. Божко, Л.
Г. Прошина // Вестник НовГУ. Сер. Медицинские науки. – 2006. – № 35. – С. 45- 47.
4. Григорьева, М.В. Цитохимическая характеристика соединительной ткани при экстремальных и экспериментальных воздействиях / М. В.
Григорьева, Н.П. Божко, Л. Г. Прошина // Актуальные проблемы современной медицины : респ. межвуз. науч.-практ. сб. – Великий Новгород, 2006. – Т. 8. – С. 165-168.
5. Божко, Н.П. Функциональные аспекты морфологии и видовые отличия соединительной ткани беспородных крыс и линии Вистар в норме и при экспериментальной дегидратации / Н.П. Божко // Актуальные проблемы современной медицины : респ. межвуз. науч. практ. сб. – Великий Новгород, 2006. – Т. 8. – С. 163-164.
6. Григорьева, М.В. Функциональная морфология соединительной ткани при экспериментальном сахарном диабете / М. В. Григорьева, Божко Н.П., Либо Ю. М. // Морфология. – 2006. – Т. 129, № 4. – С. 40-41.
7. Функциональная морфология соединительной ткани при экспериментальных и экстремальных воздействиях / Н.П. Божко, М.
В. Григорьева, Л. Г. Прошина, Ю. М. Либо // Материалы VII Международной научно-практической конференции “Здоровье и Образование в XXI веке”, 23-26 ноября 2006, Москва. – М., 2006. – С.
79.
8. Божко, Н.П. Морфологические и биохимические изменения подкожной рыхлой соединительной ткани у крыс линии Wistar при дегидратации / Н.П. Божко // Ученые записки института ИСХиПР НовГУ. – Великий Новгород, 2006. – Т. 14, вып. 3. – С. 63-67.
9. Божко, Н.П. Реакция клеточных элементов соединительной ткани на фоне экзогенного введения инсулина и альфа-токоферола / Н.П. Божко, М. В. Григорьева, Л. Г. Прошина // Бабухинские чтения в Орле, 28- марта 2007 г. : Материалы 6-й Всероссийской научной конференции. – М., 2007. – Вып. 25. – C. 39-40.
10. Морфологические и биохимические изменения подкожной рыхлой соединительной ткани у крыс линии Wistar при экспериментальных воздействиях / Л. Г. Прошина, М.В. Григорьева, Н.П. Божко, Ю. М. Либо // Современный мир, природа и человек (Сборник научных трудов «Естествознание и гуманизм») – Томск, 2007 – Том 4, № 2. – С. 33 – 34.
11.Божко, Н.П. Состояние защитных систем при дегидратации организма / Н.П. Божко // Актуальные проблемы современной медицины : респ.
межвуз. науч.-практ. сб. – Великий Новгород, 2007. – Т. 9, ч. 1. – С. 307 309.
12.Структурная перестройка соединительной ткани при экспериментальном аллоксановом диабете и введении витамина Е. / Л.Г. Прошина, Н.П.
Божко, М.В. Григорьева, Ю.М. Либо// Морфология. – 2007. – Т. 131, № 3. – С. 87.
13.Проблема адаптации соединительной ткани при экспериментальной патологии / М. В. Григорьева, Н.П. Божко, Л. Г. Прошина, Ю. М.
Либо //Клиническая медицина : межвуз. сб. стран СНГ. – Великий Новгород;
Алматы, 2007. – Т. 14. – С. 15-18.
14.Прошина, Л. Г. Ультраструктурная организация макрофагов соединительной ткани при экспериментальных воздействиях / Л.
Г.Прошина, М. В. Григорьева, Н.П. Федорова // Актуальные проблемы современной медицины – Великий Новгород, 2008. – Т.10. – С. 74-78.
15.Федорова, Н.П. Цитохимия и ультраструктура макрофагов подкожной соединительной ткани при введении мексидола / Н.П. Федорова, Л.Г.
Прошина, Ю.М. Либо // Клиническая медицина : межвуз. сб. стран СНГ. – Великий Новгород;
Алматы, 2008. – Т.16. – С. 25-30.
16.Федорова, Н.П. Гистохимия соединительной ткани и роль макрофагов в защитно-компенсаторных реакциях организма при экспериментальных воздействиях / Н.П. Федорова, Л.Г. Прошина, М.В. Григорьева // Клиническая медицина : межвуз. сб. стран СНГ. – Великий Новгород;
Алматы, 2008. – Т.16. – С. 35-39.
17.Влияние -токоферола на метаболизм клеток соединительной ткани / М.В. Григорьева, Н.П. Федорова, Л.Г. Прошина, Ю.М. Либо // Морфология – 2008 – № 2. – с. 36.
18.Федорова, Н.П. Соединительная ткань при гипоинсулинемии и обезвоживании организма / Н.П. Федорова, М.В. Григорьева, Л.Г.
Прошина// Научные труды IX международного конгресса Здоровье и образование в XXI веке. Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения А.Л. Чижевского, 27-30 ноября 2008. – М., 2008. – С.168-169.
19. Морфофункциональное состояние тимуса в норме и при экспериментальных воздействиях / Л.Г. Прошина, Н.П. Федорова, М.В. Григорьева, А.С. Александров* // Клиническая медицина :
межвуз. сб. стран СНГ. – Великий Новгород;
Алматы, 2009. – Т.17. – С.169-174.
20.Функциональная морфология соединительной ткани кожи и поджелудочной железы при экспериментальных воздействиях / Л.Г.
Прошина, М.В. Григорьева, Н.П. Федорова, Ю.М. Либо // Клиническая медицина : межвуз. сб. стран СНГ. – Великий Новгород;
Алматы, 2009. – Т.17. – С.165-169.
Подписано в печать 21.05. 2009г.
Формат 60х84 1/16, бумага офсетная.
Заказ № Тираж 100 экз.
Издательство –