авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Морфологическая вариабельность гипоталамуса в обеспечении конституциональной стресс-реактивности (экспериментальное исследование)

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Потанин Михаил Борисович МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГИПОТАЛАМУСА В ОБЕСПЕЧЕНИИ КОНСТИТУЦИОНАЛЬНОЙ СТРЕСС-РЕАКТИВНОСТИ (экспериментальное исследование) 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Волгоград - 2008 2

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Капитонова Марина Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Хлопонин Петр Андреевич доктор медицинских наук, профессор Швалев Вадим Николаевич доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Росздрава»

Защита состоится «_» _ 2008 года в _ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.008.01 при Волгоградском го сударственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «_» _ 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук Н.В. Григорьева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Стремительно нарастающий темп урбанической жизни, информаци онная перегрузка, скученность населения, возрастающая роль фактора об щения в обеспечении социального статуса, нарастание доли ксенобиотиков в питании и окружающей бытовой среде современного человека – вот дале ко не полный перечень факторов, определяющих возрастание роли стресса в патологии [Селье Г., 1960, 1982;

Судаков К.В., 1997, 2002;

Крыжановский Г.Н., 1999, 2004;

Пшенникова М.Г., 2001;

Вашадзе Ш.В., 2006;

Глазачев О.С., 2006;

Oliver G., Wardle J., 1999;

Bell M.E. et al., 2002;

Sivukhina E.V. et al., 2006;

Gibson L.E., 2006].

С момента публикации Г.Селье в 1936 году статьи «Синдром, вызы ваемый разными повреждающими агентами», теория стресса прочно вошла в арсенал медицины. На настоящий момент в теории стресса рас крыто немало клеточных и молекулярных механизмов, определяющих его основную динамику и органопатологию, как в остром, так и хроническом варианте развития стрессорной реакции. Определен спектр стресс активирующих и лимитирующих медиаторов, а также ульцирогенные, кар диотропные, иммуномодулирующие, эндокринные и поведенческие эффек ты развития стрессорных реакций [Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998;

Котов А.В., 1999;

Судаков К.В., 2003;

Devries A.C., et al., 1997;

Berridge M.J., et al., 1998;

Hamano H., et al., 2002;

Dube L, et al., 2005;

Wu Y.H. et al., 2006;

Stone EA, et al., 2006;

McCormick CM, et al., 2007].

В то же время, даже при ярко выраженных социальных и природных катастрофах тяжесть стрессорной реакции становится фатальной и опреде ляет течение и прогноз болезней лишь примерно у трети лиц, в то время как примерно 20-25% людей при воздействиях тех же факторов практически не реализуют стресс-индуцированную патологию [Анохина И.П., 1997, 2002;

Бадыштов Б.А., 1998;

Соколова Е.Б., с соавт., 2000;

Судаков К.В., Юматов Е.А., 2001;

Bremner J.D., et al., 1996;

Kelley A.E., Berridge K.C., 2002;

Pecora ro N., et al., 2004;

Dallman M.F., et al., 2005]. Изучение этой проблемы можно проводить с различных позиций. Сейчас уже известно немало генетических особенностей, определяющих уровень реактивности при стрессе и чувстви тельности к действию стрессорных факторов, причем два этих свойства не могут рассматриваться как полностью генетически сопряженные [Середенин С.Б., с соавт., 2000;

Анохин К.В., Судаков К.В., 2003;

Маркина Н.В., с со авт., 2003;

Bartolomucci A., et al., 2003;

Simpkiss J.L., Devine D.P., 2003;

McGill, et al., 2006;

Centeno M.L. et al., 2007;

Goto S., et al., 2007;

Ulrich-Lai Y.M. et al., 2007].

Помимо генетической детерминированности, одну из составляющих стресс-реактивности следует искать в морфофункциональных особенностях основных структур, отвечающих за регуляцию отношений организма с внешней средой в целом – прежде всего в организации церебральных струк тур [Пшенникова М.Г., с соавт., 2000;

Yehuda R., et al., 1991;

Avishai-Eliner S., et al., 2001;

Morin SM, et al., 2001;

Krady J.K., et al., 2002;

Bluthe R.M., et al., 2002;

Figueiredo H.F. et al., 2003;

Inoue K., et al., 2003;

Dallman M.F., et al., 2004;

Badowska-Szalewska E., et al., 2006;

Girotti M., et al., 2006].

Отечественными исследователями были раскрыты фундаментальные закономерности организации различных структур головного мозга при кон ституциональных фенотипах, связанных с высоким риском таких распро страненных заболеваний как ишемическая болезнь сердца и алкоголизм.

Расширены представления о структурных основах реагирования головного мозга на стресс, определяющих общую неспецифическую реактивность ор ганизма и, в итоге, нейроиммуно-эндокринные взаимодействия и органопа тологию стрессовой реакции [Писарев В.Б. с соавт., 1990, 2006;

Баннов А.Н., 1994;

Ерофеев А.Ю., 1995;

Смирнов А.В., 1998, 2005;

Гуров Д.Ю., 1999, 2005;

Фролов В.И., 2004;

Капитонова М.Ю. с соавт., 2005, 2007;

Мо розова З.Ч., 2006;

Загребин В.Л., 2007].

За рубежом многими учеными также демонстрировалась важная роль гипоталамуса в акцепции, трансформации и регулировании силы ответной реакции на стрессовые воздействия [Calogero A.E., 1995;

Stratakis C.A., Chrousos G.P., 1998;

Thompson R.H., Swanson L.W., 2003;

Okere C.O., Water house B.D., 2004;

Kwon M.S., et al., 2006;

Ostrander M.M., et al., 2006;

Mura matsu T., et al., 2006;

Kiss A., 2007;

Lowry C.A., et al., 2007].

За рамками этих исследований осталась такая теоретически и практи чески важная проблема, как определение особенностей стресс ассоциированных изменений в тех или иных структурах гипоталамуса у жи вотных с доказанной высокой или низкой стресс-реактивностью. Равно не изучались в сравнительном аспекте изменения этих структур при его вос произведении у животных с диаметрально противоположными уровнями стресс-реактивности.

Получение новых данных в нейроморфологии на современном этапе немыслимо без сопоставления результатов классических методов светоопти ческого исследования, иммуногистохимического выявления специфических молекул-участниц работы головного мозга и данных электронной микроско пии нейронов, нейроглии и других элементов нейронного окружения [Бого лепов Н.Н., 2002;

Николлс Дж.Г., с соавт., 2003;

Ахмадеев А.В., Калимулли на Л.Б., 2007;

Bonini P., et al., 2004;

Gingerich S., Krukoff T.L., et al., 2006;

Muramatsu T., et al., 2006;

Block M.L., et al., 2007;

Ma S., et al., 2007]. С тео ретических позиций рассмотрение структур мозга как гистотопографически очерченных ядер и проводников, выделение нейронных модулей и изучение межклеточных отношений в мозге следует рассматривать как взаимодопол няющие при выполнении подобного исследования.

С этих позиций актуальным представляется фундаментальное морфо функциональное исследование гипоталамуса как одной из ключевых струк тур в обеспечении конституционально различной стресс-реактивности.

Цель работы – установить закономерности варьирования отдельных гипоталамических структур у животных с различным уровнем конституцио нальной стресс-реактивности и уточнить на этой основе участие гипотала муса в обеспечении силы и выраженности стрессорной реакции.

Задачи исследования.

1. Изучить морфофункциональные различия отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

2. Изучить на иммуногистохимическом и ультрамикроскопическом уровне особенности строения нейронов ядер гипоталамуса, наиболее разли чающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

3. Выявить характер и выраженность стресс-индуцированных измене ний в ядрах гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

4. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и морфометрии различных структур гипоталамуса.

5. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и стрессорных изменений в гипоталамусе и разработать математическую модель, характеризующую выраженность и характер стрес сорных реакций с учетом стресс-реактивности и особенностей строения ги поталамуса на светооптическом и ультрамикроскопическом уровне.

Научная новизна.

На основании сопоставления результатов светооптического, иммуно гистохимического, ультрамикроскопического методов исследования и при влечения методов современного математического анализа результатов мор фометрии и определения стресс-реактивности получены новые данные о выделении ядер и полей гипоталамуса, наиболее значимых с позиции фор мирования конституциональной стресс-реактивности. К ним, помимо обще признанных, впервые отнесены дорсомедиальное ядро, латеральное гипота ламическое поле и два ядра маммилярного комплекса. Показано, что нейро ны разных ядер, участвующих в формировании стресс-реактивности, обла дают общим ультрамикроскопическим признаком – сравнительно более вы соким удельным объемом митохондрий в перикарионах и их более функ ционально активной организацией. Выявлены как стойкие признаки строе ния ядер гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью: более плотная упаковка нейронов при относительно малом количестве граничных сосудов и астроглиоцитов, относительно больший процент катехоламинер гических и глутаматцептивных нейронов.

Показаны различия в краниокаудальных и дорсовентральных гради ентах строения ядер и полей гипоталамуса как отражения различной кон ституциональной стресс-реактивности животных.

На основе полученных данных была сформирована теоретическая концепция о фенотипической вариабельности гипоталамуса, которая может рассматриваться как ключевой морфофункциональный субстрат стресс реактивности. Это подтверждено данными математического анализа с по строением адекватной модели взаимоотношений стрессорной афферента ции, взаимоотношений между ядрами гипоталамуса с учетом их конститу циональных особенностей и параметров последующего стрессорного ответа.

Научно-практическая значимость.

Полученные данные расширяют имеющиеся представления о струк турных основах стрессорной реакции с позиции конституциональной ней роморфологии. Выделение компонента вариабельности в участии отдельных структур гипоталамуса за счет особенностей их строения в итоге существен но проясняет общие различия в выраженности стрессорного ответа у раз личных организмов на идентичные по характеру и силе воздействия.

Моделирование стресса у животных с конституционально высокой стресс-реактивностью целесообразно для получения наиболее ранней и пол ной картины стресс-индуцированной патологии при воздействии стрессоров любой силы, в том числе умеренной.

Положения, выносимые на защиту.

1. На ультраструктурном, клеточном и тканевом уровне ядра и поля гипоталамуса (каждое – в разной степени) обладают широкой вариабельно стью строения, при этом можно выделить устойчивые наборы признаков, свойственных животным с конституционально высокой и низкой стресс реактивностью.

2.Особенности исходного строения отдельных ядер и полей гипотала муса у животных с различной стресс-реактивностью частично определяет характер и выраженность последующих стресс-индуцированных изменений в этих структурах.

3. Особенности строения гипоталамуса и происходящих в нем при стрессе изменений, в свою очередь, определяют общую выраженность и те чение стрессорной реакции.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались научных сессиях профессорско-преподавательского состава Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 1998-2006), на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), III Всероссийской научно-практической конференции «Медико биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека» (Волгоград, 2004), VII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), V съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2005);

Между народном конгрессе «Проблемы вегетативной дисрегуляции» (Донецк, 2005);

Российской научной конференции с международным участием «Ме дико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006);

Всероссийской конференции «Новые медицинские технологии» (Вол гоград, 2007).

Апробация работы осуществлена на совместном заседании кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии, анатомии человека, судебной медицины Волгоградского государственного медицин ского университета 25 апреля 2008 года.

По материалам диссертации опубликованы 26 научных работ, в том числе 9 - в журналах «Морфология», «Морфологические ведомости», «Бюл летень экспериментальной биологии и медицины» и «Вестник Волгоград ского государственного медицинского университета», включенных в дейст вующий «Перечень … ВАК» (медицинские науки, редакция апрель 2008).

Реализация и внедрение результатов исследования.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Волгоград ском государственном медицинском университете, Волгоградском государ ственном университете, Волгоградской государственной академии физиче ской культуры, Саратовском государственном медицинском университете, Ставропольской государственной медицинской академии, Астраханской го сударственной медицинской академии. Разработанные и апробированные диагностические методики используются Волгоградского областного пато лого-анатомического бюро и Волгоградского научного центра РАМН и ад министрации Волгоградской области.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 269 страницах машинописного текста, со держит 50 таблиц, иллюстрирована 62 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований с их обсуждением, заключения и выводов. Спи сок использованной литературы включает в себя 370 источников: 147 отече ственных и 233 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Специфика настоящего исследования потребовала решения несколь ких методических задач:

- максимально адекватного выделения животных с доказанными кон ституциональными особенностями стресс-реактивности без повреждения го ловного мозга;

- выделение из большого числа нейроморфологических методик дос тупного и воспроизводимого набора, на основании которого можно описать различия в строении гипоталамуса у выбранных животных с альтернатив ной стресс-реактивностью;

- выбора метода и интенсивности стрессорного повреждения, при ко тором уже имеется морфологический субстрат повреждения гипоталамуса, но еще не утрачена его относительная специфичность, позволяющая количе ственно оценивать различия между группами;

- выбор адекватного математического подхода для описания происхо дящих событий в виде модели, пригодной для интерпретации выявленных изменений морфологами.

Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был со ставлен на основе базисных нормативных документов МЗ РФ, рекоменда циями ВОЗ [Червонская Г. П., с соавт., 1998;

Zutphen L.F., 1993] и согласо ван с Локальным независимым этическим комитетом (Протокол №4 от декабря 2004 года).

На основании изложенных принципов после скрининга в основной части работы было проведено сравнительное изучение головного мозга у крыс: по пять в каждой подгруппе в зависимости от стресс-реактивности, вне стресса и после его воспроизведения (табл. 1).

Таблица Общая характеристика материала исследования по сериям Кол-во жи Серии экспериментов Характеристика серии вотных Скрининговый этап (неинвазивные тесты) определение уровня низкий уровень общей неспецифической средний уровень реактивности организма высокий уровень определение уровня низкий уровень хемоиндуцированной средний уровень стресс-реактивности высокий уровень Основной этап интактные высокая реактивность животные низкая реактивность Моделирование 24-часового высокая реактивность иммобилизационного стресса низкая реактивность Первым тестом для разделения животных на группы было определе ние универсального критерия стандартизации биомоделей - уровня общей неспецифической реактивности организма. Метод основан на определении болевой (ноцицептивной) чувствительности посредством дозированного электроболевого воздействия [Мулик А.Б., 1993, 2002]. Вторым относитель но малоинвазивным тестом стало определение термолабильности животных при действии сверхмалых доз бактериального липополисахарида. Для тако го свойства организма предложено соответствующее название - уровень хе моиндуцированной стресс-реактивности [Горизонтов П.Д., 1984]. В резуль тате этого тестирования для исследования было выделено 20 крыс с низким и 22 – с высоким уровнем реактивности.

Сопоставление сочетаемости тестов (конкордантности) показало, что среди 21 животного хотя бы с одним из признаков низкой реактивности у 17 (74%) присутствовали оба признака. Аналогично, среди 22 животных с высоким уровнем хемоиндуцированной стресс-реактивности оказались все 15 животных с высоким уровнем общей неспецифической реактивности ор ганизма (конкордантность – 68%).

Для исследования гипоталамуса интактных животных и после воспро изведения стресса из каждой группы крыс отобрано по 10 животных с мак симальной экспрессией признаков, то есть минимальным порогом электро болевой вокализации и максимальной термолабильностью – для группы жи вотных с высокой стресс-реактивностью (ВСР) и альтернативными характе ристиками – для группы крыс с низкой стресс-реактивностью (НСР).

Стресс моделировали у 5 крыс группы ВСР и у 5 крыс групп НСР пу тем однократной 24-часовой иммобилизации. С целью верификации стадии стресса проводилось взвешивание органов животных, макро- и микроскопи ческое исследование желудочно-кишечного тракта, тимуса и надпочечни ков.

Непосредственно после эвтаназии головной мозг животных извлекали ща дящим образом из черепа, помещали в 10%-ный раствор нейтрального забуфе ренного формалина (рН=7,4) на 30 мин, после чего разделяли на 3 блока (А, В и С) фронтальной секцией через точку P0 по Сентаготаи и тангенциальной – от бо розды, разделяющей полушария большого мозга и мозжечка до границы между стволом и промежуточным мозгом на вентральной его поверхности. Материал дофиксировали в течение 24 ч. С фронтальной поверхности блока В и окципи тальной поверхности блока А начинали приготовление серийных срезов толщи ной 5-7 микрон – 200-240 для блока В и 100-150 – для блока А. Каждый пятый срез наклеивали на предметные стекла в порядке их получения и маркировали.

Это позволяло воспроизвести стререометрическую архитектонику гипоталамуса от фронта А1 до Р4,0 в координатах Хорслей-Кларка, то есть целиком [Paxinos G., Watson C., 1986]. Для уточнения расположения ряда объектов и идентификации срезов вне типичных проекций использовали также современные атласы проме жуточного мозга: Н.Н. Боголепова с соавт. (2002), Paxinos G., Watson C. (1996) и Swanson L.W. (1998).

Передняя гипоталамическая область была нами объединена с иногда описываемой отдельно преоптической областью. В ней выделяли и отдельно изучали строение медиального (POM) и латерального преоптических (POL), перивентрикулярного (PeV), переднего гипоталамического (NAH), супраоп тического (SO), супрахиазматического (SCh) и паравентрикулярного (PV) ядер. Помимо ядер, здесь присутствовали и проводники, описанные как элементы нейропиля по различным направлениям и смешанные области, в частности - ретрохиазмалъная (RCA).

В медиальной группе основу вещества гипоталамуса составляли крупные дорсомедиальное (DM) и вентромедиальное (VM) и аркуатное (Arc) ядра. В первом различали дорсальную и вентральную части.

Особеннностью этой области было обилие вертикальных и горизонтальных проводников, формирующих в нейропиле ассоциативные связи с другими элементами стресс-системы.

Латеральное гипоталамическое ядро (LH) и серый бугор, составляю щие наружную группу ядер гипоталамуса, были представлены скоплениями неплотно расположенных нейронов средних размеров с достаточно большим количеством астроглии и микроглии между ними. Большая масса нейропиля в этой области позволила рассматривать эту зону как единое латеральное гипоталамическое поле (AHL), простирающееся во фронтальных срезах в координатах P1,5-P3,0.

Элементы маммилярного комплекса, то есть заднего гипоталамуса, об наруживали в сечениях Р3,0 – P4,5 по Сентаготаи и идентифицировали как супрамаммилярное ядро (SuM), дорсальная (PMd) и вентральная (PMv) час ти премаммилярных ядер, латеральное маммилярное ядро (ML), медиальная (MMm) и латеральная (MMl) части медиального маммилярного ядра. В свя зи с достаточно однородным строением и непостоянством выявления MMl у крыс последние два объекта были подвергнуты анализу совместно. Среди большого количества проводников в задней гипоталамической области большое внимание уделяли мощному восходящему маммило-таламическому тракту.

Для классического нейрогистологического исследования использовали окрашивание препаратов мозга гематоксилином и эозином, а также по Нисслю.

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 1996, 2002] с использованием автоматического анализатора изображений «Видео тест-Морфо» (СПб, Россия). В каждом ядре раздельно определяли объемную долю нейронов (%), среднее число нейронов в 1 мм 3 ткани, средние объемы (СО) перикариона нейронов и нейронного окружения (мкм 3), их отношение, а также среднее число граничных нейронов и астроглиоцитов в окружении перикариона нейрона. Выраженность глиальной реакции оценивали по среднему численному соотношению глия/нейрон, среднему размеру ядер глиоцитов и средней суммарной яркости иммунопозитивного материала по сле окраски на макрофагальный антиген и кислый глиальный протеин.

Результаты при исследовании областей, наиболее «актуальных» по ре зультатам предшествующего анализа, дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН. После указания границ объекта и его логического центра (им был выбран геометрический центр ядра) программа самостоятельно разби вала объект на выбранное число секторов и зон. Для нейронов нами было эмпирически подобрано 36 секторов и 10 зон – всего 360 участков (рис. 2).

В качестве первичного материала получали матрицу секторального и ради ального распределения тинкториальной плотности, в качестве окончатель ного – коэффициенты, характеризующие графическую функцию распреде ления:

K1 – тангенс угла подъема кривой в восходящей части графика, K1 – тангенс угла снижения кривой в восходящей части графика, Im – максимальная интенсивность окраски в кольцевой зоне, усл. ед., R – расстояние от центра ядрышка до зоны с I m Vm – максимальная вариабельность интенсивности по секторам, усл. ед.

Полученные количественные показатели достаточно полно характери зуют изменения нейронов в динамике повреждения [Новочадов В.В., 2005].

На срезах, окрашенных по Нисслю, определяли степень стрессорного поражения нейронов [Чубинидзе А. И., 1972]. Производился подсчет нейро нов коры, которые разделили на 4 группы:

- нейроны нормальные, неизмененные (НН);

- слабоизмененные нейроны (СН) с сохранением ядра, но со структур ными или тинкториальными нарушениями компонентов цитоплазмы (ост рое набухание, гиперхроматоз, хроматолиз, центральная тинкториальная ацидофилия);

- грубо измененные нейроны (ГН) (сморщивание, «тяжелое измене ние», гомогенизирующее изменение нейронов, клетки-тени);

- нейроны отсутствующие (ОН).

Степень поражения нейронов вычисляли по формуле:

СП=(2ОН+2ГН+СН)x100/2(ГН+ОН+СН+НН) и выражали в процентах. Вы деляли 4 степени поражения: легкая (менее 20%), средняя (20-50%), тяже лая (более 50%), распространенный некроз. Исследование проводили в полях зрения на 4 срезах для каждой области ГМ (100-120 измерений на се рию).

Иммуногистохимическое исследование производили с использова нием следующих моноклональных мышиных антител коммерческими набо рами фирмы Dako Cytomation (Дания):

- к макрофагальному антигену, окрашивающий микроглию (HAM-56);

- к кислому глиальному протеину (GFAP);

- к тирозингидроксилазе (TH) - к глутаматному рецептору (GR-2) - к нейрональной нитроксидсинтазе (NOS-1);

- к эндотелиальной нитроксидсинтазе (NOS-3).

Выбор двух последних антигенов был обусловлен тем, что по совре менными данным, именно дисбаланс нитроксидсинтаз становится ключе вым стартовым механизмом повреждений в центральной нервной системе при стрессе [Han H.S.,et al., 2002;

Kotake Y., et al. 2002].

Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидаз ного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антиге нов. Экспрессию оценивали по разделению нейронов на классы в зависимо сти от степени экспрессии иммунопозитивного материала по оптической плотности выделенных масок: негативные, слабопозитивные, позитивные и гиперэкспрессирующие с выражением доли каждого класса в процентах.

Соотношение экспрессий определяли через их удельные яркости в сопоста вимых областях ГМ на серийных срезах, обработанных на одном предмет ном стекле. Для достоверности полученных результатов применяли пози тивные и негативные контроли антигенов, а также негативные контроли ан тител [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004;

Kelman Z., 1997;

Rosa M.A., et al.

2000;

Paunesku T. et al., 2001].

Для электронно-микроскопического исследования животных под вергли эвтаназии путем внутривенной инфузии 4%-ного раствора парафор ма на 0,1 М какодилатном буфере (суправитальной фиксации) под нембута ловым наркозом. Дофиксацию кусочков размером 1 мм 3 производили в те чение 12 часов в 4%-ном растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1% растворе тетраокиси осмия в 0,1М какодилатном буфере (pH=7,4) при температуре +4 оС [12].

После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера ма териал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротомах LKB- 8800 и монтировали на медные сетки.

После контрастирования в 2,5% растворе уранилацетата на 50 о этаноле в те чение 40 минут и 0,3 % растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-540 при ускоряющем напря жении 60 кВ. Документирование производили с использованием фотопла стинок «Для ядерных исследований». Электронные микрофотограммы изго тавливали на фотографической черно-белой бумаге «Унибром 160 БП».

Сканированные ультрамикрофотографии анализировали в программе AM Lab Hesperus v3.0 beta. В качестве показателей для структурного анали за использовались такие показатели, как объемная доля митохондрий в пе рикарионе, отношение яркостей эухроматин/гетерохроматин, эухрома тин/матрикс цитоплазмы, матрикс митохондрий/матрикс цитоплазмы и матрикс цитоплазмы/содержимое синаптосом в трехмерной системе коорди нат RGB. Также анализировали фактор формы кариолеммы, наружной мем браны митохондрий, показатель выраженности крист митохондрий.

Вариационно-статистическую обработку результатов проводили в среде электронных таблиц MS Excel. Она была проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами (расчет средней арифме тической величины, среднего квадратичного отклонения, ошибки репрезен тативности для каждого параметра в исследуемых группах животных, срав нение средних значений по критерию Стьюдента с достоверностью разли чий. Затем, руководствуясь закономерностями, принятыми для медико биологических исследований (объем выборок, характер распределения, не параметрические критерии), оценивали достоверность различий выборок.

Корреляционный анализ проводился методом простых парных корреляций Спирмена [Зайцев В.М., с соавт., 2003;

Петри А., Сабин К., 2003;

Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В преоптической области у животных с высокой стресс-реактивностью для POM характерно более редкое расположение относительно крупных нейронов с большим объемом окружения и количеством граничных астрог лиоцитов;

в PeV выявляются более мелкие, но плотнее расположенные ней роны с большим числом граничных нейронов и малым представительством микроглии, а строение POL не отличалось от такового у животных с низкой стресс-реактивностью. Полученные данные в целом свидетельствуют о не однородности строения ядер преоптической группы переднего гипоталамуса в срезе конституциональной реактивности.

В собственно переднем гипоталамусе для крыс с высокой стресс реактивностью были характерны относительно более крупные размеры ней ронов, их ядер и нейронного окружения (более всего – для SCh). Но для SCh характерна более высокая ОД нейронов, а для SO и PV – относительно более низкая. Интересно, что в триггерном ядре стресса – паравентрикулярном отличия между группами интактных крыс были минимально выражены.

Животные с высокой стресс-реактивностью имеют в передней гипоталами ческой области меньшее представительство астро- и микроглии (SCh PV SO) и неодинаково выраженное, но относительно высокие экспрессии нит роксидсинтаз (максимальные – в SO), рис. 1.

Исследования, проведенные в медиальной и латеральной гипоталами ческой области у интактных животных с различной стресс-реактивностью, выявили существование целого ряда существенных отличий различий толь ко в двух ядрах – дорсомедиальном и аркуатном, а также в латеральной ги поталамической области. Они касались как показателей размерности ядер и отдельных структур, так и сложности их организации.

NOS- NOS- Микроглия Аст роглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Супраоптическое ядро NOS- NOS- Микроглия Аст роглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Супрахиазматическое ядро NOS- NOS- Микроглия Аст роглия СО нейронного окружения 0, СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Паравентрикулярное ядро Рис. 1. Особенности строения ядер передней гипоталамической области крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.

Принципиальные различия в отношении дорсомедиального и вентро медиального ядра гипоталамуса (первое имеет яркие отличия, зависящие от стресс-реактивности, второе – практически отличий не имеет) может иметь ключевое значение в участии этой области гипоталамуса при развитии стресса. Также удалось показать, что нейроны аркуатного и дорсомедиаль ного ядер гипоталамуса обладают общей особенностью у крыс с высокой стресс-реактивностью. Она заключается в более высоком представительстве катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов, что определяет для этих ядер повышенную роль в модуляции силы и продолжительности стрес совой реакции (рис. 2).

Рецептор GR Тирозингидроксилаза Микроглия Астроглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Вентромедиальное ядро Рецептор GR Тирозингидроксилаза Микроглия Астроглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Дорсомедиальное ядро Рис. 2. Особенности строения ядер медиальной группы гипоталамуса крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.

Большая сложность организации латеральной гипоталамической об ласти (но не серого бугра) является одним из доказательств большего значе ния внешних связей гипоталамуса с таламусом и фронтальными областями коры головного мозга в обеспечении высокой стресс-реактивности в сравне нии с нервными связями между ядрами гипоталамуса (рис. 3).

Более сложное строение нейропиля было характерно для ретрохиаз мальной и латеральной гипоталамической области животных с высокой стресс-реактивностью.

Рецептор GR Тирозингидроксилаза Микроглия Астроглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Аркуатное ядро Рецептор GR Тирозингидроксилаза Микроглия Астроглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Латеральное гипоталамическое ядро Рис. 3. Особенности строения ядер латеральной группы гипоталамуса крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.

На уровне маммилярного комплекса показана максимальная вариа бельность строения SuM и PMv, для которых были характерны более плот ная нейронная упаковка, относительно большие размеры нейронов и их ядер, большое количество микроглии.

Математический анализ методом определения асимметрии выборок, цензурированных по признаку реактивности, выявил многочисленные «сце пления» данных показателей строения нейронов и их окружения со стресс реактивностью животных. Практически те же показатели выявлялись как связанные с реактивностью при корреляционном анализе.

Обобщая представления о строении ядер у интактных животных, мы предположили их реакцию при стрессе с учетом строения нейронов, их ок ружения, астроглиального и микроглиального представительства, картиро вания ряда изученных медиаторов, а для SO и SCh - ультрамикроскопиче ского строения. Все исследованные ядра гипоталамуса были разделены на пять групп (рис. 4).

«слабые» ядра с низкой практические не зави- «слабые» ядра с высокой по потенциальной рези- сящие от реактивности – тенциальной резистентно стентностью – POM POL, VM, PMd и ML стью – PeV и SO «сильные» ядра с низкой потенциаль- «сильные» ядра с высокой потенциаль ной резистентностью – PV и DM ной резистентностью – SCh, ARC, SuM, и PMv Рис. 4. Распределение вариабельных ядер гипоталамуса у крыс с высокой стресс-реактивностью на основании математического анализа.

1. К «сильным» ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессорному повреждению у животных с высокой стресс-реактивностью отнесены супрахиазматическое, аркуатное, супрамамиллярное и вентраль ная часть премамиллярного ядра.

2. «Сильными», но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессорному повреждению для животных ВСР группы были признаны триггерные ядра стресса - паравентрикулярное и дорсомедиальное.

3. К «слабым» структурам, но с высокой резистентностью к поврежде нию были отнесены супраоптическое и перивентрикулярное ядро.

4. Медиальное преоптическое ядро было единственным, расцененным как «слабое» с низкой резистентностью.

5. Латеральное преоптическое ядро, вентромедиальное ядро, медиаль ная часть премамиллярного ядра и латеральное мамиллярное ядро – ядра, строение и резистентность которых к повреждению от стресс-реактивности практически не зависели.

Безусловно, проводя такое разделение, мы отдавали себе отчет в том, что при развитии стресса на реальные изменения в ядре будет оказывать влияние не только особенности его нейронного окружения или устройства самих нейронов, но также общая и специфическая функциональная нагру женность в реализации работы стрессорной системы.

Подобный анализ возможен только в сопоставлении изменений по от дельным ядрам применительно к их установленной функции, рецепторному аппарату, медиаторному представительству и вовлеченности в развитие стрессорных реакций.

В преоптической зоне гипоталамуса, помимо развитого нейропиля, определялись три основных ядра, из которых максимально вариабельным от стресс-реактивности оказалось POM. Эта структура связана с терморегуля цией и участвует в регуляции секреции половых гормонов, сексуального по ведения, имеет выраженные различия у самцов и самок [Yoshida K. et al., 2002;

Lowry C.A. et al., 2007]. Предполагается также участие этой зоны и в интеграции импульсов сердечно-сосудистой системы [Акмаев И.Г., 2003;

Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.В., 2006], реакциях гипоталамуса на хрони ческую эндогенную интоксикацию [Фролов В.И., 2004].

На основе нашего анализа POM интактных животных было отнесено к «слабым» ядрам с низкой резистентностью. Это определялось относительно меньшими размерами перикарионов и ядер нейронов, менее плотной их упаковкой в ядре с относительно малым количеством граничных клеток и относительно низким микроглиальным представительством. В POM живот ных ВСР группы определялся относительно высокий исходный уровень экс прессии нейрональной нитроксидсинтазы.

В то же время, при стрессе это ядро оказалось поврежденным в отно сительно малой степени (около 5,0%), причем в равной степени в группах с различной стресс-реактивностью. Аналогичные факты были выявлены и при последующем анализе строения ядра после стресса.

По-видимому, POM не относится к ядрам, в значительной степени включающимся в реализацию стресс-системы, в связи с чем его изменения в нашей модели стресса оказываются менее ожидаемых и в малой степени за висят от стресс-реактивности. Определенную роль в этом может играть и общая картина защитного торможения, описанная для стресса в отношении преоптических структур в целом [Crowder R.J., Freeman R.S., 1998;

Stone E.A., et al., 2006], равно как и относительно умеренная реализации сосуди стых нарушений за счет активации нитроксидсинтаз и ФНО-зависимого апоптоза нейронов [Куликов В.П. с соавт., 2005;

Меньшанов П.Н. с соавт., 2007;

Schuler M., Green D.R., 2001;

Schultz D.R., Harrington W.J.Jr., 2003;

Mattson M.P., Kroemer G., 2003 ].

Перивентрикулярное ядро гипоталамуса у животных с высокой стресс реактивностью было нами отнесено к «слабым», но с высокой резистентно стью к повреждению. Этот прогноз полностью подтвердился. Степень по вреждения нейронов в PeV была чуть более 5% в ВСР группе, более 11% - в НСР группе. Изменения других показателей, в том числе незначительная ак тивация нитроксидсинтаз, хорошо согласуются с известными из литературы сведениями об относительно малом участии PeV в стрессорной реакции, умеренной выраженности ФНО-зависимого апоптоза при стрессе [Меньша нов П.Н. с соавт., 2007;

Figueiredo H.F. et al., 2003;

Badowska-Szalewska E., et al., 2006]. Локальное повреждение PeV способно предотвратить стрессорное ограничение секреции тиротропного гормона и гормона роста [Лычкова А.Э., Смирнов В.М., 2002;

Campbell R.E. et al., 2003].

Таким образом, мы подтвердили предположение о том, что у живот ных с высокой конституциональной стресс-реактивностью имеется исходно большая вероятность стрессорного повреждения POM, тогда как PeV по вреждается в меньшей степени и обладает высокой резистентностью к по вреждению.

Супраоптическое ядро рассматривается как наиболее поражаемое ядро при хроническом стрессе самой разной этиологии [Писарев В.Б., 1990;

Писарев В.Б., с соавт., 1998, 2006;

Фролов В.И., 2004]. Нейроэндокринные клетки SO и PV являются источниками кортиколиберина, тиролиберина и ряда других нейрогормонов, непосредственно вовлекающихся в стартовые (триггерные) механизмы стресса [Казакова с Т.Б. соавт., 2000;

Рыбникова Е.А. с соавт., 2001;

Вашадзе Ш.В., 2006;

Jorgensen H. et al., 2003;

Inoue T. et al., 2004].

В отношении этой структуры анализ выявил несколько противоречи вых данных. С одной стороны, при стрессе данное ядро у крыс с высокой стресс-реактивностью повреждалось сильнее, ОД нейронов в SO у животных ВСР группы уменьшалась на 22,3%, тогда как в НСР группе – только на 14%. Изменение размеров нейронов, сложности их окружения и количества нейроглии в принципе свидетельствовали, что SO ядро является «сильным звеном» главным образом у крыс с низкой конституциональной стресс реактивностью. В то же время существенные различия в экспрессии нитро ксидсинтаз, отсутствие существенных корреляционных доказательств между степенью повреждения и другими морфометрическими показателями не по зволили считать резистентность этого ядра сниженной. В итоге SO у живот ных с высокой стресс-реактивностью следовало отнести к группе «слабых» ядер с высокой резистентностью к повреждению.

При ультрамикроскопическом исследовании были выявлены еще не сколько особенностей SO у крыс с высоким уровнем стресс-реактивности:

относительно более высокий удельный объем митохондрий в перикарионах с их более функционально активной организацией.

Исходя из ключевых функций SO, результаты нашего анализа можно интерпретировать следующим образом.

1. Супраоптическое ядро способно к медленноволновой секреции кор тиколиберина, является основным продуцентом вазопрессина. Продукцию окситоцина и половых стероидов следует отнести скорее к минорным функ циям ядра [Patel K.P., et al., 2000;

Nomura M. et al., 2003]. Наряду с прямым своим действием, вазопрессин и окситоцин через местные механизмы моду лируют секрецию кортиколиберина и запуск секреции АКТГ [Sun Y. et al., 2001;

Wotjak C.T. et al., 2002].

2. При стрессе в SO происходит резкое уменьшение секреции вазо прессина, и данный эффект нередко приводит к развитию сосудистого кол лапса с переходом в шоковое состояние [Сивухина Е.В. с соавт., 2003;

Giusti-Paiva A., et al., 2002]. Подъем синтеза и секреции кортиколиберина начинается не сразу после стресса, а через 6-12 часов, обеспечивая закреп ление и определенную пролонгацию стрессовой реакции. Синтез окситоци на при стрессе в SO практически не меняется, а половых стероидов (что не столь существенно для гормонального пула в целом) – снижается [Berciano M.T. et al., 2002].

3. Следовательно, у животных с высокой стресс-реактивностью за счет существования особенностей строения SO в полной мере не обеспечивается адекватное развитие второй, более медленной волны выброса кортиколибе рина и соответствующих колебаний секреции стресс-лимитирующих гормо нов. Это и придает стрессу скоротечность и остроту, выдаваемую по внеш ним признакам за «высокую» реактивность.

Супрахиазматическое ядро было отнесено нами к сильным ядрам с потенциально высокой устойчивостью к повреждению.

Наличие в SCh интактных крыс ВСР группы относительно более вы сокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS 1/NOS-3 мы рассматриваем в качестве одной из ключевых характеристик, связанных с конституциональной стресс-реактивностью.

В нейронах SCh крыс ВСР группы также выявлено преобладание ге терохроматина, преимущественно рядом с ядерной оболочкой, отсутствие инвагинаций кариолеммы и высокая электронная плотность кариоплазмы.

Для них характерно обилие органелл в цитоплазме перикариона, моно морфность митохондрий и относительно малая плотность их матрикса. В своей совокупности эти особенности также рассматривались как субстрат большей функциональной активности и лабильности SCh у животных с вы сокой стресс-реактивностью.

При стрессе в SCh развивались относительно малые изменения, и ми нимальные – у животных с высокой стресс-реактивностью. Наличие в SCh стрессированных крыс ВСР группы относительно небольшого прироста NOS-1-позитивных нейронов и умеренный коэффициент NOS-1/NOS-3 сви детельствовали о его резистентности к стрессорному повреждению. Элек тронно-микроскопическое исследование нейронов выявило сохранение структуры ядерного хроматина и кариолеммы, небольшое увеличение числа митохондрий без структурных особенностей в них. В перинуклеарной об ласти части нейронов наблюдалась отчетливая вакуолизация, но мембран ные органеллы были многочисленны и структурно не повреждены.

Гуморальная активность SCh многообразна - это секреция вазопрес сина, окситоцина, опиатов, гонадолиберина, бомбезина [Владимиров С.В., Угрюмов М.В., 1995;

Васильев Ю.Г., с соавт., 2003;

Калинкин М.Н., с со авт., 2004;

Chan R.K. et al., 1993;

Carloni S. et al., 2004].

Сопоставление этих особенностей SCh у интактных животных и стресс-индуцированных изменений позволило с функциональным предна значением ядра позволило сделать следующее логическое построение.

1. SCh является центром циркадианных ритмов, которое воспроизво дится даже на удаленных из организма плоскостных срезах-культурах гипо таламуса, содержащих данное ядро. Важным входом этого ядра является проекция глаза, после разрушения SCh у крыс теряется способность на страивать эндогенный ритм на частоту чередования свет/темнота [Николс Дж. Г., 2003;

Васильев Ю.Г., с соавт., 2003;

Калинкин М.Н., с соавт., 2004;

Chan R.K. et al., 1993;

Carloni S. et al., 2004].

2. При стрессе и шоке с сохранением активности SCh связывают ос новные механизмы резистентности. Происходит учащение спонтанной им пульсации нейронов SCH, не связанных с суточной активностью, секреция коритиколиберина и окситоцина при этом увеличивается, гонадолиберина и опиоидов - уменьшается [Демко П.С. с соавт., 2002;

Кузнецов И.Э., 2003;

Sharkey J. et al., 2000;

Fonnum F., Lock E.A., 2004;

Slikker W.Jr. et al., 2005].

3. Следовательно, наличие сильного относительно мало повреждаемо го SCh у животных с высокой стресс-реактивностью способно модулировать триггерные эффекты стресса, тонически повышая активность многих струк тур ЦНС и более жестко блокируя основные гормональные оси, затормажи ваемые при остром стрессе (половых гормонов, гормона роста и др.). Этим и достигается более очерченная яркая картина стрессовой реакции у живот ных с высокой стресс-реактивностью.

Наконец, паравентрикулярное ядро занимало в наших исследовани ях особое место. Детально изученное, оно справедливо называется ключе вым триггерным ядром стресса. В первую фазу стресса оно выбрасывает большие количества кортиколиберина, оказывающего дальнейшее влияние на деятельность симпатико-адреналовой системы и, соответственно, измене ние коронарного кровотока, артериального давления, частоты сердечных сокращений, сосудистой проницаемости [Кузнецов И.Э., 2003;

Хитров Н.К., Салтыков А.Б., 2003;

Куликов В.П. с соавт., 2005;

Писарев В.Б. с соавт., 2006;

М.Ю.Капитонова с соавт., 2008]. Известно, что при стрессе кортико либерин может непосредственно использоваться в ткани гипоталамуса в ка честве нейротрансмиттера для модуляции высших поведенческих реакций [Shumake J. et al., 2001;

Boutahricht M. et al. 2005].

У интактных животных мы не выявили существенных особенностей строения самих нейронов PV в связи со стресс-реактивностью. В то же вре мя, на один нейрон в PV животных ВСР группы приходилось в среднем меньше граничных нейронов и астроглиоцитов, в сравнении с аналогичны ми показателями в НСР группе. Мы предположили, что стресс-реактивность определяется на уровне гипоталамуса не столько филогенетически закреп ленным для данного вида строением PV, сколько особенностями относи тельно молодых в филогенетическом отношении ядер с модулирующим в отношении стрессовой реакции действием, а также сложностью организации внутригипоталамических связей (нейропиля).

В то же время, наличие в PV интактных крыс ВСР группы относи тельно более высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый ко эффициент NOS-1/NOS-3 свидетельствовали о его более высокой реактивно сти при развитии стресса. На основании математического анализа связей со стресс-реактивностью PV было отнесено к «сильным», но со сниженной по тенциальной резистентностью к стрессу.

Действительно, при моделировании стресса у животных ВСР группы мы обнаружили большую степень поражения нейронов (25,6% против 13,8% в НСР группе). ОД нейронов в PV у животных с высокой стресс реактивностью уменьшалась почти вдвое, а в НСР группе – только на 37%, аналогично более интенсивные изменения были определены и для размеров ядер нейронов, прироста коэффициента окружение/нейрон и микроглиаль ной реакции.

При сопоставлении полученных данных о строении интактного PV в связи со стресс-реактивностью и его стресс-индуцированных изменений, мы построили следующее логическое заключение.

1. Основной функцией PV является секреция окситоцина и вазопрес сина крупноклеточной частью нейронов, мелкоклеточная часть ядра моду лирует эти функции и секретирует кортиколиберин [Акмаев И.Г., 2001;

Ев сеев В.А., с соавт. 2001;

Stern J.E., Zhang W., 2003]. Кроме этого, в PV про исходит синтез эндорфинов, ангиотензина, соматостатина, соматолиберина и пролактолиберина [Campbell R.E. et al., 2003]. Ассоциативные нейроны PV имеют в основном пептидергическую природу и обеспечивают взаимо действие пулов основных клеток-гормонопродуцентов, и на местном уровне акцептируют результат [Сивухина Е.В. с соавт., 2003;

Лискина Е.Б., 2003;

Кузнецов И.Э., 2003;

Kc P. et al. 2002;

Figueiredo H.F. et al., 2003;

Jingyi M.A.

et al., 1994;

Jorgensen H. et al., 2003;

Nomura M. et al., 2003;

Dallman M.F. et al., 2005].

2. PV непосредственно участвует в запуске стрессовых реакций. Вы брос кортиколиберина и молекулярные изменения в нейронах PV показаны уже спустя несколько секунд от начала стрессорного повреждения – раньше всех других изменений секреции в ЦНС [Корнева Е.А., 2000;

Суворов Н.Ф., Шуваев В.Т., 2002;

Reyes T.M. et al., 2003;

Campbell R.E. et al., 2003;

Girotti M. et al., 2006;

McCormick C.M. et al., 2007]. Нейроны PV, синтезирующие вазопрессин и соматостатин, также являются стресс-реактивными с ответом на стрессорное раздражение через 3-6 мин от его начала [Kc P. et al. 2002;

Girotti M. et al., 2006;

Dallman M.F. et al., 2005].

3. Соответственно, у животных с высокой стресс-реактивностью мы наблюдаем не столько повреждение, сколько истощение PV при стрессе, обеспечивающее максимально выраженный характер стрессорной актива ции с выбросом кортиколиберина и других модулирующих стрессорные ре акции гормонов. Это, безусловно, «сильное» ядро у животных с высокой стресс-реактивностью. Его весьма высокая степень повреждения при разви тии стресса преимущественно определяются функциональной нагрузкой PV и слабостью его микроглиального представительства.

Завершая описание переднего гипоталамуса в нашей работе, мы не можем не коснуться и не обсудить результатов нового метода исследования в нейроморфологии – радиальной морфометрии биологических объектов с использованием биологически актуальной системы координат.

Принцип радиальной морфометрии основан на классических концеп тах нейроморфологии, благодаря которым и были, собственно говоря, выде лены, ядра гипоталамуса [Автандилов Г.Г., 1973;

Боголепов Н.Н, 1980;

Пи сарев В.Б., 1990;

Thompson R.H., Swanson L.W., 2002]. Компьютерная мор фометрия, основанная на построении осевых градиентов (трансверсального, дорсовентрального и краниокаудального) тинкториальных свойств нервной ткани является эффективным подходом к анализу конституциональных осо бенностей морфологии ЦНС. С помощью формализованных показателей функции распределения интенсивности при морфометрии препаратов, ок рашенных классическим для нейроморфологии методом – тионином по Нисслю, нам удалось показать особенности, свойственные SO, SCh, PV у животных с различной стресс-реактивностью.

1. У животных с высокой стресс-реактивностью, структуры переднего гипоталамуса, расположенные краниально, имели меньшее соотношение нейрон/глия, а структуры, расположенные каудальнее – большее, в сравне нии с НСР группой.

2. У интактных крыс с высокой стресс-реактивностью плотность рас положения нейронов в SO оказывалась достоверно выше в вентральной час ти ядра и имела флуктуации плотности (идентифицируемые как нейронные ансамбли), тогда как у крыс НСР группы нейроны располагались более рав номерно по всему объему SO. При стрессе наблюдалось выравнивание (го могенизация) плотности, более показательное у животных с высокой стресс реактивностью.

3. У животных ВСР группы вне стресса нейроны плотнее располага лись к дорсомедиальной части SCh, в то время как у крыс с конституцио нально низкой реактивностью - к медиальной части, часто образуя при этом нейронные ансамбли. При стрессе у животных ВСР группы снижались ме диолатеральный и дорсовентральный градиенты, тогда как у крыс с низкой стресс-реактивностью сохранялось относительно плотное и гомогенное рас положение нейронных ансамблей со склонностью к концентрации в дорсо медиальном направлении от центра ядра.

4. В PV интактных животных ВСР группы нейроны располагались равномерно, тогда как у крыс с низкой стресс-реактивностью их плотность нарастала к центру ядра. При стрессе дорсовентральный градиент плотности нейронов выравнивался, появлялось четкое понижение плотности к лате ральной периферии ядра, более выраженные в ВСР группе.

В настоящее время все чаще звучит мысль о том, что современная ко личественная морфология с введением в практику компьютерного анализа образов должна перейти от механической «оцифровки» численных показа телей, описывающих структуры, к более сложным, интерпретирующим свя зям между элементами единой системы гистиона [Автандилов Г.Г., 2002;

Писарев В.Б., с соавт., 2006;

Hamano H. et al., 2002].

В переднем гипоталамусе удалось проанализировать и NO-зависимый механизм повреждения нейронов.

Окись азота участвует в механизмах повреждения нейронов при трав ме, острой ишемии мозга, стрессе и шоке. Любые процессы, ведущие к на коплению ионов Са2+ в клетке (энергетический дефицит, изменения актив ного ионного транспорта, глутаматная «эксайтотоксичность», оксидантный стресс), сопровождаются повышением уровня NO [Марков Х.М., 2006;

Ya mamoto F. et al., 2007;

Gingerich S., Krukoff T.L., 2006].

Возбуждение NMDA рецепторов приводит к активации NOS-1 и по вышенному высвобождению NO. В настоящее время нет однозначного мне ния о роли оксида азота в механизме токсического действия глутамата. Его токсическое действие связано с нарушением митохондриального окисли тельного фосфорилирования и метаболизма рибонуклеотидредуктазы, об разованием свободнорадикального соединения пероксинитрит-аниона, ко торое блокирует ряд нейрональных рецепторов, инактивирует фермент су пероксиддисмутазу и вызывает углубление свободнорадикального окисле ния, приводящего к гибели клетки. Кроме того, пероксинитрит способен тормозить тирозинкиназу, входящую в активный центр нейротрофических факторов, увеличивая степень недостаточности трофического обеспечения мозга [Лискина Е.Б., 2003;

Zanchi A. et al., 1995;

Brenman J.E., Bredt D.S., 1996;

Eliasson M.J. et al., 1999;

Han H.S. et al., 2002;

Meini A. et al., 2006].

В то же время, имеются сведения о том, что NO, активируя раствори мую гуанилатциклазу, повышает синтез циклического гуанозинмонофосфа та и может защищать нейроны при токсическом воздействии глутамата.

Формирование нитрозониума-иона NO+, связывающего регуляторный центр NMDA рецепторов, уменьшает их возбудимость и снижает чувствительность к повреждению [Недоспасов А.А., 1998;

Тотолян А.А., 2003;

Малышев И.Ю., с соавт., 2004;

Pringle A.K. et al. 1999;

Golde S. et al., 2002;

Yamamoto F. et al., 2007].

Таким образом, проявляется двойственная природа окиси азота, при сущая многим природным модуляторам.

Результаты наших экспериментов свидетельствуют о неодинаковой экспрессии нитроксидсинтазы в переднем гипоталамусе.

У интактных крыс ВСР группы относительно высокий процент имму нопозитивных нейронов выявлялся в медиальном преоптическом, паравен тиркулярном и супраоптическом ядрах, несколько меньше была экспрессия в POl, PeV и SCh. Экспрессия NOS-3 была относительно невелика, в сравне нии с НСР группой. Наличие относительно высокого процента NOS-1 позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3, свидетельст вующий о более высоком представительстве эндотелиальной нитроксидсин тазы, мы отнесли к предикторам более высокой стресс-реактивности. По видимому, исходно низкое представительство эндотелиальной изоформы NOS имеет прямое отношение к последующей динамике стрессорного по вреждения нейронов в этом участке ГМ и может быть использовано при разработке новых подходов к нейропротекции.

Действительно, при стрессе мы увидели различия в экспрессии нитро ксидсинтаз по отдельным ядрам.

1. В SO и PV крыс ВСР группы при стрессе наблюдался относительно больший прирост NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS 1/NOS-3, что отражало более высоком участие эндотелиальной нитроксид синтазы в развитии стрессорного повреждения нейронов.

2. В SCh стрессированных крыс ВСР группы наблюдался относитель но меньший прироста NOS-1 и умеренный коэффициент NOS-1/NOS-3, что соответствовало меньшему повреждению нейронов.

В то же время, интенсивность повреждения нейронов при стрессе, за висящая от стресс-реактивности животных, в преоптической группе ядер, по-видимому, в малой степени была связана с местными механизмами взаимодействия двух изоформ нитроксидсинтаз.

Вентромедиальное ядро особенностей, связанных со стресс реактивностью, практически не имело. Лишь у крыс ВСР группы нейроны VM имели несколько большие размеры ядра и меньшее отношение перика рион/ядро, среднее количество граничных астроглиоцитов было больше примерно на треть аналогичного показателя у крыс с низкой стресс реактивностью.

При стрессе степень повреждения нейронов в VM также не различа лась между группами, была относительно высокой, составляя около 22%.

Как известно, вентромедиальное ядро функционально является «цен тром насыщения» и через свои многочисленные связи с различными струк турами ЦНС и внутри гипоталамуса является классически модулирующим для большинства других ядер [Акмаев И.Г., 2003;

Писарев В.Б. с соавт., 2006;

Bowie A., O’Neill L.A., 2000;

Tran P.V., et al., 2006;

Goto S. et al., 2007].

По-видимому, фенотипически проявляющаяся высокая стресс реактивность не требует каких-либо особенностей от строения VM, равно как она и не отражается на его вовлеченности в стресс-индуцированное по вреждение гипоталамуса.

Дорсомедиальное ядро у интактных крыс имело многочисленные особенности в связи с их стресс-реактивностью. Для животных ВСР группы были характерны относительно более плотно расположенные крупные ней роны с большим ядром и объемом перикариона, малым объемом перикари онного окружения. Для таких нейронов характерно большое число гранич ных нейронов, микроглии и, в особенности, - астроглии. Процент катехола минергических и глутаматцептивных нейронов был достоверно больше. На основании математического анализа мы отнесли DM у крыс с высокой стресс-реактивностью к числу «сильных», но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессорному повреждению.

При стрессе степень повреждения нейронов в DM существенно разли чалась между группами: 7,2% в ВСР и 15,2% - в НСР группе.

У животных с высокой стресс-реактивностью ОД нейронов уменьша лась 10,7%, у крыс НСР группы – на 15%. Объемное отношение нейронного окружения к перикариону увеличивалось при стрессе в ВСР группе в 1, раза, в НСР группе – в 1,1раза. Коэффициент микроглия/нейрон возрастал на 23,9% в ВСР группе, на 81,3% - в НСР группе. При иммуногистохимиче ском выявлении тирозингидроксилазы зафиксировано частичное истощение синтетической активности катехоламинергических нейронов, более выра женное у животных с низкой стресс-реактивностью. В противовес этому, экспрессия GR2 увеличивалась без каких-либо существенных различий ме жду группами.

Для объяснения подобного несовпадения между изначальным прогно зом и степенью стрессорных изменений нами были проанализированы воз можные дополнительные факторы, имеющие значения для повреждения DM в связи с его функцией и участием в развитии стрессовой системы.

1. Как известно, DM относится к структурам, осуществляющим на уровне гипоталамуса коммуникацию между нейроэндокринными, вегета тивными и поведенческими реакциями, включая участие в болевой (ноци цептивной) системе. Это обеспечивается наличием весьма широкого спектра медиаторов: норадреналина, серотонина, дофамина, ГАМК, ряда пептидов [Westphal R.S. et al., 1999;

Morin S.M. et al., 2001;

Lay A.J. et al., 2007;

Gos wami C. et al., 2007]. Не следует забывать о сексуальном диморфизме ядра и о его участии в регуляции полового поведения [Ахмадеев А.В., Калимулли на Л.В., 2006].

2. При стрессе в DM происходит многократное увеличение (взрыв) медиаторной активности, причем описано генетическое детерминирование силы ответа [Kovacs K.J., Sawchenko P.E., 1996;

Paskitti M.E. et al., 2000;

Lowry C.A. et al., 2003]. Сама территория DM при стрессе относится к уяз вимым, и становится местом выраженных микроциркулярторных наруше ний, отека и гибели нейронов [Смирнов А.В., 2003, 2005;

Nedungadi T.P. et al., 2006].

3. Следовательно, объяснение столь мощного повреждения DM у жи вотных с высокой стресс-реактивностью следует искать не столько в особен ностях строения ядра до начала стресса, сколько в его более интенсивном вовлечении в развитие стрессовой системы при активации «сильных» триг герных ядер, прежде всего – PV. Это позволяет отнести механизм большего стресс-индуцированного повреждения DM у животных с высокой стресс реактивностью к вторичным.

Аркуатное ядро у крыс с высокой стресс-реактивностью имело ряд особенностей. Прежде всего, для него были характерны относительно боль шая ОД нейронов, с несколько меньшие размеры ядер нейронов, но большие размеры перикарионов. При относительно небольшом объеме перикарион ного окружения нейроны ARC у животных с высокой стресс-реактивностью имели большее число граничных астроглиоцитов и меньшее – микроглиоци тов. Для них характерны более низкие экспрессии тирозингидроксилазы и рецепторов глутамата. По результатам математического анализа ARC было отнесено к «сильным» ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессорному повреждению.

Как и большинство ядер переднего и среднего гипоталамуса, ARC имеет множественное медиаторное представительство (дофамин, серотонин, брадикинин, ГАМК, нейропептид Y, субстанция Р, эндорфин), и выполняет ассоциативные и гормональные функции. Основные гормоны, происходя щие из ARC – меланокортин и гонадолиберины, частично разделенные в ядре пространственно [Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.В., 2006;

Boche D. et al. 2003;

Balkan B. et al., 2003;

Wu Y.H., et al., 2006;

Lowry C.A. et al., 2007].

При стрессе одни авторы указывают на умеренное [Демко П.С. с со авт., 2002;

Кузнецов И.Э., 2003;

Sharkey J. et al., 2000;

Fonnum F., Lock E.A., 2004;

Slikker W.Jr. et al., 2005], другие – на весьма высокое повреждение ARC [Писарев В.Б., 1990;

Казакова Т.Б. с соавт., 2000;

Смирнов А.В., 2003;

Фролов В.И., 2004;

Копылова Г.Н., с соавт., 2007].

В наших исследованиях, при стрессе степень повреждения нейронов в ARC достоверно различалась между группами: 2,6% в ВСР и 9,2% - в НСР группе. Аналогичные доказательства были получены и при корреляционном анализе основных морфометрических показателей.

Для дополнительного обоснования этого факта мы приняли во внима ние несколько известных данных.

Во-первых, наибольшая концентрации рецепторов к кортиколиберину за пределами гипофиза выявлена в аркуатном ядре гипоталамуса [Slikker W.Jr. et al., 2005]. Это свидетельствует в пользу его быстрого вовлечения в работу стрессовой системы.

Далее (это уже наши находки), нейроны аркуатного ядра обладают у крыс с высокой стресс-реактивностью более высоким представительством катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов, что определяет для этих ядер повышенную роль в модуляции силы и продолжительности стрес совой реакции.

Еще одна особенность лежала в специфичности ядра в связи с его уча стием в регуляции секреции половых гормонов. Освобождаемый из нейро нов гонадолиберин только по «классической» схеме избирательно действует на клетки аденогипофиза. Реально локальное выделение этого релизинг гормона в гипоталамусе сопряжено с активностью и секрецией не только половых гормонов, но и норадреналина, дофамина, гистамина, глутамата, ГАМК. Они обладают мощными связями с циркадианной ритмикой, акцеп цией боли, и многими другими вегетативными функциями, а также иммуно логической реактивностью организма [Николс Дж. Г., 2003;

Васильев Ю.Г., с соавт., 2003;

Калинкин М.Н., с соавт., 2004;

Chan R.K. et al., 1993;

Carloni S. et al., 2004]. Эти факты лежат в основе прямого доказательства паралле лей между иммуносупрессивным и гипорепродуктивными эффектами хро нического стресса [Клименко В.М., 1993;

Friedman E.M., Irwin M.R., 1995;

Dufourny L., Skinner D.C., 2002].

В мамиллярном комплексе наше внимание привлекли в основном две структуры: супрамамиллярное ядро и дорсальная часть премамиллярно го ядра.

У животных с высокой стресс-реактивностью в супрамамиллярном ядре ОД нейронов, СО ядер и перикарионов нейронов, объемы нейронного окружения, среднее число граничных клеток на 12%-25% превышали анало гичные показатели у крыс НСР группы. При высоком микроглиальном представительстве в целом, коэффициент микроглия/нейрон был на 25% меньше в ВСР группе.

При стрессе у животных ВСР группы степень повреждения нейронов в SuM оказывалась значительно выше, чем в НСР группе (29,8% против 12,1%). Такие важнейшие для определения стресс-индуцированного повре ждения ядра показатели морфометрии, как снижение ОД нейронов, увели чение СО ядер нейронов и увеличение коэффициента микроглия/нейрон бы ли выражены в SuM у животных с высокой стресс-реактивностью значи тельно ярче, в сравнении с альтернативной группой.

В PMd объемная доля нейронов у крыс с высокой стресс реактивностью на 24,9% превышала аналогичный показатель в НСР группе с низкой стресс-реактивностью, среднее число нейронов и средние размеры их ядер – на 20%. На каждый нейрон PMd у животных с высокой стресс реактивностью приходилось на 39,6% больше граничных нейронов и на 51% больше граничных астроглиоцитов, в сравнении с аналогичными пока зателями в НСР группе. Остальные показатели существенно не отличались между группами.

При стрессе в PMd различий между группами в степени повреждения нейронов не было отмечено (около 12%). Не было различий у степени сни жения ОД нейронов, изменения СО ядер нейронов, отношения окруже ние/перикарион и коэффициента микроглия/нейрон.

На основании математического анализа мы пришли к выводу, что SuM относится к «сильным» ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессовому повреждению, а PMd – к ядрам, строение и резистентность которых к повреждению от стресс-реактивности практически не зависит.

Для объяснения феноменов, развивающихся в мамиллярном комплек се при стрессе, мы приняли во внимание следующие факты.

1. Мамиллярный комплекс относится к наиболее древним образовани ям гипоталамуса и функционально связан скорее с другими отделами лим бической системы (прежде всего – гиппокампом), нежели с вентральными ядрами и секреторной частью гипоталамуса. Нейроны SuM и PMd этого комплекса оказывают тормозное ГАМК-ергическое влияние на кору, рети кулярную формацию и элементы лимбической системы. На основании на личия этих связей предполагают участие структур мамиллярной области в выявлении образов памяти и формировании эмоциональной окраски пове дения, в том числе – при стрессе [Писарев В.Б. с соавт., 2006;

Kovacs K.J., Sawchenko P.E., 1996;

Wirtshafter D., 1998;

Nakamura M., et al., 2007].

2. Исследуя PMd при хроническом стрессе, В.Б.Писарев с соавт.

(1995) описали нейроны этих ядер как максимально резистентные к повре ждению среди всех структур маммилярного комплекса, а нейроны SuM – как наименее резистентные. Предварительное повреждение мамиллярных тел сопровождается снижением скорости принятия решений при стрессор ных нагрузках и усиливает степень стрессорного повреждения внутренних органов [Тарабрина Н.В. с соавт., 1996;

Beracochea D.J., Jaffard R., 1995] 3. Следовательно, элементы мамиллярного комплекса не могут, за ис ключением SuM, быть отнесены к ключевым структурам, определяющим на уровне гипоталамуса стресс-реактивность и уровень стрессорного повреж дения. Их собственное повреждение носит скорее перегрузочный характер и определяется относительно большей интенсивностью стрессорной афферен тации лимбической системы у животных с высокой стресс-реактивностью.

Таким образом, проведя детальный анализ по отдельным ядрам гипо таламуса, мы можем утверждать, что на ультраструктурном, клеточном и тканевом уровне ядра и поля гипоталамуса (каждое – в разной степени) обладают широкой вариабельностью строения, в котором можно выде лить устойчивые наборы признаков, свойственных животным с кон ституционально высокой и низкой стресс-реактивностью. С другой стороны, наличие (предсуществование) этих особенностей только час тично определяет характер и выраженность последующих стресс индуцированных изменений в этих структурах.

Изменения гипоталамуса при стрессе развиваются не во всех ядрах и носят комплексный характер, в качестве обязательных компонентов вклю чая в себя сосудистые нарушения, повреждение и компенсаторную пере стройку нейронов, изменения нервных проводников и реакцию нейрогли альных элементов (табл.2).

В целом, можно подтвердить, что конституционально высокая стресс реактивность является фактором, обеспечивающим при стрессе относитель но более высокое повреждение нейронов в супраоптическом, паравентри кулярном и супрамамиллярном ядрах и ретрохиазмальной области гипота ламуса, но меньшее повреждение нейронов в перивентрикулярном, супра хиазматичеком, дорсомедиальном ядрах и латеральной гипоталамической области. Эти различия не обязательно наблюдались только в ядрах с высо кой интенсивностью стресс-индуцированных повреждений.

Обнаруженный полиморфизм изменений основных ядер гипоталами ческой области выявил ряд специфических черт, характерных для высоко организованных структур ЦНС:

- высокий процент клеток с сохранной структурой, находящихся в со стоянии повышенной функциональной активности;

- большую зависимость изменений от локализации и функционального предназначения ядра, нежели от его васкуляризации и глиального предста вительства;

- выраженный краниокаудальный и дорсо-вентральный градиент по ражения при полном отсутствии билатеральной асимметрии (рис. 5).

Таблица Степень повреждения нейронов (%, M±m) при 24-часовом иммобилизационном стрессе крыс с различной стресс-реактивностью Группы животных Ядра и поля ВСР НСР Гипоталамуса Интактные Стресс Интактные Стресс Передняя группа Мед. преоптическое (POM) 4,5±0,3* 0 0 5,0±0,4* Лат. преоптическое (POL) 2,3±0,2* 2,6±0,3* 0 Перивентрикулярное (PeV) Супраоптическое (SO) 0,9±0,1 6,1±0,5* 1,0±0,2 11,0±0,2*# Супрахиазматическое 2,7±0,2 22,0±1,2* 0,6±0,1# 14,3±1,1*# (SCh) Паравентрикулярное (PV) 3,4±0,2* 7,1±0,5*# 0 Преоптическая область 3,5±0,2 25,6±1,3* 0,5±0,1# 13,8±1,4*# (APO) Ретрохиазмальная область 3,8±0,3* 4,0±0,3* 0 (RCh) 0,5±0,1 6,2±0,5*# 9,1±0,7* Медиальная и латеральная группы Дорсомедиальное (DM) 0,6±0,1 7,2±0,5* 16,5±1,3*# Вентромедиальное (VM) 1,3±0,2 22,0±2,1* 21,8±1,6* Аркуатное (ARC) 2,6±0,2* 9,2±0,8*# 0 Лат. гипоталамическое яд ро (NHL) 11,2±0,7* 11,0±1,2* 0 Латеральное поле (AHL) 0,6±0,1 9,1±0,6* 12,5±1,6*# Серый бугор (TGr) 3,3±0,4* 0 0 3,2±0,4* Задняя группа Супрамамиллярное (SuM) 2,1±0,2 29,8±2,3* 1,1±0,2# 14,8±1,1*# Лат. мамиллярное (ML) 3,0±0,3* 0 2,9±0,2* Мед. часть медиального мамиллярного (MMm) 2,8±0,2* 3,2±0,3* 0 лат. часть медиального мамиллярного MMl) 3,1±0,2* 3,3±0,3* 0 Дорсальная часть премамиллярного (PMd) 1,1±0,2 11,8±1,0* 0,5±0,1# 12,1±1,0* Вентральная часть премамиллярного (PMv) 1,0±0,2 3,6±0,4* 0 3,9±0,5* * - достоверные различия между интактными и после стресса, # - между ВСР и НСР группами 14 Интактные Стресс 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Дорсовентральный градиент Интактные Стресс 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Медиолатеральный градиент Рис. 5. Дорсовентральный и медиолатеральный градиенты плотности нейро нов в супраоптическом ядре гипоталамуса при стрессе крыс с высокой стресс реактивностью. Ось абсцисс – доли в масштабах ядра, ось ординат - удельная плот ность нейронов.

При прочих равных в гипоталамусе в большей степени подвергаются морфофункциональным преобразованиям эволюционно молодые, лучше васкуляризованные и более функционально нагруженные области. Выяв ленные закономерности в целом не противоречат общим представлениям о нейроморфологии стресса [Крыжановский Г.Н., 2001;

Зиматкин С.М., с со авт., 2003;

Schiltz J.C., Sawchenko P.E., 2002;

Ajmone-Cat M.A., et al., 2002;

McGill B.E., et al., 2006;

Ostrander M.M., et al., 2006].

Следующий вопрос, требующий обсуждения, - возможные пути и ме ханизмы деплеции нейронов при стрессорном повреждении.

Во-первых, наблюдаемая в наших опытах при стрессе степень повре ждения нейронов ни в одном из ядер и полей гипоталамуса не была фаталь ной. Оставшийся объем нейронов был вполне достаточен для выполнения функции ядра и поддержания его структурно-функциональной целостности.

При этом степень повреждения существенно варьировала (от 2,9%-5,0% (то есть статистически недостоверного), до 25%-30%, что могло рассматривать ся как повреждение средней степени с серьезными последствиями для само го ядра и организма в целом.

У животных НСР группы максимальные изменения фиксировались в VM (22%), DM (16,5%), PeV, SO, PV, SuM, PMd и латеральном гипотала мическом поле (все в пределах 11% -14,3%). У животных с высокой стресс реактивностью степень повреждения в VM (21,8%) и PMd (12,1%) была аналогичной, в SO (22%), PV (25,6%), SuM (29,8%) - оказывалось значи тельно выше, а в PeV, SCh и DM - достоверно ниже, в сравнении с этими же показателями в НСР группе.

Таким образом, анализ степени стрессорного повреждения выявил не сколько структур гипоталамуса, «актуальных» с точки зрения стресс реактивности. Наиболее поражаемыми при стрессе являлись нейроны (в по рядке убывания) в следующих ядрах гипоталамуса: паравентрикулярное, супрамамиллярное, вентромедиальное, супраоптическое.

Нами на основании математического анализа были выделены не сколько ключевых изменений, связанных как со стрессом, так и различиями в стресс-реактивности животных.

1. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с увеличением степени повреждения нейронов, уменьшением ОД нейронов и СО их ядер, что ха рактерно для SO, PV, SuM, PMd.

2. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с уменьшением степе ни повреждения нейронов, уменьшением ОД нейронов и СО их ядер, что характерно для SCh и DM.

3. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с более выраженной микроглиальной реакцией, что характерно для SO, PV и SuM.

4. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с менее выраженной микроглиальной реакцией, что характерно для DM и PMd.

Интересно, что такие исследованные показатели, как тканевое распре деление нейрональной нитроксидсинтазы и ее соотношение с эндотелиаль ной изоформой, тирозингидроксилазы (дофаминергического представитель ства) и глутаматного рецептора не позволили прийти к сколько-нибудь од нозначному заключению об их роли в нейрональном повреждении при стрессе, тем более – о его зависимости от стресс-реактивности.

При наличии стрессорного повреждения основная реакция в яд рах гипотатамуса, на наш взгляд, связана с изменением межклеточного взаимодействия микроглия – нейрон.

Большая сложность организации нейропиля ретрохиазмальной и лате ральной гипоталамической области является одним из доказательств боль шего значения внешних связей гипоталамуса с таламусом и фронтальными областями коры головного мозга в обеспечении высокой стресс реактивности в сравнении с нервными внутригипотамическими связями.

Изменения нервных волокон и нервных проводников характеризова лись набуханием, гомогенизацией, избыточной аргирофилией и частичной фрагментацией. Максимальным изменениям подвергались нисходящие та ламические волокна и эфферентные пути самого гипоталамуса, меньшему повреждению - афферентные восходящие волокна и гипоталамо гипофизарные связи. На всем протяжении гипоталамуса, с постепенным уменьшением к преоптической области и усилением в вентральных отделах, обнаруживались мелкие и более крупные участки микроглиоза. В зонах максимального повреждения нейронов (PV, VM, SuM) возможно было по явление мелких групп гипертрофированных микроглиоцитов, иногда с об разованием зернистых шаров. Степень микроглиальной реакции была про порционально степени нейронального повреждения и, соответственно, убы вала в ряду PV, SO, VM, SuM передняя и наружная группы ядер PeV, RCh, AHL, PMd POM, DM, ARC остальные ядра преоптической области и мамиллярного комплекса.

При иммуногистохимическом окрашиванием на кислый глиальный протеин мы показали, что при стрессе наблюдается уменьшение фактора формы проводников, снижение отношения яркостей GLAP/матрикс более чем на треть в ВСР группе и на 45% - в ВСР, а также снижение объемной доли GLAP-позитивного материала.

Как известно, именно в сохранности проводников усматривается про лонгация работы стресс-системы на высоком уровне активности. При стрес се нейроны латеральной области быстро истощаются и становятся гипосек реторными [Талалаенко А.Н. с соавт., 2001;

Bruses J.L., Rutishauser U., 1998;

Kiss A., 2007;

McCormick C.M., et al., 2007].

В любом ядре ГМ астроглия, олигодендроглия и микроглиоциты весь ма плотно упакованы, но взаимодействие между этими клетаками не в пол ной мере определяется плотностью этой упаковки [Krasowska-Zoladek A., et al., 2007].

Обычно астроциты и микроглия клетки реагируют на повреждение нейронов репликацией. Они участвуют в удалении продуктов распада и восстановлении тканевых взаимоотношений. На первом этапе микроглиаль ные клетки и макрофаги, которые проникают в поврежденный участок ЦНС из крови, соответственно делятся и удаляют продукты распада умирающих клеток [Block M.L. et al., 2007;

Taner D., et al., 2007].

Сразу после повреждения ЦНС микроглиальные клетки мигрируют к месту повреждения со скоростью около 300 мкм/час, аккумулируются на этом месте и фагоцитируют поврежденную ткань. Гибридизация in situ и иммунохимические реакции показали, что микроглиальные клетки проду цируют в месте повреждения ламинин — молекулу экстраклеточного мат рикса, которая способствует росту нейритов в культуре и in vivo.



Pages:   || 2 |
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.