Морфологическая вариабельность гипоталамуса в обеспечении конституциональной стресс-реактивности (экспериментальное исследование)
На правах рукописи
Потанин Михаил Борисович МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГИПОТАЛАМУСА В ОБЕСПЕЧЕНИИ КОНСТИТУЦИОНАЛЬНОЙ СТРЕСС-РЕАКТИВНОСТИ (экспериментальное исследование) 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Волгоград - 2008 2
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Капитонова Марина Юрьевна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Хлопонин Петр Андреевич доктор медицинских наук, профессор Швалев Вадим Николаевич доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Росздрава»
Защита состоится «_» _ 2008 года в _ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.008.01 при Волгоградском го сударственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.
Автореферат разослан «_» _ 2008 года.
Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук Н.В. Григорьева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность.
Стремительно нарастающий темп урбанической жизни, информаци онная перегрузка, скученность населения, возрастающая роль фактора об щения в обеспечении социального статуса, нарастание доли ксенобиотиков в питании и окружающей бытовой среде современного человека – вот дале ко не полный перечень факторов, определяющих возрастание роли стресса в патологии [Селье Г., 1960, 1982;
Судаков К.В., 1997, 2002;
Крыжановский Г.Н., 1999, 2004;
Пшенникова М.Г., 2001;
Вашадзе Ш.В., 2006;
Глазачев О.С., 2006;
Oliver G., Wardle J., 1999;
Bell M.E. et al., 2002;
Sivukhina E.V. et al., 2006;
Gibson L.E., 2006].
С момента публикации Г.Селье в 1936 году статьи «Синдром, вызы ваемый разными повреждающими агентами», теория стресса прочно вошла в арсенал медицины. На настоящий момент в теории стресса рас крыто немало клеточных и молекулярных механизмов, определяющих его основную динамику и органопатологию, как в остром, так и хроническом варианте развития стрессорной реакции. Определен спектр стресс активирующих и лимитирующих медиаторов, а также ульцирогенные, кар диотропные, иммуномодулирующие, эндокринные и поведенческие эффек ты развития стрессорных реакций [Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998;
Котов А.В., 1999;
Судаков К.В., 2003;
Devries A.C., et al., 1997;
Berridge M.J., et al., 1998;
Hamano H., et al., 2002;
Dube L, et al., 2005;
Wu Y.H. et al., 2006;
Stone EA, et al., 2006;
McCormick CM, et al., 2007].
В то же время, даже при ярко выраженных социальных и природных катастрофах тяжесть стрессорной реакции становится фатальной и опреде ляет течение и прогноз болезней лишь примерно у трети лиц, в то время как примерно 20-25% людей при воздействиях тех же факторов практически не реализуют стресс-индуцированную патологию [Анохина И.П., 1997, 2002;
Бадыштов Б.А., 1998;
Соколова Е.Б., с соавт., 2000;
Судаков К.В., Юматов Е.А., 2001;
Bremner J.D., et al., 1996;
Kelley A.E., Berridge K.C., 2002;
Pecora ro N., et al., 2004;
Dallman M.F., et al., 2005]. Изучение этой проблемы можно проводить с различных позиций. Сейчас уже известно немало генетических особенностей, определяющих уровень реактивности при стрессе и чувстви тельности к действию стрессорных факторов, причем два этих свойства не могут рассматриваться как полностью генетически сопряженные [Середенин С.Б., с соавт., 2000;
Анохин К.В., Судаков К.В., 2003;
Маркина Н.В., с со авт., 2003;
Bartolomucci A., et al., 2003;
Simpkiss J.L., Devine D.P., 2003;
McGill, et al., 2006;
Centeno M.L. et al., 2007;
Goto S., et al., 2007;
Ulrich-Lai Y.M. et al., 2007].
Помимо генетической детерминированности, одну из составляющих стресс-реактивности следует искать в морфофункциональных особенностях основных структур, отвечающих за регуляцию отношений организма с внешней средой в целом – прежде всего в организации церебральных струк тур [Пшенникова М.Г., с соавт., 2000;
Yehuda R., et al., 1991;
Avishai-Eliner S., et al., 2001;
Morin SM, et al., 2001;
Krady J.K., et al., 2002;
Bluthe R.M., et al., 2002;
Figueiredo H.F. et al., 2003;
Inoue K., et al., 2003;
Dallman M.F., et al., 2004;
Badowska-Szalewska E., et al., 2006;
Girotti M., et al., 2006].
Отечественными исследователями были раскрыты фундаментальные закономерности организации различных структур головного мозга при кон ституциональных фенотипах, связанных с высоким риском таких распро страненных заболеваний как ишемическая болезнь сердца и алкоголизм.
Расширены представления о структурных основах реагирования головного мозга на стресс, определяющих общую неспецифическую реактивность ор ганизма и, в итоге, нейроиммуно-эндокринные взаимодействия и органопа тологию стрессовой реакции [Писарев В.Б. с соавт., 1990, 2006;
Баннов А.Н., 1994;
Ерофеев А.Ю., 1995;
Смирнов А.В., 1998, 2005;
Гуров Д.Ю., 1999, 2005;
Фролов В.И., 2004;
Капитонова М.Ю. с соавт., 2005, 2007;
Мо розова З.Ч., 2006;
Загребин В.Л., 2007].
За рубежом многими учеными также демонстрировалась важная роль гипоталамуса в акцепции, трансформации и регулировании силы ответной реакции на стрессовые воздействия [Calogero A.E., 1995;
Stratakis C.A., Chrousos G.P., 1998;
Thompson R.H., Swanson L.W., 2003;
Okere C.O., Water house B.D., 2004;
Kwon M.S., et al., 2006;
Ostrander M.M., et al., 2006;
Mura matsu T., et al., 2006;
Kiss A., 2007;
Lowry C.A., et al., 2007].
За рамками этих исследований осталась такая теоретически и практи чески важная проблема, как определение особенностей стресс ассоциированных изменений в тех или иных структурах гипоталамуса у жи вотных с доказанной высокой или низкой стресс-реактивностью. Равно не изучались в сравнительном аспекте изменения этих структур при его вос произведении у животных с диаметрально противоположными уровнями стресс-реактивности.
Получение новых данных в нейроморфологии на современном этапе немыслимо без сопоставления результатов классических методов светоопти ческого исследования, иммуногистохимического выявления специфических молекул-участниц работы головного мозга и данных электронной микроско пии нейронов, нейроглии и других элементов нейронного окружения [Бого лепов Н.Н., 2002;
Николлс Дж.Г., с соавт., 2003;
Ахмадеев А.В., Калимулли на Л.Б., 2007;
Bonini P., et al., 2004;
Gingerich S., Krukoff T.L., et al., 2006;
Muramatsu T., et al., 2006;
Block M.L., et al., 2007;
Ma S., et al., 2007]. С тео ретических позиций рассмотрение структур мозга как гистотопографически очерченных ядер и проводников, выделение нейронных модулей и изучение межклеточных отношений в мозге следует рассматривать как взаимодопол няющие при выполнении подобного исследования.
С этих позиций актуальным представляется фундаментальное морфо функциональное исследование гипоталамуса как одной из ключевых струк тур в обеспечении конституционально различной стресс-реактивности.
Цель работы – установить закономерности варьирования отдельных гипоталамических структур у животных с различным уровнем конституцио нальной стресс-реактивности и уточнить на этой основе участие гипотала муса в обеспечении силы и выраженности стрессорной реакции.
Задачи исследования.
1. Изучить морфофункциональные различия отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.
2. Изучить на иммуногистохимическом и ультрамикроскопическом уровне особенности строения нейронов ядер гипоталамуса, наиболее разли чающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.
3. Выявить характер и выраженность стресс-индуцированных измене ний в ядрах гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.
4. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и морфометрии различных структур гипоталамуса.
5. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и стрессорных изменений в гипоталамусе и разработать математическую модель, характеризующую выраженность и характер стрес сорных реакций с учетом стресс-реактивности и особенностей строения ги поталамуса на светооптическом и ультрамикроскопическом уровне.
Научная новизна.
На основании сопоставления результатов светооптического, иммуно гистохимического, ультрамикроскопического методов исследования и при влечения методов современного математического анализа результатов мор фометрии и определения стресс-реактивности получены новые данные о выделении ядер и полей гипоталамуса, наиболее значимых с позиции фор мирования конституциональной стресс-реактивности. К ним, помимо обще признанных, впервые отнесены дорсомедиальное ядро, латеральное гипота ламическое поле и два ядра маммилярного комплекса. Показано, что нейро ны разных ядер, участвующих в формировании стресс-реактивности, обла дают общим ультрамикроскопическим признаком – сравнительно более вы соким удельным объемом митохондрий в перикарионах и их более функ ционально активной организацией. Выявлены как стойкие признаки строе ния ядер гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью: более плотная упаковка нейронов при относительно малом количестве граничных сосудов и астроглиоцитов, относительно больший процент катехоламинер гических и глутаматцептивных нейронов.
Показаны различия в краниокаудальных и дорсовентральных гради ентах строения ядер и полей гипоталамуса как отражения различной кон ституциональной стресс-реактивности животных.
На основе полученных данных была сформирована теоретическая концепция о фенотипической вариабельности гипоталамуса, которая может рассматриваться как ключевой морфофункциональный субстрат стресс реактивности. Это подтверждено данными математического анализа с по строением адекватной модели взаимоотношений стрессорной афферента ции, взаимоотношений между ядрами гипоталамуса с учетом их конститу циональных особенностей и параметров последующего стрессорного ответа.
Научно-практическая значимость.
Полученные данные расширяют имеющиеся представления о струк турных основах стрессорной реакции с позиции конституциональной ней роморфологии. Выделение компонента вариабельности в участии отдельных структур гипоталамуса за счет особенностей их строения в итоге существен но проясняет общие различия в выраженности стрессорного ответа у раз личных организмов на идентичные по характеру и силе воздействия.
Моделирование стресса у животных с конституционально высокой стресс-реактивностью целесообразно для получения наиболее ранней и пол ной картины стресс-индуцированной патологии при воздействии стрессоров любой силы, в том числе умеренной.
Положения, выносимые на защиту.
1. На ультраструктурном, клеточном и тканевом уровне ядра и поля гипоталамуса (каждое – в разной степени) обладают широкой вариабельно стью строения, при этом можно выделить устойчивые наборы признаков, свойственных животным с конституционально высокой и низкой стресс реактивностью.
2.Особенности исходного строения отдельных ядер и полей гипотала муса у животных с различной стресс-реактивностью частично определяет характер и выраженность последующих стресс-индуцированных изменений в этих структурах.
3. Особенности строения гипоталамуса и происходящих в нем при стрессе изменений, в свою очередь, определяют общую выраженность и те чение стрессорной реакции.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались научных сессиях профессорско-преподавательского состава Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 1998-2006), на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), III Всероссийской научно-практической конференции «Медико биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека» (Волгоград, 2004), VII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), V съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2005);
Между народном конгрессе «Проблемы вегетативной дисрегуляции» (Донецк, 2005);
Российской научной конференции с международным участием «Ме дико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006);
Всероссийской конференции «Новые медицинские технологии» (Вол гоград, 2007).
Апробация работы осуществлена на совместном заседании кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии, анатомии человека, судебной медицины Волгоградского государственного медицин ского университета 25 апреля 2008 года.
По материалам диссертации опубликованы 26 научных работ, в том числе 9 - в журналах «Морфология», «Морфологические ведомости», «Бюл летень экспериментальной биологии и медицины» и «Вестник Волгоград ского государственного медицинского университета», включенных в дейст вующий «Перечень … ВАК» (медицинские науки, редакция апрель 2008).
Реализация и внедрение результатов исследования.
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Волгоград ском государственном медицинском университете, Волгоградском государ ственном университете, Волгоградской государственной академии физиче ской культуры, Саратовском государственном медицинском университете, Ставропольской государственной медицинской академии, Астраханской го сударственной медицинской академии. Разработанные и апробированные диагностические методики используются Волгоградского областного пато лого-анатомического бюро и Волгоградского научного центра РАМН и ад министрации Волгоградской области.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 269 страницах машинописного текста, со держит 50 таблиц, иллюстрирована 62 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований с их обсуждением, заключения и выводов. Спи сок использованной литературы включает в себя 370 источников: 147 отече ственных и 233 зарубежных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Специфика настоящего исследования потребовала решения несколь ких методических задач:
- максимально адекватного выделения животных с доказанными кон ституциональными особенностями стресс-реактивности без повреждения го ловного мозга;
- выделение из большого числа нейроморфологических методик дос тупного и воспроизводимого набора, на основании которого можно описать различия в строении гипоталамуса у выбранных животных с альтернатив ной стресс-реактивностью;
- выбора метода и интенсивности стрессорного повреждения, при ко тором уже имеется морфологический субстрат повреждения гипоталамуса, но еще не утрачена его относительная специфичность, позволяющая количе ственно оценивать различия между группами;
- выбор адекватного математического подхода для описания происхо дящих событий в виде модели, пригодной для интерпретации выявленных изменений морфологами.
Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был со ставлен на основе базисных нормативных документов МЗ РФ, рекоменда циями ВОЗ [Червонская Г. П., с соавт., 1998;
Zutphen L.F., 1993] и согласо ван с Локальным независимым этическим комитетом (Протокол №4 от декабря 2004 года).
На основании изложенных принципов после скрининга в основной части работы было проведено сравнительное изучение головного мозга у крыс: по пять в каждой подгруппе в зависимости от стресс-реактивности, вне стресса и после его воспроизведения (табл. 1).
Таблица Общая характеристика материала исследования по сериям Кол-во жи Серии экспериментов Характеристика серии вотных Скрининговый этап (неинвазивные тесты) определение уровня низкий уровень общей неспецифической средний уровень реактивности организма высокий уровень определение уровня низкий уровень хемоиндуцированной средний уровень стресс-реактивности высокий уровень Основной этап интактные высокая реактивность животные низкая реактивность Моделирование 24-часового высокая реактивность иммобилизационного стресса низкая реактивность Первым тестом для разделения животных на группы было определе ние универсального критерия стандартизации биомоделей - уровня общей неспецифической реактивности организма. Метод основан на определении болевой (ноцицептивной) чувствительности посредством дозированного электроболевого воздействия [Мулик А.Б., 1993, 2002]. Вторым относитель но малоинвазивным тестом стало определение термолабильности животных при действии сверхмалых доз бактериального липополисахарида. Для тако го свойства организма предложено соответствующее название - уровень хе моиндуцированной стресс-реактивности [Горизонтов П.Д., 1984]. В резуль тате этого тестирования для исследования было выделено 20 крыс с низким и 22 – с высоким уровнем реактивности.
Сопоставление сочетаемости тестов (конкордантности) показало, что среди 21 животного хотя бы с одним из признаков низкой реактивности у 17 (74%) присутствовали оба признака. Аналогично, среди 22 животных с высоким уровнем хемоиндуцированной стресс-реактивности оказались все 15 животных с высоким уровнем общей неспецифической реактивности ор ганизма (конкордантность – 68%).
Для исследования гипоталамуса интактных животных и после воспро изведения стресса из каждой группы крыс отобрано по 10 животных с мак симальной экспрессией признаков, то есть минимальным порогом электро болевой вокализации и максимальной термолабильностью – для группы жи вотных с высокой стресс-реактивностью (ВСР) и альтернативными характе ристиками – для группы крыс с низкой стресс-реактивностью (НСР).
Стресс моделировали у 5 крыс группы ВСР и у 5 крыс групп НСР пу тем однократной 24-часовой иммобилизации. С целью верификации стадии стресса проводилось взвешивание органов животных, макро- и микроскопи ческое исследование желудочно-кишечного тракта, тимуса и надпочечни ков.
Непосредственно после эвтаназии головной мозг животных извлекали ща дящим образом из черепа, помещали в 10%-ный раствор нейтрального забуфе ренного формалина (рН=7,4) на 30 мин, после чего разделяли на 3 блока (А, В и С) фронтальной секцией через точку P0 по Сентаготаи и тангенциальной – от бо розды, разделяющей полушария большого мозга и мозжечка до границы между стволом и промежуточным мозгом на вентральной его поверхности. Материал дофиксировали в течение 24 ч. С фронтальной поверхности блока В и окципи тальной поверхности блока А начинали приготовление серийных срезов толщи ной 5-7 микрон – 200-240 для блока В и 100-150 – для блока А. Каждый пятый срез наклеивали на предметные стекла в порядке их получения и маркировали.
Это позволяло воспроизвести стререометрическую архитектонику гипоталамуса от фронта А1 до Р4,0 в координатах Хорслей-Кларка, то есть целиком [Paxinos G., Watson C., 1986]. Для уточнения расположения ряда объектов и идентификации срезов вне типичных проекций использовали также современные атласы проме жуточного мозга: Н.Н. Боголепова с соавт. (2002), Paxinos G., Watson C. (1996) и Swanson L.W. (1998).
Передняя гипоталамическая область была нами объединена с иногда описываемой отдельно преоптической областью. В ней выделяли и отдельно изучали строение медиального (POM) и латерального преоптических (POL), перивентрикулярного (PeV), переднего гипоталамического (NAH), супраоп тического (SO), супрахиазматического (SCh) и паравентрикулярного (PV) ядер. Помимо ядер, здесь присутствовали и проводники, описанные как элементы нейропиля по различным направлениям и смешанные области, в частности - ретрохиазмалъная (RCA).
В медиальной группе основу вещества гипоталамуса составляли крупные дорсомедиальное (DM) и вентромедиальное (VM) и аркуатное (Arc) ядра. В первом различали дорсальную и вентральную части.
Особеннностью этой области было обилие вертикальных и горизонтальных проводников, формирующих в нейропиле ассоциативные связи с другими элементами стресс-системы.
Латеральное гипоталамическое ядро (LH) и серый бугор, составляю щие наружную группу ядер гипоталамуса, были представлены скоплениями неплотно расположенных нейронов средних размеров с достаточно большим количеством астроглии и микроглии между ними. Большая масса нейропиля в этой области позволила рассматривать эту зону как единое латеральное гипоталамическое поле (AHL), простирающееся во фронтальных срезах в координатах P1,5-P3,0.
Элементы маммилярного комплекса, то есть заднего гипоталамуса, об наруживали в сечениях Р3,0 – P4,5 по Сентаготаи и идентифицировали как супрамаммилярное ядро (SuM), дорсальная (PMd) и вентральная (PMv) час ти премаммилярных ядер, латеральное маммилярное ядро (ML), медиальная (MMm) и латеральная (MMl) части медиального маммилярного ядра. В свя зи с достаточно однородным строением и непостоянством выявления MMl у крыс последние два объекта были подвергнуты анализу совместно. Среди большого количества проводников в задней гипоталамической области большое внимание уделяли мощному восходящему маммило-таламическому тракту.
Для классического нейрогистологического исследования использовали окрашивание препаратов мозга гематоксилином и эозином, а также по Нисслю.
Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 1996, 2002] с использованием автоматического анализатора изображений «Видео тест-Морфо» (СПб, Россия). В каждом ядре раздельно определяли объемную долю нейронов (%), среднее число нейронов в 1 мм 3 ткани, средние объемы (СО) перикариона нейронов и нейронного окружения (мкм 3), их отношение, а также среднее число граничных нейронов и астроглиоцитов в окружении перикариона нейрона. Выраженность глиальной реакции оценивали по среднему численному соотношению глия/нейрон, среднему размеру ядер глиоцитов и средней суммарной яркости иммунопозитивного материала по сле окраски на макрофагальный антиген и кислый глиальный протеин.
Результаты при исследовании областей, наиболее «актуальных» по ре зультатам предшествующего анализа, дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН. После указания границ объекта и его логического центра (им был выбран геометрический центр ядра) программа самостоятельно разби вала объект на выбранное число секторов и зон. Для нейронов нами было эмпирически подобрано 36 секторов и 10 зон – всего 360 участков (рис. 2).
В качестве первичного материала получали матрицу секторального и ради ального распределения тинкториальной плотности, в качестве окончатель ного – коэффициенты, характеризующие графическую функцию распреде ления:
K1 – тангенс угла подъема кривой в восходящей части графика, K1 – тангенс угла снижения кривой в восходящей части графика, Im – максимальная интенсивность окраски в кольцевой зоне, усл. ед., R – расстояние от центра ядрышка до зоны с I m Vm – максимальная вариабельность интенсивности по секторам, усл. ед.
Полученные количественные показатели достаточно полно характери зуют изменения нейронов в динамике повреждения [Новочадов В.В., 2005].
На срезах, окрашенных по Нисслю, определяли степень стрессорного поражения нейронов [Чубинидзе А. И., 1972]. Производился подсчет нейро нов коры, которые разделили на 4 группы:
- нейроны нормальные, неизмененные (НН);
- слабоизмененные нейроны (СН) с сохранением ядра, но со структур ными или тинкториальными нарушениями компонентов цитоплазмы (ост рое набухание, гиперхроматоз, хроматолиз, центральная тинкториальная ацидофилия);
- грубо измененные нейроны (ГН) (сморщивание, «тяжелое измене ние», гомогенизирующее изменение нейронов, клетки-тени);
- нейроны отсутствующие (ОН).
Степень поражения нейронов вычисляли по формуле:
СП=(2ОН+2ГН+СН)x100/2(ГН+ОН+СН+НН) и выражали в процентах. Вы деляли 4 степени поражения: легкая (менее 20%), средняя (20-50%), тяже лая (более 50%), распространенный некроз. Исследование проводили в полях зрения на 4 срезах для каждой области ГМ (100-120 измерений на се рию).
Иммуногистохимическое исследование производили с использова нием следующих моноклональных мышиных антител коммерческими набо рами фирмы Dako Cytomation (Дания):
- к макрофагальному антигену, окрашивающий микроглию (HAM-56);
- к кислому глиальному протеину (GFAP);
- к тирозингидроксилазе (TH) - к глутаматному рецептору (GR-2) - к нейрональной нитроксидсинтазе (NOS-1);
- к эндотелиальной нитроксидсинтазе (NOS-3).
Выбор двух последних антигенов был обусловлен тем, что по совре менными данным, именно дисбаланс нитроксидсинтаз становится ключе вым стартовым механизмом повреждений в центральной нервной системе при стрессе [Han H.S.,et al., 2002;
Kotake Y., et al. 2002].
Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидаз ного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антиге нов. Экспрессию оценивали по разделению нейронов на классы в зависимо сти от степени экспрессии иммунопозитивного материала по оптической плотности выделенных масок: негативные, слабопозитивные, позитивные и гиперэкспрессирующие с выражением доли каждого класса в процентах.
Соотношение экспрессий определяли через их удельные яркости в сопоста вимых областях ГМ на серийных срезах, обработанных на одном предмет ном стекле. Для достоверности полученных результатов применяли пози тивные и негативные контроли антигенов, а также негативные контроли ан тител [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004;
Kelman Z., 1997;
Rosa M.A., et al.
2000;
Paunesku T. et al., 2001].
Для электронно-микроскопического исследования животных под вергли эвтаназии путем внутривенной инфузии 4%-ного раствора парафор ма на 0,1 М какодилатном буфере (суправитальной фиксации) под нембута ловым наркозом. Дофиксацию кусочков размером 1 мм 3 производили в те чение 12 часов в 4%-ном растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1% растворе тетраокиси осмия в 0,1М какодилатном буфере (pH=7,4) при температуре +4 оС [12].
После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера ма териал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротомах LKB- 8800 и монтировали на медные сетки.
После контрастирования в 2,5% растворе уранилацетата на 50 о этаноле в те чение 40 минут и 0,3 % растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-540 при ускоряющем напря жении 60 кВ. Документирование производили с использованием фотопла стинок «Для ядерных исследований». Электронные микрофотограммы изго тавливали на фотографической черно-белой бумаге «Унибром 160 БП».
Сканированные ультрамикрофотографии анализировали в программе AM Lab Hesperus v3.0 beta. В качестве показателей для структурного анали за использовались такие показатели, как объемная доля митохондрий в пе рикарионе, отношение яркостей эухроматин/гетерохроматин, эухрома тин/матрикс цитоплазмы, матрикс митохондрий/матрикс цитоплазмы и матрикс цитоплазмы/содержимое синаптосом в трехмерной системе коорди нат RGB. Также анализировали фактор формы кариолеммы, наружной мем браны митохондрий, показатель выраженности крист митохондрий.
Вариационно-статистическую обработку результатов проводили в среде электронных таблиц MS Excel. Она была проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами (расчет средней арифме тической величины, среднего квадратичного отклонения, ошибки репрезен тативности для каждого параметра в исследуемых группах животных, срав нение средних значений по критерию Стьюдента с достоверностью разли чий. Затем, руководствуясь закономерностями, принятыми для медико биологических исследований (объем выборок, характер распределения, не параметрические критерии), оценивали достоверность различий выборок.
Корреляционный анализ проводился методом простых парных корреляций Спирмена [Зайцев В.М., с соавт., 2003;
Петри А., Сабин К., 2003;
Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].
СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В преоптической области у животных с высокой стресс-реактивностью для POM характерно более редкое расположение относительно крупных нейронов с большим объемом окружения и количеством граничных астрог лиоцитов;
в PeV выявляются более мелкие, но плотнее расположенные ней роны с большим числом граничных нейронов и малым представительством микроглии, а строение POL не отличалось от такового у животных с низкой стресс-реактивностью. Полученные данные в целом свидетельствуют о не однородности строения ядер преоптической группы переднего гипоталамуса в срезе конституциональной реактивности.
В собственно переднем гипоталамусе для крыс с высокой стресс реактивностью были характерны относительно более крупные размеры ней ронов, их ядер и нейронного окружения (более всего – для SCh). Но для SCh характерна более высокая ОД нейронов, а для SO и PV – относительно более низкая. Интересно, что в триггерном ядре стресса – паравентрикулярном отличия между группами интактных крыс были минимально выражены.
Животные с высокой стресс-реактивностью имеют в передней гипоталами ческой области меньшее представительство астро- и микроглии (SCh PV SO) и неодинаково выраженное, но относительно высокие экспрессии нит роксидсинтаз (максимальные – в SO), рис. 1.
Исследования, проведенные в медиальной и латеральной гипоталами ческой области у интактных животных с различной стресс-реактивностью, выявили существование целого ряда существенных отличий различий толь ко в двух ядрах – дорсомедиальном и аркуатном, а также в латеральной ги поталамической области. Они касались как показателей размерности ядер и отдельных структур, так и сложности их организации.
NOS- NOS- Микроглия Аст роглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Супраоптическое ядро NOS- NOS- Микроглия Аст роглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Супрахиазматическое ядро NOS- NOS- Микроглия Аст роглия СО нейронного окружения 0, СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Паравентрикулярное ядро Рис. 1. Особенности строения ядер передней гипоталамической области крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.
Принципиальные различия в отношении дорсомедиального и вентро медиального ядра гипоталамуса (первое имеет яркие отличия, зависящие от стресс-реактивности, второе – практически отличий не имеет) может иметь ключевое значение в участии этой области гипоталамуса при развитии стресса. Также удалось показать, что нейроны аркуатного и дорсомедиаль ного ядер гипоталамуса обладают общей особенностью у крыс с высокой стресс-реактивностью. Она заключается в более высоком представительстве катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов, что определяет для этих ядер повышенную роль в модуляции силы и продолжительности стрес совой реакции (рис. 2).
Рецептор GR Тирозингидроксилаза Микроглия Астроглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Вентромедиальное ядро Рецептор GR Тирозингидроксилаза Микроглия Астроглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Дорсомедиальное ядро Рис. 2. Особенности строения ядер медиальной группы гипоталамуса крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.
Большая сложность организации латеральной гипоталамической об ласти (но не серого бугра) является одним из доказательств большего значе ния внешних связей гипоталамуса с таламусом и фронтальными областями коры головного мозга в обеспечении высокой стресс-реактивности в сравне нии с нервными связями между ядрами гипоталамуса (рис. 3).
Более сложное строение нейропиля было характерно для ретрохиаз мальной и латеральной гипоталамической области животных с высокой стресс-реактивностью.
Рецептор GR Тирозингидроксилаза Микроглия Астроглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Аркуатное ядро Рецептор GR Тирозингидроксилаза Микроглия Астроглия СО нейронного окружения СО перикарионов СО ядер нейронов ОД нейронов 0 0,5 1 1,5 Латеральное гипоталамическое ядро Рис. 3. Особенности строения ядер латеральной группы гипоталамуса крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных.
На уровне маммилярного комплекса показана максимальная вариа бельность строения SuM и PMv, для которых были характерны более плот ная нейронная упаковка, относительно большие размеры нейронов и их ядер, большое количество микроглии.
Математический анализ методом определения асимметрии выборок, цензурированных по признаку реактивности, выявил многочисленные «сце пления» данных показателей строения нейронов и их окружения со стресс реактивностью животных. Практически те же показатели выявлялись как связанные с реактивностью при корреляционном анализе.
Обобщая представления о строении ядер у интактных животных, мы предположили их реакцию при стрессе с учетом строения нейронов, их ок ружения, астроглиального и микроглиального представительства, картиро вания ряда изученных медиаторов, а для SO и SCh - ультрамикроскопиче ского строения. Все исследованные ядра гипоталамуса были разделены на пять групп (рис. 4).
«слабые» ядра с низкой практические не зави- «слабые» ядра с высокой по потенциальной рези- сящие от реактивности – тенциальной резистентно стентностью – POM POL, VM, PMd и ML стью – PeV и SO «сильные» ядра с низкой потенциаль- «сильные» ядра с высокой потенциаль ной резистентностью – PV и DM ной резистентностью – SCh, ARC, SuM, и PMv Рис. 4. Распределение вариабельных ядер гипоталамуса у крыс с высокой стресс-реактивностью на основании математического анализа.
1. К «сильным» ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессорному повреждению у животных с высокой стресс-реактивностью отнесены супрахиазматическое, аркуатное, супрамамиллярное и вентраль ная часть премамиллярного ядра.
2. «Сильными», но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессорному повреждению для животных ВСР группы были признаны триггерные ядра стресса - паравентрикулярное и дорсомедиальное.
3. К «слабым» структурам, но с высокой резистентностью к поврежде нию были отнесены супраоптическое и перивентрикулярное ядро.
4. Медиальное преоптическое ядро было единственным, расцененным как «слабое» с низкой резистентностью.
5. Латеральное преоптическое ядро, вентромедиальное ядро, медиаль ная часть премамиллярного ядра и латеральное мамиллярное ядро – ядра, строение и резистентность которых к повреждению от стресс-реактивности практически не зависели.
Безусловно, проводя такое разделение, мы отдавали себе отчет в том, что при развитии стресса на реальные изменения в ядре будет оказывать влияние не только особенности его нейронного окружения или устройства самих нейронов, но также общая и специфическая функциональная нагру женность в реализации работы стрессорной системы.
Подобный анализ возможен только в сопоставлении изменений по от дельным ядрам применительно к их установленной функции, рецепторному аппарату, медиаторному представительству и вовлеченности в развитие стрессорных реакций.
В преоптической зоне гипоталамуса, помимо развитого нейропиля, определялись три основных ядра, из которых максимально вариабельным от стресс-реактивности оказалось POM. Эта структура связана с терморегуля цией и участвует в регуляции секреции половых гормонов, сексуального по ведения, имеет выраженные различия у самцов и самок [Yoshida K. et al., 2002;
Lowry C.A. et al., 2007]. Предполагается также участие этой зоны и в интеграции импульсов сердечно-сосудистой системы [Акмаев И.Г., 2003;
Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.В., 2006], реакциях гипоталамуса на хрони ческую эндогенную интоксикацию [Фролов В.И., 2004].
На основе нашего анализа POM интактных животных было отнесено к «слабым» ядрам с низкой резистентностью. Это определялось относительно меньшими размерами перикарионов и ядер нейронов, менее плотной их упаковкой в ядре с относительно малым количеством граничных клеток и относительно низким микроглиальным представительством. В POM живот ных ВСР группы определялся относительно высокий исходный уровень экс прессии нейрональной нитроксидсинтазы.
В то же время, при стрессе это ядро оказалось поврежденным в отно сительно малой степени (около 5,0%), причем в равной степени в группах с различной стресс-реактивностью. Аналогичные факты были выявлены и при последующем анализе строения ядра после стресса.
По-видимому, POM не относится к ядрам, в значительной степени включающимся в реализацию стресс-системы, в связи с чем его изменения в нашей модели стресса оказываются менее ожидаемых и в малой степени за висят от стресс-реактивности. Определенную роль в этом может играть и общая картина защитного торможения, описанная для стресса в отношении преоптических структур в целом [Crowder R.J., Freeman R.S., 1998;
Stone E.A., et al., 2006], равно как и относительно умеренная реализации сосуди стых нарушений за счет активации нитроксидсинтаз и ФНО-зависимого апоптоза нейронов [Куликов В.П. с соавт., 2005;
Меньшанов П.Н. с соавт., 2007;
Schuler M., Green D.R., 2001;
Schultz D.R., Harrington W.J.Jr., 2003;
Mattson M.P., Kroemer G., 2003 ].
Перивентрикулярное ядро гипоталамуса у животных с высокой стресс реактивностью было нами отнесено к «слабым», но с высокой резистентно стью к повреждению. Этот прогноз полностью подтвердился. Степень по вреждения нейронов в PeV была чуть более 5% в ВСР группе, более 11% - в НСР группе. Изменения других показателей, в том числе незначительная ак тивация нитроксидсинтаз, хорошо согласуются с известными из литературы сведениями об относительно малом участии PeV в стрессорной реакции, умеренной выраженности ФНО-зависимого апоптоза при стрессе [Меньша нов П.Н. с соавт., 2007;
Figueiredo H.F. et al., 2003;
Badowska-Szalewska E., et al., 2006]. Локальное повреждение PeV способно предотвратить стрессорное ограничение секреции тиротропного гормона и гормона роста [Лычкова А.Э., Смирнов В.М., 2002;
Campbell R.E. et al., 2003].
Таким образом, мы подтвердили предположение о том, что у живот ных с высокой конституциональной стресс-реактивностью имеется исходно большая вероятность стрессорного повреждения POM, тогда как PeV по вреждается в меньшей степени и обладает высокой резистентностью к по вреждению.
Супраоптическое ядро рассматривается как наиболее поражаемое ядро при хроническом стрессе самой разной этиологии [Писарев В.Б., 1990;
Писарев В.Б., с соавт., 1998, 2006;
Фролов В.И., 2004]. Нейроэндокринные клетки SO и PV являются источниками кортиколиберина, тиролиберина и ряда других нейрогормонов, непосредственно вовлекающихся в стартовые (триггерные) механизмы стресса [Казакова с Т.Б. соавт., 2000;
Рыбникова Е.А. с соавт., 2001;
Вашадзе Ш.В., 2006;
Jorgensen H. et al., 2003;
Inoue T. et al., 2004].
В отношении этой структуры анализ выявил несколько противоречи вых данных. С одной стороны, при стрессе данное ядро у крыс с высокой стресс-реактивностью повреждалось сильнее, ОД нейронов в SO у животных ВСР группы уменьшалась на 22,3%, тогда как в НСР группе – только на 14%. Изменение размеров нейронов, сложности их окружения и количества нейроглии в принципе свидетельствовали, что SO ядро является «сильным звеном» главным образом у крыс с низкой конституциональной стресс реактивностью. В то же время существенные различия в экспрессии нитро ксидсинтаз, отсутствие существенных корреляционных доказательств между степенью повреждения и другими морфометрическими показателями не по зволили считать резистентность этого ядра сниженной. В итоге SO у живот ных с высокой стресс-реактивностью следовало отнести к группе «слабых» ядер с высокой резистентностью к повреждению.
При ультрамикроскопическом исследовании были выявлены еще не сколько особенностей SO у крыс с высоким уровнем стресс-реактивности:
относительно более высокий удельный объем митохондрий в перикарионах с их более функционально активной организацией.
Исходя из ключевых функций SO, результаты нашего анализа можно интерпретировать следующим образом.
1. Супраоптическое ядро способно к медленноволновой секреции кор тиколиберина, является основным продуцентом вазопрессина. Продукцию окситоцина и половых стероидов следует отнести скорее к минорным функ циям ядра [Patel K.P., et al., 2000;
Nomura M. et al., 2003]. Наряду с прямым своим действием, вазопрессин и окситоцин через местные механизмы моду лируют секрецию кортиколиберина и запуск секреции АКТГ [Sun Y. et al., 2001;
Wotjak C.T. et al., 2002].
2. При стрессе в SO происходит резкое уменьшение секреции вазо прессина, и данный эффект нередко приводит к развитию сосудистого кол лапса с переходом в шоковое состояние [Сивухина Е.В. с соавт., 2003;
Giusti-Paiva A., et al., 2002]. Подъем синтеза и секреции кортиколиберина начинается не сразу после стресса, а через 6-12 часов, обеспечивая закреп ление и определенную пролонгацию стрессовой реакции. Синтез окситоци на при стрессе в SO практически не меняется, а половых стероидов (что не столь существенно для гормонального пула в целом) – снижается [Berciano M.T. et al., 2002].
3. Следовательно, у животных с высокой стресс-реактивностью за счет существования особенностей строения SO в полной мере не обеспечивается адекватное развитие второй, более медленной волны выброса кортиколибе рина и соответствующих колебаний секреции стресс-лимитирующих гормо нов. Это и придает стрессу скоротечность и остроту, выдаваемую по внеш ним признакам за «высокую» реактивность.
Супрахиазматическое ядро было отнесено нами к сильным ядрам с потенциально высокой устойчивостью к повреждению.
Наличие в SCh интактных крыс ВСР группы относительно более вы сокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS 1/NOS-3 мы рассматриваем в качестве одной из ключевых характеристик, связанных с конституциональной стресс-реактивностью.
В нейронах SCh крыс ВСР группы также выявлено преобладание ге терохроматина, преимущественно рядом с ядерной оболочкой, отсутствие инвагинаций кариолеммы и высокая электронная плотность кариоплазмы.
Для них характерно обилие органелл в цитоплазме перикариона, моно морфность митохондрий и относительно малая плотность их матрикса. В своей совокупности эти особенности также рассматривались как субстрат большей функциональной активности и лабильности SCh у животных с вы сокой стресс-реактивностью.
При стрессе в SCh развивались относительно малые изменения, и ми нимальные – у животных с высокой стресс-реактивностью. Наличие в SCh стрессированных крыс ВСР группы относительно небольшого прироста NOS-1-позитивных нейронов и умеренный коэффициент NOS-1/NOS-3 сви детельствовали о его резистентности к стрессорному повреждению. Элек тронно-микроскопическое исследование нейронов выявило сохранение структуры ядерного хроматина и кариолеммы, небольшое увеличение числа митохондрий без структурных особенностей в них. В перинуклеарной об ласти части нейронов наблюдалась отчетливая вакуолизация, но мембран ные органеллы были многочисленны и структурно не повреждены.
Гуморальная активность SCh многообразна - это секреция вазопрес сина, окситоцина, опиатов, гонадолиберина, бомбезина [Владимиров С.В., Угрюмов М.В., 1995;
Васильев Ю.Г., с соавт., 2003;
Калинкин М.Н., с со авт., 2004;
Chan R.K. et al., 1993;
Carloni S. et al., 2004].
Сопоставление этих особенностей SCh у интактных животных и стресс-индуцированных изменений позволило с функциональным предна значением ядра позволило сделать следующее логическое построение.
1. SCh является центром циркадианных ритмов, которое воспроизво дится даже на удаленных из организма плоскостных срезах-культурах гипо таламуса, содержащих данное ядро. Важным входом этого ядра является проекция глаза, после разрушения SCh у крыс теряется способность на страивать эндогенный ритм на частоту чередования свет/темнота [Николс Дж. Г., 2003;
Васильев Ю.Г., с соавт., 2003;
Калинкин М.Н., с соавт., 2004;
Chan R.K. et al., 1993;
Carloni S. et al., 2004].
2. При стрессе и шоке с сохранением активности SCh связывают ос новные механизмы резистентности. Происходит учащение спонтанной им пульсации нейронов SCH, не связанных с суточной активностью, секреция коритиколиберина и окситоцина при этом увеличивается, гонадолиберина и опиоидов - уменьшается [Демко П.С. с соавт., 2002;
Кузнецов И.Э., 2003;
Sharkey J. et al., 2000;
Fonnum F., Lock E.A., 2004;
Slikker W.Jr. et al., 2005].
3. Следовательно, наличие сильного относительно мало повреждаемо го SCh у животных с высокой стресс-реактивностью способно модулировать триггерные эффекты стресса, тонически повышая активность многих струк тур ЦНС и более жестко блокируя основные гормональные оси, затормажи ваемые при остром стрессе (половых гормонов, гормона роста и др.). Этим и достигается более очерченная яркая картина стрессовой реакции у живот ных с высокой стресс-реактивностью.
Наконец, паравентрикулярное ядро занимало в наших исследовани ях особое место. Детально изученное, оно справедливо называется ключе вым триггерным ядром стресса. В первую фазу стресса оно выбрасывает большие количества кортиколиберина, оказывающего дальнейшее влияние на деятельность симпатико-адреналовой системы и, соответственно, измене ние коронарного кровотока, артериального давления, частоты сердечных сокращений, сосудистой проницаемости [Кузнецов И.Э., 2003;
Хитров Н.К., Салтыков А.Б., 2003;
Куликов В.П. с соавт., 2005;
Писарев В.Б. с соавт., 2006;
М.Ю.Капитонова с соавт., 2008]. Известно, что при стрессе кортико либерин может непосредственно использоваться в ткани гипоталамуса в ка честве нейротрансмиттера для модуляции высших поведенческих реакций [Shumake J. et al., 2001;
Boutahricht M. et al. 2005].
У интактных животных мы не выявили существенных особенностей строения самих нейронов PV в связи со стресс-реактивностью. В то же вре мя, на один нейрон в PV животных ВСР группы приходилось в среднем меньше граничных нейронов и астроглиоцитов, в сравнении с аналогичны ми показателями в НСР группе. Мы предположили, что стресс-реактивность определяется на уровне гипоталамуса не столько филогенетически закреп ленным для данного вида строением PV, сколько особенностями относи тельно молодых в филогенетическом отношении ядер с модулирующим в отношении стрессовой реакции действием, а также сложностью организации внутригипоталамических связей (нейропиля).
В то же время, наличие в PV интактных крыс ВСР группы относи тельно более высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый ко эффициент NOS-1/NOS-3 свидетельствовали о его более высокой реактивно сти при развитии стресса. На основании математического анализа связей со стресс-реактивностью PV было отнесено к «сильным», но со сниженной по тенциальной резистентностью к стрессу.
Действительно, при моделировании стресса у животных ВСР группы мы обнаружили большую степень поражения нейронов (25,6% против 13,8% в НСР группе). ОД нейронов в PV у животных с высокой стресс реактивностью уменьшалась почти вдвое, а в НСР группе – только на 37%, аналогично более интенсивные изменения были определены и для размеров ядер нейронов, прироста коэффициента окружение/нейрон и микроглиаль ной реакции.
При сопоставлении полученных данных о строении интактного PV в связи со стресс-реактивностью и его стресс-индуцированных изменений, мы построили следующее логическое заключение.
1. Основной функцией PV является секреция окситоцина и вазопрес сина крупноклеточной частью нейронов, мелкоклеточная часть ядра моду лирует эти функции и секретирует кортиколиберин [Акмаев И.Г., 2001;
Ев сеев В.А., с соавт. 2001;
Stern J.E., Zhang W., 2003]. Кроме этого, в PV про исходит синтез эндорфинов, ангиотензина, соматостатина, соматолиберина и пролактолиберина [Campbell R.E. et al., 2003]. Ассоциативные нейроны PV имеют в основном пептидергическую природу и обеспечивают взаимо действие пулов основных клеток-гормонопродуцентов, и на местном уровне акцептируют результат [Сивухина Е.В. с соавт., 2003;
Лискина Е.Б., 2003;
Кузнецов И.Э., 2003;
Kc P. et al. 2002;
Figueiredo H.F. et al., 2003;
Jingyi M.A.
et al., 1994;
Jorgensen H. et al., 2003;
Nomura M. et al., 2003;
Dallman M.F. et al., 2005].
2. PV непосредственно участвует в запуске стрессовых реакций. Вы брос кортиколиберина и молекулярные изменения в нейронах PV показаны уже спустя несколько секунд от начала стрессорного повреждения – раньше всех других изменений секреции в ЦНС [Корнева Е.А., 2000;
Суворов Н.Ф., Шуваев В.Т., 2002;
Reyes T.M. et al., 2003;
Campbell R.E. et al., 2003;
Girotti M. et al., 2006;
McCormick C.M. et al., 2007]. Нейроны PV, синтезирующие вазопрессин и соматостатин, также являются стресс-реактивными с ответом на стрессорное раздражение через 3-6 мин от его начала [Kc P. et al. 2002;
Girotti M. et al., 2006;
Dallman M.F. et al., 2005].
3. Соответственно, у животных с высокой стресс-реактивностью мы наблюдаем не столько повреждение, сколько истощение PV при стрессе, обеспечивающее максимально выраженный характер стрессорной актива ции с выбросом кортиколиберина и других модулирующих стрессорные ре акции гормонов. Это, безусловно, «сильное» ядро у животных с высокой стресс-реактивностью. Его весьма высокая степень повреждения при разви тии стресса преимущественно определяются функциональной нагрузкой PV и слабостью его микроглиального представительства.
Завершая описание переднего гипоталамуса в нашей работе, мы не можем не коснуться и не обсудить результатов нового метода исследования в нейроморфологии – радиальной морфометрии биологических объектов с использованием биологически актуальной системы координат.
Принцип радиальной морфометрии основан на классических концеп тах нейроморфологии, благодаря которым и были, собственно говоря, выде лены, ядра гипоталамуса [Автандилов Г.Г., 1973;
Боголепов Н.Н, 1980;
Пи сарев В.Б., 1990;
Thompson R.H., Swanson L.W., 2002]. Компьютерная мор фометрия, основанная на построении осевых градиентов (трансверсального, дорсовентрального и краниокаудального) тинкториальных свойств нервной ткани является эффективным подходом к анализу конституциональных осо бенностей морфологии ЦНС. С помощью формализованных показателей функции распределения интенсивности при морфометрии препаратов, ок рашенных классическим для нейроморфологии методом – тионином по Нисслю, нам удалось показать особенности, свойственные SO, SCh, PV у животных с различной стресс-реактивностью.
1. У животных с высокой стресс-реактивностью, структуры переднего гипоталамуса, расположенные краниально, имели меньшее соотношение нейрон/глия, а структуры, расположенные каудальнее – большее, в сравне нии с НСР группой.
2. У интактных крыс с высокой стресс-реактивностью плотность рас положения нейронов в SO оказывалась достоверно выше в вентральной час ти ядра и имела флуктуации плотности (идентифицируемые как нейронные ансамбли), тогда как у крыс НСР группы нейроны располагались более рав номерно по всему объему SO. При стрессе наблюдалось выравнивание (го могенизация) плотности, более показательное у животных с высокой стресс реактивностью.
3. У животных ВСР группы вне стресса нейроны плотнее располага лись к дорсомедиальной части SCh, в то время как у крыс с конституцио нально низкой реактивностью - к медиальной части, часто образуя при этом нейронные ансамбли. При стрессе у животных ВСР группы снижались ме диолатеральный и дорсовентральный градиенты, тогда как у крыс с низкой стресс-реактивностью сохранялось относительно плотное и гомогенное рас положение нейронных ансамблей со склонностью к концентрации в дорсо медиальном направлении от центра ядра.
4. В PV интактных животных ВСР группы нейроны располагались равномерно, тогда как у крыс с низкой стресс-реактивностью их плотность нарастала к центру ядра. При стрессе дорсовентральный градиент плотности нейронов выравнивался, появлялось четкое понижение плотности к лате ральной периферии ядра, более выраженные в ВСР группе.
В настоящее время все чаще звучит мысль о том, что современная ко личественная морфология с введением в практику компьютерного анализа образов должна перейти от механической «оцифровки» численных показа телей, описывающих структуры, к более сложным, интерпретирующим свя зям между элементами единой системы гистиона [Автандилов Г.Г., 2002;
Писарев В.Б., с соавт., 2006;
Hamano H. et al., 2002].
В переднем гипоталамусе удалось проанализировать и NO-зависимый механизм повреждения нейронов.
Окись азота участвует в механизмах повреждения нейронов при трав ме, острой ишемии мозга, стрессе и шоке. Любые процессы, ведущие к на коплению ионов Са2+ в клетке (энергетический дефицит, изменения актив ного ионного транспорта, глутаматная «эксайтотоксичность», оксидантный стресс), сопровождаются повышением уровня NO [Марков Х.М., 2006;
Ya mamoto F. et al., 2007;
Gingerich S., Krukoff T.L., 2006].
Возбуждение NMDA рецепторов приводит к активации NOS-1 и по вышенному высвобождению NO. В настоящее время нет однозначного мне ния о роли оксида азота в механизме токсического действия глутамата. Его токсическое действие связано с нарушением митохондриального окисли тельного фосфорилирования и метаболизма рибонуклеотидредуктазы, об разованием свободнорадикального соединения пероксинитрит-аниона, ко торое блокирует ряд нейрональных рецепторов, инактивирует фермент су пероксиддисмутазу и вызывает углубление свободнорадикального окисле ния, приводящего к гибели клетки. Кроме того, пероксинитрит способен тормозить тирозинкиназу, входящую в активный центр нейротрофических факторов, увеличивая степень недостаточности трофического обеспечения мозга [Лискина Е.Б., 2003;
Zanchi A. et al., 1995;
Brenman J.E., Bredt D.S., 1996;
Eliasson M.J. et al., 1999;
Han H.S. et al., 2002;
Meini A. et al., 2006].
В то же время, имеются сведения о том, что NO, активируя раствори мую гуанилатциклазу, повышает синтез циклического гуанозинмонофосфа та и может защищать нейроны при токсическом воздействии глутамата.
Формирование нитрозониума-иона NO+, связывающего регуляторный центр NMDA рецепторов, уменьшает их возбудимость и снижает чувствительность к повреждению [Недоспасов А.А., 1998;
Тотолян А.А., 2003;
Малышев И.Ю., с соавт., 2004;
Pringle A.K. et al. 1999;
Golde S. et al., 2002;
Yamamoto F. et al., 2007].
Таким образом, проявляется двойственная природа окиси азота, при сущая многим природным модуляторам.
Результаты наших экспериментов свидетельствуют о неодинаковой экспрессии нитроксидсинтазы в переднем гипоталамусе.
У интактных крыс ВСР группы относительно высокий процент имму нопозитивных нейронов выявлялся в медиальном преоптическом, паравен тиркулярном и супраоптическом ядрах, несколько меньше была экспрессия в POl, PeV и SCh. Экспрессия NOS-3 была относительно невелика, в сравне нии с НСР группой. Наличие относительно высокого процента NOS-1 позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3, свидетельст вующий о более высоком представительстве эндотелиальной нитроксидсин тазы, мы отнесли к предикторам более высокой стресс-реактивности. По видимому, исходно низкое представительство эндотелиальной изоформы NOS имеет прямое отношение к последующей динамике стрессорного по вреждения нейронов в этом участке ГМ и может быть использовано при разработке новых подходов к нейропротекции.
Действительно, при стрессе мы увидели различия в экспрессии нитро ксидсинтаз по отдельным ядрам.
1. В SO и PV крыс ВСР группы при стрессе наблюдался относительно больший прирост NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS 1/NOS-3, что отражало более высоком участие эндотелиальной нитроксид синтазы в развитии стрессорного повреждения нейронов.
2. В SCh стрессированных крыс ВСР группы наблюдался относитель но меньший прироста NOS-1 и умеренный коэффициент NOS-1/NOS-3, что соответствовало меньшему повреждению нейронов.
В то же время, интенсивность повреждения нейронов при стрессе, за висящая от стресс-реактивности животных, в преоптической группе ядер, по-видимому, в малой степени была связана с местными механизмами взаимодействия двух изоформ нитроксидсинтаз.
Вентромедиальное ядро особенностей, связанных со стресс реактивностью, практически не имело. Лишь у крыс ВСР группы нейроны VM имели несколько большие размеры ядра и меньшее отношение перика рион/ядро, среднее количество граничных астроглиоцитов было больше примерно на треть аналогичного показателя у крыс с низкой стресс реактивностью.
При стрессе степень повреждения нейронов в VM также не различа лась между группами, была относительно высокой, составляя около 22%.
Как известно, вентромедиальное ядро функционально является «цен тром насыщения» и через свои многочисленные связи с различными струк турами ЦНС и внутри гипоталамуса является классически модулирующим для большинства других ядер [Акмаев И.Г., 2003;
Писарев В.Б. с соавт., 2006;
Bowie A., O’Neill L.A., 2000;
Tran P.V., et al., 2006;
Goto S. et al., 2007].
По-видимому, фенотипически проявляющаяся высокая стресс реактивность не требует каких-либо особенностей от строения VM, равно как она и не отражается на его вовлеченности в стресс-индуцированное по вреждение гипоталамуса.
Дорсомедиальное ядро у интактных крыс имело многочисленные особенности в связи с их стресс-реактивностью. Для животных ВСР группы были характерны относительно более плотно расположенные крупные ней роны с большим ядром и объемом перикариона, малым объемом перикари онного окружения. Для таких нейронов характерно большое число гранич ных нейронов, микроглии и, в особенности, - астроглии. Процент катехола минергических и глутаматцептивных нейронов был достоверно больше. На основании математического анализа мы отнесли DM у крыс с высокой стресс-реактивностью к числу «сильных», но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессорному повреждению.
При стрессе степень повреждения нейронов в DM существенно разли чалась между группами: 7,2% в ВСР и 15,2% - в НСР группе.
У животных с высокой стресс-реактивностью ОД нейронов уменьша лась 10,7%, у крыс НСР группы – на 15%. Объемное отношение нейронного окружения к перикариону увеличивалось при стрессе в ВСР группе в 1, раза, в НСР группе – в 1,1раза. Коэффициент микроглия/нейрон возрастал на 23,9% в ВСР группе, на 81,3% - в НСР группе. При иммуногистохимиче ском выявлении тирозингидроксилазы зафиксировано частичное истощение синтетической активности катехоламинергических нейронов, более выра женное у животных с низкой стресс-реактивностью. В противовес этому, экспрессия GR2 увеличивалась без каких-либо существенных различий ме жду группами.
Для объяснения подобного несовпадения между изначальным прогно зом и степенью стрессорных изменений нами были проанализированы воз можные дополнительные факторы, имеющие значения для повреждения DM в связи с его функцией и участием в развитии стрессовой системы.
1. Как известно, DM относится к структурам, осуществляющим на уровне гипоталамуса коммуникацию между нейроэндокринными, вегета тивными и поведенческими реакциями, включая участие в болевой (ноци цептивной) системе. Это обеспечивается наличием весьма широкого спектра медиаторов: норадреналина, серотонина, дофамина, ГАМК, ряда пептидов [Westphal R.S. et al., 1999;
Morin S.M. et al., 2001;
Lay A.J. et al., 2007;
Gos wami C. et al., 2007]. Не следует забывать о сексуальном диморфизме ядра и о его участии в регуляции полового поведения [Ахмадеев А.В., Калимулли на Л.В., 2006].
2. При стрессе в DM происходит многократное увеличение (взрыв) медиаторной активности, причем описано генетическое детерминирование силы ответа [Kovacs K.J., Sawchenko P.E., 1996;
Paskitti M.E. et al., 2000;
Lowry C.A. et al., 2003]. Сама территория DM при стрессе относится к уяз вимым, и становится местом выраженных микроциркулярторных наруше ний, отека и гибели нейронов [Смирнов А.В., 2003, 2005;
Nedungadi T.P. et al., 2006].
3. Следовательно, объяснение столь мощного повреждения DM у жи вотных с высокой стресс-реактивностью следует искать не столько в особен ностях строения ядра до начала стресса, сколько в его более интенсивном вовлечении в развитие стрессовой системы при активации «сильных» триг герных ядер, прежде всего – PV. Это позволяет отнести механизм большего стресс-индуцированного повреждения DM у животных с высокой стресс реактивностью к вторичным.
Аркуатное ядро у крыс с высокой стресс-реактивностью имело ряд особенностей. Прежде всего, для него были характерны относительно боль шая ОД нейронов, с несколько меньшие размеры ядер нейронов, но большие размеры перикарионов. При относительно небольшом объеме перикарион ного окружения нейроны ARC у животных с высокой стресс-реактивностью имели большее число граничных астроглиоцитов и меньшее – микроглиоци тов. Для них характерны более низкие экспрессии тирозингидроксилазы и рецепторов глутамата. По результатам математического анализа ARC было отнесено к «сильным» ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессорному повреждению.
Как и большинство ядер переднего и среднего гипоталамуса, ARC имеет множественное медиаторное представительство (дофамин, серотонин, брадикинин, ГАМК, нейропептид Y, субстанция Р, эндорфин), и выполняет ассоциативные и гормональные функции. Основные гормоны, происходя щие из ARC – меланокортин и гонадолиберины, частично разделенные в ядре пространственно [Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.В., 2006;
Boche D. et al. 2003;
Balkan B. et al., 2003;
Wu Y.H., et al., 2006;
Lowry C.A. et al., 2007].
При стрессе одни авторы указывают на умеренное [Демко П.С. с со авт., 2002;
Кузнецов И.Э., 2003;
Sharkey J. et al., 2000;
Fonnum F., Lock E.A., 2004;
Slikker W.Jr. et al., 2005], другие – на весьма высокое повреждение ARC [Писарев В.Б., 1990;
Казакова Т.Б. с соавт., 2000;
Смирнов А.В., 2003;
Фролов В.И., 2004;
Копылова Г.Н., с соавт., 2007].
В наших исследованиях, при стрессе степень повреждения нейронов в ARC достоверно различалась между группами: 2,6% в ВСР и 9,2% - в НСР группе. Аналогичные доказательства были получены и при корреляционном анализе основных морфометрических показателей.
Для дополнительного обоснования этого факта мы приняли во внима ние несколько известных данных.
Во-первых, наибольшая концентрации рецепторов к кортиколиберину за пределами гипофиза выявлена в аркуатном ядре гипоталамуса [Slikker W.Jr. et al., 2005]. Это свидетельствует в пользу его быстрого вовлечения в работу стрессовой системы.
Далее (это уже наши находки), нейроны аркуатного ядра обладают у крыс с высокой стресс-реактивностью более высоким представительством катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов, что определяет для этих ядер повышенную роль в модуляции силы и продолжительности стрес совой реакции.
Еще одна особенность лежала в специфичности ядра в связи с его уча стием в регуляции секреции половых гормонов. Освобождаемый из нейро нов гонадолиберин только по «классической» схеме избирательно действует на клетки аденогипофиза. Реально локальное выделение этого релизинг гормона в гипоталамусе сопряжено с активностью и секрецией не только половых гормонов, но и норадреналина, дофамина, гистамина, глутамата, ГАМК. Они обладают мощными связями с циркадианной ритмикой, акцеп цией боли, и многими другими вегетативными функциями, а также иммуно логической реактивностью организма [Николс Дж. Г., 2003;
Васильев Ю.Г., с соавт., 2003;
Калинкин М.Н., с соавт., 2004;
Chan R.K. et al., 1993;
Carloni S. et al., 2004]. Эти факты лежат в основе прямого доказательства паралле лей между иммуносупрессивным и гипорепродуктивными эффектами хро нического стресса [Клименко В.М., 1993;
Friedman E.M., Irwin M.R., 1995;
Dufourny L., Skinner D.C., 2002].
В мамиллярном комплексе наше внимание привлекли в основном две структуры: супрамамиллярное ядро и дорсальная часть премамиллярно го ядра.
У животных с высокой стресс-реактивностью в супрамамиллярном ядре ОД нейронов, СО ядер и перикарионов нейронов, объемы нейронного окружения, среднее число граничных клеток на 12%-25% превышали анало гичные показатели у крыс НСР группы. При высоком микроглиальном представительстве в целом, коэффициент микроглия/нейрон был на 25% меньше в ВСР группе.
При стрессе у животных ВСР группы степень повреждения нейронов в SuM оказывалась значительно выше, чем в НСР группе (29,8% против 12,1%). Такие важнейшие для определения стресс-индуцированного повре ждения ядра показатели морфометрии, как снижение ОД нейронов, увели чение СО ядер нейронов и увеличение коэффициента микроглия/нейрон бы ли выражены в SuM у животных с высокой стресс-реактивностью значи тельно ярче, в сравнении с альтернативной группой.
В PMd объемная доля нейронов у крыс с высокой стресс реактивностью на 24,9% превышала аналогичный показатель в НСР группе с низкой стресс-реактивностью, среднее число нейронов и средние размеры их ядер – на 20%. На каждый нейрон PMd у животных с высокой стресс реактивностью приходилось на 39,6% больше граничных нейронов и на 51% больше граничных астроглиоцитов, в сравнении с аналогичными пока зателями в НСР группе. Остальные показатели существенно не отличались между группами.
При стрессе в PMd различий между группами в степени повреждения нейронов не было отмечено (около 12%). Не было различий у степени сни жения ОД нейронов, изменения СО ядер нейронов, отношения окруже ние/перикарион и коэффициента микроглия/нейрон.
На основании математического анализа мы пришли к выводу, что SuM относится к «сильным» ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессовому повреждению, а PMd – к ядрам, строение и резистентность которых к повреждению от стресс-реактивности практически не зависит.
Для объяснения феноменов, развивающихся в мамиллярном комплек се при стрессе, мы приняли во внимание следующие факты.
1. Мамиллярный комплекс относится к наиболее древним образовани ям гипоталамуса и функционально связан скорее с другими отделами лим бической системы (прежде всего – гиппокампом), нежели с вентральными ядрами и секреторной частью гипоталамуса. Нейроны SuM и PMd этого комплекса оказывают тормозное ГАМК-ергическое влияние на кору, рети кулярную формацию и элементы лимбической системы. На основании на личия этих связей предполагают участие структур мамиллярной области в выявлении образов памяти и формировании эмоциональной окраски пове дения, в том числе – при стрессе [Писарев В.Б. с соавт., 2006;
Kovacs K.J., Sawchenko P.E., 1996;
Wirtshafter D., 1998;
Nakamura M., et al., 2007].
2. Исследуя PMd при хроническом стрессе, В.Б.Писарев с соавт.
(1995) описали нейроны этих ядер как максимально резистентные к повре ждению среди всех структур маммилярного комплекса, а нейроны SuM – как наименее резистентные. Предварительное повреждение мамиллярных тел сопровождается снижением скорости принятия решений при стрессор ных нагрузках и усиливает степень стрессорного повреждения внутренних органов [Тарабрина Н.В. с соавт., 1996;
Beracochea D.J., Jaffard R., 1995] 3. Следовательно, элементы мамиллярного комплекса не могут, за ис ключением SuM, быть отнесены к ключевым структурам, определяющим на уровне гипоталамуса стресс-реактивность и уровень стрессорного повреж дения. Их собственное повреждение носит скорее перегрузочный характер и определяется относительно большей интенсивностью стрессорной афферен тации лимбической системы у животных с высокой стресс-реактивностью.
Таким образом, проведя детальный анализ по отдельным ядрам гипо таламуса, мы можем утверждать, что на ультраструктурном, клеточном и тканевом уровне ядра и поля гипоталамуса (каждое – в разной степени) обладают широкой вариабельностью строения, в котором можно выде лить устойчивые наборы признаков, свойственных животным с кон ституционально высокой и низкой стресс-реактивностью. С другой стороны, наличие (предсуществование) этих особенностей только час тично определяет характер и выраженность последующих стресс индуцированных изменений в этих структурах.
Изменения гипоталамуса при стрессе развиваются не во всех ядрах и носят комплексный характер, в качестве обязательных компонентов вклю чая в себя сосудистые нарушения, повреждение и компенсаторную пере стройку нейронов, изменения нервных проводников и реакцию нейрогли альных элементов (табл.2).
В целом, можно подтвердить, что конституционально высокая стресс реактивность является фактором, обеспечивающим при стрессе относитель но более высокое повреждение нейронов в супраоптическом, паравентри кулярном и супрамамиллярном ядрах и ретрохиазмальной области гипота ламуса, но меньшее повреждение нейронов в перивентрикулярном, супра хиазматичеком, дорсомедиальном ядрах и латеральной гипоталамической области. Эти различия не обязательно наблюдались только в ядрах с высо кой интенсивностью стресс-индуцированных повреждений.
Обнаруженный полиморфизм изменений основных ядер гипоталами ческой области выявил ряд специфических черт, характерных для высоко организованных структур ЦНС:
- высокий процент клеток с сохранной структурой, находящихся в со стоянии повышенной функциональной активности;
- большую зависимость изменений от локализации и функционального предназначения ядра, нежели от его васкуляризации и глиального предста вительства;
- выраженный краниокаудальный и дорсо-вентральный градиент по ражения при полном отсутствии билатеральной асимметрии (рис. 5).
Таблица Степень повреждения нейронов (%, M±m) при 24-часовом иммобилизационном стрессе крыс с различной стресс-реактивностью Группы животных Ядра и поля ВСР НСР Гипоталамуса Интактные Стресс Интактные Стресс Передняя группа Мед. преоптическое (POM) 4,5±0,3* 0 0 5,0±0,4* Лат. преоптическое (POL) 2,3±0,2* 2,6±0,3* 0 Перивентрикулярное (PeV) Супраоптическое (SO) 0,9±0,1 6,1±0,5* 1,0±0,2 11,0±0,2*# Супрахиазматическое 2,7±0,2 22,0±1,2* 0,6±0,1# 14,3±1,1*# (SCh) Паравентрикулярное (PV) 3,4±0,2* 7,1±0,5*# 0 Преоптическая область 3,5±0,2 25,6±1,3* 0,5±0,1# 13,8±1,4*# (APO) Ретрохиазмальная область 3,8±0,3* 4,0±0,3* 0 (RCh) 0,5±0,1 6,2±0,5*# 9,1±0,7* Медиальная и латеральная группы Дорсомедиальное (DM) 0,6±0,1 7,2±0,5* 16,5±1,3*# Вентромедиальное (VM) 1,3±0,2 22,0±2,1* 21,8±1,6* Аркуатное (ARC) 2,6±0,2* 9,2±0,8*# 0 Лат. гипоталамическое яд ро (NHL) 11,2±0,7* 11,0±1,2* 0 Латеральное поле (AHL) 0,6±0,1 9,1±0,6* 12,5±1,6*# Серый бугор (TGr) 3,3±0,4* 0 0 3,2±0,4* Задняя группа Супрамамиллярное (SuM) 2,1±0,2 29,8±2,3* 1,1±0,2# 14,8±1,1*# Лат. мамиллярное (ML) 3,0±0,3* 0 2,9±0,2* Мед. часть медиального мамиллярного (MMm) 2,8±0,2* 3,2±0,3* 0 лат. часть медиального мамиллярного MMl) 3,1±0,2* 3,3±0,3* 0 Дорсальная часть премамиллярного (PMd) 1,1±0,2 11,8±1,0* 0,5±0,1# 12,1±1,0* Вентральная часть премамиллярного (PMv) 1,0±0,2 3,6±0,4* 0 3,9±0,5* * - достоверные различия между интактными и после стресса, # - между ВСР и НСР группами 14 Интактные Стресс 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Дорсовентральный градиент Интактные Стресс 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Медиолатеральный градиент Рис. 5. Дорсовентральный и медиолатеральный градиенты плотности нейро нов в супраоптическом ядре гипоталамуса при стрессе крыс с высокой стресс реактивностью. Ось абсцисс – доли в масштабах ядра, ось ординат - удельная плот ность нейронов.
При прочих равных в гипоталамусе в большей степени подвергаются морфофункциональным преобразованиям эволюционно молодые, лучше васкуляризованные и более функционально нагруженные области. Выяв ленные закономерности в целом не противоречат общим представлениям о нейроморфологии стресса [Крыжановский Г.Н., 2001;
Зиматкин С.М., с со авт., 2003;
Schiltz J.C., Sawchenko P.E., 2002;
Ajmone-Cat M.A., et al., 2002;
McGill B.E., et al., 2006;
Ostrander M.M., et al., 2006].
Следующий вопрос, требующий обсуждения, - возможные пути и ме ханизмы деплеции нейронов при стрессорном повреждении.
Во-первых, наблюдаемая в наших опытах при стрессе степень повре ждения нейронов ни в одном из ядер и полей гипоталамуса не была фаталь ной. Оставшийся объем нейронов был вполне достаточен для выполнения функции ядра и поддержания его структурно-функциональной целостности.
При этом степень повреждения существенно варьировала (от 2,9%-5,0% (то есть статистически недостоверного), до 25%-30%, что могло рассматривать ся как повреждение средней степени с серьезными последствиями для само го ядра и организма в целом.
У животных НСР группы максимальные изменения фиксировались в VM (22%), DM (16,5%), PeV, SO, PV, SuM, PMd и латеральном гипотала мическом поле (все в пределах 11% -14,3%). У животных с высокой стресс реактивностью степень повреждения в VM (21,8%) и PMd (12,1%) была аналогичной, в SO (22%), PV (25,6%), SuM (29,8%) - оказывалось значи тельно выше, а в PeV, SCh и DM - достоверно ниже, в сравнении с этими же показателями в НСР группе.
Таким образом, анализ степени стрессорного повреждения выявил не сколько структур гипоталамуса, «актуальных» с точки зрения стресс реактивности. Наиболее поражаемыми при стрессе являлись нейроны (в по рядке убывания) в следующих ядрах гипоталамуса: паравентрикулярное, супрамамиллярное, вентромедиальное, супраоптическое.
Нами на основании математического анализа были выделены не сколько ключевых изменений, связанных как со стрессом, так и различиями в стресс-реактивности животных.
1. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с увеличением степени повреждения нейронов, уменьшением ОД нейронов и СО их ядер, что ха рактерно для SO, PV, SuM, PMd.
2. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с уменьшением степе ни повреждения нейронов, уменьшением ОД нейронов и СО их ядер, что характерно для SCh и DM.
3. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с более выраженной микроглиальной реакцией, что характерно для SO, PV и SuM.
4. Высокая стресс-реактивность ассоциируется с менее выраженной микроглиальной реакцией, что характерно для DM и PMd.
Интересно, что такие исследованные показатели, как тканевое распре деление нейрональной нитроксидсинтазы и ее соотношение с эндотелиаль ной изоформой, тирозингидроксилазы (дофаминергического представитель ства) и глутаматного рецептора не позволили прийти к сколько-нибудь од нозначному заключению об их роли в нейрональном повреждении при стрессе, тем более – о его зависимости от стресс-реактивности.
При наличии стрессорного повреждения основная реакция в яд рах гипотатамуса, на наш взгляд, связана с изменением межклеточного взаимодействия микроглия – нейрон.
Большая сложность организации нейропиля ретрохиазмальной и лате ральной гипоталамической области является одним из доказательств боль шего значения внешних связей гипоталамуса с таламусом и фронтальными областями коры головного мозга в обеспечении высокой стресс реактивности в сравнении с нервными внутригипотамическими связями.
Изменения нервных волокон и нервных проводников характеризова лись набуханием, гомогенизацией, избыточной аргирофилией и частичной фрагментацией. Максимальным изменениям подвергались нисходящие та ламические волокна и эфферентные пути самого гипоталамуса, меньшему повреждению - афферентные восходящие волокна и гипоталамо гипофизарные связи. На всем протяжении гипоталамуса, с постепенным уменьшением к преоптической области и усилением в вентральных отделах, обнаруживались мелкие и более крупные участки микроглиоза. В зонах максимального повреждения нейронов (PV, VM, SuM) возможно было по явление мелких групп гипертрофированных микроглиоцитов, иногда с об разованием зернистых шаров. Степень микроглиальной реакции была про порционально степени нейронального повреждения и, соответственно, убы вала в ряду PV, SO, VM, SuM передняя и наружная группы ядер PeV, RCh, AHL, PMd POM, DM, ARC остальные ядра преоптической области и мамиллярного комплекса.
При иммуногистохимическом окрашиванием на кислый глиальный протеин мы показали, что при стрессе наблюдается уменьшение фактора формы проводников, снижение отношения яркостей GLAP/матрикс более чем на треть в ВСР группе и на 45% - в ВСР, а также снижение объемной доли GLAP-позитивного материала.
Как известно, именно в сохранности проводников усматривается про лонгация работы стресс-системы на высоком уровне активности. При стрес се нейроны латеральной области быстро истощаются и становятся гипосек реторными [Талалаенко А.Н. с соавт., 2001;
Bruses J.L., Rutishauser U., 1998;
Kiss A., 2007;
McCormick C.M., et al., 2007].
В любом ядре ГМ астроглия, олигодендроглия и микроглиоциты весь ма плотно упакованы, но взаимодействие между этими клетаками не в пол ной мере определяется плотностью этой упаковки [Krasowska-Zoladek A., et al., 2007].
Обычно астроциты и микроглия клетки реагируют на повреждение нейронов репликацией. Они участвуют в удалении продуктов распада и восстановлении тканевых взаимоотношений. На первом этапе микроглиаль ные клетки и макрофаги, которые проникают в поврежденный участок ЦНС из крови, соответственно делятся и удаляют продукты распада умирающих клеток [Block M.L. et al., 2007;
Taner D., et al., 2007].
Сразу после повреждения ЦНС микроглиальные клетки мигрируют к месту повреждения со скоростью около 300 мкм/час, аккумулируются на этом месте и фагоцитируют поврежденную ткань. Гибридизация in situ и иммунохимические реакции показали, что микроглиальные клетки проду цируют в месте повреждения ламинин — молекулу экстраклеточного мат рикса, которая способствует росту нейритов в культуре и in vivo.