авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Разработка биокаталитических методов получения (r)- и (s)-энантиомеров 1-фенилэтанола и эйкозапентаеновой кислоты

На правах рукописи

КАЛИМУЛЛИНА ЛИЛИЯ ЯГФАРЬЕВНА РАЗРАБОТКА БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ (R)- И (S)-ЭНАНТИОМЕРОВ 1-ФЕНИЛЭТАНОЛА И ЭЙКОЗАПЕНТАЕНОВОЙ КИСЛОТЫ 03.00.23 – Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Казань – 2008

Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета.

Научный руководитель доктор химических наук, профессор Зорин Владимир Викторович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Гамаюрова Валентина Семеновна кандидат технических наук, доцент Кусова Ирина Валерьевна Ведущая организация Институт биологии Уфимского научного центра Российской академии наук

Защита состоится «12» ноября 2008 года в 14:00 на заседании диссертационного совета Д 212.080.02 при Казанском государственном технологическом университете по адресу:

420015, г. Казань, ул. К.Маркса, 68, зал заседаний Ученого Совета (А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Электронный вариант автореферата размещен на сайте Казанского государственного технологического университета (www.kstu.ru)

Автореферат разослан « » октября 2008 года.

Ученый секретарь совета Сироткин А.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Процессы биотрансформации органических соединений, осуществляемые с помощью оксидоредуктаз микроорганизмов (карбонилредуктаз и де сатураз), представляют значительный интерес для создания перспективных методов получения практически важных веществ, таких как эйкозапентаеновая кислота (ЭПК), (R)- и (S)-энантиомеры 1-фенилэтанола (1-ФЭ) и др.

ЭПК используется в качестве диетарных добавок при лечении и для профилакти ки различных хронических и воспалительных заболеваний, включая сердечно сосудистые заболевания, ревматоидные артриты, астму, экзему, псориаз и рак.

(R)- и (S)-энантиомеры 1-фенилэтанола а также их производные являются синто нами лекарственных препаратов, обладающих антидиабетическим, антидепрессантным и антирабическим действием. Эти соединения используются также при получении жид ких кристаллов и в синтезе оптически активных полимеров, применяемых для разделе ния рацемических смесей органических веществ.

Получение этих соединений химическими методами представляется мало эффек тивным.

В связи с этим создание высокоэффективных биокаталитических систем и разра ботка на их основе регио- и стереонаправленных методов получения ЭПК и оптически чистых энантиомеров 1-ФЭ, а также поиск методов их интенсификации являются акту альной задачей.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой про граммой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундамен тальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракт № 02.438.11.7003), планами научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой «Развитие научного потенциала высшей школы» (2006-2008 гг., № РНП.2.2.3.1.5668).

Цель работы. Разработка регио- и стереоселективных биокаталитических мето дов получения эйкозапентаеновой кислоты и оптически чистых энантиомеров 1-фенилэтанола из доступного сырья.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

• проведение скрининга микроорганизмов, способных осуществлять энантиоселек тивное восстановление ацетофенона (АФ) при высоких концентрациях субстрата;

• разработка энантиоселективных биокатализаторов на основе клеток микроорга низмов для получения оптически чистых энантиомеров 1-фенилэтанола;

• разработка методов получения (S)- и (R)-энантиомеров 1-фенилэтанола с помо щью разработанных биокатализаторов;

• разработка эффективного метода получения эйкозапентаеновой кислоты био трансформацией доступных растительных масел.

Научная новизна. Создан новый биокатализатор на основе гриба Geotrichum sp. 85-1 и найдены условия, в которых с его участием осуществляется энантио селективное восстановление ацетофенона в S-энантиомер 1-фенилэтанола при высоких концентрациях субстрата.

Обнаружена реакция изомеризации рацемической смеси (S)-изомера 1-фенилэтанола в (R)-изомер при инкубировании биомассами культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13 и Candida sake 777.

Показана способность гриба Mortierella alpina 18-1 или его галорезистентного мутан та ХН1 трансформировать соевое, подсолнечное и оливковое масла в липиды, обогащен ные эйкозапентаеновой кислотой.

Практическая значимость. Разработаны методы получения эйкозапентаеновой ки слоты с помощью гриба Mortierella alpina 18-1 биотрансформацией растительных масел (льняного, соевого, подсолнечного и оливкового) с выходом 5,2 – 7,9 г/кг среды.

Созданы методы получения (S)-(-)-1-фенилэтанола энантиоселективным биовосста новлением ацетофенона с помощью культуры микроорганизма Geotrichum sp. 85-1 с выхо дом 83,6% и оптической чистотой не менее 99%ее, а также (R)-(+)-1-фенилэтанола изоме ризацией S-энантиомера рацемической смеси с помощью культуры микроорганизма Can dida sp. 81-12 с выходом 95% и оптической чистотой 95,8%ее.

Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных ра бот и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 24.09.01 - Биотехнология в Уфимском государственном нефтяном техническом универси тете.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на IV, V Всероссийских научных INTERNET-конференциях «Интеграция науки и высшего образо вания в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа,2005-2006), VI Все российском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа,2007).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, и тезисы 3 докладов.

Структура и объем работы: Диссертация включает введение, обзор литературы ( глава), описание объектов и методов исследования (2 глава), обсуждение результатов (3 гла ва), выводы, список цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 143 страни цах машинописного текста, содержит 34 рисунка, 19 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Разработка биокаталитических методов получения оптически активных (S)- и (R)-1-фенилэтанолов 1.1 Скрининг микроорганизмов Основным недостатком известных биокатализаторов, энантиоселективно восста навливающих ацетофенон (АФ), является необходимость проведения реакции при низ ких концентрациях токсичного субстрата, а также использование большого количества биомассы.

Поиск микроорганизмов, обладающих карбонилредуктазной активностью в от ношении АФ, осуществляли среди дрожжей из музея кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, у которых ранее была выявлена способность к энантиоселективному восстановлению этилацетоацетата в S- и R-этил-3 оксибутираты. Кроме того, были выделены 3 изолята грибов рода Geotrichum, так как согласно литературным данным представители этих грибов являются наиболее эффек тивными восстановителями АФ.

В результате исследования были выявлены 4 культуры микроорганизмов, способ ные восстанавливать АФ в высокой концентрации (5 г/л) с выходом более 75 % 1-ФЭ за 24 ч трансформации (таблица 1). Дрожжевые культуры восстанавливали субстрат пре имущественно в (S)-1-ФЭ, тогда как гриб Geotrichum sp. 85-1 в основном накапливал (R)-1-ФЭ.

Таблица 1 – Удельная активность биомассы, оптические свойства продуктов и конвер сия субстрата при трансформации АФ клетками микроорганизмов [ ] Выход Оптическая Удельная ак- D Конверсия, Микроорганизм чистота, 1-ФЭ, тивность, (конфи % % ее % ммоль/(г(асв)*ч) гурация) Geotrichum sp. 85-1 98,6 0,18 76,8 + 17,5 (R) 29, Candida sake 777 89,6 0,07 80,4 – 42,4 (S) 74, Candida sp. 81-12 98,6 0,09 85,6 – 41,3 (S) 72, Metschnikowia sp. 84-13 91,6 0,1 87,8 – 38,0 (S) 66, Условия реакции: 30 оС;

0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0;

биомасса - 80 г (асв)/л;

АФ - 5 г/л;

время реакции - 24 ч. Стандартная величина удельного вращения: (S)-(-)-1-фенилэтанола [ ] 25 = -57 (с=5,12;

CHCl3), (R)-(+)-1-фенилэтанола [ ] 25 = +58,7 (с=1,03;

CHCl3).

D D Оптическая чистота,%ee R Рисунок 1 - Изменение оптической чистоты 1-ФЭ при трансформации АФ с помощью биомассы гриба Geotrichum sp. 85- S - Условия реакции: 30 оС;

0,1М фосфатный - буфер рН 7,0;

биомасса - 80 г (асв)/л;

0 24 48 72 АФ - 5 г/л.

Время, ч Однако, исследование зависимости энантиоселективности трансформации АФ грибом Geotrichum sp. 85-1 от продолжительности реакции показало, что вначале реак ции также превалирует (S)-1-ФЭ (рисунок 1), но затем увеличивается содержание (R)-энантиомера в реакционной среде.

Изменение энантиомерного состава продуктов в процессе трансформации АФ в сто рону обогащения (R)-энантиомером происходило также и в случае остальных культур мик роорганизмов (таблица 1 и 2).

Таблица 2 - Оптические свойства 1-фенилэтанола, полученного при трансформации АФ дрожжевыми микроорганизмами [ ] 25 Оптическая чистота, D Микроорганизм % ее (конфигурация) Candida sp. 81-12 – 22,0 (S) 38, Metschnikowia sp. 84-13 – 19,2 (S) 33, Candida sake 777 + 12,4 (R) 21, Условия реакции:30 оС;

0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0;

биомасса - 80 г(асв)/л;

АФ - 5 г/л;

48 ч.

Возможным объяснением этого явления может служить изомеризация (S)-энантиомера 1-ФЭ, образующегося первоначально в качестве основного оптического изомера при восстановлении АФ, в (R)-энантиомер.

OH OH O ацетофенон (R)-1-фенилэтанол (S)-1-фенилэтанол В основе такой изомеризации может лежать низкая энантиоселективность фер мента(ов), восстанавливающего АФ, и низкая активность или отсутствие фермента(ов), окисляющего (R)-1-ФЭ.

1.2 Исследование восстановления ацетофенона в биоэмульсиях Одним из подходов, позволяющих повысить энантиоселективность клеточных ка тализаторов восстановления карбонилсодержащих соединений, является подавление не целевых ферментов с помощью органического растворителя (гексана, гептана, изопро панола, ацетона и др.). При использовании гидрофобных растворителей перспективным представляется проведение данных трансформаций в биоэмульсиях, образованных клетками микроорганизмов.

Исследование эмульгуриющих свойств биомассы микроорганизмов показало, что водные суспензии всех исследуемых культур образуют эмульсии типа «масло в воде» с органическими растворителями (н-гексадеканом, н-тетрадеканом, н-деканом, изоокта ном, хлороформом, этилацетатом, метилэтилкетоном). Образованные эмульсии характе ризуются высокими значениями индекса эмульгирующей активности (более 50%).

При микроскопировании препаратов эмульсий обнаружено, что клетки микроор ганизмов иммобилизуются на поверхности капель органической фазы (рисунок 2).

Рисунок 2 - Микрофотография эмуль сии декана в воде, образованная био массой дрожжей Candida sp. 81- (х 250) На основании результатов исследования распределения субстрата и продукта, жизнеспособности микроорганизмов и их карбонилредуктазной активности в органиче ских растворителях при проведении трансформации АФ в биоэмульсиях с органически ми растворителями была выбрана система буфер-изооктан.

Сравнение выхода 1-ФЭ при трансформации АФ биомассой гриба Geotrichum sp. 85-1 в буферном растворе и биоэмульсии показало, что наибольший вы ход продукта может быть получен при проведении реакции в биоэмульсиях (рисунок 3).

Выход 1-ФЭ, г/л Рисунок 3 – Сравнение выхода 1-ФЭ при трансформации АФ биомассой гриба Geotrichum sp. 85-1 в буфер ном растворе и биоэмульсии 5 10 Условия реакции: биомасса - 80 г (асв)/л;

Концентрация ацетофенона, г/л 30 оС;

24 ч.

буфер эмульсия Таблица 3 – Выход и оптические свойства 1-фенилэтанола, полученного при трансформа ции АФ исследуемыми культурами микроорганизмов в биоэмульсии Выход Оптическая [ ] Концентрация D Микроорганизм чистота, 1-ФЭ, АФ, г/л (конфигурация) % ее % 5 88,0 – 4,5 (S) 7, Geotrichum sp. 85-1 10 87,0 - 4,0 (S) 7, 15 80,6 – 4,3 (S) 7, Candida sp. 81-12 5 74,0 - 42,1 (S) 73, Metschnicowia sp. 84-13 5 75,0 - 40,6 (S) 71, Candida sake 777 5 71,1 - 41,4 (S) 72, Условия реакции: 30 оС;

вода – изооктан в соотношении 1:1;

биомасса - 80 г (асв)/л;

АФ - 5 г/л;

24 ч.

Установлено, что в биоэмульсиях во всех вариантах преимущественно накаплива ется S-энантиомер (таблица 3). Однако, оптическая чистота продукта при этом не пре вышала 74% ее.

1.3 Трансформация ацетофенона в буфере с помощью пермеабилизованных клеток Другим из известных подходов увеличения селективности биокатализаторов, яв ляется использование пермеабилизованных органическими растворителями клеток, в присутствии экзогенного донора и кофермента (NADPH).

Пермеабилизацию клеток микроорганизмов осуществляли обработкой биомассы с помощью ацетона или изопропанола. В качестве экзогенного восстановителя был ис пользован изопропанол.

OH O NAD(P)+ пермеабилизованная NAD(P)H клетка OH O Таблица 4 - Трансформация АФ пермеабилизованными клетками микроорганизмов [ ] Кон- Выход Оптиче Удельная D Микроорганизм версия ская чис 1-ФЭ, активность, (конфи (растворитель) ммоль/(г(асв)*ч) АФ, % тота, % ее % гурация) Geotrichum sp. 85- 0,078 79,4 49,4 – 56,9 (S) (ацетон) Geotrichum sp. 85- 0,053 91,4 56,6 – 57,0 (S) (изопропанол) Candida sake 0,093 80,6 67,6 – 51,8 (S) 90, (ацетон) Candida sp. 81- 0,088 94,0 92,2 – 42,8 (S) 75, (ацетон) Metschnikowia sp. 84- 0,078 98,4 98,0 – 42,1 (S) 73, (ацетон) Условия реакции: 30-32 оС;

0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0;

АФ - 5 г/л;

пермеабилизованные клетки - 80 г/л;

NADPН – 0,26 г/л;

изопропанол - 0,33%;

аэробные условия;

24 ч.

При трансформации АФ пермеабилизованными клетками микроорганизмов в присутствии изопропанола было показано, что в этом случае достигается более глубо кая, чем в эмульсии конверсия субстрата (79 - 98%) с образованием преимущественно S-энантиомера 1-ФЭ (таблица 4).

При этом в случае гриба Geotrichum sp. 85-1 образуется целевой продукт с высо кой оптической чистотой (не менее 99 % ее). Однако выход (S)-1-ФЭ в этом случае не превышает 49 – 57%.

1.4 Исследование трансформации ацетофенона с помощью гриба Geotrichum sp. 85-1 в системах буфер – изопропанол С целью разработки более эффективного метода получения (S)-1-ФЭ с помощью гриба Geotrichum sp. 85-1 была исследована трансформация АФ интактными клетками в буферном растворе, содержащем изопропанол в различных концентрациях.

Было обнаружено, что в отличие от пермеабилизованных клеток, для активности которых необходимо было вводить NAD(P)Н, в случае использования необработанной органическим растворителем биомассы проявляется высокая карбонилредуктазная ак тивность даже в отсутствие кофермента (таблица 5). Увеличение содержания изопропа нола в реакционной смеси до 33,0 % приводит к возрастанию удельной активности кле ток.

Таблица 5 - Удельная активность биомассы гриба Geotrichum sp. 85- Изопропанол, Удельная активность, NAD(P)H, Биомасса г/л ммоль/(г(асв)*ч) % Предварительно обработанная 0 0 изопропанолом 0,33 0,26 0, 0 0 0, Без предварительной обработ- 0,33 0 0, ки изопропанолом 3,30 0 0, 33,0 0 0, Условия реакции: 30 оС;

0,1М фосфатный буфер рН 7,0;

АФ - 5 г/л;

биомасса - 80 г (асв)/л Установлено также, что добавление в реакционную смесь с необработанной био массой даже небольшого количества изопропанола (0,33%) вызывает изменение стерео направленности реакции, что, возможно, связано с ингибированием R-редуктазы дан ным растворителем.

Таблица 6 – Выход и оптические свойства 1-ФЭ, полученного при трансформации АФ биомассой гриба Geotrichum sp. 85-1 в системе с изопропанолом Концентрация Выход Оптическая [ ] Конверсия, D Время, ч изопропанола, чистота, 1-ФЭ, % (конфигурация) % ее % % 0 24 98,6 76,1 +17,5 (R) 29, 0,33 24 98,6 82,6 -4,8 (S) 8, 3,3 24 85,2 82,0 -21,5 (S) 37, 3 83,6 72,1 - 5 85,6 83,6 -56,7 (S) 33, 7 90,8 83,2 - 24 62,0 60,0 -56,9 (S) Условия реакции: 30 оС;

0,1М фосфатный буфер рН 7,0;

АФ - 5 г/л;

биомасса - 80 г (асв)/л Было обнаружено, что увеличение содержания изопропанола в реакционной сме си до 33,0 % приводит к возрастанию карбонилредуктазной активности клеток, а также к существенному повышению оптической чистоты продукта до 99% ее (таблица 6).

Вместе с тем, было обнаружено, что при данной концентрации изопропанола вы ход 1-ФЭ через 24 ч составил лишь 60%, что сопоставимо с выходами, полученными при работе с пермеабилизованными клетками микроорганизмов (таблица 4 и 6).

Концентрация, г/л Изопропанол:

Рисунок 4- Кинетика нако 0% пления 1-ФЭ при транс 0,33% формации АФ биомассой 3,30% 1 гриба Geotrichum sp. 85- 33% при различном содержании изопропанола в реакцион 0 6 12 18 ной смеси Время, ч Однако исследование динамики выхода продукта в системе буфер-изопропанол (33,0%) показало, что при менее продолжительной трансформации (5-7 ч) можно полу чить продукт с выходом 83% (рисунок 4). При этом оптическая чистота (S)-1-ФЭ оста ется очень высокой (таблица 6).

1.5 Исследование условий получения (S)-(-)-1-фенилэтанола с помощью гриба Geotrichum sp. 85-1 в системе буфер – изопропанол (33%) При изучении зависимости параметров восстановления АФ в подобранной систе ме буфер – изопропанол (33%) от возраста биомассы было установлено, что карбонил редуктазная активность биокатализатора, а также выход продукта и биомассы достига ют максимального значения на третьи сутки (рисунок 5, 6). Время выращивания био массы практически не влияет на энантиоселективность восстановления АФ (рисунок 5).

Во всех исследуемых вариантах (S)-1-ФЭ получен с высокой оптической чистотой (не менее 99 %ее).

Влияние кислотности среды на выход продукта восстановления АФ в изучаемом диапазоне (рН 6–8) незначительно. Наибольший выход наблюдали при рН в области 7,0.

Оптимальная температура для осуществления реакции лежит в области от о до 32 С, хотя реакция протекает с достаточно высокими выходами во всем исследуемом диапазоне температур от 20 до 50 оС.

Энантиоселективность реакции оставалась неизменно на высоком уровне при всех исследуемых значениях рН и температуры.

Оптическая чистота, %ee 100 100 0,4 Удельная активность, Выход 1-ФЭ, % Биомасса, г(асв)/л 80 ммоль/(г(асв)*ч) 0,3 60 0,2 40 20 20 0,1 0 0 1 2 3 0 1 2 3 4 Время выращивания биомассы, сут Время выращивания биомассы, сут выход 1-ФЭ оптическая чистота удельная активность биомасса Рисунок 5– Зависимость оптической Рисунок 6 – Динамика роста и чистоты и выхода 1-ФЭ от возраста карбонилредуктазной активности биомассы Geotrichum sp. 85-1 биокатализатора В результате исследования зависимости выхода целевого продукта от начальной концентрации АФ было обнаружено, что трехсуточная биомасса Geotrichum sp. 85- в подобранных условиях проявляет высокую устойчивость к токсическому действию этого соединения и может восстанавливать 10 – 15 г/л субстрата в (S)-1-ФЭ высокой оп тической чистоты (рисунок 7).

10 Оптическая чистота, Выход 1-ФЭ, г/л 8 6 %ее Рисунок 7 – Зависимость выхода и 4 оптической чистоты 1-ФЭ от началь 2 20 ной концентрации субстрата 0 Условия: 5 ч при 30 оС;

0,1М фосфатный 0 5 10 буфер рН 7,0;

изопропанол – 33%;

био Начальная концентарция АФ, г/л масса – 80 г (асв)/л;

5 ч выход оптическая чистота При оптимальной концентрации 10 г/л АФ за 5 ч трансформации образуется ~ 7 г/л (S)-1-ФЭ с энантиомерным избытком не менее 99% ее.

1.6 Исследование стереоинверсии рацемического 1-фенилэтанола С целью разработки метода получения (R)-1-ФЭ была исследована трансформа ция рацемического 1-ФЭ с помощью микроорганизмов, для которых была выявлена изомеризация (S)-1-ФЭ в R-энантиомер в ходе восстановления АФ.

Было обнаружено, что исследуемые микроорганизмы осуществляют дерацемиза цию рацемического 1-ФЭ с накоплением (R)-1-ФЭ в реакционной смеси (рисунок 8).

В качестве промежуточного продукта в реакционной смеси обнаруживается АФ (до 0,07 г/л). Выход 1-ФЭ в конце трансформации составляет 91-95% (рисунок 8а).

Оптическая чистота (R)-1 Выход 1-фенилэтанола,% 80 ФЭ, %ее 60 0 1 2 3 4 5 1 2 3 Время, сут а б 1-Geotrichum sp. 85-1;

2-Candida sp. 81-12;

3- Metschnikowia sp. 84-13;

4- Candida sake Рисунок 8 – Выход 1-ФЭ (а) и динамика изменения энантиомерного избытка R-энантиомера 1-ФЭ (б) во времени Условия реакции: 30 оС;

0,1М фосфатный буфер рН 7,0;

биомасса - 80 г (асв)/л;

1-ФЭ - 5 г/л В случае культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Metschnikowia sp. 84-13, Candida sake 777 оптическая чистота (R)-1-ФЭ увеличивается до 45-70%ее за 5 суток трансформации (рисунок 8б). При инкубировании рацемического субстрата с биомассой Candida sp. 81-12 в течение 6 суток энантиомерный избыток (R)-1-ФЭ существенно вы ше и достигает 95,8% ее.

1.7 Принципиальная схема получения оптических изомеров (S)- и (R)-1-фенилэтанола На основе произведенных исследований разработана схема препаративного полу чения оптического изомера (S)-(-)-1-ФЭ путем энантиоселективного восстановления АФ биокатализатором на основе культуры микроорганизма Geotrichum sp. 85-1 и получения оптического изомера (R)-(+)-1-ФЭ путем стереоинверсии рацемического 1-ФЭ биоката лизатором на основе культуры микроорганизма Candida sp. 81-12, состоящая из 3 ста дий: получения биокатализатора, энантиоселективного восстановления/стереоинверсии и выделения полученного энантиомера из реакционной смеси (рисунок 9).

Биомассу микроорганизма Geotrichum sp. 85-1 выращивают в ферментере 1 в те чение 72 ч при температуре 28 - 30 оС и рН 6,2. Биомассу микроорганизма Candida sp. 81-12 выращивают в ферментере 1 в течение 72 ч при температуре 28 - 30 оС и рН 6,5. Выращенная биомасса подается в центрифугу 2. Осажденная биомасса посту пает в емкость 3, в которой она суспендируется в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,0).

Полученная суспензия поступает в реактор 4. Туда же подается изопропанол и субстрат трансформации. В случае восстановления АФ трансформация осуществляется в течение 5 ч при температуре 30 оС и непрерывном перемешивании. При трансформа ции рацемического 1-ФЭ процесс дерацемизации осуществляется в течение 6 сут при температуре 30 оС и непрерывном перемешивании.

субстрат биокатализатор хлороформ ПС Ин СВ хв 4 гв MgSO отработанный биокатализатор буфер NaCl 9 MgSO хлороформ культуральная жидкость I (S)-(-)-1-ФЭ II (R)-(+)-1-ФЭ 1 - ферментер;

2 - центрифуга;

3, 6, 8 - ёмкости с мешалкой;

4 - реактор;

5, 9 – фильтры;

7 экстрактор;

10-вакуумный испаритель;

11 – ёмкость. ПС – питательная среда;

Ин – инокулят;

СВ - стерильный воздух.

Рисунок 9 - Принципиальная технологическая схема получения (S)-(-)-1-фенилэтанола биокатализатором на основе культуры Geotrichum sp. 85-1 и (R)-(+)-1-фенилэтанола биокатализатором на основе культуры Candida sp. 81- После трансформации биомасса удаляется из реакционной смеси на фильтре 5.

Фильтрат собирается в емкость 6, куда также добавляется NaCl (до насыщения) для вы саливания продуктов реакции. Полученная смесь направляется в экстрактор 7 для экс тракции продуктов хлороформом. Хлороформная фракция обезвоживается с помощью MgSO4 в емкости 8. Обезвоженный экстракт фильтруется на фильтре 9 и направляется в испаритель 10 для отгонки растворителя. Готовые продукты собираются в емкости 11.

2 Разработка методов биоконверсии растительных масел в грибные липиды, обогащенные эйкозапентаеновой кислотой 2.1 Исследование трансформации льняного масла галорезистентным грибом Mortierella alpinа ХН-1 на среде ОГ с 5% NaCl Ранее было показано, что гриб M. alpinа 18-1 может трансформировать -линолевую кислоту, содержащейся в льняном масле, в ЭПК с выходом 1,48 г/кг среды за 13 сут трансформации10-ти суточным мицелием. Предполагается, что в этом процес се участвуют те же ферменты, что и в биосинтезе арахидоновой кислоты, продуцентом которой является данный гриб.

Олеиновая 12-десатураза COOH COOH кислота Альфа-линоленовая кислота 18:1 w9 Линолевая кислота 18:3 w 18:2 w 9-десатураза 6-десатураза 6-десатураза Глюкоза Стеариновая COOH COOH (глицерин) кислота 18:0 Гамма-линоленовая кислота Стеаридоновая кислота 18:3 w6 18:4 w элонгаза элонгаза COOH COOH Дигомо-гамма -линоленовая кислота Эйкозатетраеновая кислота 20:3 w6 20:4 w 5-десатураза 5-десатураза COOH 5% NaCl COOH w3-десатураза Эйкозапентаеновая кислота Арахидоновая кислота.

20:4 w6 20:5 w.

В связи с низким выходом ЭПК в данной работе решались 3 основные задачи, на правленные на интенсификацию получения ЭПК: исследование возможности замены гриба M. alpinа 18-1 его галорезистентным мутантом ХН1, который, как известно, мо жет синтезировать эту кислоту de novo из глицерина;

исследование трансформации льняного масла биомассой дикого и мутантного грибов, полученной на оптимизирован ной среде с сульфатом цинка;

исследование возможности получения ЭПК трансформа цией других доступных растительных масел.

При исследовании возможности использования для трансформации льняного масла галорезистентного мутанта ХН1 были получены грибные липиды, содержащее 21,9 % ЭПК (рисунок 10). При этом выход ЭПК через 10 суток трансформации составил 1,35 г/кг среды, что сопоставимо с выходом этого соединения, полученным ранее с по мощью исходного гриба M. alpinа 18-1, но за 13 суток.

25, Жирные кислоты, % 25 21, (от суммы ЖК) 18, 15, 13, 15 Рисунок 10 – Жирнокислотный 10 профиль 20-суточного мицелия гри 5 1,1 1,6 2,2 ба M. alpinа ХН1 при трансформа 0 ции льняного масла на среде ОГ с 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n 14:' 16:' 18:' NaCl (5%) Вместе с тем, следует отметить, что в обоих случаях выход целевого продукта не достаточно высок и требуется поиск способов интенсификации разрабатываемых био трансформаций.

2.2 Исследование влияния сульфата цинка на синтез ЭПК de novo у галорезистентного мутанта Одним из подходов к такой интенсификации является подбор условий культиви рования гриба, обеспечивающий эффективный синтез высокоактивной биомассы мик роорганизма. В этом аспекте заслуживает внимание факт стимулирования липидообра зования у микроорганизмов ионами некоторых двухвалентных металлов. В частности известно, что ионы цинка и магния активируют ацетил-СоА-карбоксилазу – ключевой фермент синтеза жирных кислот. Активация этого фермента ионами металлов должна приводить к ускорению синтеза жирных кислот. Положительное влияние ионов цинка на синтез арахидоновой кислоты de novo грибом M. alpina 18-1 было выявлено ранее.

В результате исследования влияния сульфата цинка на рост и липидообразование галорезистентного мутанта ХН1 было обнаружено, что введение цинка в среду приводит к существенному увеличению выхода биомассы в конце культивирования (таблица 7).

Таблица 7 – Влияние ионов цинка на выход биомассы и липидов при росте гриба ХН на овсяной среде с глицерином и хлоридом натрия Среда Нелипидные Содержание Время, Липиды, Биомасса, Липиды, компоненты, сут % от асв г/кг г/кг Обозначение сульфата г/кг цинка, % ОГ с NaCl 0 21 43,5 14,51 8,2 6, ОГЦ с NaCl 0,01 21 64 23,15 8,34 14, При этом содержание липидов в 21-суточной биомассе гриба, растущего на ОГЦ среде с 5 % NaCl, достигало 64 %, тогда как на среде без сульфата цинка липиды состав ляли лишь около 43 % грибной массы. В тоже время выход нелипидных компонентов гриба остается на том же уровне.

При исследовании состава липидной фракции 18-суточного гриба M. alpinа ХН1, выращенного на среде ОГЦ, содержащей 5% NaCl, было обнаружено, что в ней содер жится свыше 22 % ЭПК (рисунок 11).

34, Жирные кислоты, % (от 25 22, суммы ЖК) 15 12, Рисунок 11 – Жирнокислотный 8,9 9, 5,4 5,1 профиль липидов 18-суточного 5 1, 0 0 мицелия M. alpinа ХН1 на среде 14:' 16:' 18:' 20:' 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n ОГЦ с NaCl (5%) Выход этого соединения при выращивании гриба на среде ОГЦ в течение 18 су ток составил 2,71 г/кг среды. Ранее на аналогичной среде без цинка с помощью галоре зистентного гриба удалось получить ЭПК только с выходом 0,95 г/кг за 23 суток куль тивирования.

2.3 Исследование трансформации льняного масла грибами, выращенными на средах с сульфатом цинка Были исследованы процессы трансформации льняного масла с помощью биомас сы исходного и галорезистентного грибов, полученной на овсяной среде с глицерином в присутствии 0,01 % сульфата цинка.

При трансформации льняного масла в течение 10 суток с помощью биомассы га лорезистентного гриба M. alpinа ХН1, выращенной на среде ОГЦ с хлоридом натрия (5%), были получены липиды с более высоким содержанием ЭПК (таблица 8), чем на среде без цинка. При этом также существенно возрастает доля всех С20 ПНЖК (с 40, до 86,4 %). Выход ЭПК при трансформации льняного масла грибом M. alpinа ХН1 на среде с сульфатом цинка достигает 5,63 г/кг, что почти в 4 раза выше, чем на среде без ионов цинка (1,35 г/кг).

Таблица 8 – Содержание ПНЖК при трансформации льняного масла на средах с суль фатом цинка Содержание ПНЖК, % Выход Микроорга- Дигомо-- Арахидо- Эйкозапен Среда ЭПК, низм линоленовая новая таеновая г/кг кислота кислота кислота M. alpinа ХН1 ОГ с NaCl 0 18,6 21,9 1, M. alpinа ХН1 ОГЦ с NaCl 22,2 27,3 36,9 5, ОГЦ M. alpinа 18-1 17,6 38,8 26,2 5, При трансформации льняного масла с помощью биомассы исходного гриба, по лученной на овсяной среде с глицерином в присутствии сульфата цинка, обнаружено, что выход ЭПК в расчете на 1 кг среды также существенно увеличился (с 1,48 на среде ОГ до 5,2 г/кг на среде ОГЦ).

2.4 Исследование трансформации растительных масел, обедненных или несодержащих -линоленовую кислоту Была исследована возможность получения ЭПК, а также других ценных ПНЖК, с помощью исследуемых грибов M. alpinа путем трансформации других растительных масел, несодержащих или содержащих лишь небольшие количества -линоленовой ки слоты. В качестве субстратов использовали соевое, подсолнечное и оливковое масла.

Преобладающей жирной кислотой в соевом и подсолнечном масле является линолевая кислота (54 и 67 %, соответственно), а в оливковом масле – олеиновая кислота (80 %).

Доля -линоленовой кислоты в данных маслах колеблется от 0,2 до 8 %.

32,7 40,5 Жирные кислоты, % Жирные кислоты, % 40 33,3 (от суммы ЖК) (от суммы ЖК) 17, 25 20 15 10, 15 9, 10 3,2 2,8 4, 4,1 3, 1 2, 5 5 14:' 16:' 18:' 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n 14:' 16:' 18:' а Mortierella alpinа 18-1 а Mortierella alpinа ХН 32,6 27, 35 30, 24, Жирные кислоты, % Жирные кислоты, % 30 (от суммы ЖК) (от суммы ЖК) 20, 16, 20 13, 15 10, 15 10, 9, 3, 1, 5 0 0 14:' 16:' 18:' 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n 14:' 16:' 18:' 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n б Mortierella alpinа 18-1 б Mortierella alpinа ХН 35, Жирные кислоты, % 35 29, (от суммы ЖК) 15 9, Рисунок 12 – Жирнокислотный профиль липи 2,1 5 дов грибов при трансформации соевого (а), 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n 14:' 16:' 18:' оливкового (б) и подсолнечного (в) масел на средах с 0,01% сульфатом цинка в Mortierella alpinа 18- Было обнаружено, что ЭПК может быть получена не только из льняного масла, содержащего -линоленовую кислоту, но и из растительных масел, не содержащих это соединение. При трансформации соевого, подсолнечного и оливкового масел содержа ние ЭПК достигало 20-40%. Кроме того, в ряде случаев в липидах в значительных коли чествах обнаружена арахидоновая кислота (до 33% от суммы жирных кислот) (рисунок 12).

2.5 Анализ выхода липидов и ПНЖК при трансформации растительных масел Анализ выхода липидов при трансформации растительных масел показал, что с помощью исследуемых грибов на среде ОГЦ можно получать от 15 до 22 г/кг среды грибного масла (рисунок 13 а). При этом более высокий выход липидов может быть достигнут при трансформации растительных масел с помощью исходного гриба 18-1.

Наиболее высокий выход ценных ПНЖК (17,3 г/кг среды) может быть получен при трансформации грибом M. alpinа 18-1 льняного масла (рисунок 13 б).

17, 25 22, 16 13, 20 14, 19,7 Выход ПНЖК, г/кг Выход липидов, г/кг 20 17,8 14 12, 16, 16 15,3 12 10 7, ЛМ СМ ПМ ОМ ЛМ СМ ПМ ОМ б а – M. alpina 18-1 (среда ОГЦ);

7,9 – M. alpina ХН1 (среда ОГЦ с 5 % NaCl) 8 7, Эйкозапентаеновая 7 5, 5,2 5, кислота, г/кг 6 Масло: ЛМ – льняное, СМ – соевое, ПМ – подсолнечное, ОМ – оливковое 3, Рисунок Выход липидов 13 – (а), 1 ПНЖК (б) и ЭПК (в) при трансформации 0 растительных масел с помощью ЛМ СМ ПМ ОМ исследуемых грибов в Наибольший выход целевой ЭПК (7,2 – 7,9 г/кг среды) был достигнут при транс формации в течении 10 сут соевого и подсолнечного масел с помощью M. alpinа 18-1, что превышает ее выход при трансформации льняного масла, изначально прогнозируе мого как наиболее перспективного источника богатого предшественником ЭПК -линоленовой кислотой (рисунок 13 в).

Согласно литературным данным, одним из наилучших достижений в получении ЭПК является процесс трансформации льняного масла с помощью мутантного гриба M. alpinа, дефицитного по 12-десатуразе, накапливающего около 6,4 % ЭПК от веса биомассы. Нами при трансформации растительных масел на средах с сульфатом цинка с помощью исследуемых грибов удалось получить от 11,9 до 18,3 % ЭПК от веса сухой биомассы.

Помимо ЭПК трансформацией исследуемых масел можно получать сопутствую щую арахидоновую кислоту с выходом 4,3 – 7,6 г/кг среды, а также дигомо- линоленовую кислоту с выходом 3,5 - 3,6 г/кг среды при использовании в качестве суб страта льняного масла.

ВЫВОДЫ 1 В результате скрининга найдены микроорганизмы Geotrichum sp. 85-1, Candida sake 777, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13, проявляющие карбонилредуктазную активность в отношении ацетофенона при высоких концентрациях субстрата (5-15 г/л).

2 Разработаны методы получения (S)-1-фенилэтанола c выходом 56-83% высокой оптической чистоты менее с помощью клеток (не 99%ее) Geotrichum sp. 85-1, пермеабилизованных ацетоном или изопропанолом, а также с по мощью интактных клеток в буфере, содержащем 33% изопропанола.

3 Обнаружена реакция окислительно-восстановительной изомеризации (S)-изомера 1-фенилэтанола в (R)-изомер при инкубировании их рацемической смеси с биомассами микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Candida sake 777, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13.

4 На основе культуры Candida sp. 81-12 предложен метод получения (R)-1-фенилэтанола стереоизомеризацией S-энантиомера рацемического 1-фенилэтанола с выходом 95% и оптической чистотой 95,8%ее.

5 Научно обоснована принципиальная технологическая схема получения энантиоселективным восстановлением ацетофенона (S)-(-)-1-фенилэтанола и (R)-(+)-1-фенилэтанола дерацемизаций рацемической смеси 1-фенилэтанола с исполь зованием разработанных биокатализаторов на основе культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1 и Candida sp. 81-12.

6 Показана возможность использования гриба Mortierella alpina 18-1 и его галоре зистентного мутанта ХН1 для трансформации растительных масел (льняного, соевого, подсолнечного и оливкового) с высоким содержанием -линоленовой, линолевой и олеиновой кислот в грибные липиды, обогащенные эйкозапентаеновой кислотой, обра зующейся с выходом 3,4 – 7,9 г/кг среды в составе других ценных полиненасыщенных жирных кислот (общий выход 7,9 – 17,3 г/кг среды).

7 Выявлена способность гриба Mortierella alpina 18-1 и его галорезистентного му танта ХН1 трансформировать льняное масло в дигомо--линоленовую кислоту с выхо дом 3,5 - 3,6 г/кг среды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Калимуллина, Л.Я. Скрининг дрожжевых штаммов, способных продуцировать био эмульгаторы / Л.Я. Калимуллина, О.В. Семенова, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Ин теграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии: Материалы IV Всероссийской научной INTERNET-конференции. Уфа: Изд-во Реактив.- 2006.- С.100-101.

Калимуллина, Л.Я. Стереоинверсия 1-фенилэтанола грибом рода Geotrichum / Л.Я.

Калимуллина, Н.И. Петухова, Д.Г. Ханнанова, В.В. Зорин // Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии: Ма териалы V Всероссийской научной INTERNET-конференции.- Уфа: Изд-во Реак тив.- 2007.- С. 63-64.

Ханнанова, Д.Г. Скрининг биокатализаторов для энантиоселективной трансформа ции ацетофенона / Д.Г. Ханнанова, Л.Я. Калимуллина, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Башкирский химический журнал.- 2007.- №1.-С.148-150.

Калимуллина, Л.Я. Восстановление карбонилсодержащих соединений в биоэмуль сиях с помощью клеток дрожжей / Л.Я. Калимуллина, Э.Р. Мухитдинов, Н.И. Пе тухова, В.В. Зорин // Башкирский химический журнал.- 2007.– № 1.- С. 151-153.

Сюндюкова, Ю.Р. Разработка методов биоконверсии растительных масел в липиды, обогащенные арахидоновой и экозапентаеновой кислотами / Ю.Р. Сюндюкова, Л.Я.

Калимуллина, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Химия и медицина: Материалы VI Все российского научного семинара с Молодежной научной школой.- Уфа: Гилем. 2007.- С. 227.

Калимуллина, Л.Я. Восстановление ацетофенона с помощью клеток гриба Geotrichum sp. 85-1 в биоэмульсиях / Л.Я. Калимуллина, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Башкирский химический журнал.- 2008.– №1. -С. 8-10.

Петухова, Н.И. Биотрансформация льняного масла в липиды, обогащенные эйкоза пентаеновой кислотой / Н.И. Петухова, Л.Я. Калимуллина, Ю.Р. Рахматуллина, В.В. Зорин // Башкирский химический журнал.- 2008.– №1. -С. 19-21.

Соискатель Калимуллина Л.Я.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.